專利名稱：豬仔笠異黃酮類化合物及其提取方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及豬仔笠異黃酮類化合物的提取方法與應(yīng)用，屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豬仔笠屬名五n'(wema c&i加rae 7og，為豆科毛瓣花屬植物，約100種，分布于熱帶和亞 熱帶地區(qū)。據(jù)《中藥大詞典》記載豬仔笠塊根入藥，具有清熱解毒、生熱煩渴、化痰潤(rùn) 肺、止咳之功效，而且是治療傷風(fēng)咳嗽、止呼吸道感染、發(fā)熱煩渴、痢疾、跌打損傷等疾 病的珍稀名貴中草藥。豬仔笠主要用于治療咳嗽、哮喘，療效顯著，安全可靠，價(jià)廉而方 便，是一種良好的中草藥資源，值得開發(fā)研究和推廣運(yùn)用。豬仔笠雖然已在民間應(yīng)用較廣， 但對(duì)豬仔笠的有效成分以及生物活性的研究未見有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，豬仔笠的臨床用藥機(jī)理尚 不明確，僅憑經(jīng)驗(yàn)，這就限制了其在臨床上的應(yīng)用范圍而沒有得到充分有效的開發(fā)利用。 同時(shí)，由于其主要活性成分不明，就無(wú)法對(duì)豬仔笠的有效成分進(jìn)行檢測(cè)、對(duì)藥材質(zhì)量進(jìn)行 有效控制和道地藥材進(jìn)行權(quán)威鑒定。
在中藥的諸多研究中，對(duì)活性成分、藥理作用和藥效與成分關(guān)系的研究較少，所以無(wú) 法闡明中藥治療疾病的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)理等重要科學(xué)問題，也無(wú)法為尋找新藥物或 合成新藥提供先導(dǎo)物或結(jié)構(gòu)母核，無(wú)法提升中藥新藥研究方法和技術(shù)水平。因此深入、系 統(tǒng)和有效地分離、純化、結(jié)構(gòu)鑒定以及活性的追蹤驗(yàn)證是開展和加強(qiáng)中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和 作用機(jī)理系統(tǒng)研究的必然。而在傳統(tǒng)的分離技術(shù)基礎(chǔ)之上，積極探索和應(yīng)用新的分離方法 和技術(shù)是加速中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)理系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢(shì)。
開展對(duì)豬仔笠藥理活性成分的研究，掌握豬仔笠被廣泛用于治療咳嗽、化痰的藥效物 質(zhì)基礎(chǔ)，可為豬仔笠治療咳嗽、化痰的藥理研究和臨床應(yīng)用提供參考，為探索該屬植物的 活性成分及其化學(xué)分類學(xué)方面提供借鑒。
本發(fā)明的目的是提供一種豬仔笠異黃酮類化合物及其提取方法與應(yīng)用。 本發(fā)明所述的豬仔笠異黃酮類化合物，具有下述結(jié)構(gòu)的異黃酮類化合物，本發(fā)明以化
合物5表述。本發(fā)明所采用的高速逆流色譜法(High-speed Ccmnterctirrerrt Chro-matography)，
簡(jiǎn)稱"HSCCC"，下同
發(fā)明內(nèi)容
:本發(fā)明所述的豬仔笠異黃酮類化合物的提取方法為包括如下步驟
1)將豬仔笠塊根粉碎，用乙醇回流提取獲得乙醇提取液，將乙醇提取液減壓濃縮得浸 膏，浸膏加入水混懸得混懸液，混懸液用石油醚萃取，把經(jīng)石油醚萃取后留下的混懸液再 用醋酸乙酯萃取獲得醋酸乙酯萃取液，減壓濃縮醋酸乙酯萃取液得醋酸乙酯浸膏；2)將醋 酸乙酯浸膏用正己垸醋酸乙酯甲醇水混合溶劑體系的下相溶解后得溶解液，可取等 體積的上相萃取該溶解液多次，至上相萃取液為無(wú)色或幾乎無(wú)色為止，不要上相萃取的萃 取液，只把下相部分蒸干即得醋酸乙酯浸膏II; 3)醋酸乙酯浸膏II經(jīng)過制備型HSCCC在 正己垸醋酸乙酯甲醇水按適宜體積比例的溶劑體系下分離，獲得色譜峰，其中只有 一個(gè)峰5的峰型對(duì)稱且含量較高的組分流出液，通過手工收集該組分流出液，本發(fā)明可通 過自然蒸發(fā)流出液的部分溶劑后析出白色針晶的異黃酮類化合物。
上述步驟2)的醋酸乙酯浸膏用混合溶劑(正己烷、醋酸乙酯、甲醇、水)萃取分離的 溶劑體系配比以體積比計(jì)量是正己垸醋酸乙酯甲醇水=3 6: 3 6: 4 8: 2 6。
步驟3)的HSCCC分離的溶劑體系(體積比計(jì)量)為正己烷醋酸乙酯甲醇水= 1 6: 2 9: 1 6: 2 8);固定相為上相；流動(dòng)相為下相；HSCCC分離流速(X5 4. 0
mL.min—1;轉(zhuǎn)速500 1500 r min—1;固定相的保留值不低于50%。
步驟l)粉碎的豬仔笠塊根，粉碎的豬仔笠塊根，可以用50 100%乙醇浸沒藥材且液 面高出藥材約0.5 icm在80 95t:和常壓力回流提取2 4次，合并乙醇提取液，將乙醇 提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮得浸膏，浸膏加入2 15倍量的水混懸得混懸液，混懸液用 0. 5 2倍水的石油醚萃取8 12次后所余下的混懸液再用是混懸液量的0. 5 2倍的醋酸乙 酯萃取8 12次，合并萃取液，采用目前本領(lǐng)域通用的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮醋酸乙酯萃取 液得醋酸乙酯浸膏。當(dāng)然優(yōu)選用95%乙醇在優(yōu)選82 85°0和常壓力回流提取三次，合并三 次乙醇提取液，將乙醇提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮得浸膏，浸膏加入3 5倍的;dC混.懸， 用0. 5 1倍水的石油醚萃取10次后所余下的混懸液再用0. 5 1倍余下的混懸液量的醋酸 乙酯萃取10次獲得醋酸乙酯萃取液，合并獲得的醋酸乙酯萃取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮 醋酸乙酯萃取液得醋酸乙酯浸膏。
步驟2)的醋酸乙酯浸膏用混合溶劑萃取分離的正己烷醋酸乙酯甲醇水的優(yōu)選混 合溶劑體系是5: 5: 5: 5。
步驟3)所述的HSCCC分離的最佳的HSCCC溶劑優(yōu)選體系為正己烷醋酸乙酯甲
醇水=3: 6: 3: 6;固定相上相；流動(dòng)相下相；流速2.0 mL min";轉(zhuǎn)速700 r min";
周定相的保留值不低于50%，檢測(cè)波長(zhǎng)254rai。
經(jīng)測(cè)定本發(fā)明正己烷醋酸乙酯甲醇水(3: 6: 3: 6)固定相的保留率為52.4%。 本發(fā)明所述的豬仔笠異黃酮提取物，能作為防治抑菌、抗炎、止咳和化痰的藥物。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明采用分離、純化的新手段HSCCC分離方法來(lái)分離純化豬仔笠 異黃酮提取物。HSCCC利用多層螺旋管行星式運(yùn)動(dòng)形成特殊的離心力矢量場(chǎng)，來(lái)實(shí)現(xiàn)兩溶 劑相在管柱里的單向性流體動(dòng)力學(xué)分布狀態(tài)，在這種情況下，可以保證流動(dòng)相高速穿過管柱時(shí)周定相在管柱里的保留百分率達(dá)50 %以上，同時(shí)大大促進(jìn)了兩相間的充分混合和逆流 傳遞。這種體系由于能夠釆用多樣的體系條件和操作方式，對(duì)從天然產(chǎn)物粗提物中分離提 取不同特性的有效成分提供了良好的條件，因而，更符合分離分析和制備純化工作的需要。 HSCCC溶劑體系的選擇對(duì)于HSCCC十分關(guān)鍵，同時(shí)也是最難解決的問題，溶劑選擇 的困難制約了逆流色譜的應(yīng)用。通常，兩相溶劑體系應(yīng)滿足以下要求(1)不造成樣品的 分解或變性；(2)足夠高的樣品溶解度；(3)上-下兩相的體積大致相等，以免浪費(fèi)溶劑； (4)樣品在溶劑系統(tǒng)中合適的分配系數(shù)值；(5)溶劑體系的分層時(shí)間小于30s，使固定相 能實(shí)現(xiàn)足夠高的保留。 一般來(lái)說，前三點(diǎn)可以較簡(jiǎn)便地進(jìn)行判斷，后兩點(diǎn)對(duì)高速逆流色譜 儀顯得特別重要，需要經(jīng)過測(cè)定或?qū)嶒?yàn)判斷。測(cè)定方法包括TLC、 HPLC和分析型HSCCC 法等。
TLC法的準(zhǔn)確度較低，但方便、快速，可以對(duì)溶劑系統(tǒng)的適用性作出便捷的初步判斷。 根據(jù)斑點(diǎn)色度可以觀察樣品中各組分的相對(duì)含量及其在兩相溶劑中的分配情況，即估計(jì)分 配系數(shù)的大小及差異，由此可以確定溶劑系統(tǒng)的適用性及各組分的流出順序。因此本發(fā)明 的實(shí)驗(yàn)釆用TLC法，但TLC法只能對(duì)溶劑系統(tǒng)的適用性作出初歩的判斷，對(duì)分配系數(shù)作大 致的估算，在缺乏經(jīng)驗(yàn)的情況下，很難據(jù)此把握溶劑系統(tǒng)用于逆流色譜分離的可行性。因 此本實(shí)驗(yàn)通過TLC法檢測(cè)到溶劑的上、下相均有目標(biāo)產(chǎn)物后，再通過分析型HSCCC法篩 選最佳的溶劑系統(tǒng)。
結(jié)果表明
1. 溶劑體系的選擇是HSCCC分離中最為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，溶劑體系選擇的合適與否，直 接關(guān)系到分離結(jié)果得好壞。正己烷/醋酸乙酯/甲醇/水是已被廣泛應(yīng)用的溶劑分離系統(tǒng)之一， 主要應(yīng)用于弱極性物質(zhì)的分離。在溶劑體系中，正己烷和水分別成為兩相，再根據(jù)需要加 入甲醇、醋酸乙酯來(lái)調(diào)節(jié)溶劑系統(tǒng)的極性，以達(dá)到好的分離效果。對(duì)于正己像醋酸乙酯/甲 醇/水的體系，若目標(biāo)組分易溶于該體系的上相，增加甲醇水的含量，可將目標(biāo)組分拉向下 相。反之，則可降低甲醇的比例。原因在于當(dāng)甲醇的量增加時(shí)，其一方面可以減小水相的 極性，同對(duì)又可增加有機(jī)相的極性,可以達(dá)到改變待分離成分在兩相中的分配系數(shù)的目的。 本研究探索出分離醋酸乙酯浸膏n部位的最佳溶劑系統(tǒng)為正己烷醋酸乙酯甲醇水=3: 6: 3: 6，這些溶劑體系不僅有合適的上、下相之比，合適的固定相保留值，而且對(duì)目標(biāo)成 分有比較理想的分配。
2. 和傳統(tǒng)的通過溶劑萃取、反復(fù)層析的方法相比，HSCCC不僅可以大大簡(jiǎn)化諸多步驟、 節(jié)約時(shí)間，且不會(huì)造成溶劑和樣品的損失，目標(biāo)產(chǎn)物能達(dá)到較高的純度。且在HSCCC操作 過程中，只要調(diào)試好儀器，進(jìn)樣完畢后，后續(xù)分離過程則完全可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，且分離過 程可以結(jié)合紫外進(jìn)行檢測(cè)。上述特點(diǎn)顯示了 HSCCC在分離、提純化合物方面的明顯優(yōu)勢(shì)。 當(dāng)然，HSCCC在分離、提純化合物方面也不會(huì)是萬(wàn)能的。有的化合物由于難于選擇合適的 溶劑系統(tǒng)，則不能借助HSCCC的手段分離。另有，用來(lái)進(jìn)行HSCCC分離的樣品應(yīng)盡可能 使目標(biāo)成分純度提高。這樣既便于尋找合適的溶劑系統(tǒng)，又可有效地提高分離效果。因此，
6HSCCC在應(yīng)用于化學(xué)成分的分離提純時(shí)，應(yīng)盡可能與其它常用的分離方法互補(bǔ)進(jìn)行。本實(shí) 驗(yàn)用傳統(tǒng)的溶劑回流提取方法，通過HSCCC與傳統(tǒng)的薄層層析制備相結(jié)合進(jìn)行分離純化，
首次從該藥材醋酸乙酯浸膏n部位分離得到新化合物5。本發(fā)明通過對(duì)醋酸乙酯浸膏n提取
物——化合物5研究發(fā)現(xiàn)，1)醋酸乙酯浸膏II提取物——化合物5對(duì)金黃葡萄球菌有較好 的抑菌活性，醋酸乙酯浸膏II提取物——化合物5對(duì)某些菌也具有一定的抑制效果，可能 含有量比較少但是活性很高的物質(zhì)。2)本發(fā)明的醋酸乙酯浸膏II提取物——化合物5能抑
制二甲苯所致的小白鼠耳腫脹作用，具有良好的抗炎效果。3)本發(fā)明的醋酸乙酯浸膏n提
取物——化合物5能延長(zhǎng)咳嗽潛伏期，減少咳嗽次數(shù)，具有良好的鎮(zhèn)咳作用。4)本發(fā)明的
醋酸乙酯浸膏n提取物——化合物5明顯增加小鼠氣管酚紅排泌量，表明可促進(jìn)腺體分泌， 使痰液黏度下降而易于咳出，從而起到祛痰作用。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明
第一部分醋酸乙酯部位的化學(xué)成分研究 1實(shí)驗(yàn)儀器及材料 1.1藥材
豬仔笠購(gòu)自地點(diǎn)福建龍巖；鑒定福建省中醫(yī)藥研究院王振登研究員鑒定。 1.2儀器
微量分析天平(北京塞多利斯天平有限公司)；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀 器廠)；恒溫水浴鍋；玻璃硅膠柱子(4cmX30cm);部分收集器(上海滬西分析儀器廠 有限公司)；恒流泵(上海滬西分析儀器廠有限公司)；層析缸；超聲清洗儀(昆山市超 聲儀器有限公司)；紫外可見分光光度計(jì)(VARIAN,Cary50) ; HP68鄰氣相色譜-HP5973 質(zhì)譜聯(lián)用儀；AVATAR360紅外光譜儀(美國(guó)Thermo Nicoler) ; GS 20分析型高速逆流色 譜儀(北京天寶物華生物技術(shù)有限公司)；GS10制備型高速逆流色譜儀(北京天寶物華生 物技術(shù)有限公司)；高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent 1100series);元素分析儀(德國(guó)Vario EL ffl);質(zhì)譜儀(美國(guó)LCQDecaXPMax );核磁共振儀(美國(guó)Unity 500)。
1.3試劑
正己烷、醋酸乙酯、甲醇、雙蒸水、石油醚(60-90 °C)均為AR級(jí)；色譜甲醇；無(wú)特 別標(biāo)明均為分析純?cè)噭?；柱層析硅膠100-200目、薄層層析硅膠H均為青島海洋化工生產(chǎn)。 2實(shí)驗(yàn)方法
2.2醋酸乙酯浸膏II化學(xué)成分研究 2.2.1樣品的制備
將豬仔笠塊根粉碎lkg，用95%乙醇浸沒藥材且液面高出藥材約lcm，在優(yōu)選84t:溫 度和常壓力下回流提取三次(2h， 2h， 2h)，合并三次乙醇提取液，將乙醇提取液用旋轉(zhuǎn) 蒸發(fā)儀減壓濃縮得浸膏140g,浸膏加入850毫升水混懸，用0. 8倍上述水量的石油醚萃取 10次后留下的混懸液再用與所留下的混懸液同等體積的醋酸乙酯萃取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓、濃縮醋酸乙酯萃取液得醋酸乙酯浸膏60 g。
將上述60g的醋酸乙酯浸膏用正己烷醋酸乙酯甲醇水(以體積比計(jì)量)=5.* 5: 5: 5體系的下相100mL溶解后得溶解液，取與下相等體積的上相萃取上述的溶解液多次， 至上相萃取的液體為無(wú)色后，把溶于下相部分蒸干析出醋酸乙酯浸膏Il48g。
2.2.2 HSCCC溶劑體系的選擇及樣品溶液的制備
HSCCC溶劑體系的選擇按照被分離物質(zhì)的粗略極性選擇用哪類分離體系，在該實(shí)驗(yàn) 中，選擇弱極性的正己烷體系，同時(shí)采用薄層色譜法選擇溶劑體系的配比，首先按選定的 溶劑系統(tǒng)配制一定量的兩相溶劑，各取2mL于小試管中，加入數(shù)毫克樣品，劇烈振蕩lmin 后，靜置分層，用毛細(xì)管取近似等量的上下兩層溶液于TLC板上，待溶劑揮發(fā)完后用溶劑 系統(tǒng)中的有機(jī)層展開，用碘缸顯色，根據(jù)斑點(diǎn)色度和面積可以觀察樣品中各組分在兩相溶 劑中的分配情況，即估算分配系數(shù)的大小和差異，由此判斷溶劑系統(tǒng)的適用性，再通過分析 型高速逆流儀確定溶劑系統(tǒng)。
樣品溶液的制備:將200mg醋酸乙酯浸膏n溶解在2tnL體積比為1/1的上下相溶劑系 統(tǒng)中，用4.5 Ji邁有機(jī)系的濾膜過濾，本發(fā)明的實(shí)例中濾膜釆用尼龍的濾膜，以備HSCCC 進(jìn)樣。
2.2.3 HSCCC分離步驟
每次分離之前，首先配制已選擇好的兩相溶劑系統(tǒng)，將其充分混合后靜置分層。在使 用前將兩相分離，先用恒流泵將上述選定溶劑體系的上相打入HSCCC的柱內(nèi)(總體積為V), 直至注滿整個(gè)管子。然后開啟HSCCC，轉(zhuǎn)速為700 r min",同時(shí)流動(dòng)相以2.0 mL min'1 的流速打入HSCCC，等到聚四氟乙烯管尾端流出流動(dòng)相后，表明HSCCC中兩相已達(dá)到平 衡，收集柱尾端流出的固定相體積V!，通過六通閥將樣品注入HSCCC，流動(dòng)相流出端紫外 檢測(cè)器波長(zhǎng)為254 nm。根據(jù)色譜圖手工收集各色譜峰組分。分離結(jié)束后，用氮?dú)鈱上嗳?劑從聚四氟乙烯螺旋管中沖出，測(cè)定固定相的保留值(Sf) Sf-V-V!/VX100M。
2.2.4各個(gè)組分的純度分析
豬仔笠醋酸乙酯浸膏II經(jīng)HSCCC分離得到的各組分通過HPLC進(jìn)fi^度分析。 2丄5各個(gè)組分的結(jié)構(gòu)鑒定
分離得到的化合物通過元素分析、MS 、 IR、 UV、 NMR、 GC/MS等波譜學(xué)方法進(jìn)行 結(jié)構(gòu)鑒定。
3.7醋酸乙酯浸膏IIHSCCC溶劑體系
按"2.22"項(xiàng)下方法篩選，最后得到較佳的溶劑體系(以體積比計(jì)量)正己烷醋酸
乙酯甲醇水==3: 6: 3: 6。獲得醋酸乙酯浸膏II的分析型HSCCC圖譜，從圖譜中可知
主要有3個(gè)峰，其中第一個(gè)峰，可能是幾種極性相似的化合物的混合體，后2個(gè)峰分離度
比較好，達(dá)到基線分離，故選擇該溶劑體系。
3.8醋酸乙酯浸膏II的HSCCC分離結(jié)果
200mg浸膏II在一定色譜條件(正己烷醋酸乙酯甲醇水=3:6: 3: 6)下經(jīng)過
8制備型HSCCC分離，獲得色譜峰形圖譜。從圖譜可以看出，只有一個(gè)峰5峰型對(duì)稱且含量 較高，通過手工收集得到白色針晶，得到3mg化合物5。實(shí)驗(yàn)條件為溶劑體系正己烷-
醋酸乙酯甲醇水=3: 6: 3: 6;固定相上相；流動(dòng)相下相；流速2.0mL'min";
轉(zhuǎn)速700r'min"。
3.9醋酸乙酯浸膏II固定相保留值
測(cè)定正己垸醋酸乙酯甲醇水=3: 6: 3: 6固定相的保留率為52.4%。
3.10化合物5的純度
HSCCC分離所得化合物5的HPLC分析結(jié)果，顯示為單一峰，且峰形對(duì)稱，色譜條件: 水/乙腈以起始比例95:5 ， 10min后為卯:IO， 15 min后為80:20， 20 min為60:40， 30 min 后為50:50， 40 min后為40:60，柱溫30 °C，流速lmL'min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。
3.H化合物5的結(jié)構(gòu)
3.11.1化合物5的紫外吸收光譜
大多數(shù)黃酮類化合物在乙醇中的紫外吸收光譜由兩個(gè)主要吸收帶組成。出現(xiàn)在3加 400nm之間的吸收帶稱為帶I ，出現(xiàn)在2鄰 2S0 nm之間的吸收帶稱為帶II 。不同類型的 黃酮化合物的帶I或帶II的峰位、峰形和吸收強(qiáng)度不同，因此從紫外光譜可以推測(cè)黃酮類 化合物的結(jié)構(gòu)類型，從化合物5的紫外光譜的圖譜可知，以在240 280 nm之間的吸收帶 為主，桂皮?；到y(tǒng)破壞，故帶I為弱峰，帶H為主峰，推測(cè)是異黃酮類。
3.112化合物5的紅外吸收光譜
根據(jù)化合物5的紅外光譜圖譜，將主要峰歸屬如下3374 cm—1附近的強(qiáng)吸收峰，表明 有酚羥基存在，1638 cm —1為不飽和酮基吸收峰，示有酮結(jié)構(gòu)存在；1617 cm"， 1576 cm'1顯 示有苯環(huán)存在，841 cm"為苯中C-H面內(nèi)彎曲振動(dòng)；2880cm"-2815cm"附近的吸收峰，為 -0013的(:11鍵的伸縮振動(dòng)吸收；進(jìn)一步證實(shí)有黃酮骨架結(jié)構(gòu)存在。
3.11.3化合物5的元素組成和質(zhì)譜分析結(jié)果
元素分析測(cè)定值N:<0.30%， C:67.45 %， H:4.92 %; ESI-MS圖譜顯示負(fù)離子峰為 283[M-ir，說明分子量為284;結(jié)合元素分析，推斷分子式為C16H1205; GC/MS測(cè)定 結(jié)果，顯示分子量為284，結(jié)構(gòu)為4'-Methoxy-5，7-dihydroxy isoflavcme;結(jié)合元素分析和質(zhì) 譜，故初步鑒定化合物5為4'-Methoxy-5,7-dihydroxy isoflavone。
3.11.4化合物5的核磁共振氫譜和碳譜
化合物5的'HNMR圖譜顯示，^-NMR (400 MHZ， MeOD) S :7.85(1 H,s)，異黃酮 C-2上氫的特征峰；7.24(2H,d, 2' ,6' -H),6.73(2H,d, 3' ,5' -H)，為B環(huán)中C-2' ,6' -H和 C-3' ，5' -H的特征峰；6.32(2H,s),芳環(huán)上的羥基使得鄰位氫產(chǎn)生高場(chǎng)位移，提示為C-6，8 位上氫的吸收峰；3.78 (3H,s,OCH3)為甲氧基上氫的吸收峰。
化合物5的13 C NMR圖譜顯示，B C NMR (100 MHZ, MeOD) S :55.02(-0013)為C-4' 上甲氧基的C信號(hào)；151.11(C-2)， 123.08(C-3), 176.37(C-4)為異黃酮類的特征吸收峰； 13(U7(C-2' ，6' ), U4.62(C國(guó)3' ,5' ), 157.14(C-9) ， 160,06(C-5) , 161.60(C-4'),163.40(07)， 125.55 (C-1' )， 107.82 (C-10) ， 94.72(C-8)， 96.04(C曙6)。上述氫譜的氫信號(hào) 和碳譜的碳信號(hào)與4'-Methoxy-5,7-dihydroxy isoflavone基本符合。
綜合上述紅外圖譜、紫外圖譜、核磁共振圖譜、元素分析及質(zhì)譜，最后鑒定化合物5 為4'-甲氧基-5，7-二羥基異黃酮(4'-Methoxy-5,7-dihydroxy isoflavone)，結(jié)構(gòu)式如下，是首 次從該植物分離得到的一個(gè)化合物。
本研究采用分離、純化的新手段HSCCC來(lái)分離純化豬仔笠的化學(xué)成分，探索出分離醋
酸乙酯浸膏II的最佳溶劑系統(tǒng)(以體積比計(jì)量)為正己烷醋酸乙酯.*甲醇水=3: 6: 3: 6，這些溶劑體系不僅有合適的上、下相之比，合適的固定相保留值，而且對(duì)目標(biāo)成分有比 較理想的分配，首次從豬仔笠中得到化合物5的物質(zhì)。利用質(zhì)譜技術(shù)得出的物質(zhì)分子離子
峰、紅外光譜技術(shù)所得的特征官能團(tuán)信息、核磁共振(氫譜、碳譜等)技術(shù)分析出的碳?xì)涞仍?br> 素的結(jié)構(gòu)分布情況，從化學(xué)式量、主要官能團(tuán)等方面進(jìn)行解析，確定該種化合物為4'-甲 氧基-5，7-二羥基異黃酮。
第二部分豬仔笠異黃酮類化合物的生物活性的初步研究 1實(shí)驗(yàn)儀器及材料 1.1藥材
豬仔笠購(gòu)自地點(diǎn)福建龍巖；鑒定福建省中醫(yī)藥研究院王振登研究員鑒定。 1.2儀器
紫外可見分光光度計(jì)(VARIAN ，Cary 50) ; RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器 廠)；BS210S型微量分析天平(北京塞多利斯天平有限公司)；電熱干燥箱(上海陽(yáng)光實(shí) 驗(yàn)儀器有限公司)；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海國(guó)華儀器設(shè)備有限公司)；超低溫冰箱 (Sanyo);超聲清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；TGL—16G高速冷凍離心機(jī)(上海 安亭儀器廠)；低速大容量離心機(jī)(上海安亭儀器廠)；蒸餾水器(上海亞榮生化儀器廠)； SSB—1超凈工作臺(tái)(上海凈化設(shè)備廠)。 1.3試劑
細(xì)菌菌株金黃色葡萄球菌(GIM1.55)、大腸桿菌(GIM1.115)、傷寒沙門氏菌 (ATCC6539)、枯草芽抱桿菌(0901)，由福建農(nóng)林大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供；普通瓊脂培 養(yǎng)基(醫(yī)用)，新華中速濾紙，紅霉素，復(fù)方甘草口服溶液(廣西醫(yī)科大學(xué)制藥廠)；氨水(2i % 28%);地塞米松磷酸鈉(福建三愛藥業(yè)有限公司)；酚紅；石油醚(AR，沸程60-9(TC)、 無(wú)水乙醇(AR) 、 NaOH、 NaCl、 NH4Cl均為國(guó)產(chǎn)分析純。1.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
昆明小鼠，平均體重為U8 22g)，購(gòu)自福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。 2 實(shí)驗(yàn)方法
2.1抑菌活性的初步研究 2丄1檢測(cè)菌懸液的制備
將檢測(cè)菌接至斜面，37。C培養(yǎng)24h，用震蕩器將菌苔在生理鹽水(已滅菌)中震蕩分散， 并用瓊脂培養(yǎng)基將其稀釋到所需的OD值。 2丄2濾紙片法測(cè)定抑菌活性
用打孔器將濾紙片(厚約4 mm)打成直徑5 mm的圓片，高壓滅菌后待用。用上述制備 好的菌懸液浸濕無(wú)菌棉簽后，讓棉簽在試管壁上輕輕擠壓，擠掉多余的菌懸液，用棉簽的 側(cè)面而不是頂端從三個(gè)不同角度密涂平皿，每個(gè)角度相差約60度，最后沿平皿內(nèi)緣涂沫一 周。取直徑6 mm的滅菌濾紙片，每片滴加含量為250 mg mL—1的提取液20 ul作為實(shí)驗(yàn) 樣片，陰性對(duì)照樣片滴加20iU無(wú)菌水，陽(yáng)性對(duì)照樣片滴加20nl的10ug'mL"紅霉素溶 液，5(TC烘干，用無(wú)菌鑷子取出濾紙片貼在含菌平板上，并輕輕按壓使其充分接觸。置37 r恒溫培養(yǎng)18—24h。測(cè)定濾紙片的抑菌圈大小，比較抑菌效果。
2丄3試管連續(xù)稀釋法
根據(jù)抑菌實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選取敏感菌測(cè)定各提取物對(duì)其的最低抑菌濃度。采用雙倍稀釋 法，以吐溫80做為助溶劑，吐溫80的濃度為2%。取小號(hào)試管7支，編號(hào)。第l步每支 管各加lmL肉湯培養(yǎng)基，然后在第1管加1 mL藥液，用吸管在第1管吹吸數(shù)次，使藥液 與肉湯培養(yǎng)基混勻，取出l mL加于第2管，混均取出l mL加于第3管，如此稀釋至第6 管棄去lmL，第7管不加藥液作為對(duì)照。第3步每管加菌液50lU，混勻，置37 'C溫箱中 培養(yǎng)24h。然后從每管中取出培養(yǎng)物20)U接種于普通瓊脂平板上，再繼續(xù)培養(yǎng)24h,觀察 結(jié)果。以無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的最高稀釋濃度為該藥液的最低抑菌濃度。平行做3次，以2次或3 次相同結(jié)果為準(zhǔn)，并設(shè)立吐溫80對(duì)照和無(wú)菌水對(duì)照。因?yàn)橹兴幰罕旧淼幕鞚岷腿藶橐曈X的 差異，細(xì)菌生長(zhǎng)后，使得肉眼無(wú)法觀察，或觀察的實(shí)驗(yàn)結(jié)果易出現(xiàn)偏差，因此，再?gòu)拿恳?管中取培養(yǎng)物20ixl,轉(zhuǎn)種到瓊脂平板培養(yǎng)基上，用L棒涂布，置37 'C培養(yǎng)箱培養(yǎng)18-24 h, 以不生長(zhǎng)菌落的最高藥物稀釋度為該藥物對(duì)該種細(xì)菌的最小抑菌濃度(MIC)。
2.2抗炎活性的初步研究
2.2.1供試液的制備
醋酸乙酯浸膏II提取物——化合物5分別以適量乙醇溶解后，加水加熱使乙醇揮發(fā)， 最后以水定容，配制成濃度為7.488 mg mL—1 (小白鼠的用藥量按照體表面積由人的用藥量 折算)。
2.2.2對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響
將30只小白鼠隨機(jī)分成3組，每組10只；陰性對(duì)照組灌生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組按5 mg kg"經(jīng)皮下注射地塞米松磷酸鈉給藥，實(shí)驗(yàn)組灌醋酸乙酯浸膏n提取物——化合物5
11液，每日上午給動(dòng)物喂食前給藥，給藥液體積為10mL*kg—、連續(xù)給藥10d。于第10d給 藥lh后右耳殼滴二甲苯20lU，致炎后30min脫臼處死小鼠，用脫脂棉輕拭去左右耳殘留 藥物，沿耳廓基線剪下兩耳，用直徑為8 mm的打孔器分別在兩耳同一部位打下圓耳片，電 子天平稱重，求出兩耳重量差，以兩耳重量差作為炎癥腫脹程度的指標(biāo)進(jìn)行t檢驗(yàn)。
2.3止咳活性的初步研究
2.3.1供試液的制備
醋酸乙酯浸膏II提取物——化合物5以適量乙醇溶解后，加水加熱使乙醇揮發(fā)，最后 以水定容，配制成濃度為7.488 mg，mL"(小白鼠的用藥量按照體表面積由人的用藥量折 算)。
2.32實(shí)驗(yàn)分組及^"藥方法
將30只小白鼠隨機(jī)分成3組，每組10只；陰性對(duì)照組灌生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組灌復(fù) 方甘草口服溶液(小白鼠的用藥量按照體表面積由人的用藥量折算)，實(shí)驗(yàn)組灌醋酸乙酯浸 膏II提取物——化合物5，每日上午給動(dòng)物喂食前灌胃給藥，給藥液體積為10mL kg: 連續(xù)給藥10 d。
2.3.3 小鼠氨水引咳法
本試驗(yàn)于末次給藥1 h后進(jìn)行。250mL廣口瓶?jī)?nèi)放一注有80 u 1氨水的棉球，用裝有通 氣管的塞子塞上，待氨水飽和后，將被測(cè)試的小白鼠逐個(gè)放入廣口瓶?jī)?nèi)，記錄小白鼠被放 入杯內(nèi)到出現(xiàn)腹肌收縮張嘴的時(shí)間(即第一次咳嗽的時(shí)間)以及l(fā)-5min內(nèi)的咳嗽次數(shù)，觀 察記錄氨水引起動(dòng)物的咳嗽潛伏期和咳嗽次數(shù)，每測(cè)試一只動(dòng)物均要更換新的氨水棉球。
2.4化痰活性的初步研究
2.4.1供試液的制備
醋酸乙酯浸膏II提取物~~化合物5以適量乙醇溶解后，加水加熱使乙醇揮發(fā)，最后 以水定容，配制成濃度為.488mg mL4 (小白鼠的用藥量按照體表面積由人的用藥量折算)。 2.4.2標(biāo)準(zhǔn)酚紅曲線的繪制
用分析天平準(zhǔn)確稱取一定量的酚紅，加5%碳酸氫鈉溶液溶解，配成lmL含100ug， 然后順次稀釋成每毫升含酚紅0.050, 0.100， (U25, 0.250， 0-500， 1.000， 1-250， 2.500， 5.000， 10.000 ug,用分光光度計(jì)于546nm處測(cè)吸光值A(chǔ)，以酚紅劑量為橫坐標(biāo)，吸光值A(chǔ) 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2.4.3氣管段酚紅法
取小鼠30只，隨機(jī)分成3組，每組0只。陰性對(duì)照組灌生理鹽水，按J0mL ig'1灌胃 蒸餾水，陽(yáng)性對(duì)照組按l g'kg"灌胃氯化銨，實(shí)驗(yàn)組灌醋酸乙酯浸膏II提取物——化合物 5液，按10ml^kg"灌胃,給藥每日上午給動(dòng)物喂食前灌胃給藥，連續(xù)給藥10d。
末次給藥lh后，按0.5 g'kg"的劑量分別給每只小白鼠腹腔注射酚紅-生理鹽水，注 射酚紅0.5h后，處死小白鼠，小心剝離氣管周圍結(jié)締組織，剪下從甲狀軟骨至支氣管分叉 處的氣管，放入盛有2mL生理鹽水的試管中，再加O.lmL氫氧化鈉溶液(lmol'L'1),
12搖勻，于546mn處測(cè)吸光值A(chǔ)。根據(jù)酚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酚紅含量，給藥組和陰性對(duì)照組之 間進(jìn)行組間t檢驗(yàn)。
校正酚紅含量=酚紅含量(mg) /小鼠體重(kg)
化痰率(％)=(給藥組的酚紅含量/模型組的酚紅含量)X100%
3結(jié)果與分析
3.1抑菌效果
3丄1各提取物的抑菌效果
供試樣醋酸乙酯浸膏II提取物——化合物5對(duì)醋酸乙酯浸膏II對(duì)金黃葡萄球菌的抑制
作用最強(qiáng)。醋酸乙酯浸膏II提取物——化合物5的抑菌效果見下表
表4醋酸乙酯浸膏II提取物——化合物5對(duì)濃氨水致咳小鼠的影響
組別 劑量(mg'kg—1)咳嗽潛伏期Cs)1.5min內(nèi)的咳嗽次數(shù)
生理鹽水 -22.83 ±0.7538.17±4.88
醋酸乙酯浸膏H提取物74.8823.00±0.8934.67±2.88*
注與生理鹽水比較，*P<0.05 3.4化痰效果
以酚紅劑量為橫坐標(biāo)，吸光值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線回歸方程為y = 0.1727x-0.0011;化痰實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5，醋酸乙酯浸膏II提取物——化合物5對(duì)小白鼠具有
很強(qiáng)的化痰作用，與陰性對(duì)照組比較，差異極顯著，具有較強(qiáng)的化痰活性。 表5醋酸乙酯浸膏II提取物——化合物5對(duì)小鼠氣管酚紅排泌量的影響
組別 劑量酚紅含量校正酚紅含量化痰率(％)
(mg * kg-1)(ug ml/1)(ug ml/1 kg")
生理鹽水 -0.14 土 0.047.69±1.79-
醋酸乙酯浸膏II提取物74.880.29 土 0.0513.11±1.63**170.55
氯化銨 1000.000.43 ±0.0721.10±1.16**274.53
注與陰性對(duì)照組比較，**P<0.01 4本章小結(jié)與討論 4.1抑菌實(shí)驗(yàn)
本試驗(yàn)采用濾紙片法和試管稀釋法，選用常見的革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性代表菌，對(duì) 豬仔笠醋酸乙酯浸膏II提取物——化合物5的抑菌活性進(jìn)行了研究。天然植物在長(zhǎng)期的自 然選擇過程中，形成了一套精細(xì)的抗菌防御系統(tǒng)，表現(xiàn)為抗菌成分豐富多樣，如揮發(fā)油、 脂溶性色素、黃酮類化合物、皂武、多酚類化合物和生物堿等。植物體外抑菌作用的強(qiáng)弱 與提取物的成分和濃度有密切關(guān)系，大多數(shù)植物粗提物濃縮到較高的生藥濃度時(shí)，往往變 得粘稠，這種提取物成分復(fù)雜，常含有多種抗菌或抑菌成分，也有多糖、淀粉、樹脂、蛋 白質(zhì)等無(wú)抑菌作用的成分，無(wú)抑菌作用的成分往往會(huì)影響抑菌效果。本實(shí)驗(yàn)利用萃取將醇 提物進(jìn)行分段分離，得到醋酸乙酯浸膏II提取物"~"化合物5這種提取物，再進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，使得有抑菌或殺菌活性的成分更加集中。
通過對(duì)豬仔笠各提取物的體外抑菌試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，醋酸乙酯浸膏II提取物——化合物5 對(duì)金黃葡萄球菌有很好的抑菌活性，是由于含有某些高效的具有廣譜抗菌性的物質(zhì)。
4.2抗炎實(shí)驗(yàn)
隨著生命科學(xué)的發(fā)展，人們逐漸認(rèn)識(shí)到各種炎癥的發(fā)病機(jī)制，開發(fā)抗炎藥物成了藥學(xué) 領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。而目前抗炎藥物主要來(lái)源于副作用大的化學(xué)藥物，而中藥在抗炎藥物的 研究中，因其藥效好，不良反應(yīng)少以及來(lái)源豐富等優(yōu)勢(shì)，越來(lái)越受到人們的重視，研究和 開發(fā)具有抗炎活性成分的中藥也逐漸成為熱點(diǎn)。
本實(shí)驗(yàn)選用常用的炎癥模型對(duì)其進(jìn)行初步研究，以期從中找到具有抗炎作用的組分應(yīng) 用于臨床。在以血管通透性為主要改變的急性炎癥模型實(shí)驗(yàn)中，豬仔笠醋酸乙酯浸膏II提 取物——化合物5能抑制二甲苯所致的小白鼠耳腫脹作用，對(duì)急性炎癥反應(yīng)有顯著抑制作 用。
4.3止咳實(shí)驗(yàn)
咳嗽是上呼吸道一種重要的保護(hù)性反射，是呼吸系統(tǒng)疾病中的常見癥狀。有研究表明， 咳嗽的產(chǎn)生主要與RARs受體和C-纖維受體接受刺激有關(guān),RARs受體主要對(duì)機(jī)械刺激敏感， 而C-纖維受體則主要對(duì)化學(xué)刺激敏感，如辣椒素、枸櫞酸等。
在動(dòng)物身上，咳嗽可由機(jī)械、化學(xué)刺激和電刺激氣管粘膜、迷走神經(jīng)而產(chǎn)生，其中以 化學(xué)和機(jī)械刺激最接近正常生理情況。所以本實(shí)驗(yàn)釆用以化學(xué)刺激引咳來(lái)考察藥物的鎮(zhèn)咳 作用。豬仔笠的醋酸乙酯浸膏II提取物——化合物5能延長(zhǎng)咳嗽潛伏期，減少咳嗽次數(shù)， 具有良好的鎮(zhèn)咳作用。
4.4化痰實(shí)驗(yàn)
本實(shí)驗(yàn)采用酚紅氣管排泄法，利用酚紅至小鼠注射后可從氣管排泄的特點(diǎn)，測(cè)定氣管 酚紅的排泄量，以判斷受試藥物對(duì)氣管分泌液量的影響。此法簡(jiǎn)便，但用強(qiáng)堿洗出氣管內(nèi) 酚紅能損傷氣管粘膜。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，醋酸乙酯浸膏II提取物——化合物5明顯增加小鼠 氣管酚紅排泌量，表明可促進(jìn)腺體分泌，使痰液黏度下降而易于咳出，從而起到祛痰作用。
權(quán)利要求
1、一種豬仔笠異黃酮類化合物，具有下述結(jié)構(gòu)的異黃酮化合物
2、 權(quán)利要求1所述的豬仔笠異黃酮類化合物的提取方法，包括如下步驟])將豬仔笠塊根粉碎，用乙醇回流提取獲得乙醇提取液，將乙醇提取液減壓濃縮得浸 膏，浸膏加入水混懸得混懸液，混懸液用石油醚萃取，把經(jīng)石油醚萃取后留下的混懸液再 用醋酸乙酯萃取獲得醋酸乙酯萃取液，減壓濃縮醋酸乙酯萃取液得醋酸乙酯浸膏；2)將醋 酸乙酯浸膏用正己垸醋酸乙酯甲醇水混合溶劑體系的下相溶解后得溶解液，取適宜 體積的上相來(lái)萃取該溶解液多次，至上相萃取液為無(wú)色或幾乎無(wú)色為止，把下相部分蒸干 得醋酸乙酯浸膏II; 3)醋酸乙酯浸膏II經(jīng)過制備型HSCCC在正己烷醋酸乙酯甲醇 水按適宜體積比例的溶劑體系下分離，獲得色譜峰，其中只有一個(gè)峰5的峰型對(duì)稱且含量 較高的組分流出液，通過手工收集該組分流出液，蒸發(fā)流出液的部分溶劑后析出白色針晶 的異黃酮類化合物。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的豬仔笠異黃酮類化合物的提取方法，其特征在于步驟3)的 HSCCC分離的溶劑體系以體積比計(jì)量為正己烷醋酸乙酯甲醇水=1 6: 2 9: 1 6:2 8;固定相為上相；流動(dòng)相為下相；HSCCC分離流速0.5 4. 0 mL min";轉(zhuǎn)速500 1500 r min—、周定相的保留值不低于50%。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的豬仔笠異黃酮類化合物的提取方法，其特征在于步驟l) 粉碎的豬仔笠塊根，可以用50 100%乙醇浸沒藥材且液面高出藥材約0.5 lcm,在80 躬。C和常壓力回流提取2 4次，合并乙醇提取液，將乙醇提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮得 浸膏，浸膏加入2 15倍量的水混懸得混懸液，混懸液用0. 5 2倍水的石油醚萃取8 2 次，經(jīng)石油醚萃取8 12次后所余下的混懸液再采用是余下的混懸液量的0. 5 2倍的醋酸 乙酯萃取混懸液8 12次，合并醋酸乙酯萃取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮醋酸乙酯萃取液 得醋酸乙酯浸膏。
5、 根據(jù)權(quán)利要求2或3或4所述的豬仔笠異黃酮類化合物的提取方法，其特征在于所 述步驟2)的醋酸乙酯浸膏用由正己垸、醋酸乙酯、甲醇、水組成的混合溶劑的下相溶解、上相萃取分離，所述的混合溶劑體系以體積比計(jì)量配比是正己烷醋酸乙酯甲醇水=3 6: 3 6: 4 8: 2 6。
6、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的豬仔笠異黃酮類化合物的提取方法，其特征在于步驟3)所 述的HSCCC分離的HSCCC溶劑體系為正己垸醋酸乙酯甲醇水=3: 6: 3: 6;畫定 相上相；流動(dòng)相下相；流速2.0 mL min—、轉(zhuǎn)速700 r min—1;固定相的保留值不 低于50%，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。
7、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的豬仔笠異黃酮提取物的提取方法，其特征在于用95%乙醇在 82 85'C和常壓力回流提取三次，合并三次乙醇提取液，將乙醇提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓 濃縮得浸膏，浸膏加入3 5倍的水混懸，用0.5 1倍水的石油醚萃取10次后所余下的混 懸液再用是余下的混懸液量的0.5 1倍的醋酸乙酯萃取10次獲得醋酸乙酯萃取液，合并 獲得的醋酸乙酯萃取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮醋酸乙酯萃取液得醋酸乙酯浸膏。
8、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的豬仔笠異黃酮提取物的提取方法，其特征在于步驟2)的醋酸乙酯浸膏用混合溶劑萃取分離的正己垸醋酸乙酯甲醇水的溶劑體系以體積比計(jì)量
9、 權(quán)利要求1所述的豬仔笠異黃酮類化合物，在帶j備抑菌、抗炎、止咳、化痰和防治金黃葡萄球菌的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種豬仔笠異黃酮類化合物及其提取方法與應(yīng)用，所述豬仔笠異黃酮類化合物為白色針晶的異黃酮類化合物，其提取方法包括如下步驟將豬仔笠塊根粉碎，用乙醇回流提取、減壓濃縮得浸膏，浸膏加入水制得的混懸液用石油醚萃取，石油醚萃取后留下的混懸液再用醋酸乙酯萃取、減壓萃取液得醋酸乙酯浸膏；將醋酸乙酯浸膏用正己烷∶醋酸乙酯∶甲醇∶水混合溶劑體系的下相溶解后，取等體積的上相萃取該溶解液多次至上相為無(wú)色，把下相部分蒸干得醋酸乙酯浸膏II；醋酸乙酯浸膏II經(jīng)過制備型HSCCC分離，手工收集一個(gè)峰型對(duì)稱且含量較高的組分流出液，把此流出液蒸發(fā)部分溶劑后得到具有抑菌、抗炎、止咳和化痰作用的異黃酮類化合物。
文檔編號(hào)C07D311/00GK101665481SQ20091011241
公開日2010年3月10日 申請(qǐng)日期2009年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月24日
發(fā)明者李凌峰, 李宇翔, 李清祿, 黃美玲 申請(qǐng)人:李清祿