專利名稱：去除多殺菌素發(fā)酵液中色素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物農(nóng)藥生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種去除多殺菌素發(fā)酵液 中色素的方法。
背景技術(shù)：
多殺菌素(Spinosad)是1982年美國禮萊公司科研人員從維爾京群島土 壤中分離的刺糖多胞菌(Saccharopolyspora spinosa)發(fā)酵液中提取得到的一 種新穎的大環(huán)內(nèi)酯類超高效生物源殺蟲劑。該類化合物不僅有很高的生物 活性，而且對(duì)非靶標(biāo)生物的毒性很低，對(duì)人和其他哺乳動(dòng)物非常安全。在 天然多殺菌素分離提取物中，兩個(gè)最高活性組份A和D的混和物被稱為 spinosad，中文通用名為多殺菌素，它是商業(yè)化產(chǎn)品的主要成分。多殺菌 素主要應(yīng)用于對(duì)棉鈴蟲、煙青蟲、小菜蛾、果蠅、甜菜夜蛾、薊馬等的防 治，適用于棉花、茶、蔬菜和蘋果、梨、桃等落葉果樹。到1999年多殺 菌素已經(jīng)在24個(gè)國家、100多種作物上進(jìn)行了注冊(cè)登記。多殺菌素具有高 殺蟲活性的同時(shí)，對(duì)捕食性昆蟲還表現(xiàn)出較低毒性，對(duì)鱗翅目害蟲而言， 多殺菌素是已發(fā)現(xiàn)的殺蟲劑中選擇性最高的化合物之一。多殺菌素的另一 個(gè)優(yōu)點(diǎn)是對(duì)哺乳動(dòng)物和鳥類相對(duì)低毒，對(duì)水生動(dòng)物也只是輕微的中等毒 性，此外，哺乳動(dòng)物的慢性毒性試驗(yàn)表明，多殺菌素?zé)o致癌、致畸、致突 變性或神經(jīng)毒性。目前，多殺菌素商業(yè)化的品種有用于棉花的Tmcer，用 于蔬菜類的菜喜(Success)，以及Conerve和SpinTor。我國目前使用的有用 于蔬菜的菜喜。在美國，多殺菌素產(chǎn)品標(biāo)簽上標(biāo)明可應(yīng)用于100多種作物， 同時(shí)它還在其他24個(gè)國家進(jìn)行了注冊(cè)登記，并在全世界范圍內(nèi)為廣大種 植者所接受。
對(duì)于多殺菌素的分離純化工藝，國內(nèi)外的研究并不多，其主要方法是 利用溶媒萃取法，此法雖然也能取得一定的效果，但有機(jī)溶媒使用量大， 環(huán)境污染嚴(yán)重，利用樹脂吸附法則能克服這一缺點(diǎn)，但目前樹脂吸附的工
3藝并不成熟，尤其是發(fā)酵液必須經(jīng)過一定的預(yù)處理后樹脂才能發(fā)揮其作 用。
發(fā)表于2005年5月的華中農(nóng)業(yè)大學(xué)的碩士學(xué)位論文"多殺菌素分離 純化工藝的研究"披露了一種多殺菌素的樹脂吸附法提取多殺菌素的工 藝，文獻(xiàn)中先對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理，然后采用XAD-4大孔吸附樹脂對(duì)多 殺菌素進(jìn)行粗提。此樹脂在PH5-11對(duì)多殺菌素進(jìn)行吸附時(shí)均有泄露，不 能達(dá)到完全吸附的效果，并且對(duì)吸附速率也有較高的要求，不利于工藝的 放大生產(chǎn)。
多殺菌素的發(fā)酵液由于雜質(zhì)較多，濾液混濁，目前現(xiàn)有技術(shù)中還沒有 一種簡單的方法能夠?qū)l(fā)酵液的色素有效去除，并將多殺菌素的純度提到 較高的水平。

發(fā)明內(nèi)容
為解決該技術(shù)問題，本發(fā)明通過動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)，篩選了各種吸附劑，選取 了一種效果較好的吸附劑，并對(duì)吸附條件進(jìn)行了探索，使得能夠基本除去 多殺菌素發(fā)酵液中的色素，且減少了很多雜質(zhì)，使多殺菌素的純度得到提 高，減輕了后面的樹脂分離的壓力，整個(gè)工藝簡單，操作十分方便。
因此，本發(fā)明提供一種去除多殺菌素發(fā)酵液中色素的方法，該方法包 括將預(yù)處理后的多殺菌素發(fā)酵液上氧化鋁柱吸附并用溶劑系統(tǒng)洗脫的步 驟。
所述預(yù)處理后的多殺菌素發(fā)酵液按照下列步驟得到取多殺菌素發(fā)酵 液，離心得菌絲體，用丙酮浸泡過夜，再次離心，所得上清液即為預(yù)處理 后的發(fā)酵液。
具體處理方法取多殺菌素發(fā)酵液3L， 4000r/min， 30min離心得菌絲 體，用3L的丙酮浸泡過夜，再次4000r/min，離心30min取上清，即得預(yù)
處理后的多殺菌素發(fā)酵液。
本發(fā)明所述氧化鋁柱選自酸性氧化鋁柱、中性氧化鋁柱或堿性氧化鋁 柱，考慮到多殺菌素在堿性氧化鋁和中性氧化鋁中的穩(wěn)定性問題，優(yōu)選酸 性氧化鋁柱。
本發(fā)明所述溶劑系統(tǒng)可以選自丙酮、甲醇或乙醇等，但比較下來，丙酮能夠更好的溶解多殺菌素，且所含的雜質(zhì)最少。因此所述溶劑系統(tǒng)優(yōu)選
為丙酮水溶液，且優(yōu)選丙酮濃度為80%-100%的丙酮水溶液。
本發(fā)明方法中，多殺菌素的發(fā)酵液pH—般比較穩(wěn)定，基本上在2 11， 優(yōu)選3 10之間。
本發(fā)明方法中，所述處理后的多殺菌素發(fā)酵液可以配成丙酮水溶液后 上柱，也可以直接上柱。但由于多殺菌素在水溶液中的溶解性不好，含水 量超過一定比例后多殺菌素會(huì)沉淀析出，不利于過氧化鋁柱，所以丙酮水 溶液的含水比例不能超過30%。同樣，洗脫用的丙酮水溶液中的含水量也 不能超過30%。
本發(fā)明去除多殺菌素發(fā)酵液中色素的方法的具體步驟如下
取預(yù)處理后的多殺菌素發(fā)酵液500ml，將pH調(diào)為3 10，選用一根高 為20cm，直徑3cm的玻璃層析柱，均勻填入氧化鋁約10cm，往預(yù)處理后 的多殺菌素發(fā)酵液加入一定量的去離子水，配成丙酮水溶液后上柱，或?qū)?預(yù)處理后的多殺菌素發(fā)酵液直接上柱，控制其流速為15ml/min，將500ml 浸取液過完柱后，繼續(xù)用一定濃度的丙酮500ml將柱上的多殺菌素洗下來， 收集所有的洗脫液。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)洗脫液已經(jīng)變得澄清，幾乎沒有顏色，除去了絕大部分的色 素，且純度大大提高，除去了很多極性的雜質(zhì)，收率為77%以上。
多殺菌素是刺糖多孢菌在培養(yǎng)介質(zhì)中經(jīng)有氧發(fā)酵而得的次級(jí)代謝產(chǎn) 物，其生產(chǎn)菌種單一，但由于發(fā)酵培養(yǎng)基的配方不同，其最終發(fā)酵液的成 分也會(huì)不同，本實(shí)驗(yàn)室通過對(duì)比不同培養(yǎng)基配方的發(fā)酵液，發(fā)現(xiàn)其中的色 素成分比較固定，因此都可以用本發(fā)明方法除去。
本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)得到吸附力強(qiáng)，吸附速度快的氧化鋁柱，并通過洗脫 條件的摸索，使得其用于去除多殺菌素發(fā)酵液中色素時(shí)優(yōu)點(diǎn)突出。此方法 比文獻(xiàn)報(bào)道的方法有以下優(yōu)點(diǎn)
1. 色素去除較為徹底，與文獻(xiàn)中報(bào)道的方法相比，可省去脫色步驟。
2. 所得產(chǎn)物純度可達(dá)66%以上。
3. 可節(jié)省有機(jī)溶劑，且在泄露率相同的條件下，洗脫體積較小，從而 提高了回收率。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例1的處理后的多殺菌素發(fā)酵液過氧化鋁柱前的 HPLC圖譜；
圖2為本發(fā)明實(shí)施例2的處理后的多殺菌素發(fā)酵液過氧化鋁柱后的 HPLC圖譜；
其中多殺菌素A和D的保留時(shí)間都在5 6分鐘。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明多殺菌素發(fā)酵條件如下
菌種NRRL18395
斜面培養(yǎng)
培養(yǎng)基全脂奶粉2.0%、葡萄糖0.5%、進(jìn)口酵母粉0.3%、硫酸鎂 0.2%、自來水
條件28°C， 6天
種子培養(yǎng)
培養(yǎng)基葡萄糖3.0%、可溶性淀粉1.0%、棉籽粉2.0%、魚粉1.0%、 熱黃豆粉0.2%、玉米漿0.2。/。、碳酸l丐0.5%、自來水
條件25°C， 3天，搖床轉(zhuǎn)速250rpm 發(fā)酵培養(yǎng)
培養(yǎng)基葡萄糖8.0%、葵花油2.0%、棉籽粉3.0%、魚粉1.0%、賴 氨酸0.2%、 KH2PO4 0.1%、檸檬酸三鈉0.1%、自來水
12rC滅菌20min，接種量10%，搖瓶裝量100ml/750ml，置于25T恒溫 室中旋轉(zhuǎn)式搖床250rpm搖瓶發(fā)酵9天后，得到多殺菌素發(fā)酵液。
實(shí)施例1
培養(yǎng)基配方碳源-葡萄糖氮源-棉籽粉
取多殺菌素發(fā)酵液3L， 4000r/min， 30min離心得菌絲體，用3L的丙 酮浸泡過夜，再次4000r/min，離心30min取上清，即得預(yù)處理后的多殺 菌素發(fā)酵液。
取預(yù)處理后的多殺菌素發(fā)酵液500ml，單位為823ug/ml， pH為6.0，選用一根高為20cm，直徑3cm的玻璃層析柱，均勻填入酸性氧化鋁約 10cm，將丙酮浸取液加入一定量的去離子水，配成9: 1的丙酮水溶液后 上柱，控制其流速為15ml/min，將500ml浸取液過完柱后，繼續(xù)用9: 1 的丙酮水500ml將柱上的多殺菌素洗下來，收集所有的洗脫液。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)洗脫液己經(jīng)變得澄清，幾乎沒有顏色，除去了絕大部分的色 素，且純度由19.8%提高到68%，除去了很多極性的雜質(zhì)，收率為95%。
實(shí)施例2
培養(yǎng)基配方碳源-葡萄糖氮源-棉籽粉
取多殺菌素發(fā)酵液3L， 4000r/min， 30min離心得菌絲體，用3L的丙 酮浸泡過夜，再次4000r/min，離心30min取上清，即得預(yù)處理后的多殺 菌素發(fā)酵液。
取預(yù)處理后的多殺菌素發(fā)酵液500ml，單位為823ug/ml， pH為6.4， 選用一根高為20cm，直徑3cm的玻璃層析柱，均勻填入酸性氧化鋁約 10cm，將丙酮浸取液直接上柱，流速控制為15ml/min，過柱后繼續(xù)用丙酮 將柱上的多殺菌素洗下來，收集所有的洗脫液。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)洗脫液已經(jīng)變得澄清，幾乎沒有顏色，除去了絕大部分的色 素，純度由19.4%提高到66%，收率為89%。
實(shí)施例3
培養(yǎng)基配方碳源-葡萄糖氮源-棉籽粉
取多殺菌素發(fā)酵液3L， 4000r/min， 30min離心得菌絲體，用3L的丙 酮浸泡過夜，再次4000r/min，離心30min取上清，即得預(yù)處理后的多殺 菌素發(fā)酵液。
取預(yù)處理后的多殺菌素發(fā)酵液500ml，單位為823ug/ml， pH為6.5， 選用一根高為20cm，直徑3cm的玻璃層析柱，均勻填入酸性氧化鋁約 10cm，配成4: 1的丙酮水溶液后上柱，控制其流速為15ml/min，將500ml 浸取液過完柱后，繼續(xù)用4: 1的丙酮水500ml將柱上的多殺菌素洗下來，
收集所有的洗脫液。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)洗脫液己經(jīng)變得澄清，幾乎沒有顏色，除去了絕大部分的色素，純度由19.4%提高到68%，但收率為降為77%。 實(shí)施例4
培養(yǎng)基配方碳源-葡萄糖，淀粉氮源-花生柏粉
取多殺菌素發(fā)酵液3L， 4000r/min， 30min離心得菌絲體，用3L的丙 酮浸泡過夜，再次4000r/min，離心30min取上清，即得預(yù)處理后的多殺 菌素發(fā)酵液。
取預(yù)處理后的多殺菌素發(fā)酵液500ml，單位為756ug/ml， pH為6.6， 選用一根高為20cm，直徑3cm的玻璃層析柱，均勻填入中性氧化鋁約 10cm，將丙酮浸取液直接上柱，流速控制為15ml/min,過柱后繼續(xù)用丙酮 將柱上的多殺菌素洗下來，收集所有的洗脫液。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)洗脫液變得澄清，顏色很淡，除去了絕大部分的色素，純度 由18.9%提高到65.4%，收率為87。％。
實(shí)施例5
培養(yǎng)基配方碳源-葡萄糖，淀粉氮源-花生柏粉
取多殺菌素發(fā)酵液3L， 4000r/min， 30min離心得菌絲體，用3L的丙 酮浸泡過夜，再次4000r/min，離心30min取上清，即得預(yù)處理后的多殺 菌素發(fā)酵液。
取預(yù)處理后的多殺菌素發(fā)酵液500ml，單位為756ug/ml,pH為6.6，選 用一根高為20cm，直徑3cm的玻璃層析柱，均勻填入堿性氧化鋁約10cm， 將丙酮浸取液直接上柱，流速控制為15ml/min，過柱后繼續(xù)用丙酮將柱上 的多殺菌素洗下來，收集所有的洗脫液。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)洗脫液變得澄清，顏色不深，除去了大部分的色素，純度由 18.9。％提高到60.2%，收率為84Q/^。
實(shí)施例6
培養(yǎng)基配方碳源-葡萄糖，糊精氮源-玉米漿，棉籽粉
取多殺菌素發(fā)酵液3L， 4000r/min， 30min離心得菌絲體，用3L的丙 酮浸泡過夜，再次4000r/min，離心30min取上清，即得預(yù)處理后的多殺菌素發(fā)酵液。
取預(yù)處理后的多殺菌素發(fā)酵液500ml，單位為655ug/ml， pH為4.9， 選用一根高為20cm，直徑3cm的玻璃層析柱，均勻填入酸性氧化鋁約 10cm，將丙酮浸取液直接上柱，流速控制為15ml/min，過柱后繼續(xù)用丙酮 將柱上的多殺菌素洗下來，收集所有的洗脫液。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)洗脫液變得澄清，幾乎沒有顏色，除去了大部分的色素，純 度由18.9%提高到67.2%，收率為88%。
實(shí)施例7
培養(yǎng)基配方碳源-葡萄糖，糊精氮源-玉米漿，棉籽粉 取多殺菌素發(fā)酵液3L， 4000r/min， 30min離心得菌絲體，用3L的丙
酮浸泡過夜，再次4000r/min，離心30min取上清，即得預(yù)處理后的多殺
菌素發(fā)酵液。
取預(yù)處理后的多殺菌素發(fā)酵液500ml，單位為655ug/ml， pH為9.5， 選用一根高為20cm，直徑3cm的玻璃層析柱，均勻填入酸性氧化鋁約 10cm，將丙酮浸取液直接上柱，流速控制為15ml/min，過柱后繼續(xù)用丙酮 將柱上的多殺菌素洗下來，收集所有的洗脫液。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)洗脫液變得澄清，幾乎沒有顏色，除去了大部分的色素，純 度由18.9%提高到66.9%,收率為84%。
對(duì)比例l:考察不同吸附劑對(duì)色素去除的比較 考察用活性炭、氧化鋁、大孔吸附樹脂對(duì)色素去除的比較。
培養(yǎng)基配方碳源-葡萄糖氮源-全脂奶粉
取多殺菌素發(fā)酵液3L， 4000r/min， 30min離心得菌絲體，用3L的丙 酮浸泡過夜，再次4000r/min，離心30min取上清，即得預(yù)處理后的多殺 菌素發(fā)酵液。
取預(yù)處理后的多殺菌素發(fā)酵液500ml，單位為742ug/ml， pH為6.1， 選用一根高為20cm，直徑3cm的玻璃層析柱，分別均勻填入氧化鋁、活 性炭、大孔吸附樹脂XAD-2約10cm，將丙酮浸取液加入一定量的去離子 水，配成9: 1的丙酮水溶液后分別上柱，三種吸附劑都控制其流速為
915ml/min，將500ml浸取液過完柱后，繼續(xù)用9: 1的丙酮水500ml將柱 上的多殺菌素洗下來，收集所有的洗脫液。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)活性炭作為吸附劑時(shí)，多殺菌素大部分被吸附在活性炭上洗 不下來，損失很大。
XAD-2作為吸附劑時(shí)，很多色素都隨著多殺菌素一起洗下來，除色素 效果不好。
只有氧化鋁作為吸附劑時(shí)，洗脫液中幾乎沒有色素，顏色澄清。 對(duì)比例2:考察用絮凝劑除色素的效果
按照華中農(nóng)大碩士學(xué)位論文"多殺菌素分離純化工藝的研究"的方法， 采用絮凝劑處理多殺菌素發(fā)酵液，結(jié)果表明該方法只能沉淀發(fā)酵液中的蛋 白等大分子物質(zhì)，對(duì)于色素去除的效果不佳，絮凝后發(fā)酵液的透光度仍然 不高，除色素效果遠(yuǎn)不如氧化鋁。
附吸附劑規(guī)格 100 200目酸性氧化鋁 技術(shù)條件
性狀白色無定形粉末 主要性能指標(biāo)-
技術(shù)條件符合Q/CYDZ 1791-2005
顆粒度>75.0%
千燥失重《1.0%
水溶解物《0.5%
灼燒失重《8.0%
pH3.8 4.8
生產(chǎn)廠家國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 XAD-2大孔吸附樹脂
基質(zhì) 苯乙烯 直徑20-60目密度1.08 g/ml
生產(chǎn)廠家美國羅門哈斯公司 。
權(quán)利要求
1.去除多殺菌素發(fā)酵液中色素的方法，該方法包括將預(yù)處理后的多殺菌素發(fā)酵液上氧化鋁柱吸附并用溶劑系統(tǒng)洗脫的步驟。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述預(yù)處理后的多殺菌 素發(fā)酵液按照下列步驟得到取多殺菌素發(fā)酵液，離心得菌絲體，用丙酮 浸泡過夜，再次離心，所得上清液即為預(yù)處理后的發(fā)酵液。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述氧化鋁柱選自酸性 氧化鋁柱、中性氧化鋁柱或堿性氧化鋁柱。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述氧化鋁柱為酸性氧 化鋁柱。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶劑系統(tǒng)為丙酮水 溶液。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述丙酮水溶液中丙酮 的濃度為80%-100%。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述預(yù)處理后的多殺菌 素發(fā)酵液配成丙酮水溶液后上柱或直接上柱。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述預(yù)處理后的多殺菌 素發(fā)酵液的pH值為2 11。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述預(yù)處理后的多殺菌 素發(fā)酵液的pH值為3 10。
全文摘要
本發(fā)明公開一種去除多殺菌素發(fā)酵液中色素的方法，該方法包括將預(yù)處理后的多殺菌素發(fā)酵液上氧化鋁柱吸附并洗脫的步驟。由該方法得到的多殺菌素洗脫液中的色素基本除去，純度和收率均得到提高。整個(gè)工藝簡單，操作方便。
文檔編號(hào)C07H17/08GK101659685SQ20091013311
公開日2010年3月3日 申請(qǐng)日期2009年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月27日
發(fā)明者亮 盧, 李繼安, 韓麗敏 申請(qǐng)人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院