專利名稱：從虎皮楠中分離提取兩種雙黃酮的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于有機化合物提取領域，尤其是涉及一種虎皮楠科植物即狹葉虎皮楠的 提取物——雙黃酮A和雙黃酮B的制備方法。
背景技術：
雙黃酮A的化學名為5，7，14三羥基黃烷(2 —0—7，4 —8)3' ，5' ，14'-三羥 基黃酮醇，雙黃酮B的化學名為5，7，14三羥基黃烷醇(2 —0 —7，4 —8)3' ，5' ，14'-三 羥基黃酮醇，其結構式如下
雙黃酮A 雙黃酮B 雙黃酮A為淡黃色粉末，M. p. 264-266 °C， ESI-MS (negative mode) :m/z = 539[M-H]—。結合NMR數據確定分子式為C3。H2。0i。，不飽和度為21。該化合物遇FeCl3顯色劑 顯藍色，說明分子中含有酚羥基，在254nm紫外燈下和碘蒸汽中均能顯色。紫外光譜顯示該 化合物在350. 60， 245. 50， 212. 50nm處有吸收。紅外光譜有酚羥基的伸縮振動(3378cm—1)， 羰基伸縮振動(1613cm—1)，苯環(huán)的特征吸收(1654cm—1,1515cm—1,1491cm—1)，苯環(huán)CH面外彎 曲振動(1254cm—、 1160cm—1,833cm—1) ， C-O-C伸縮振動(1136cm—0。 雙黃酮B為淡黃色粉末，M. p. 239-241 °C， ESI-MS (negative mode) :m/z = 555[M-H]—。結合NMR數據確定分子式為C3。H2。0n，不飽和度為21。雙黃酮B遇FeCl3顯色 劑顯藍色，說明分子中含有酚羥基，在254nm紫外燈下和碘蒸汽中均能顯色。紫外光譜顯示 雙黃酮B在283. 5， 323. 5nm處有吸收。紅外光譜有酚羥基的伸縮振動(3260cm—1)，羰基伸 縮振動(1638cm—1)，苯環(huán)的特征吸收(1614cm—1,1515cm—1,1458cm—1)，苯環(huán)CH面外彎曲振動 (1274cm—1,1160cm—、 816cm—1) ， C-O-C伸縮振動(1115cm—1)。狹葉虎皮楠Daphniphyllum angustifolium Hutch.為虎皮楠科
3D即hniphyllaceae植物，該科植物在傳統(tǒng)中藥中主要有愈合和消炎的作用，可以用來治療 哮喘、風濕、發(fā)熱、流行性感冒，蛇咬傷等，在現代的臨床運用中可以有治療腸胃炎、促進消 化、治療濕疹等作用，但同時也是一種毒藥，所以對它化學成分的研究具有重要意義。狹葉 虎皮楠常綠小喬木，主要分布在湖北和四川等地；生于海拔1600 2300m的闊葉林中，習 見速生樹種，花期4月，果期10 11月。 目前還沒有從狹葉虎皮楠中提取雙黃酮A和雙黃酮B的報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種工藝簡潔、收率高的從虎皮楠中分離提取兩 種雙黃酮的方法。 為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種從虎皮楠中分離提取兩種雙黃酮的方 法，包括 1)、將狹葉虎皮楠莖粉碎后，用乙醇回流提?。凰锰崛∫航浾婵粘闉V和減壓濃 縮，得浸膏； 2)、將浸膏分散于水中，得懸浮液；再將懸浮液用等體積的石油醚萃取，得石油醚 萃取液和萃取后水相； 3)、所述萃取后水相用等體積的乙酸乙酯萃取，分層后得上層有機相和下層水 相； 將上層有機相過濾，得乙酸乙酯萃取液；再將乙酸乙酯萃取液在減壓真空條件下 旋轉蒸發(fā)濃縮，得到乙酸乙酯相浸膏； 4)、以石油醚與乙酸乙酯分別按i : o、io : iuo : 3、2 : i的體積比所得的混合
液作為洗脫劑，依次對乙酸乙酯相浸膏進行梯度洗脫，分別對應獲得洗脫液1、洗脫液II、
洗脫液III和洗脫液IV; 以石油醚和乙酸乙酯分別按3 : 2、i : i的體積比所得的混合液作為洗脫劑，依
次對上述洗脫液IV進行梯度洗脫，分別對應獲得洗脫液IV-1和洗脫液IV-2 ; 5)、將洗脫液IV-2減壓旋轉蒸發(fā)溶劑，得淡黃色粉末狀固體；再將上述淡黃色粉
末狀固體用制備型HPLC進一步分離純化，得雙黃酮A和雙黃酮B。 作為本發(fā)明的從虎皮楠中分離提取兩種雙黃酮的方法的改進，步驟5)的分離純 化的條件如下 JAI LC-9103制備型液相，JAIGEL 0DS-BP-30， 30. 0 X 250mm液相柱，流動相梯度條 件為在第0-5min，甲醇-水體積比為20 : 80 ;在第6-10min，甲醇-水體積比為50 : 50 ; 第11-30min，甲醇-水體積比為70 : 30 ;流速:10mL/min ;在12. 5和17分鐘的出峰時間， 分別得雙黃酮A和雙黃酮B。 作為本發(fā)明的從虎皮楠中分離提取兩種雙黃酮的方法的進一步改進步驟2)中， 浸膏與水的質量/體積比為lg/2 3ml ;步驟l)中，狹葉虎皮楠莖與乙醇的質量/體積比 為lg/2 3ml。 作為本發(fā)明的從虎皮楠中分離提取兩種雙黃酮的方法的進一步改進，步驟1)中 用乙醇回流提取至少2次，合并每次提取所得的提取液，經真空抽濾和減壓濃縮，得浸膏。
在本發(fā)明中，狹葉虎皮楠莖可以通過市購的方式獲得，例如可從重慶市藥物種植研究所購得。 在本發(fā)明的制備方法中，步驟2)所得的石油醚萃取液在減壓條件下旋轉蒸發(fā)濃 縮，可得石油醚相浸膏。 步驟3)所得的下層水相用等體積的正丁醇萃取，得正丁醇萃取液；再將正丁醇萃 取液在減壓條件下旋轉蒸發(fā)濃縮，可得到正丁醇相浸膏。 利用本發(fā)明的方法從虎皮楠中分離提取雙黃酮A和雙黃酮B，具有以下優(yōu)點
1、只需要經過硅膠柱就能獲得雙黃酮A和雙黃酮B的混合成分。
2、經過一次制備液相分離，就能很好的將雙黃酮A和雙黃酮B分開，并且使所得雙 黃酮A和雙黃酮B的純度達到96%以上。


下面結合附圖對本發(fā)明的具體實施方式
作進一步詳細說明。
圖1是本發(fā)明的從虎皮楠中提取兩種雙黃酮的方法的工藝流程圖； 圖2是雙黃酮A和雙黃酮B的制備型HPLC分離譜圖(JAI LC_9103，
JAIGEL0DS-BP-30，30. 0X250mm柱，甲醇-水70 : 30，流速10mL/min檢測波長280nm);圖3是雙黃酮A的MS譜圖；圖4是雙黃酮A的IR譜圖；圖5是雙黃酮A的^-NMR譜圖；圖6是雙黃酮A的13C-NMR譜圖；圖7是雙黃酮A的DEPT 135譜圖；圖8是雙黃酮A的力」H COSY譜圖；圖9是雙黃酮A的HSQC譜圖；圖IO是雙黃酮A的HMBC譜圖；圖ll是雙黃酮B的MS譜圖；圖12是雙黃酮B的IR譜圖；圖13是雙黃酮B的^-NMR譜圖；圖14是雙黃酮B的13C-NMR譜圖；圖15是雙黃酮B的DEPT 135譜圖；圖16是雙黃酮B的力」H COSY譜17是雙黃酮B的HSQC譜圖；圖18是雙黃酮B的HMBC譜圖。
具體實施例方式
實施例1、一種從虎皮楠中提取兩種雙黃酮的方法，依次進行以下步驟 1)、將狹葉虎皮楠莖10kg粉碎后，用乙醇回流提取3次(20LX3);合并3次提取
所得的提取液，經真空抽濾和旋轉蒸發(fā)儀減壓(50Pa)濃縮，得浸膏750g。 2)、取750g浸膏分散于1. 5L水中，使浸膏成懸浮狀，得懸浮液； 再將懸浮液用等體積的石油醚萃取，所得萃取液分層后，得石油醚萃取液(位于
上層)和萃取后水相(位于下層)；
石油醚萃取共3次(石油醚每次的用量均相等)，得經過3次萃取處理后的萃取后 水相，合并3次所得的石油醚萃取液。 3)、將步驟2)所得的石油醚萃取液(3次合并所得)在減壓(50Pa)條件下旋轉蒸 發(fā)濃縮，得石油醚相浸膏80g; 4)、將步驟2)最終所得的萃取后水相(即經過3次萃取處理后的萃取后水相)用 等體積的乙酸乙酯萃取(3次)，所得萃取液分層后得上層有機相和下層水相。
合并3次所得的上層有機相。 將所得的上層有機相(合并3次所得)過濾，得乙酸乙酯萃取液；再將乙酸乙酯萃 取液在減壓(50Pa)真空條件下旋轉蒸發(fā)濃縮，得到乙酸乙酯相浸膏156g。
將所得的下層水相(即經過3次乙酸乙酯萃取處理后的下層水相)用等體積的正 丁醇萃取(3次)，所得萃取液分層后取上層有機相，過濾，得正丁醇萃取液。將正丁醇萃取 液在減壓(20Pa)條件下旋轉蒸發(fā)濃縮，得到正丁醇相浸膏325g。 5)、先將156g的乙酸乙酯相浸膏和150g 100 200目硅膠相拌，干法上樣，選用 5L體積的硅膠柱進行分離； 然后分別以石油醚與乙酸乙酯分別按i : o，io : i，io : 3，2 : i的體積比所得
的混合液各10000ml作為洗脫劑，以10ml/min的流速依次對上述灌有乙酸乙酯相浸膏的硅
膠柱進行梯度洗脫，分別對應的獲得洗脫液1、洗脫液n、洗脫液III和洗脫液IV ; 將洗脫液IV在減壓(50Pa)條件下旋轉蒸發(fā)濃縮，得到洗脫液IV濃縮組分6g。
6)、將上述洗脫液IV濃縮組分6g進行TLC分析并選用合適的溶劑系統(tǒng)，經硅膠柱 色譜分離，具體如下 ①、將洗脫液IV濃縮組分6g溶解在石油醚與乙酸乙酯按3 : 2體積比混合的流 動相10ml中，用800ml體積的硅膠柱進行分離； ②、分別以石油醚乙酸乙酯(體積比)=3 : 2， i : i的洗脫劑各ieoomi，以
5ml/min的流速對上述硅膠柱進行梯度洗脫；對應的分別得到洗脫液IV-1和洗脫液IV-2。 7)、將洗脫液IV-2減壓(50Pa)旋轉蒸發(fā)溶劑，得淡黃色粉末狀固體50mg ;再將該
50mg淡黃色粉末狀固體用制備型HPLC進一步分離純化，具體如下①、選用JAI LC-9103制備型液相，JAIGEL 0DS-BP-30， 30. 0 X 250mm液相柱； ②、將50mg淡黃色粉末狀固體溶解在2ml的甲醇中， 一次性灌注；③、流動相條件為在第0-5min，甲醇-水體積比為20 : 80 ;在第6-10min，甲
醇_水體積比為50 : 50 ;第11-30min，甲醇-水體積比為70 : 30 ;流速10mL/min。
、在12. 5和17分鐘的出峰時間，分別得雙黃酮A和雙黃酮B18mg和22mg，經測
定該雙黃酮A和B的純度為96%以上。 該雙黃酮A的各項檢測結果如圖3 圖IO所示。通過圖3 圖IO給出的結論， 證明所得物確為雙黃酮A。 該雙黃酮B的各項檢測結果如圖11 圖18所示。通過圖11 圖18給出的結論， 證明所得物確為雙黃酮B。 對比實施例1、步驟1) 步驟6)的內容同實施例1 ;僅將步驟7)中的流動相條件 改為以甲醇_水90 : 10 (體積比)為流動相，流速10mL/min ;結果為雙黃酮A和雙黃 酮B這兩種化合物在制備液相上重疊無法分開。
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對比實施例2、步驟1) 步驟6)的內容同實施例l ;僅將步驟7)中的流動相條件 改為以甲醇_水70 : 30 (體積比)為流動相，流速10mL/min ;結果為雙黃酮A和雙黃 酮B這兩種化合物在制備液相上重疊無法分開。 最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā) 明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發(fā)明公開的內容 直接導出或聯(lián)想到的所有變形，均應認為是本發(fā)明的保護范圍。
權利要求
從虎皮楠中分離提取兩種雙黃酮的方法，其特征是包括以下步驟1)、將狹葉虎皮楠莖粉碎后，用乙醇回流提取；所得提取液經真空抽濾和減壓濃縮，得浸膏；2)、將浸膏分散于水中，得懸浮液；再將懸浮液用等體積的石油醚萃取，得石油醚萃取液和萃取后水相；3)、所述萃取后水相用等體積的乙酸乙酯萃取，分層后得上層有機相和下層水相；將上層有機相過濾，得乙酸乙酯萃取液；再將乙酸乙酯萃取液在減壓真空條件下旋轉蒸發(fā)濃縮，得到乙酸乙酯相浸膏；4)、以石油醚與乙酸乙酯分別按1∶0、10∶1、10∶3、2∶1的體積比所得的混合液作為洗脫劑，依次對乙酸乙酯相浸膏進行梯度洗脫，分別對應獲得洗脫液I、洗脫液II、洗脫液III和洗脫液IV；以石油醚和乙酸乙酯分別按3∶2、1∶1的體積比所得的混合液作為洗脫劑，依次對上述洗脫液IV進行梯度洗脫，分別對應獲得洗脫液IV-1和洗脫液IV-2；5)、將洗脫液IV-2減壓旋轉蒸發(fā)溶劑，得淡黃色粉末狀固體；再將上述淡黃色粉末狀固體用制備型HPLC進一步分離純化，得雙黃酮A和雙黃酮B。
2. 根據權利要求1所述的從虎皮楠中分離提取兩種雙黃酮的方法，其特征是所述步 驟5)的分離純化的條件如下JAI LC-9103制備型液相，JAIGEL 0DS-BP-30， 30. 0 X 250mm液相柱，流動相梯度條件 為在第0-5min，甲醇-水體積比為20 : 80 ;在第6-10min，甲醇-水體積比為50 : 50; 第11-30min，甲醇-水體積比為70 : 30 ;流速:10mL/min ;在12. 5和17分鐘的出峰時間， 分別得雙黃酮A和雙黃酮B。
3. 根據權利要求1或2所述的從虎皮楠中分離提取兩種雙黃酮的方法，其特征是所 述步驟2)中，浸膏與水的質量/體積比為lg/2 3ml。
4. 根據權利要求3所述的從虎皮楠中分離提取兩種雙黃酮的方法，其特征是所述步 驟l)中，狹葉虎皮楠莖與乙醇的質量/體積比為lg/2 3ml。
5. 根據權利要求4所述的從虎皮楠中分離提取兩種雙黃酮的方法，其特征是所述步 驟1)中用乙醇回流提取至少2次，合并每次提取所得的提取液經真空抽濾和減壓濃縮，得 浸膏。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從虎皮楠中分離提取兩種雙黃酮的方法，包括以下步驟1)將狹葉虎皮楠莖粉碎后，用乙醇回流提??；2)將提取液制成的浸膏分散于水中，再將所得懸浮液用石油醚萃?。?)所得萃取后水相用乙酸乙酯萃取，分層后得上層有機相和下層水相；將上層有機相過濾、濃縮，得乙酸乙酯相浸膏；4)以石油醚與乙酸乙酯的混合物作為洗脫劑，對乙酸乙酯相浸膏進行梯度洗脫，得洗脫液IV；以石油醚和乙酸乙酯的混合物作為洗脫劑，對洗脫液IV進行梯度洗脫，得洗脫液IV-2；5)將洗脫液IV-2減壓旋轉蒸發(fā)溶劑，再將所得的淡黃色粉末狀固體用制備型HPLC進一步分離純化，得雙黃酮A和雙黃酮B。
文檔編號C07D493/00GK101723953SQ20091015522
公開日2010年6月9日 申請日期2009年12月8日 優(yōu)先權日2009年12月8日
發(fā)明者沈蓮清, 王奎武, 許明峰 申請人:浙江工商大學