專利名稱：嗜中性活性肽2(72)作為原發(fā)性肝癌標(biāo)志物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種多肽標(biāo)志物的應(yīng)用，具體為一種嗜中 性活性肽2 (72)作為原發(fā)性肝癌血清標(biāo)志物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
原發(fā)性肝癌(Primary h印atic carcinoma,以下簡稱肝癌)是世界上流 行最廣的惡性腫瘤之一，國際癌癥研究中心(IARC)估計，2000年全球肝癌發(fā)病 56.4萬人，肝癌死亡54.9萬人。而我國由于肝炎和肝炎轉(zhuǎn)肝硬化的病人眾多， 致使肝癌在我國的發(fā)病率和死亡率均高于世界平均水平。與70年代比較，中國 肝癌死亡率水平有了較大幅度的增高，與世界其^k國家相比,我國肝癌死亡率位 居各國肝癌死亡率之首。原發(fā)性肝癌是一種惡性程度高、進(jìn)展快、預(yù)后差、侵 襲性強(qiáng)的惡性腫瘤。早期一般無明顯癥狀， 一旦出現(xiàn)臨床表現(xiàn)，病情大多已屆 入中、晚期。因此為降低其發(fā)病率和死亡率，諸多學(xué)者長期致力于防治肝癌的 研究。近幾十年來，肝癌的臨床診治及基礎(chǔ)研究均取得了豐碩成果，但其總體 預(yù)后并未得到顯著改善，難以明確診斷而失去手術(shù)的時機(jī)是重要的原因之一。
目前圖像檢測(包括CT， MRI)、化學(xué)檢測(血清學(xué)和免疫學(xué))及細(xì)胞組織 學(xué)檢測是癌癥診斷的三大支柱。常規(guī)的肝癌診斷主要為血清AFP檢測，肝臟 B超檢查或磁共振檢查，肝動脈造影，肝穿剌活組織檢查，外科手術(shù)活檢或冰 凍切片檢查等。其中AFP已成為最有價值的肝癌標(biāo)志物，多年以來一直作為診 斷肝癌的重要參考依據(jù)。但是30%-40%的肝癌病人的AFP陰性，常使臨床的早 期診斷遇到這兩種情況 一是APP濃度高于正常(20Pg/L)但不達(dá)到診斷肝癌的 標(biāo)準(zhǔn)(40(Htg/L)，如若影像診斷未有肝內(nèi)占位性病變發(fā)現(xiàn)，則可 被視為活動性 肝病，長期門診隨訪，而坐失根治良機(jī)。二是AFP陰性病例，實時超聲出現(xiàn)可疑占位性病變而無法定性，對這類病人進(jìn)一步再作CT、磁共振成像、放射性核 素掃描等檢測，往往眾說紛紜，結(jié)論不一，因而延誤了肝癌的診斷。為此近年 來提倡多種標(biāo)志物聯(lián)合檢測以提高肝癌檢測的靈敏度和特異度，但多項指標(biāo)組 合在提高肝癌診斷敏感性的同時，降低了其診斷的特異性及準(zhǔn)確性，多種標(biāo)志 物聯(lián)合檢測的應(yīng)用也具有了一定的局限性。因此，尋找有效的腫瘤標(biāo)志物用于 癌變機(jī)理研究、藥物靶標(biāo)的設(shè)計、腫瘤的診斷及高危人群的篩査成為肝癌研究 的當(dāng)務(wù)之急。
為了更快速、簡便、直接檢測在異源樣品中大量的蛋白質(zhì)，Hutchins和Yip 提出了 一種新的質(zhì)譜技術(shù)表面增強(qiáng)激光解吸/電離時間飛行質(zhì)譜 (Surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, SELDI-TOF-MS)，這一技術(shù)為從蛋白質(zhì)組學(xué)的角度研究腫瘤，尋 找特異、靈敏的標(biāo)志物提供了優(yōu)良的技術(shù)平臺。應(yīng)用SELDI-TOF-MS技術(shù)目前已 在卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌等研究中成功找到多個新的腫瘤標(biāo)志物，并由此 建立了一些檢測惡性腫瘤的方法。進(jìn)一步通過色譜純化，SDS-PAGE凝膠電泳， 胰酶消化，MALDI分析肽譜或MS/MS檢測出部分序列，再通過網(wǎng)上比對可鑒定 出部分蛋白標(biāo)志物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種嗜中性活性肽2 (72)在原發(fā)性肝癌檢測中的應(yīng)用。
高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)鑒定原發(fā)性肝癌血清標(biāo)本在7.7kDa位置蛋白 為嗜中性活性肽2(72) (Neutrophil -activating p印tide 2(72))，它存在于 人的血清和肝癌組織中，為血小板堿性蛋白(Platelet basic protein)在胞 外被胰酶酶切后，形成11條肽鏈的其中一條，分子量為7789道爾頓，由72個 氨基酸組成，在原發(fā)性肝癌病人的血清和組織中嗜中性活性肽2(72)表達(dá)明顯 升高。
嗜中性活性肽2(72)在原發(fā)性肝癌檢測中的應(yīng)用，用表面加強(qiáng)激光解吸電離 一飛行時間質(zhì)譜儀測定肝癌患者血清嗜中性活性肽2(72)的含量，用免疫組化 的方法檢測肝癌組織中嗜中性活性肽2(72)的表達(dá)，用實時熒光定量PCR檢測 NAP-2(72)mRNA在肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平。利用嗜中性活性肽2 (72)對肝癌的檢測具體通過以下方案實現(xiàn)
(1) 用表面加強(qiáng)激光解吸電離一飛行時間質(zhì)譜儀測定原發(fā)性肝癌患者與健
康的血清標(biāo)本的7. 7-7. 9kDa位置蛋白的差異圖譜。
(2) 利用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)鑒定7. 7kDa位置蛋白為嗜中性活性肽 2(72)。
(3) 用相應(yīng)的抗體進(jìn)行免疫沉淀實驗驗證7. 7kDa位置蛋白為嗜中性活性肽 2(72)。
本發(fā)明利用弱陽離子(WCX2)芯片檢測原發(fā)性肝癌患者與健康人對照樣本， 發(fā)現(xiàn)原發(fā)性肝癌血清樣本在7. 7kDa位置蛋白表達(dá)水平明顯高于健康對照樣本。 選擇在SELDI檢測中7. 7kDa位置蛋白高表達(dá)的肝癌病人血清，運(yùn)用Blue 3GA 和Protein A去除血清中的白蛋白和IgG，將去除白蛋白和IgG的血清樣品與 樣品緩沖液混勻后，Tricine-SDS-PAGE電泳，將凝膠目的蛋白條帶用1.5 mm 切膠筆切下，置于離心管中，脫色后進(jìn)行膠內(nèi)酶解。將酶解好的樣品用C18反 相柱進(jìn)行分離后，直接串聯(lián)質(zhì)譜檢測，質(zhì)譜打擊條件為ESI噴霧電壓3.2 kV， ION TRAP碰撞能量35%。將質(zhì)譜檢測到的肽段的質(zhì)量和序列在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫 SWISS-PROT/TrAEM-BL上進(jìn)行搜索比較，獲取可信的完整蛋白。確定蛋白質(zhì)一 級序列后制備相應(yīng)的多克隆抗體，并用抗體與目的蛋白高表達(dá)的樣本結(jié)合，再 用質(zhì)譜檢測以驗證7. 7kDa位置蛋白為嗜中性活性肽2(72)。
本發(fā)明應(yīng)用SELDI質(zhì)譜儀，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)等，首次發(fā)現(xiàn)嗜中 性活性肽2(72)可用于肝癌的檢測，為原發(fā)性肝癌的發(fā)現(xiàn)和檢測提供了新的標(biāo) 志物，對進(jìn)一步提高目前原發(fā)性肝癌的診治水平具有一定的意義。


圖1為SELDI檢測嗜中性活性肽2(72)在肝癌中高表達(dá)，上為肝癌病人血 清，下為正常對照血清。
圖2為SELDI檢測免疫沉淀實驗，圖2中的①為未加抗體的肝癌血清中嗜 中性活性肽2(72)高表達(dá)，②為與相應(yīng)抗體反應(yīng)過后的血清，嗜中性活性肽2(72) 水平明顯下降。
圖3為嗜中性活性肽2(72)在肝癌組織中的表達(dá)，A為肝癌組織NAP-2陽性表達(dá)，箭頭所指為陽性表達(dá)的肝癌細(xì)胞，B為癌旁組織NAP-2陰性表達(dá)。
具體實施例方式
以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，這些實例僅用于說明目的，而 不用于限制本發(fā)明范圍。
實施例l
肝癌相關(guān)血清標(biāo)志物的鑒定
分離用的樣本為lml肝癌病人血清。運(yùn)用Blue 3GA和Protein A去除血清 中的白蛋白和IgG，配制Tricine-SDS-PAGE分離膠、間隙膠和濃縮膠,將去除 白蛋白和IgG的血清樣品與樣品緩沖液混勻后，煮沸5 min，上樣，使用垂直 小電泳槽進(jìn)行電泳，40V約1.5h，當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠時，電壓升至60V約1.5h， 電泳結(jié)束后，考馬斯亮染色1 h，雙蒸水洗凈膠面直到背景清晰，將凝膠目的 蛋白條帶用1.5mm切膠筆切下，置于離心管中，脫色后進(jìn)行膠內(nèi)酶解，將酶解 好的樣品用C18反相柱進(jìn)行分離后，直接高效液相串聯(lián)質(zhì)譜檢測，質(zhì)譜打擊條 件為ESI噴霧電壓3. 2 kV, ION TRAP碰撞能量35%。將質(zhì)譜檢測到的肽段的質(zhì) 量和序列在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫SWISS-PROT/TrAEM-BL上進(jìn)行搜索比較，獲取可信的 完整蛋白。把各完整蛋白的分子量、等電點(diǎn)和可能被剪切成的肽鏈與目的蛋白 進(jìn)行比較，選擇可能與目的蛋白對應(yīng)的完整蛋白或其肽鏈進(jìn)行基因和蛋白質(zhì)水 平的分析。確定蛋白質(zhì)一級序列后制備相應(yīng)的抗體，并用抗體與高表達(dá)樣本結(jié) 合，將相應(yīng)的蛋白質(zhì)結(jié)合掉再用SELDI質(zhì)譜檢測以驗證結(jié)果。
質(zhì)譜結(jié)果在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫SWlSS-PROT/TrAEMBL上進(jìn)行搜索比較發(fā)現(xiàn)，檢測 到的一個肽段(MW=1 101.29 Da，序列為NIQSLEVIGK或Asn lie Gln Ser Leu Glu Val lie Gly Lys)與嗜中性活性肽2 (Neutrophil -activating p印tide 2)的一個肽段MW=1 100. 6310 Da，序列相符合，且這一肽鏈的分子量與SDS-PAGE 電泳測定的分子量也基本吻合。因此，根據(jù)肽鏈的分子量和等電點(diǎn)范圍進(jìn)行推 觀IJ，嗜中性活性肽2(72)可能和目的蛋白7 789Da (pl〉4)的氨基酸序列相同。
其完整序列如序列表中所示。
用相應(yīng)的兔抗人抗體與人肝癌血清樣本反應(yīng)后經(jīng)SELDI檢測7. 7kDa這個峰 明顯消失，如圖2所示。實施例2
嗜中性活性肽2 (72)在肝癌和對照樣本中的差異表達(dá)
從-80。C冰箱中取出血清樣品，置冰盒上溶解，以10000rpm， 4 。C離心5min， 取血清IOW，加入2倍體積U9緩沖液(含DTT)稀釋。稀釋時注意不要用移液器 反復(fù)吹吸，避免產(chǎn)生大量氣泡，用手指輕敲樣品管底部或震蕩器，將樣品充分 混勻。取以上樣品冰浴300rpm震蕩30min或每隔5分鐘用手指輕彈混勻一次， 將上述變性后樣品加入50mM NaAC， pH4. 0的結(jié)合緩沖液360W，使得血 清的總稀釋倍數(shù)達(dá)到約40倍。盡快混勻，避免蛋白質(zhì)變性產(chǎn)生沉淀和氣泡產(chǎn)生。
小心取出WCX2芯片，將芯片裝入生物芯片處理器(Bioprocessor)，每孔加 入50mMNaAC， PH4. 0的結(jié)合緩沖液20(H4，置振蕩器300rpm震蕩5min，甩掉 緩沖液。重復(fù)上述操作一次。在芯片處理器每孔中加入10014處理好的樣品， 置振蕩器300rpm，室溫震蕩1小時。甩棄樣品或?qū)悠匪θ腩A(yù)裝消毒劑的容器。 每孔加入50mM NaAc， pH4. 0的結(jié)合緩沖液200W，室溫置振蕩器300rpm震蕩 5min，甩去孔中液體，注意不要甩得太干，再次加入結(jié)合緩沖液200W，重復(fù) 操作一次。每孔加入lmM, pH 4.0的HEPES 20(￥1，然后立刻甩出。立刻拆開 芯片處理器，取出芯片后，待干后，在每個加樣孔上加SPA0.5W，待干后，重 復(fù)加SPA0.5W—次。自然干燥待干，上機(jī)測定。
采用PBS 11-c型蛋白芯片閱讀儀讀取芯片信息。用加有標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的 All-in-one芯片校正儀器，使分子量偏差至0. 1%范圍內(nèi)。芯片閱讀儀參數(shù)設(shè)置 如下激光強(qiáng)度185，檢測靈敏度8，優(yōu)化范圍2 OOO—IO OOODa,最高分子量 50 OOODa，芯片上的每個點(diǎn)采集130次。用Ciphergen ProteinChip 3. 2軟件 采集數(shù)據(jù)，所有原始數(shù)據(jù)先用Proteinchip Software 3. 2做校正總離子強(qiáng)度及 分子量的均一，將所有樣本2000m/z以上的質(zhì)荷比峰，用Proteinchip Software 3.2的biomark wizard過濾噪音，設(shè)置初始的噪音過濾值為5,第二次的噪音 過濾值為2，以10%為最小閾值進(jìn)行聚類。
嗜中性活性肽2(72)在肝癌患者和健康人中的差異表達(dá)結(jié)果如下7789Da 在原發(fā)性肝癌病人血清中的表達(dá)量為21. 662616±9. 007951，在正常對照人群 血清中的表達(dá)量為8. 8290885±6. 779427 (尸<0.05)。嗜中性活性肽2(72)在肝 癌病人血清中表達(dá)顯著高于正常對照人群。實施例3
嗜中性活性肽2 (72)在肝癌組織中的表達(dá)
肝癌組織和對應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本30例，均系07年1月至08年1月期間在 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科住院患者。所有患者均經(jīng)肝切除術(shù)，術(shù)前 未接受化療、放療和/或其他抗腫瘤治療，術(shù)后病理檢査證實為原發(fā)性肝細(xì)胞癌。 標(biāo)本均采用中性福爾馬林固定，石蠟包埋。
兔抗人NAP-2多克隆抗體(加拿大Immunechem Pharmaceuticals, INC)， 羊抗兔服P標(biāo)記二抗(廣西南寧中加生物免疫科技公司)，DAB試劑盒(福州邁 新公司)，人肝癌細(xì)胞株SMCC-7721和人肝正常細(xì)胞株HL-7702由廣西醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)科學(xué)實驗中心腫瘤實驗室提供。
肝癌組織和對應(yīng)的癌旁組織蠟塊4um厚連續(xù)切片，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度 酒精水化，用檸檬酸鹽高溫修復(fù)法修復(fù)抗原，用39&過氧化氫處理20min后加正 常羊血清封閉15min，滴加1: 3000稀釋的抗NAP-2抗體，免疫濕盒內(nèi)4t過夜。 滴加HRP標(biāo)記羊抗兔二體置37°C30min， DAB顯色，蘇木素復(fù)染。以PBS代替 一抗作空白對照。結(jié)果判定以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性標(biāo)志，分4個級 別。分級標(biāo)準(zhǔn)胞核陽性率<5%為陰性(一)，6% 40%胞核陽性率為弱陽性 (+ )， 41% 70%胞核陽性率為陽性(++)， 71% 100%胞核陽性率為強(qiáng)陽性(+++)。 實驗結(jié)果采用SPSS10. 0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，以卡方檢驗比較計數(shù)資料間的 顯著性差異。
結(jié)果NAP-2在肝癌細(xì)胞中呈強(qiáng)陽性表達(dá)，但在癌旁細(xì)胞中呈弱陽性或陰 性表達(dá)。陽性細(xì)胞以黃色、棕黃色及棕褐色細(xì)顆粒均勻著色，NAP-2表達(dá)主要 定位于細(xì)胞核(圖3)。肝癌組織中NAP-2表達(dá)陽性率為100% (30/30)，其中 63.3% (19/30)表達(dá)為強(qiáng)陽性。癌旁組織NAP-2表達(dá)與肝癌組織比較，癌旁組 織NAP-2表達(dá)陽性率及表達(dá)程度與肝癌組織有明顯差別(x2=15， p<0.01)
實施例4
嗜中性活性肽2(72)基因mRNA在肝癌S畫C-7721細(xì)胞株中的表達(dá) 根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)所提供的Enrtez核酸數(shù)據(jù)庫中檢 索到的人源NAP-2基因和內(nèi)參看家基因P -actin的完整cDNA序列，應(yīng)用oligo6.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計，然后將引物輸入BLAST數(shù)據(jù)庫比較序列同源性，最終 得到特異性引物序列及PCR產(chǎn)物片段長度。所有的引物合成由大連寶生物生物 工程有限公司合成。擴(kuò)增NAP-2基因的引物為P15， GTGACTTGTATGCTGAACTCC 3， ， P2 5， TGGCAGAAACAGAA CAMT 3，，擴(kuò)增產(chǎn)物218bp。擴(kuò)增P -actin的 引物為Pl 5' CGGGMATCGTGCGTGAC 3' ， P2: 5' GGAAATGA GGGCAGGACTTAG 3'， 擴(kuò)增產(chǎn)物275bp。 '
肝癌7721細(xì)胞和正常肝細(xì)胞7702兩株細(xì)胞長滿250ml培養(yǎng)瓶后，用PBS 洗3遍后，每瓶加入8mlTrizo1試劑，輕搖幾次，室溫靜置5分鐘。轉(zhuǎn)移裂解 液于15ml離心管中，按每lmlTrizol加0.2ml氯仿的比例加入氯仿1.6ml，劇 烈震蕩15秒，室溫靜置3分鐘，12000g，低溫離心15分鐘。轉(zhuǎn)移水相于另一 離心管中，加入異丙醇4ml，室溫靜置10分鐘，12000g，低溫離心10分鐘。 棄上清，用75%酒精洗3次，每次8ml， 7500g低溫離心5分鐘。干燥RNA沉淀， 用DEPC水溶解。檢測RNA純度和完整性。
按如下條件進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)Total RNA 1-5ng ， 01igo(dT)18 2ul ， dNTP Mixture(lOmM) 2ul ， Rnase Free dH20 8ul， 70° C 5min， 冰浴2min。加入5Xreact ion Buffer 4 u l，DTT(O. 1M) lul ， TIANScript M-MLV lyl， 42° C 50min， 95° C 5min。
按如下條件進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)反應(yīng)體系包括SYBR 10nl , R0X 0.4ul ，上下引物各0.4ul ， cDNA 2nl， ddH20 6. 8ul 。 95° C lmin后 進(jìn)入循環(huán)，95° C 5S， 60° C 25S， 72° C 15S，共進(jìn)行40個循環(huán)。熒光定量 PCR的結(jié)果以Ct值顯示。實時熒光定量PCR中每個樣本重復(fù)2次，取Ct值的 平均值。采用Comparative Delta-delta Ct法(2AACt)比較各基因表達(dá)的 差異厶Ct值^目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值；A厶Ct值=目的基因△Ct值-內(nèi)參基因△Ct值； 以對照組表達(dá)量為1， 2厶ACt值即為目的基因較正常段基 因表達(dá)的倍數(shù)。
結(jié)果處理樣品的待測基因SMMC-7721臨界循環(huán)值的均數(shù)Ct 1=26. 036，處 理樣品持家基因SMMC-7721 P-actin臨界循環(huán)值的均數(shù)Ct2=21.476，對照樣品待測基因7702待測基因的臨界循環(huán)值的均數(shù)Ct3 = 29. 675， 7702 P -actin對
照樣品持家基因的臨界循環(huán)值的均數(shù)Ct4=22. 3135。
△ △Ct=(26. 036—21. 476) —(29. 675—22. 3135)=4. 56 — 7. 3615= —2. 8015 Folds=2—AACt=2—(—2則5)=22'則5=6.9716，即NAP-2 (72)的mRNA在SMMC-7721
肝癌細(xì)胞的表達(dá)水平相對于HL-7702正常肝細(xì)胞上調(diào)了將近7倍?！?10〉廣西醫(yī)科大學(xué)
〈120〉嗜中性活性肽2 (72)作為原發(fā)性肝癌標(biāo)志物及其應(yīng)用 〈130〉 123 〈160〉 1 ' 〈170〉 Patentln version 3.2 〈210〉 1 〈211〉 72 <212〉 PRT 〈213〉人類 〈400〉 1
Asp Leu Tyr Ala Glu Leu Arg Cys Met Cys lie Lys Thr Thr Ser Gly
15 10 15
lie His Pro Lys Asn lie Gin Ser Leu Glu Val lie Gly Lys Gly Thr
20 25 30
His Cys Asn Gin Val Glu Val lie Ala Thr Leu Lys Asp Gly Arg Lys
35 40 45
lie Cys Leu Asp Pro Asp Ala Pro Arg lie Lys Lys lie Val Gin Lys
50 55 60
Lys Leu Ala Gly Asp Glu Ser Ala 65 70
權(quán)利要求
1、嗜中性活性肽2(72)(Neutrophil-activating peptide 2(72))，其特征在于，它存在于人的血清和肝癌組織中，為血小板堿性蛋白(Plateletbasic protein)在胞外被胰酶酶切后，形成11條肽鏈的其中一條，由72個氨基酸組成，分子量為7789道爾頓，在原發(fā)性肝癌血清和組織標(biāo)本中表達(dá)明顯升高，NAP-2(72)mRNA在肝癌SMMC-7721細(xì)胞株中的表達(dá)明顯升高。
2、 權(quán)利要求1所述嗜中性活性肽2(72)作為原發(fā)性肝癌標(biāo)志物及其應(yīng)用， 其特征在于，用表面加強(qiáng)電離-飛行時間質(zhì)譜儀測定原發(fā)性肝癌病人或者健康人 的血清中嗜中性活性肽2(72)的含量，用免疫組織化學(xué)的方法測定嗜中性活性 肽2(72)在肝癌組織中的表達(dá)水平，用實時熒光定量PCR檢測NAP-2(72)mRNA 在肝癌SMMC-7721細(xì)胞株中的表達(dá)水平。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種嗜中性活性肽2(72)(Neutrophil-activating peptide2(72))作為原發(fā)性肝癌標(biāo)志物及其應(yīng)用，所述嗜中性活性肽2(72)存在于人的血清和肝癌組織中，為血小板堿性蛋白(Platelet basic protein)在胞外被胰酶酶切后，形成11條肽鏈的其中一條，分子量為7789道爾頓；在原發(fā)性肝癌病人的血清和組織中嗜中性活性肽2(72)表達(dá)明顯升高。可利用表面加強(qiáng)激光解吸電離—飛行時間質(zhì)譜儀測定肝癌患者血清嗜中性活性肽2(72)的含量，用免疫組化的方法檢測肝癌組織中嗜中性活性肽2(72)的表達(dá)，用實時熒光定量PCR檢測NAP-2(72)mRNA在肝癌SMMC-7721細(xì)胞株中的表達(dá)水平，以此作為肝癌檢測的輔助指標(biāo)。
文檔編號C07K14/435GK101643503SQ20091011436
公開日2010年2月10日 申請日期2009年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月3日
發(fā)明者敏 何, 張志勇, 胡天橋, 蔣作祎, 健 覃, 霄 韋 申請人:廣西醫(yī)科大學(xué)