專利名稱：大分子膠原蛋白的精制工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白精制工藝，特別是一種大分子膠原蛋白的精制工藝。
技術(shù)背景膠原蛋白是一類在醫(yī)用外科、美容充填、護(hù)膚品等行業(yè)廣泛應(yīng)用的原材 料。目前我國(guó)膠原蛋白生產(chǎn)主以豬、牛等的皮、腱等為原料經(jīng)過(guò)提取工藝得 到大分子膠原蛋白粗品。大分子膠原蛋白粗品需要經(jīng)過(guò)精制才能在醫(yī)用外科、 美容充填、護(hù)膚品等行業(yè)應(yīng)用。傳統(tǒng)大分子膠原蛋白的精制過(guò)程為在膠原蛋白粗提液中首先加入Tris至0.01-1.0 mol/L，再加入氯化鈉至1.5 - 3.5 mol/L，鹽析并在低溫或4"C冰箱放置2-48h，后1000-20000rpm冷凍離心機(jī) 離心10-100min，得膠原蛋白沉淀；將沉淀溶解在0. 1- 10mol/L的醋酸中， 重新鹽析1-5次，用0.001- 0.1 mol/L醋酸透析10-100h，再用蒸餾水透析 10-100h，冷凍干燥得到大分子膠原蛋白。傳統(tǒng)精制工藝中，首先加入Tris，再加入氯化鈉，緩慢攪拌溶解、需要 消耗大量的Tris和分析純氯化鈉，Tris的價(jià)格昂貴，大大增加了精制成本，制 約了大分子膠原蛋白的工業(yè)提取過(guò)程。傳統(tǒng)精制工藝中，鹽析后需要低溫冷凍離心的方法得到膠原蛋白沉淀， 設(shè)備復(fù)雜，能耗高。傳統(tǒng)精制工藝中，透析過(guò)程采用兩步法，先用稀酸溶液，再用蒸餾水的方法，大分子膠原蛋白透析的過(guò)程復(fù)雜，工藝操作難度高。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種工藝簡(jiǎn)單、 可操作性強(qiáng)、成本低的大分子膠原蛋白的精制工藝。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下的技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明是 一種大分子膠原蛋白的精制工藝，其特征在于，其步驟如下(1) 向大分子膠原蛋白粗品中加入0。C一30。C的酸性溶液進(jìn)行溶解，得溶解液，大分子膠原蛋白粗品與酸性溶液的重量體積比為1: 5-50;或者直接取(TC —3(TC的大分子膠原蛋白酸性提取液作原料，向溶解液或酸性 提取液中加入0°C —30。C、濃度為0.01- 2.0mol/L的Na0H溶液，將 其pH值調(diào)節(jié)到5-12，得膠原蛋白溶液；將膠原蛋白溶液在(TC 一30'C 靜置2-48小時(shí)后，取出膠原蛋白溶液上部凝聚的膠原蛋白懸浮層；(2) 將膠原蛋白懸浮層溶解于0。C一3(TC的酸性溶液中，膠原蛋白懸浮層與 酸性溶液的重量體積比為1: 5-50，然后按步驟(1)所述的方法調(diào)節(jié) pH值、靜置，得膠原蛋白懸浮層；(3) 取膠原蛋白懸浮層用0.05—10mol/L的醋酸溶液溶解，膠原蛋白懸浮層 與醋酸溶液的重量體積比為1: 5-50，然后用蒸餾水直接透析，透析后 將得到的膠原蛋白懸浮液冷凍干燥，得精制大分子膠原蛋白；所述的酸性溶液為醋酸、檸檬酸或鹽酸溶液。 以上所述的大分子膠原蛋白的精制工藝中1、 可以重復(fù)步驟(2) 1-5次，得膠原蛋白懸浮層；2、 在步驟(1)中向大分子膠原蛋白粗品中加的酸性溶液的溫度優(yōu)選為0°C—10°C;大分子膠原蛋白粗品與酸性溶液的重量體積比優(yōu)選為1: 5-20; 或者直接取0°C —1(TC的大分子膠原蛋白酸性提取液作原料；
3、 在步驟(1)中向溶解液或酸性提取液中加入的NaOH溶液的溫度優(yōu) 選為(TC —10°C、濃度優(yōu)選為0.5- 1.0mol/L，優(yōu)選將其pH值調(diào)節(jié)到7-11。
4、 在步驟(1)中靜置時(shí)優(yōu)選將膠原蛋白溶液置于0°C —l(TC中，靜 置時(shí)間優(yōu)選為10-36小時(shí)；
5、 在步驟(2)中溶解膠原蛋白懸浮層的酸性溶液優(yōu)選為0'C—1(TC， 膠原蛋白懸浮層與酸性溶液的重量體積比優(yōu)選為1: 5-20。
6、 在步驟(3)中溶解膠原蛋白懸浮層的醋酸溶液的濃度優(yōu)選為0.1 —5mol/L，膠原蛋白懸浮層與醋酸溶液的重量體積比優(yōu)選為l: 5-20。
7、 本發(fā)明工藝適用于對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中所公開的任何一種酸法提取制得的大 分子膠原蛋白粗品進(jìn)行精制，也適用于對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中公開的任何一種酸法提 取制得的大分子膠原蛋白酸性提取液進(jìn)行精制。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明工藝具有以下優(yōu)點(diǎn)
1、 本發(fā)明精制工藝直接在酸性膠原蛋白溶液中加入NaOH溶液調(diào)酸度， 從而節(jié)省了添加大量Tris、 NaCl,使提取費(fèi)用大大降低；
2、 本發(fā)明精制工藝中省去了鹽析后膠原蛋白的冷凍離心過(guò)程，簡(jiǎn)化了工 藝過(guò)程，降低了能耗；
3、 本發(fā)明精制工藝的透析工藝采用直接蒸餾水透析工藝，使透析費(fèi)用和 時(shí)間大大縮短；
4、本發(fā)明精制工藝的成本降低一倍以上，既降低了工藝的操作難度， 又節(jié)約了生產(chǎn)成本，提取得到的膠原蛋白分子量不小于10萬(wàn)道爾頓，其純與傳統(tǒng)精制工藝制得的膠原蛋白基本無(wú)異。


圖1為采用本發(fā)明方法制得的大分子膠原蛋白的電泳圖，圖中 1:用Tris、 NaCl傳統(tǒng)方法鹽析精制得到的膠原蛋白； 2:用本發(fā)明方法制到的膠原蛋白。
具體實(shí)施例方式
以下進(jìn)一步描述本發(fā)明的具體技術(shù)方案，以便于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一 步地理解本發(fā)明，而不構(gòu)成對(duì)其權(quán)利的限制。
實(shí)施例l。 一種大分子膠原蛋白的精制工藝，其步驟如下-
(1) 向大分子膠原蛋白粗品中加入ot:的酸性溶液進(jìn)行溶解，得溶解液，大
分子膠原蛋白粗品與酸性溶液的重量體積比為1: 5;向溶解液中加入O
°C、濃度為0. Olmol/L的NaOH溶液，將其pH值調(diào)節(jié)到5，得膠原蛋白 溶液；將膠原蛋白溶液在0。C靜置2小時(shí)后，取出膠原蛋白溶液上部凝 聚的膠原蛋白懸浮層；
(2) 將膠原蛋白懸浮層溶解于or;的酸性溶液中，膠原蛋白懸浮層與酸性溶
液的重量體積比為1: 5，然后按步驟(1)所述的方法調(diào)節(jié)pH值、靜置， 得膠原蛋白懸浮層；
(3) 取膠原蛋白懸浮層用0.05mol/L的醋酸溶液溶解，膠原蛋白懸浮層與醋 酸溶液的重量體積比為1: 5，然后用蒸餾水直接透析，透析后將得到的 膠原蛋白懸浮液冷凍干燥，得精制大分子膠原蛋白；
所述的酸性溶液為醋酸溶液。
實(shí)施例2。 一種大分子膠原蛋白的精制工藝，其步驟如下(1) 向大分子膠原蛋白粗品中加入3(TC的酸性溶液進(jìn)行溶解，得溶解液，大
分子膠原蛋白粗品與酸性溶液的重量體積比為l:50;向溶解液中加入
3CTC、濃度為2. 0mol/L的NaOH溶液，將其pH值調(diào)節(jié)到12，得膠原蛋 白溶液；將膠原蛋白溶液在3(TC靜置48小時(shí)后，取出膠原蛋白溶液上 部凝聚的膠原蛋白懸浮層；
(2) 將膠原蛋白懸浮層溶解于3(TC的酸性溶液中，膠原蛋白懸浮層與酸性溶 液的重量體積比為1: 50，然后按步驟(1)所述的方法調(diào)節(jié)pH值、靜 置，得膠原蛋白懸浮層；
(3) 取膠原蛋白懸浮層用10mol/L的醋酸溶液溶解，膠原蛋白懸浮層與醋酸 溶液的重量體積比為1: 50，然后用蒸餾水直接透析，透析后將得到的 膠原蛋白懸浮液冷凍干燥，得精制大分子膠原蛋白；
所述的酸性溶液為檸檬酸溶液。
實(shí)施例3。參照?qǐng)Dl。 一種大分子膠原蛋白的精制工藝，其步驟如下
(1) 向大分子膠原蛋白粗品中加入4'C的酸性溶液進(jìn)行溶解，得溶解液，大 分子膠原蛋白粗品與酸性溶液的重量體積比為1: 20;或者直接取4°C 的大分子膠原蛋白酸性提取液作原料，向溶解液或酸性提取液中加入4 °C、濃度為0. 5mol/L的Na0H溶液，將其pH值調(diào)節(jié)到7，得膠原蛋白 溶液；將膠原蛋白溶液在4'C靜置24小時(shí)后，取出膠原蛋白溶液上部凝 聚的膠原蛋白懸浮層；
(2) 將膠原蛋白懸浮層溶解于4°。的酸性溶液中，膠原蛋白懸浮層與酸性溶 液的重量體積比為l: 20，然后按步驟(1)所述的方法調(diào)節(jié)pH值、靜 置，得膠原蛋白懸浮層；(3)取膠原蛋白懸浮層用0.05—10mol/L的醋酸溶液溶解，膠原蛋白懸浮層 與醋酸溶液的重量體積比為1: 40，然后用蒸餾水直接透析，透析后將 得到的膠原蛋白懸浮液冷凍干燥，得精制大分子膠原蛋白； 所述的酸性溶液為鹽酸溶液。
采用SDS-PAGE電泳檢測(cè)方法對(duì)上述方法制得大分子膠原蛋白進(jìn)行檢 觀jj, 具體過(guò)禾呈參考文獻(xiàn)Laemmli，U.K.(1970).Cleavage of structural proteins during assembly head of bacteriophage T4. Atowe， 277,680- 685，同時(shí)對(duì)用Tris、 NaCl傳統(tǒng)方法鹽析精制得到的膠原蛋白進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果參見圖1。 從圖l中可以看出，二者從電泳圖上看，純度差異不明顯。 實(shí)施例4。 一種大分子膠原蛋白的精制工藝，其步驟如下
(1) 向大分子膠原蛋白粗品中加入10"C的酸性溶液進(jìn)行溶解，得溶解液，大
分子膠原蛋白粗品與酸性溶液的重量體積比為1: 10;或者直接取1(TC
的大分子膠原蛋白酸性提取液作原料，向溶解液或酸性提取液中加入10 °C、濃度為1. Omol/L的NaOH溶液，將其pH值調(diào)節(jié)到9，得膠原蛋白 溶液；將膠原蛋白溶液在1(TC靜置12小時(shí)后，取出膠原蛋白溶液上部 凝聚的膠原蛋白懸浮層；
(2) 將膠原蛋白懸浮層溶解于l(TC的酸性溶液中，膠原蛋白懸浮層與酸性溶 液的重量體積比為l: 10，然后按步驟(1)所述的方法調(diào)節(jié)pH值、靜 置，得膠原蛋白懸浮層；
(3) 取膠原蛋白懸浮層用2mol/L的醋酸溶液溶解，膠原蛋白懸浮層與醋酸 溶液的重量體積比為1: 10，然后用蒸餾水直接透析，透析后將得到的 膠原蛋白懸浮液冷凍干燥，得精制大分子膠原蛋白；所述的酸性溶液為醋酸溶液。
實(shí)施例5。
一種大分子膠原蛋白的精制工藝，其步驟如下
(1) 向大分子膠原蛋白粗品中加入8'C的酸性溶液進(jìn)行溶解，得溶解液，大 分子膠原蛋白粗品與酸性溶液的重量體積比為1: 12;或者直接取8'C 的大分子膠原蛋白酸性提取液作原料，向溶解液或酸性提取液中加入8
°C、濃度為0. 8mol/L的NaOH溶液，將其pH值調(diào)節(jié)到6，得膠原蛋白 溶液；將膠原蛋白溶液在8'C靜置5小時(shí)后，取出膠原蛋白溶液上部凝 聚的膠原蛋白懸浮層；
(2) 將膠原蛋白懸浮層溶解于8'C的酸性溶液中，膠原蛋白懸浮層與酸性溶 液的重量體積比為1: 30，然后按步驟(1)所述的方法調(diào)節(jié)pH值、靜 置，得膠原蛋白懸浮層；再重復(fù)上述步驟l次，得膠原蛋白懸浮層；
(3) 取膠原蛋白懸浮層用8mol/L的醋酸溶液溶解，膠原蛋白懸浮層與醋酸 溶液的重量體積比為1: 30，然后用蒸餾水直接透析，透析后將得到的 膠原蛋白懸浮液冷凍干燥，得精制大分子膠原蛋白； 所述的酸性溶液為檸檬酸溶液。
實(shí)施例6。 一種大分子膠原蛋白的精制工藝，其步驟如下
(1)向大分子膠原蛋白粗品中加入2t:的酸性溶液進(jìn)行溶解，得溶解液，大
分子膠原蛋白粗品與酸性溶液的重量體積比為1: 18;或者直接取6°C 的大分子膠原蛋白酸性提取液作原料，向溶解液或酸性提取液中加入6 °C、濃度為1.5mol/L的Na0H溶液，將其pH值調(diào)節(jié)到ll,得膠原蛋白 溶液；將膠原蛋白溶液在6'C靜置15小時(shí)后，取出膠原蛋白溶液上部凝 聚的膠原蛋白懸浮層；(2) 將膠原蛋白懸浮層溶解于6t:的酸性溶液中，膠原蛋白懸浮層與酸性溶
液的重量體積比為l: 35，然后按步驟(1)所述的方法調(diào)節(jié)pH值、靜 置，得膠原蛋白懸浮層；再重復(fù)上述步驟5次，得膠原蛋白懸浮層；
(3) 取膠原蛋白懸浮層用1.5mol/L的醋酸溶液溶解，膠原蛋白懸浮層與醋
酸溶液的重量體積比為1: 16，然后用蒸餾水直接透析，透析后將得到 的膠原蛋白懸浮液冷凍干燥，得精制大分子膠原蛋白； 所述的酸性溶液鹽酸溶液。
實(shí)施例7。
一種大分子膠原蛋白的精制工藝，其步驟如下
(1) 向大分子膠原蛋白粗品中加入5'C的酸性溶液進(jìn)行溶解，得溶解液，大
分子膠原蛋白粗品與酸性溶液的重量體積比為1: 22;或者直接取5°C
的大分子膠原蛋白酸性提取液作原料，向溶解液或酸性提取液中加入5 °C、濃度為1.2mol/L的Na0H溶液，將其pH值調(diào)節(jié)到10，得膠原蛋白 溶液；將膠原蛋白溶液在5。C靜置36小時(shí)后，取出膠原蛋白溶液上部凝 聚的膠原蛋白懸浮層；
(2) 將膠原蛋白懸浮層溶解于5"C的酸性溶液中，膠原蛋白懸浮層與酸性溶 液的重量體積比為1: 45，然后按步驟(1)所述的方法調(diào)節(jié)pH值、靜 置，得膠原蛋白懸浮層；再重復(fù)上述步驟3次，得膠原蛋白懸浮層；
(3) 取膠原蛋白懸浮層用3mol/L的醋酸溶液溶解，膠原蛋白懸浮層與醋酸 溶液的重量體積比為1: 10，然后用蒸餾水直接透析，透析后將得到的 膠原蛋白懸浮液冷凍干燥，得精制大分子膠原蛋白；
所述的酸性溶液為檸檬酸溶液。
權(quán)利要求
1、一種大分子膠原蛋白的精制工藝，其特征在于，其步驟如下(1)向大分子膠原蛋白粗品中加入0℃-30℃的酸性溶液進(jìn)行溶解，得溶解液，大分子膠原蛋白粗品與酸性溶液的重量體積比為1∶5-50；或者直接取0℃-30℃的大分子膠原蛋白酸性提取液作原料，向溶解液或酸性提取液中加入0℃-30℃、濃度為0.01-2.0mol/L的NaOH溶液，將其pH值調(diào)節(jié)到5-12，得膠原蛋白溶液；將膠原蛋白溶液在0℃-30℃靜置2-48小時(shí)后，取出膠原蛋白溶液上部凝聚的膠原蛋白懸浮層；(2)將膠原蛋白懸浮層溶解于0℃-30℃的酸性溶液中，膠原蛋白懸浮層與酸性溶液的重量體積比為1∶5-50，然后按步驟(1)所述的方法調(diào)節(jié)pH值、靜置，得膠原蛋白懸浮層；(3)取膠原蛋白懸浮層用0.05-10mol/L的醋酸溶液溶解，膠原蛋白懸浮層與醋酸溶液的重量體積比為1∶5-50，然后用蒸餾水直接透析，透析后將得到的膠原蛋白懸浮液冷凍干燥，得精制大分子膠原蛋白；所述的酸性溶液為醋酸、檸檬酸或鹽酸溶液。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的大分子膠原蛋白的精制工藝，其特征在于，重復(fù) 步驟(2) 1-5次，得膠原蛋白懸浮層。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的大分子膠原蛋白的精制工藝，其特征在于，.在步驟(i)中向大分子膠原蛋白粗品中加的酸性溶液的溫度為or;—l(TC;大分子膠原蛋白粗品與酸性溶液的重量體積比為1: 5-20;或者直接取(TC —l(TC的大分子膠原蛋白酸性提取液作原料。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的大分子膠原蛋白的精制工藝，其特征在于， 在步驟(1)中向溶解液或酸性提取液中加入的NaOH溶液的溫度為0 °C —10°C、濃度為O. 5- L0mol/L，將其pH值調(diào)節(jié)到7-11。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的大分子膠原蛋白的精制工藝，其特征在于， 在步驟(1)中靜置時(shí)將膠原蛋白溶液置于0°C —1(TC中，靜置時(shí)間 為10-36小時(shí)。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的大分子膠原蛋白的精制工藝，其特征在于，在步驟(2)中溶解膠原蛋白懸浮層的酸性溶液為ot:—l(TC，膠原蛋白懸浮層與酸性溶液的重量體積比為l: 5-20。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的大分子膠原蛋白的精制工藝，其特征在于， 在步驟(3)中溶解膠原蛋白懸浮層的醋酸溶液的濃度為0. l—5mol/L， 膠原蛋白懸浮層與醋酸溶液的重量體積比為1: 5-20。
全文摘要
一種大分子膠原蛋白的精制工藝，其特征在于，向大分子膠原蛋白粗品中加酸性溶液進(jìn)行溶解；或者直接取大分子膠原蛋白酸性提取液作原料，向溶解液或酸性提取液中加入NaOH溶液，調(diào)pH值節(jié)，靜置后取出膠原蛋白懸浮層；將膠原蛋白懸浮層用醋酸溶液溶解后直接透析，冷凍干燥即得。本發(fā)明精制工藝直接在酸性膠原蛋白溶液中加入NaOH溶液調(diào)酸度，從而節(jié)省了添加大量Tris、NaCl，使提取費(fèi)用大大降低；省去了鹽析后膠原蛋白的冷凍離心過(guò)程，簡(jiǎn)化了工藝過(guò)程，降低了能耗；直接蒸餾水透析工藝，使透析費(fèi)用和時(shí)間大大縮短；成本降低一倍以上，既降低了工藝的操作難度，又節(jié)約了生產(chǎn)成本，提取得到的膠原蛋白分子量不小于10萬(wàn)道爾頓。
文檔編號(hào)C07K14/435GK101628937SQ20091018448
公開日2010年1月20日 申請(qǐng)日期2009年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月12日
發(fā)明者今野·久仁彥, 張俊杰, 蕊 段 申請(qǐng)人:江蘇省海洋資源開發(fā)研究院