專利名稱：土壤蛋白質(zhì)提取及胞內(nèi)蛋白質(zhì)的分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)領(lǐng)域土壤蛋白質(zhì)提取與胞內(nèi)蛋白分離的方法。
背景技術(shù)：
宏蛋白質(zhì)組學(xué)是近年來新出現(xiàn)的一種概念和研究技術(shù)，該技術(shù)除可環(huán)境中的微生物種 群進(jìn)行研究，還可對微生物群落進(jìn)行深入分析通過宏蛋白質(zhì)組研究能夠把微生物群落組 成與其功能聯(lián)系起來，從而更好的了解微生物群落。雖然現(xiàn)在已經(jīng)開展的宏蛋白質(zhì)組學(xué)的 研究很少，但是在特殊極端環(huán)境中功能基因表達(dá)、特殊功能蛋白質(zhì)的開發(fā)、生態(tài)元素循環(huán) 等研究領(lǐng)域，宏蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)初步展示了其強大的功能。
Wilmes等人首次以具有生物除磷功能的活性污泥為研究對象，研究了一個完整的廢水 除磷處理過程中活性污泥蛋白質(zhì)組的變化，展現(xiàn)了宏蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在探索環(huán)境微生物的 特殊功能方面的巨大作用。Schulze等人研究了分離于森林湖泊及土壤中溶解態(tài)有機物 (Dissolved organic matter, DOM)的各種蛋白質(zhì)，希望找到與生態(tài)碳循環(huán)有關(guān)的細(xì)胞外 蛋白質(zhì)。他們的工作是首次將宏蛋白質(zhì)組學(xué)運用于生態(tài)元素的循環(huán)研究上，得到了很多有 趣的結(jié)果，顯示了宏蛋白質(zhì)組學(xué)研究在揭示生態(tài)環(huán)境功能上的作用。美國加州大學(xué)伯利克 分校的Banfield等人成功地將宏蛋白質(zhì)組學(xué)和宏基因組學(xué)的研究結(jié)合起來對極端環(huán)境微 生物進(jìn)行了研究，成功地利用其研究成果構(gòu)建了在這種極端環(huán)境下能量和物質(zhì)的代謝循環(huán) 模式圖，充分顯示了宏基因組學(xué)和宏蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)合研究的強大力量。然而現(xiàn)在還有沒有 通用的應(yīng)用于環(huán)境樣品蛋白質(zhì)提取方法，特別是從海水、土壤等復(fù)雜環(huán)境樣品中提取還有 很大困難。已有的研究如AMD生物膜和活性污泥，這些樣品來自于極端環(huán)境，微生物多樣 性較低，對于海水，土壤等這類環(huán)境復(fù)雜、微生物多樣性高的樣品，傳統(tǒng)的平板法只能提 供不到1%的微生物信息，而現(xiàn)被宏蛋白質(zhì)組研究者廣泛使用的1993年(O. A. Ogunseitan， 1993)建立的方法，我們經(jīng)過重復(fù)，沒有獲得理想的效果，表明該方法缺乏較好的通用性， 因此發(fā)展高效、通用的蛋白質(zhì)提取方法對宏蛋白質(zhì)組學(xué)研究與應(yīng)用至關(guān)重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高效的土壤蛋白質(zhì)提取方法，對蛋白質(zhì)組分得率可提高到 37.5%。
一種高效的土壤蛋白質(zhì)提取方法包括樣品前處理、蛋白的提取，具體方法如下
樣品前處理稱取樣品土壤65g于錐形瓶，加入預(yù)冷的土壤蛋白質(zhì)提取緩沖液150ml，混勻后置4°C,搖床振蕩過夜。振蕩液用濾紙于布氏漏斗真空抽濾，取抽濾液過大孔樹脂 (DIOI)，取過柱液過0.22ym微孔濾膜，濾液為胞外蛋白質(zhì)母液，濾膜上做進(jìn)一步胞內(nèi) 蛋白質(zhì)提取。
土壤蛋白質(zhì)提取緩沖液配比0.82g磷酸二氫鉀+0. 16g磷酸氫二鉀，定容至100ml， 向其中加入8ml 0. 5M， pH8.0 EDTA。
胞外蛋白質(zhì)的提取取胞外蛋白質(zhì)母液，加入等體積的預(yù)冷的丙酮溶液，混勻后靜置 沉淀4一5h， 30000rpm， 4。C離心30min，棄上清，沉淀用預(yù)冷的丙酮洗滌，13000rpm， 4 。C離心10min，棄上清，沉淀用預(yù)冷的無水乙醇于4'C超聲波下洗滌10min, 13000rpm， 4 。C離心10min，棄上清，沉淀用預(yù)冷的乙醚洗滌，13000rpm， 4。C離心10min，棄上清，沉 淀用真空干燥機干燥，干粉即為胞外土壤蛋白質(zhì)沉淀物。
胞內(nèi)蛋白質(zhì)的提取取上述已過濾的濾膜于燒杯中，加入20ml的預(yù)冷的土壤蛋白質(zhì) 提取緩沖液，于超聲波儀器4'C超聲洗滌IO分鐘，棄濾膜，溶液倒入50ml離心管中，離 心管于細(xì)胞破碎儀中細(xì)胞破碎(功率15%，時間600s， 槽溫4'C，超聲間隔5s)，細(xì)胞破 碎完成后，向離心管中加入等體積的預(yù)冷的丙酮溶液，混勻后靜置沉淀4一5h， 30000rpm, 4。C離心30min，棄上清，沉淀用預(yù)冷的丙酮洗滌，13000rpm， 4。C離心10min，棄上清， 沉淀用預(yù)冷的無水乙醇于4'C超聲波下洗滌10min， 13000rpm， 4。C離心10min，棄上清， 沉淀用預(yù)冷的乙醚洗滌，13000rpm， 4'C離心10min,棄上清，沉淀用真空干燥機干燥，干 粉即為胞內(nèi)土壤蛋白質(zhì)沉淀物。
胞內(nèi)蛋白質(zhì)的分離方法
樣品裂解稱取胞內(nèi)蛋白質(zhì)干粉按15H 1/mg的比例用CHAPS提取液于超聲波清洗器 中2(TC超聲處理10X1. 5min,每次超聲處理間隔期間震蕩30S, 25°C12000rpm離心20min， 取上清備用。CHAPS提取液配比9M尿素，1%二硫蘇糖醇(DTT), 4%CHAPS, 2WA即holine (pH5-8)。
SDS-PAGE電泳凝膠規(guī)格為102X84X2. 4歷，分離膠為10%聚丙烯酰胺凝膠，用 1%瓊脂糖(電泳緩沖液配置)封閉；電泳槽加入電極緩沖液；IOOV恒壓進(jìn)行電泳，室溫， 待溴酚藍(lán)離底部lcm即可停止電泳，電泳2. 5小時；電泳槽電極緩沖液配比25mmol/L Tris， 192mmol/L甘氨酸，0. 1%SDS。
反復(fù)實驗證明10%聚丙烯酰胺凝膠對土壤蛋白的分辨效果更好，達(dá)到能清楚分辨的程度。
上述方法中上壤蛋白質(zhì)提取緩沖液及各類試劑的量可以根據(jù)土壤的量按比例放大，但配比、方法及工藝條件不變。
采用本發(fā)明所提供的方法具有突出的特點
1、 采用大孔樹酯.過濾可截留土壤樣品中的有機質(zhì)，而微生物和胞外蛋O不能和樹酯 中的共價鍵結(jié)合，因向不能被大孔樹酯吸附，而被洗脫于緩沖液中。該方法不僅能提高土 壤微生物的提取得率，同時也能提高蛋白質(zhì)電泳的電泳、分離效率。
2、 所提取的土壤蛋白質(zhì)得率約為37. 5%.與通過吖啶橙染色細(xì)胞計數(shù)所得微生物的得 率相似。
3、 10%聚丙烯酰胺凝膠對土壤蛋白的分辨效果更好，達(dá)到能清楚分辨的程度。 具體實施例
稱取樣品土壤65g于錐形瓶，加入預(yù)冷的土壤蛋白質(zhì)提取緩沖液150ml，混勻后置4 'C，搖床振蕩過夜。振蕩液用濾紙于布氏漏斗真空抽濾，取抽濾液過大孔樹脂(DIOI)， 取過柱液過0.22ym微孔濾膜，濾液為胞外蛋白質(zhì)母液，濾膜上做進(jìn)一步胞內(nèi)蛋白質(zhì)提取。
土壤蛋白質(zhì)提取緩沖液配制0. 82g磷酸二氫鉀+O. 16g磷酸氫二鉀，定容至100ml， 向其中加入8ml 0. 5M， pH8. 0 EDTA。
胞外蛋白質(zhì)的提取取胞外蛋白質(zhì)母液，加入等體積的預(yù)冷的丙酮溶液，混勻后靜置 沉淀4一5h， 30000rpm， 4'C離心30min，棄上清，沉淀用預(yù)冷的丙酮洗滌，13000rpm， 4 。C離心10min，棄上清，沉淀用預(yù)冷的無水乙醇于4'C超聲波下洗滌10min, 13000rpm， 4 。C離心10min，棄上清，沉淀用預(yù)冷的乙醚洗滌，13000rpm， 4'C離心10min，棄上清，沉 淀用真空干燥機干燥，干粉即為胞外土壤蛋白質(zhì)沉淀物。
胞外土壤蛋白質(zhì)干粉置-20'C冰箱中短期保藏，長期保藏于-8(TC冰箱中。
胞內(nèi)蛋白質(zhì)的提取取上述已過濾的濾膜于燒杯中，加入20ml的預(yù)冷的土壤蛋白質(zhì) 提取緩沖液，于超聲波儀器4'C超聲洗滌10分鐘，棄濾膜，溶液倒入50ml離心管中，離 心管于細(xì)胞破碎儀中細(xì)胞破碎，細(xì)胞破碎的條件1000s，間隔5s，功率輸出15%，溫度4 'C。細(xì)胞破碎完成后，向離心管中加入等體積的預(yù)冷的丙酮溶液，混勻后靜置沉淀4一5h， 30000rpm， 4'C離心30min，棄上清，沉淀用預(yù)冷的丙酮洗滌，13000rpm， 4。C離心10min, 棄上清，沉淀用預(yù)冷的無水乙醇于4'C超聲波下洗滌10min, 13000rpm， 4。C離心10min， 棄上清，沉淀用預(yù)冷的乙醚洗滌，13000rpm， 4'C離心10min，棄上清，沉淀用真空干燥機 干燥，干粉即為胞內(nèi)土壤蛋白質(zhì)沉淀物。
胞內(nèi)土壤蛋白質(zhì)干粉置-2(TC冰箱中短期保藏，長期保藏于-8(TC冰箱中。
胞內(nèi)蛋白質(zhì)的分離胞內(nèi)蛋白質(zhì)裂解稱取上述的胞內(nèi)蛋白質(zhì)干粉按15n l/mg的比例加CHAPS提取液，
于超聲波清洗器中2(TC超聲處理10X1.5min，每次超聲處理間隔期間震蕩30S， 25°C
12000rpm離心20min，取上清備用。
CHAPS提取液配比:9M尿素，1%二硫蘇糖醇(DTT)， 4%CHAPS， 2Mmpholine (pH5-8)。 SDS-PAGE電泳凝膠規(guī)格為102X84X2.4mm，分離膠為10%聚丙烯酰胺凝膠，用
1%瓊脂糖封閉；電泳槽加入電極緩沖液，IOOV恒壓進(jìn)行電泳，室溫，待溴酚藍(lán)離底部lcm
即可停止電泳，電泳2.5小時。
電泳槽的電極緩沖液配比25mmol/L Tris， 192隱ol/L甘氨酸，0. 1%SDS。 然后將樣品送至上海蛋白質(zhì)組學(xué)測試中心進(jìn)行LC-MS-MS分析以鑒定蛋白質(zhì)種類和來
權(quán)利要求
1、一種高效的土壤蛋白質(zhì)提取方法，包括樣品前處理、蛋白的提取，其特征是樣品前處理稱取樣品土壤65g于錐形瓶，加入預(yù)冷的土壤蛋白質(zhì)提取緩沖液150ml，混勻后置4℃，搖床振蕩過夜；振蕩液用濾紙于布氏漏斗真空抽濾，取抽濾液過大孔樹脂(D101)，取過柱液過0.22μm微孔濾膜，濾液為胞外蛋白質(zhì)母液，濾膜上做進(jìn)一步胞內(nèi)蛋白質(zhì)提??；土壤蛋白質(zhì)提取緩沖液配制0.82g磷酸二氫鉀+0.16g磷酸氫二鉀，定容至100ml，向其中加入8ml0.5M，pH8.0EDTA；胞外蛋白質(zhì)的提取取胞外蛋白質(zhì)母液，加入等體積的預(yù)冷的丙酮溶液，混勻后靜置沉淀4—5h，30000rpm，4℃離心30min，棄上清，沉淀用預(yù)冷的丙酮洗滌，13000rpm，4℃離心10min，棄上清，沉淀用預(yù)冷的無水乙醇于4℃超聲波下洗滌10min，13000rpm，4℃離心10min，棄上清，沉淀用預(yù)冷的乙醚洗滌，13000rpm，4℃離心10min，棄上清，沉淀用真空干燥機干燥，干粉即為胞外土壤蛋白質(zhì)；胞內(nèi)蛋白質(zhì)的提取取上述0.22μm微孔濾膜于燒杯中，加入20ml的預(yù)冷的上壤蛋白質(zhì)提取緩沖液，于超聲波儀器4℃超聲洗滌10分鐘，棄濾膜，溶液倒入50ml離心管中，離心管于細(xì)胞破碎儀中細(xì)胞破碎，細(xì)胞破碎完成后，向離心管中加入等體積的預(yù)冷的丙酮溶液，混勻后靜置沉淀4—5h，30000rpm，4℃離心30min，棄上清，沉淀用預(yù)冷的丙酮洗滌，13000rpm，4℃離心10min，棄上清，沉淀用預(yù)冷的無水乙醇于4℃超聲波下洗滌10min，13000rpm，4℃離心10min，棄上清，沉淀用預(yù)冷的乙醚洗滌，13000rpm，4℃離心10min，棄上清，沉淀用真空干燥機干燥，干粉即為胞內(nèi)土壤蛋白質(zhì)沉淀物。
2、 一種高效的土壤胞內(nèi)蛋白質(zhì)的分離方法，包括土壤胞內(nèi)蛋白質(zhì)裂解和SDS-PAGE電泳， 其特征是-胞內(nèi)蛋白質(zhì)裂解稱取權(quán)利要求1方法獲得的胞內(nèi)蛋白質(zhì)干粉按15ul/mg的比例加 CHAPS提取液，于超聲波清洗器中2(TC超聲處理10X1.5min，每次超聲處理間隔期間震蕩 30S; 25。C12000rpm離心20min,取上清備用；CHAPS提取液配比為9M尿素，1%二硫蘇 糖醇(DTT)， 4%CHAPS， 2%Ampholine (pH5-8);SDS-PAGE電泳凝膠規(guī)格為102X84X2.4mm，分離膠為9_12%聚丙烯酰胺凝膠， 用1%瓊脂糖(電泳緩沖液配置)封閉；電泳槽加入電極緩沖液為25mmol/LTris， 192ramol/L 甘氨酸，0. P/6SDS; 100V恒壓進(jìn)行電泳，室溫，待溴酚藍(lán)離底部lcm即可停止電泳，電泳 2.5小時。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種高效的土壤胞內(nèi)蛋白質(zhì)的分離方法，其特征是SDS-PAGE電泳時，采用1oy。聚丙烯酰胺凝膠為分離膠。
全文摘要
一種高效的土壤蛋白質(zhì)提取方法是把土壤加入預(yù)冷的土壤蛋白質(zhì)提取緩沖液混勻后置4℃，搖床振蕩過夜。振蕩液用粗濾紙于布氏漏斗真空抽濾，取抽濾液過大孔樹脂(D101)，取過柱液過0.22μm微孔濾膜，濾液為胞外蛋白質(zhì)母液；濾膜上細(xì)胞經(jīng)洗滌、破碎、離心分離和真空干燥獲得干粉，干粉即為胞內(nèi)土壤蛋白質(zhì)沉淀物。胞外蛋白質(zhì)母液經(jīng)離心、分離和真空干燥獲胞外土壤蛋白質(zhì)干粉；胞內(nèi)蛋白質(zhì)干粉經(jīng)裂解在10％聚丙烯酰胺凝膠SDS-PAGE電泳即可清楚分離，該方法具有高分離效率，所提微生物的得率為37.5％，高于傳統(tǒng)方法0.1-1％的得率，建立了一種簡易的操作流程，提高了得率，SDS-PAGE分辨率和質(zhì)譜鑒定效果好。
文檔編號C07K1/00GK101531708SQ20091011146
公開日2009年9月16日 申請日期2009年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月14日
發(fā)明者林文雄, 林輝鋒, 君 熊 申請人:福建農(nóng)林大學(xué)