專利名稱：：一種藍(lán)藻病毒蛋白n突變體、其修飾衍生物及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種藍(lán)藻病毒蛋白N(CVN)突變體、其PEG修飾衍生物和它們在制藥中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：藍(lán)藻抗病毒蛋白N(Cyanovirin-N，CVN)是美國科學(xué)家BOYD等人從藍(lán)藻可提取的一種具有抗HIV活性的蛋白。CVN能特異地、高親合性地結(jié)合在人免疫缺陷病毒HIV-1的衣殼蛋白gpl20上從而發(fā)揮抗病毒活性，這一特點使它可以不受病毒變異的干擾，同時它還具有抗病毒譜廣，性質(zhì)穩(wěn)定等特點，這使得CVN蛋白成為一種很有價值的抗病毒藥物[BOYDMR，GUSTAFSONKR,MCMAHONJB,etal.Discoveryofcyanovirin-N，anovelhumanimmunodeficiencyvirus-inactivatingproteinthatbindsviralsurfaceenvelopeglycoproteingpl20:Potentialapplicationstomicrobicidedevelopment[J].AntimicrobialAgentsandChemotherapy,1997,41(7):1521-30.]。但因為該蛋白分子量較小，且分子中有二個二硫鍵，使得該蛋白在大腸桿菌中表達(dá)困難，產(chǎn)量低。同時作為一種原核生物來源的小分子蛋白類藥物，它存在半衰期短、細(xì)胞毒性及引起免疫應(yīng)答等缺點。聚乙二醇(PEG)是一種無毒、無免疫原性的水溶性高分子物質(zhì)，可以通過共價結(jié)合方式修飾蛋白質(zhì)，聚乙二醇修飾是用來解決或緩解蛋白和多肽在藥用過程中存在的穩(wěn)定性差，半衰期短等問題的有效途徑(IANGZY,XUSW,WANGYQ.Chemistryforpegylationofproteinandpeptidemolecules[J].ChineseJournalofOrganicChemistry,2003,23(12):1340-7.)利用PEG-馬來酰亞胺在酸性條件下修飾CVN已有文獻(xiàn)報道，Zappe等人選擇了62位谷氨酰胺被半光氨酸替代的突變體(CVN(Q62C))用mPEG-馬來酰亞胺(mPEG-MAL)在中性PH條件下對其進(jìn)行修飾，在有效改善了其成藥性(ZAPPEH,SNELLME,BOSSARDMJ.PEGylationofcyanovirin-N,anentryinhibitorofHIV[J].AdvancedDrugDeliveryReviews,2008,60(1):79-87.)。Zappe等人具體的修飾策略是選擇62和14位谷氨酰胺被半光氨酸替代的突變體分子量分別為20KD和30KD的mPEG-馬來酰亞胺(mPEG-MAL)在中性PH和偏堿性PH條件下對其進(jìn)行修飾，結(jié)果14位谷氨酰胺被半光氨酸替代的突變體(CVN(Q14C))的修飾效率非常底，而62位谷氨酰胺被半光氨酸替代的突變體(CVN(Q62C))在中性PH、CVN突變體與mPEG-MAL摩爾比為1:3的條件下修飾率較高。但是CVN(Q62C)抗HIV的活性較未突變的CVN要低，并且由于選擇的修飾位點是在CVN的內(nèi)部，所以經(jīng)過mPEG-馬來酰亞胺30KDa(mPEG-MAL-30KDa)修飾的體變體抗HIV的活性幾乎喪失。
發(fā)明內(nèi)容針對現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點和不足之處，本發(fā)明的目的首先是提供一種CVN突變體，其更容易在宿主中表達(dá)，更易于純化，并且有利于進(jìn)一步的修飾。本發(fā)明的另一目的是提供上述CVN突變體的修飾衍生物，以降低蛋白本身的細(xì)胞毒性和免疫原性，使其更適于應(yīng)用。本發(fā)明的再一目的則是將上述突變體和修飾衍生物用于制備預(yù)防和/或治療艾滋病的藥物。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案一種藍(lán)藻病毒蛋白N突變體，其氨基酸序列由序列A和序列B組成，序列A位于序列B的N端，序列A如下述之一a.序列表中的SEQIDNO:1;b.將序列表中的SEQIDNO:1的氨基酸殘基序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸，其具有親水柔性的特點；序列B如下述之一c.序列表中的SEQIDNO:2;d.將序列表中的SEQIDNO:2的氨基酸殘基序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸，但不改變其N端的前三個殘基，且其具有特異性地抗HIV病毒活性；本發(fā)明還提供了藍(lán)藻病毒蛋白N突變體的編碼核苷酸序列。優(yōu)選地，上述編碼核苷酸序列包括下述序列之一e.序列表中的SEQIDNO:3;f.在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQIDNO:3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。這里的高嚴(yán)謹(jǐn)條件是指，低鹽高溫的雜交條件，如0.1XSSC，0.1。/。SDS和65。C溫度。上述核苷酸序列主要可用于在宿主中表達(dá)目標(biāo)蛋白，含有上述核苷酸序列的表達(dá)載體，細(xì)胞系，宿主菌等均可以通過常規(guī)的技術(shù)手段得到。蛋白質(zhì)從宿主中純化過程也可采用常規(guī)的方法。在得到純化蛋白的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還提供了CVN突變體修飾衍生物，是將上述CVN突變體的N末端進(jìn)行PEG修飾，修飾位點一般是針對N末端甘氨酸殘基的a-氨基。優(yōu)選地，所述PEG修飾的修飾劑使用mPEG-ALD(單甲氧基醚PEG-丙醛)，所述mPEG-ALD的分子量優(yōu)選為10KD-20KD。上述突變體和修飾衍生物均可用于在制備預(yù)防和/或治療艾滋病的藥物中的應(yīng)用，基于相同的抗病毒機理，本發(fā)明的突變體和修飾衍生物可以應(yīng)用于制備預(yù)防和/或治療其他病毒微生物所致疾病的藥物。相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明提供的CVN突變體及其修飾衍生物是為了更好的實現(xiàn)體外重組CVN的抗病毒功能，改造后的L-CVN抗HIV活性增強(WST法和細(xì)胞融合法)。由于本發(fā)明制備的LCVN末端引入了親水柔性的多肽序列，因此可以進(jìn)行N端的定點氨基修飾。我們的實驗結(jié)果證明，LCVN經(jīng)N端定點氨基修飾后，不僅可以獲得有活性的修飾產(chǎn)物，并且修飾產(chǎn)物的抗病毒活性進(jìn)一步增強。圖1是pET3c-6His-SUMO-LCVN重組質(zhì)粒圖。圖2是重組pET3C-6His-SUMO-LCVN質(zhì)粒限制酶和PCR分析，其中M:DL2000DNAmarker;泳道l:pET3C-6His-SUMO-LCVN/MfeI+^w7i/I;泳道2:PCR。圖3是SDS-PAGE電泳分析BL21/pET3c-6His-SUMO-LCVN蛋白表達(dá)特性，其中由左至右，各泳道依次為未加IPTG誘導(dǎo)、IPTG誘導(dǎo)20h、誘導(dǎo)表達(dá)破碎離心上清、誘導(dǎo)表達(dá)破碎離心沉淀。圖4是純化目的蛋白LCVN，其中由左至右，各泳道依次為Sumo-LCVN融合蛋白、Sumo-LCVN融合蛋白經(jīng)Sumo蛋白酶酶切的混合物、LCVN蛋白。(*)表示Sumo-LCVN融合蛋白(**)表示LCVN蛋白。圖5是RP-HPL分析重組LCVN的純度。圖6是不同pH及投料比條件下10KmPEG-ALD修飾LCVN的Tricine-SDS-PAGE電泳圖，其中從左至右，泳道1是蛋白Maker,泳道2、3、4分別是PH3.5，LCVN與10KmPEG-ALD摩爾比分別為1:1、i:3、1:5時的修飾產(chǎn)物電泳條帶；泳道5、6、7分別是PH4.0,LCVN與10KmPEG-ALD摩爾比分別為1:1、1:3、1:5時的修飾產(chǎn)物電泳條帶；泳道8、9、10分別是PH5.0，LCVN與10KmPEG-ALD摩爾比分別為1:1、1:3、1:5時的修飾產(chǎn)物電泳條帶；泳道ll、12、13分別是PH6.0，LCVN與10KmPEG-ALD摩爾比分別為1:1、1:3、1:5時的修飾產(chǎn)物電泳條帶；泳道14、15、16分別是PH7.0，LCVN與10KmPEG-ALD摩爾比分別為l:l、1:3、1:5時的修飾產(chǎn)物電泳條帶。圖7是不同PH及投料比條件下10KmPEG-ALD修飾LCVN的修飾率比較圖。圖8是不同PH及投料比條件下20KmPEG-ALD修飾LCVN的Tricine-SDS-PAGE電泳圖，其中從左至右，泳道l是蛋白Maker,泳道2、3、4分別是PH3.5，LCVN與20KmPEG-ALD摩爾比分別為1:1、1:3、1:5時的修飾產(chǎn)物電泳條帶；泳道5、6、7分別是PH4.0,LCVN與20KmPEG-ALD摩爾比分別為1:1、1:3、1:5時的修飾產(chǎn)物電泳條帶；泳道8、9、10分別是PH5.0，LCVN與20KmPEG-ALD摩爾比分別為1:1、1:3、1:5時的修飾產(chǎn)物電泳條帶；泳道ll、12、13分別是PH6.0，LCVN與20KmPEG-ALD摩爾比分別為1:1、1:3、1:5時的修飾產(chǎn)物電泳條帶；泳道14、15、16分別是PH7.0，LCVN與20KmPEG-ALD摩爾比分別為l:l、1:3、1:5時的修飾產(chǎn)物電泳條帶。圖9是不同PH及投料比條件下20KmPEG-ALD修飾LCVN的修飾率比較圖。圖10是不同時間下，10KmPEG-ALD修飾LCVN的Tricine-SDS-PAGE電泳圖，其中泳道l是蛋白Maker，泳道2-8分別是反應(yīng)lh、3h、5h、7h、9h、12h和24h后的樣品電泳結(jié)果，泳道9是未修飾的LCVN。圖11是不同時間下，20KmPEG-ALD修飾LCVN的Tricine-SDS-PAGE電泳圖，其中泳道l是蛋白Maker,泳道2-8分別是反應(yīng)lh、3h、5h、7h、9h、12h和24h后的樣品電泳結(jié)果，泳道9是未修飾的LCVN。圖12是10KmPEG-ALD修飾LCVN經(jīng)SP-Sepharose分離純化的洗脫曲線。圖13是10KmPEG-ALD修飾LCVN經(jīng)SP-Sepharose分離純化各組分的Tricine-SDS誦PAGE電泳圖，其中泳道l是蛋白Maker,泳道2-5是修飾反應(yīng)的混合物、上樣穿透峰、含有80mMNaCl的bufferA的洗脫峰；含有400mMNaCl的bufferA的洗脫峰。圖14是20KmPEG-ALD修飾LCVN經(jīng)SP-Sepharose分離純化的洗脫曲線。圖15是20KmPEG-ALD修飾LCVN經(jīng)SP-Sepharose分離純化各組分的Tricine-SDS-PAGE電泳圖，其中泳道l是蛋白Maker,泳道2-5是修飾反應(yīng)的混合物、上樣穿透峰、含有70mMNaCl的bufferA的洗脫峰；含有400mMNaCl的bufferA的洗脫峰。圖16是MT-4經(jīng)不同濃度LCVN及其修飾產(chǎn)物處理后的細(xì)胞存活率(％)。圖17是CVN和LCVN對HIV-l/IIIB增殖的抑制率(％)。圖18是LCVN及其PEG修飾產(chǎn)物的抗人類免疫缺陷病毒活性，其中，圖(a)相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)24h后的(l)MOLT-4細(xì)胞、(2)MOLT-4/IIIB細(xì)胞、(3)共培養(yǎng)后的細(xì)胞、(4)假處理的共培養(yǎng)后的細(xì)胞、(5-8)濃度為113nM的CVN/LCVN/10kPEG-LCVN/20kPEG-LCVN處理后的共培養(yǎng)細(xì)胞，黑色箭頭所示處為融合的巨大細(xì)胞。圖(b)CNV、LCVN、10kPEG-LCVN、20kPEG-LCVN的融合抑制活性，所有實驗至少是3次獨立實驗后的統(tǒng)計學(xué)處理結(jié)果。圖19是LCVN及其PEG修飾產(chǎn)物抗HSV-1活性的CPE觀察結(jié)果。其中A、正常對照；B、病毒對照；C、陽性藥物ACV對照(l昭/ml);D、L-CVN樣品(1.562嗎/ml);E、SUMO-L-CVN樣品G.125pg/ml);F、mPEG垂ALD-10kDa-L-CVN(3.125pg/ml);G、mPEG-ALD-20kDa-L隱CVN(3.125嗎/ml)。具體實施例方式以下列舉一些本發(fā)明優(yōu)選的實施例，以助于進(jìn)一步理解本發(fā)明，但本發(fā)明的實施方式不限于此。本發(fā)明實施例涉及的主要材料如下宿主菌大腸桿菌BL21(DE3)(購自Novagen公司)、質(zhì)粒pET3c(購自Novagen公司)、pET3c-SUMO-CVN由本室保存(其構(gòu)建方法已申請專利"重組藍(lán)藻抗病毒蛋白的制備方法及應(yīng)用，申請?zhí)?00810198926.0"，質(zhì)粒的構(gòu)建亦可采用公知的基因工程方法，基本思路是首先通過PCR的方法得到SUMO-CVN融合序列，再連入pET3c載體即可得到質(zhì)粒pET3c-SUMO-CVN);SUMO蛋白酶(購自?；镉邢薰?；Taq酶、T4DNA連接酶、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、各種限制性內(nèi)切酶購自大連寶生物公司；蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品(購自聚研生物科技有限公司)、引物購自上海生工生物公司；Ni2+SepharoseFastFlow、SPSepharoseFastFlow購自GEHealthcare公司；MTT、WST購自美國SIGMA公司；單純皰疹病毒l型(HSV-1)F株來自武漢大學(xué)病毒研究所(CGMCCNo.0396);Vero細(xì)胞(CCL-81tm)、MOLT-4細(xì)胞(CRL-1582tm)、MT-4細(xì)胞(CRL-1942tm)、HIV-I/IIIB病毒(CRL-1973T，等來自美國典型菌種保藏中心(ATCC);mPEG-ALD(10K)和mPEG-ALD(20K)購自北京凱正生物工程發(fā)展有限公司。NTA陽0buffer(20mmol/LTris-HCl，pH8.0，0.15mol/LNaCl，)，NTA-20buffer(20mmol/LTris-HCl，pH8.0，0.15mol/LNaCl，20腿ol/L咪唑)，NTA-250buffer(20匪ol/LTris-HCl，pH8.0，0.15moi/LNaCl，250mmol/L咪唑)，酶切緩沖液(20mmol/LTris-HCi，pH8.0，0.15mol/LNaCl)，bufferA(20mmol/LNaAc-Ac，pH4.0)。實施例1、構(gòu)建重組質(zhì)粒pET3c-6ffis-SUMO-LCVNSUMO-L-CVN基因的構(gòu)建合成分兩步進(jìn)行，首先通過兩次PCR合成L-CVN基因，第一次PCR以pET3c-SUMO-CVN質(zhì)粒為模板，以F1-CVN、R-CVN為上下游引物。反應(yīng)體系為模板lng，上下游引物各lpM，20nlTaqPCRMasterMix，加水至40nl，反應(yīng)混合物94。C變性lmin，退火至55'C，保持lmin，72'C延伸lmin，進(jìn)行29個循環(huán)。反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，膠回收目的片段，作為下一輪PCR的模板。第二次PCR以上一輪PCR產(chǎn)物為模板，F(xiàn)2-CVN、R-CVN為上下游引物對(其中F2-CVN引物中含有編碼15個氨基酸殘基的柔性多肽)，合成L-CVN全長序列。SUMO全長序列通過PCR方法從pET3c-SUMO-CVN中合成。利用SUMO序列末端與L-CVN序列前端的26bp重疊互補序列進(jìn)行PCR:以SUMO序列和L-CVN序列為延伸模板，F(xiàn)-SUMO，R-CVN為上下游引物，在常規(guī)的PCR條件下進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，并做膠回收，得到SUMO-L-CVN全長序列。將質(zhì)粒pET3C禾B6His-SUMO-LCVN全長序列分別用MfeI和與5aw/H雙酶切，酶切產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳，回收酶切產(chǎn)物，T4DNA連接酶，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐青霉素的LB平板上，37'C培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，PCR擴增及AWeI與萬"m/ZI雙酶切鑒定，陽性質(zhì)粒送往英駿公司測序。表l用于合成SUMO-LCVN全長序列的引物引物名稱序列F2-CVN5，-CAGATTGGTGGTGGTGGCGGAGGGAGCGGTGGAGGGGGCAGTGGCGGAG-3'F1-CVN5'-GGAGGGGGCAGTGGCGGAGGAGGTAGCCTTGGTAAATTCTCCCAG-3'R-CVN5'-AGAG04rCCTCATCATTCGTATTTCAGGGTAC-3，F(xiàn)-SUMO5'-CAGC4Z4rGCATCATCATCATC-3，R-SUMO5'-CTCCCTCCGCCACCACCACCAATCTGTTCTCTG-3'2、LCVN工程菌的搖瓶培養(yǎng)、蛋白純化和純度測定測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，得工程菌BL21[pET3c-6His-SUMO-LCVN]，挑選單克隆進(jìn)行培養(yǎng)并誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。結(jié)果表明BL21[pET3c-6His-SUMO-LCVN]陽性克隆菌株經(jīng)誘導(dǎo)后會表達(dá)大小約為28kDa的融合蛋白，未誘導(dǎo)對照組在相應(yīng)位置無肉眼可見表達(dá)，經(jīng)超聲破碎菌體后，發(fā)現(xiàn)融合蛋白位于上清中，為可溶性表達(dá)，經(jīng)凝膠光密度掃描，可溶性目的蛋白占上清總蛋白的28.3±3.4%(圖3)。選取高表達(dá)菌株接種到1L含氨芐青霉素(100mg/)的LB培養(yǎng)基中，37°C，180rpm培養(yǎng)至OD600:0.61.0時，降溫至2(TC加IPTG至終濃度0.5mM誘導(dǎo)表達(dá)24h。4°C、6000xg、10min離心收集菌體，凍融一次，然后將菌體沉淀以l:IO比例重新懸浮于NTA-IObuffer,超聲破碎(工作時間5s、間歇時間5s，99次，重復(fù)3遍)，4°C、25000xg、30min離心收集上清。上清液上樣柱床體積為20ml的Ni-NTA親和層析柱，流速0.6ml/min,NTA-0buffer洗回基線，流速為lml/min,NTA-20buffer洗雜蛋白，NTA-250buffer洗脫目的蛋白。純化后的目的蛋白6His-SUMO-LCVN經(jīng)SephadexG-25分子篩脫咪唑后進(jìn)行SUMO蛋白酶酶切，除去SUMO融合蛋白。6His-SUMO-LCVN調(diào)整濃度至lmg/ml，加入lUSUMO蛋白酶/mg融合蛋白，30°C酶切l(wèi)h。因6His-SUMO標(biāo)簽、SUMO蛋白酶均含有6xHis標(biāo)簽，酶切后的樣品再次上樣Ni-NTA親和層柱進(jìn)行純化，除去帶6His標(biāo)簽的SUMO、未酶切的6His-SUMO-LCVN和SUMO蛋白酶，得到非融合的目的蛋白LCVN，經(jīng)G-25分子篩柱脫鹽后冷凍干燥，得LCVN制品，供后續(xù)理化性質(zhì)測定、活性測定或PEG修飾用。圖3是工程菌BL21[pET3c-6His-SUMO-LCVN]經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的蛋白表達(dá)圖譜，可見經(jīng)誘導(dǎo)后，在分子量28kD處出現(xiàn)明顯增粗的蛋白帶(泳道3)，與6His-SUMO-LCVN的理論分子量相符，超聲破碎后，目的蛋白位于菌體破碎后的上清中，含量占菌體可溶性蛋白的40%(泳道2)。圖4是SDS-PAGE分析LCVN純化過程，其中+所示處為6His-SUMO-LCVN融合蛋白，**所示處為LCVN蛋白。圖5是LCVN制品的反向高效液相色譜(RP-HPLC)純度分析結(jié)果，株型是C-18反向柱，檢測器波長為280nm，流動相A:含0.1%三氟乙酸(TFA)的超純水，流動相B:乙氰，經(jīng)40X-60X的B進(jìn)行梯度洗脫，保留時間在4-6min之間出現(xiàn)LCVN的洗脫峰。3、LCVN工程菌的中試發(fā)酵和蛋白制備工程菌BL21[pET3c-6His-SUMO-LCVN]，挑選單克隆進(jìn)行培養(yǎng)并在試管中誘導(dǎo)表達(dá)，選取高表達(dá)菌株進(jìn)行中試發(fā)酵。分別在錐形瓶中培養(yǎng)一級和二級種子，培養(yǎng)二級種子至合適濃度，以10X接種量接種到15L的發(fā)酵培養(yǎng)基中。自動控制溫度為37'C，適時調(diào)整轉(zhuǎn)速和通氣量以保持合適的溶氧水平，NaOH和HCl調(diào)節(jié)PH為7.07.2。當(dāng)菌體密度(OD600)為12左右時，溫度降至20'C，力nIPTG至終濃度0.5mM誘導(dǎo)表達(dá)20h。100ml/min，9000g，連續(xù)流離心收集菌體，15L的發(fā)酵培養(yǎng)基可以收獲約550g的濕菌體，收集的菌體于-2(TC冰箱保存。菌體沉淀以l:IO比例懸浮于NTA-Obuffer,超聲破碎(工作時間5s、間歇時間5s，99次，重復(fù)3遍)，4'C、25000xg、30min離心收集上清。柱床體積為20ml的Ni-NTA填料上樣量為250ml上清，流速lml/min,NTA-0buffer洗回基線；流速為lml/min,NTA-20buffer洗雜蛋白，NTA-250buffer洗脫目的蛋白。純化后的目的蛋白6His-SUMO-LCVN經(jīng)SephadexG-25分子篩脫咪唑后進(jìn)行SUMO蛋白酶酶切，除去SUMO融合蛋白。6His-SUMO-LCVN調(diào)整濃度至lmg/ml，加入lUSUMO蛋白酶/mg融合蛋白，3CTC酶切l(wèi)h。因6His-SUMO標(biāo)簽、SUMO蛋白酶均含有6xffis標(biāo)簽，酶切后的樣品再次上樣Ni-NTA親和層柱進(jìn)行純化，除去帶6His標(biāo)簽的SUMO、未酶切的6His-SUMO-LCVN和SUMO蛋白酶，得到非融合的目的蛋白LCVN，經(jīng)G-25分子篩柱更換緩沖液，再用截留量3KD的超濾管濃縮LCVN蛋白，供后續(xù)理化性質(zhì)測定、活性測定或PEG修飾用。4、LCVN蛋白的PEG修飾對藥用蛋白進(jìn)行PEG修飾是改善其藥代特性、穩(wěn)定性和免疫原性等多種成藥性質(zhì)的有效方法。蛋白質(zhì)可供PEG修飾的位點包括側(cè)鏈氨基、N端氨基、側(cè)鏈羧基、C端羧基、側(cè)鏈巰基等多種。現(xiàn)有的羧基修飾技術(shù)容易產(chǎn)生非特異性交聯(lián)反應(yīng)，因此氨基修飾更為常用，技術(shù)發(fā)展也更為成熟。Zappe等的研究結(jié)果表明，對野生型CVN的側(cè)鏈氨基或N端氨基的修飾都會破壞該蛋白的活性，因此，作者首先對CVN進(jìn)行定點突變，獲得Q62C突變體，然后對62位引入的Cys進(jìn)行側(cè)鏈巰基修飾，獲得了有活性的蛋白。由于天然CVN中已有的4個Cys殘基之間形成2對二硫鍵，并且在溶液中，蛋白質(zhì)的二硫鍵處在動態(tài)異構(gòu)和平衡狀態(tài)，因此引入Q62C突變后，很難避免引入的Cys不干擾二硫鍵的正確搭配，或者非62位的Cys修飾，作者最后的實驗結(jié)果也證明，CVNQ62C突變體及其修飾產(chǎn)物的活性均低于野生型CVN。由于本發(fā)明制備的LCVN末端引入了親水柔性的15肽序列，因此可以嘗試進(jìn)行N端的定點氨基修飾。我們的實驗結(jié)果證明，LCVN經(jīng)N端定點氨基修飾后，不僅可以獲得有活性的修飾產(chǎn)物，并且修飾產(chǎn)物的抗病毒活性進(jìn)一步增強。對氨基的PEG修飾方法很多，可供選擇的修飾劑也很多，本發(fā)明選擇mPEG-ALD(10K)和mPEG-ALD(20K)作為修飾劑，從底物:修飾劑比例、修飾pH、修飾反應(yīng)時間等3個方面，篩選了LCVN的最佳PEG修飾條件。選擇pH為3.5，4.0，5.0，60，7.0，離子強度為20mM的Na-Ac緩沖液，反應(yīng)體系中LCVN的濃度為5mg/ml，LCVN與mPEG-ALD(10K)的摩爾比分別選擇為1:1，1:3，1:5;NaCNBH3的終濃度為5mg/ml。室溫下，振蕩器上搖動反應(yīng)，在反應(yīng)3h后取樣，電泳鑒定修飾反應(yīng)的效果。mPEG-ALD(10K)修飾LCVN的單修飾產(chǎn)物在SDS-PAGE上的表觀分子量約30KD，SDS-PAGE分析結(jié)果表明，在pH4.0，LCVN與mPEG-ALD(10K)的摩爾比為1:3的條件下，單修飾率最高(圖6)。10類似方法，研究mPEG-ALD(20K)修飾LCVN的最佳修飾pH和投料比。mPEG-ALD(20K)修飾LCVN后，單修飾產(chǎn)物在SDS-PAGE上的表觀分子量約50KD，實驗結(jié)果表明在pH5.0，LCVN與mPEG-ALD(20K)的摩爾比為1:1的條件下，單修飾率最高(圖18)。在確定了最佳的修飾pH和投料比下，mPEG-ALD(10K)和mPEG-ALD(20K)修飾LCVN分別在反應(yīng)lh、3h、5h、7h、9h、12h和24h取樣，Tricine-SDS-PAGE電泳鑒定最佳的反應(yīng)時間。SDS-PAGE分析結(jié)果表明表明反應(yīng)時間對mPEG-ALD(10K)和mPEG-ALD(20K)修飾LCVN的反應(yīng)沒有顯著影響，綜合考慮時間成本，優(yōu)選最佳修飾反應(yīng)時間為室溫振蕩反應(yīng)2h(圖IO和圖11)。5、LCVN的PEG修飾產(chǎn)物的分離純化LCVN經(jīng)PEG-ALD修飾后，反應(yīng)混合物中主要有未修飾的LCVN，剩余的PEG,PEG多修飾的LCVN，PEG單修飾的LCVN。采用AKTAprimeplus分離純化系統(tǒng)，SPsepharose層析柱分離純化單修飾的mPEG-ALD-LCVN，流動相為20mM的Na-Ac緩沖液(bufferA)，上樣前先用5倍柱體積的bufferA平衡柱子，上樣后收集穿透峰，然后用含有不同濃度NaCl的bufferA進(jìn)行洗脫，收集各個洗脫峰。流速是lml/min，檢測波長是280nm。收集到的樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳檢測。mPEG-ALD(10K)修飾LCVN的混合物，經(jīng)SPsepharose陽離子層析純化之后，修飾劑mPEG-ALD和多修飾產(chǎn)物不與SPsepharose結(jié)合而被穿透，含有80mMNaCl的bufferA洗脫產(chǎn)物為單修飾的mPEG-ALD(1()K)-LCVN;含有400mMNaCl的bufferA洗脫產(chǎn)物是未修飾的LCVN。圖12為mPEG-ALD(I()K)-LCVN分離純化的洗脫曲線，峰1為修飾劑和多修飾產(chǎn)物，峰2為單修飾產(chǎn)物，峰3為未修飾底物。圖13為SDS-PAGE分析各洗脫組份，泳道M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道A為上樣樣品，可見未修飾底物、單修飾產(chǎn)物和多修飾產(chǎn)物；泳道l是穿透峰；泳道2是單修飾產(chǎn)物，也就是目的蛋白mPEG-ALD(u)K)-LCVN;泳道3為未修飾產(chǎn)物。mPEG-ALD(20K)修飾LCVN的混合物，經(jīng)SPsepharose陽離子層析純化之后，修飾劑mPEG-ALD和多修飾產(chǎn)物也存在于上樣穿透峰中，含有70mMNaCl的bufferA洗脫產(chǎn)物為單修飾的mPEG-ALD(2GK)-LCVN;含有400mMNaCl的bufferA洗脫產(chǎn)物是未修飾的LCVN。圖14為mPEG-ALD(2QK)-LCVN分離純化的洗脫曲線，峰1為修飾劑和多修飾產(chǎn)物，峰2為單修飾產(chǎn)物，峰3為未修飾底物。圖15為SDS-PAGE分析各洗脫組份，泳道M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道A為上樣樣品，可見未修飾底物、單修飾產(chǎn)物和多修飾產(chǎn)物；泳道l是穿透峰；泳道2是單修飾產(chǎn)物，也就是目的蛋白mPEG-ALD(K)K)-LCVN;泳道3為400mMNaCl洗脫組份，可見未修飾產(chǎn)物，但也含有部分單修飾產(chǎn)物。應(yīng)用實施例lWST法測定LCVN對T細(xì)胞的細(xì)胞毒性CVN、LCVN及PEG修飾產(chǎn)物以RPMI-1640培養(yǎng)液作5倍系列稀釋，加至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔50pl，CVN和LCVN稀釋范圍為10嗎/ml至0.04嗎/ml，PEG修飾LCVN的稀釋范圍為5(Hig/ml至0.19pg/ml。MT-4細(xì)胞調(diào)整濃度至lxl05/ml，每孔10(^1，混勻，置37'C、5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，同時設(shè)細(xì)胞對照和陽性藥物對照(63nM疊氮胸苷，AZT)，每個樣品均平行測定3個復(fù)孔。4天后培養(yǎng)板中每孔加入10nlWST-l(水溶性四氮唑，5mmol/L)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，置讀板儀上讀取吸光值(A),波長450/650nm，計算細(xì)胞存活率(Relativepercentage,RP，％)，并根據(jù)RP計算50%毒性濃度(CC50)。細(xì)胞存活率(Relativepercentage,%)=藥物處理組A值/細(xì)胞對照組A值x100。/。。圖16是不同濃度CVN、LCVN及其修飾產(chǎn)物等4種蛋白處理MT-4后的細(xì)胞存活率，圖中N.C.指未處理的細(xì)胞對照，以細(xì)胞對照的密度為100%。AZT為陽性對照藥物，63nM疊氮胸苷。經(jīng)計算后的50%毒性濃度如表2所示。表2LCVN及其PEG修飾產(chǎn)物的50%毒性濃度<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>應(yīng)用實施例2WST法測定LCVN的抗人類免疫缺陷病毒活性CVN、LCVN及PEG修飾產(chǎn)物以RPMI-1640培養(yǎng)液作5倍系列稀釋，加至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔50nl。MT-4細(xì)胞調(diào)整濃度至lxl05/ml，每孔lOO^d,混勻，然后加入HIV-1/IIIB病毒懸液50pl，滴度為100TCID50。置37'C、5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，同時設(shè)細(xì)胞對照、病毒對照和陽性藥物對照(疊氮胸苷，AZT),每個樣品均平行測定3個復(fù)孔。4天后培養(yǎng)板中每孔加入10piWST-1(水溶性四氮唑，5mmol/L)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，置讀板儀上讀取吸光值(A)，波長450/650nm。細(xì)胞存活率(Relativepercentage,%)=藥物處理組A值/細(xì)胞對照組A值x1000/。。病毒抑制率(％)=(藥物處理組A450腳-病毒對照組A450/65G)/(細(xì)胞對照組A4遍50-病毒對照組A45歸0)xlOO%Reed-Muench法計算50%抑制濃度(IC50),并根據(jù)實施例x的50。/。毒性濃度(CC50)，并算選擇指數(shù)(TI)，TI=CC50/IC50。由表3可以看出，對于陽性藥物AZT而言，CVN、LCVN對HIV-1/IIIB增殖的抑制活性更強。表3CVN和LCVN對HIV-1/IIIB增殖的抑制活性SampleIC50(nM)_CC50(岸)_SIAZT36.55±5.64〉4.482122CVN21.83±2.790.160±0.0097.3LCVN14.17±6.430.658±0.27746.4應(yīng)用實施例3融合抑制法測定LCVN及其PEG修飾產(chǎn)物的抗人類免疫缺陷病毒活性現(xiàn)有研究表明，HIV在T細(xì)胞之間的傳播主要是通過感染細(xì)胞表面表達(dá)的gpl20的介導(dǎo)，而與未感染的細(xì)胞上的受體結(jié)合，形成融合細(xì)胞而發(fā)生。CVN可以特異性結(jié)合gpl20而抑制感染細(xì)胞與正常細(xì)胞之間的融合而阻斷病毒的傳播，因此，我們應(yīng)用細(xì)胞融合抑制模型測定LCVN及其衍生物的抗病毒活性[TochikuraTS,NakashimaH,TanabeA,YamamotoN.Humanimmunodeficiencyvirus(HIV)-inducedcellfUsion:quantificationanditsapplicationforthesimpleandrapidscreeningofanti-HIVsubstancesinvitro.Virology,1988，164(2):542-546]。生長至對數(shù)期的MOLT-4細(xì)胞和MOLT-4/IIIB細(xì)胞調(diào)整密度至lxl06/ml，各取250^1細(xì)胞懸液，等體積混合，加至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(細(xì)胞總數(shù)為5xl()S/50(Vl/孔)；CVN、LCVN及其PEG修飾產(chǎn)物以含胎牛血清和抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)基作4倍系列稀釋，每種受試藥物選擇3個濃度(452nM，113nM，28nM)，等體積加至細(xì)胞懸液中，同時設(shè)置各種對照組，所有樣品平行2個復(fù)孔，37'C、5%C02培養(yǎng)24小時。24h后取細(xì)胞懸液，臺盼藍(lán)染色后充入細(xì)胞計數(shù)池，顯微鏡下計數(shù)存活的MOLT-4細(xì)胞數(shù)目。由于MOLT-4/IIIB細(xì)胞能不斷產(chǎn)生HIV-I/niB病毒顆粒，并且通過與正常MOLT-4細(xì)胞的融合，形成大的多核細(xì)胞(合胞體)而感染正常宿主細(xì)胞，在細(xì)胞計數(shù)時，融合細(xì)胞無法進(jìn)入計數(shù)池，因此，計數(shù)細(xì)胞計數(shù)池中正常大小MOLT-4或MOLT-4/IIIB細(xì)胞數(shù)，可以推算形成合胞體的細(xì)胞數(shù)目，比較給藥共培養(yǎng)組的細(xì)胞數(shù)和未進(jìn)行共培養(yǎng)組的MOLT-4細(xì)胞數(shù)，計算融合指數(shù)(FI，fusionindex)-13FI=1—(共培養(yǎng)細(xì)胞孔的細(xì)胞數(shù)+只含MOLT-4細(xì)胞的對照孔中的細(xì)胞數(shù))比較給藥共培養(yǎng)細(xì)胞和未給藥共培養(yǎng)細(xì)胞的融合指數(shù)，計算融合抑制率(FIR，fusioninhibitionrate):FIR(%)=[l-(FIT/FIc)]xl00，其中FlT是給藥樣品的融合指數(shù)，F(xiàn)Ic是未給藥共培養(yǎng)細(xì)胞的融合指數(shù)。表4LCVN及其PEG修飾產(chǎn)物對細(xì)胞的融合抑制率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表4可以看出，LCVN對HIV-1/IIIB的融合抑制活性不論在何劑量組中，均明顯高于CVN;另外，在中劑量和高劑量時，LCVN的PEG修飾產(chǎn)物的活性要高于未修飾的LCVN。圖18(a)是相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)24h后的(l)MOLT-4細(xì)胞、(2)MOLT-4/IIIB細(xì)胞、(3)共培養(yǎng)后的細(xì)胞、(4)假處理的共培養(yǎng)后的細(xì)胞、(5-8)濃度為113nM的CVN/LCVN/10kPEG-LCVN/20kPEG-LCVN處理后的共培養(yǎng)細(xì)胞，黑色箭頭所示處為融合的巨大細(xì)胞，可見未共培養(yǎng)組中無融合細(xì)胞，共培養(yǎng)組中出現(xiàn)典型融合細(xì)胞，而給藥組基本看不到融合細(xì)胞。圖18(b)是CNV、LCVN、10kPEG-LCVN、20kPEG-LCVN的融合抑制活性，所有實驗至少是3次獨立實驗后的統(tǒng)計學(xué)處理結(jié)果?？梢奓CVN對HIV-1/IIIB的融合抑制活性不論在何劑量組中，均明顯高于CVN;另外，在中劑量和高劑量時，LCVN的PEG修飾產(chǎn)物隨著分子量的增大，活性逐步增強，但在低劑量組中，PEG修飾產(chǎn)物的活性隨分子量增大而逐步降低。應(yīng)用實施例4MTT法測定LCVN的抗單純皰疹病毒(HSV-1)活性單純皰疹病毒I型(HSV-I)是一種在人群中引起廣泛感染的DNA病毒，人類是其唯一的宿主，健康成人中約有9(P/。感染HSV-1。HSV-I可引起唇皰疹、皰疹性角膜結(jié)膜炎、新生兒腦炎等多種疾病，由于HSV-I可在神經(jīng)節(jié)內(nèi)潛伏感染，故癥狀易復(fù)發(fā)。本實驗用MTT法測定重組LCVN及其修飾產(chǎn)物、野生型CVN對Vero細(xì)胞的毒性；CPE法觀察藥物對細(xì)胞的活性。單層Vero細(xì)胞中，加入不同稀釋度的受試藥物和100TCID50的HSV-l病毒液各50ul，同時設(shè)正常細(xì)胞對照及病毒對照組。5%C02培養(yǎng)48h，每孔加入5mg/mlMTT10pl，5%<302繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清液，每孔加入200ialDMSO，室溫避光放置30min，振搖培養(yǎng)板10min左右，酶標(biāo)讀數(shù)儀比色(波長570nm，參比波長630nm)，測定吸光度并計算樣品的50%毒性濃度(50%cytotoxicconcentration,CC50)。圖19是一次典型實驗后細(xì)胞在相差顯微鏡下的形態(tài)，可見病毒對細(xì)胞所致的細(xì)胞病變效應(yīng)，以及藥物對細(xì)胞的保護效應(yīng)。結(jié)果表明，LCVN及其修飾產(chǎn)物均具有良好的抗HSV-1活性，在質(zhì)量濃度接近、摩爾濃度更低的條件下，LCVN及其PEG修飾產(chǎn)物表現(xiàn)出與陽性對照藥物ACV基本接近的抗病毒活性。毒性測定結(jié)果表明，PEG修飾后的LCVN對Vero細(xì)胞的毒性也明顯降低。上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。SEQUENCELISTING〈110>暨南大學(xué)<120>—種藍(lán)藻病毒蛋白N突變體、其修飾衍生物及應(yīng)用<130>090831〈160〉11<170>Patentlnversion3.3<210>1〈211〉15<212>PRT〈213>人工序列<220><221>PEPTIDE<222>(1)..(15)<223>柔性連接肽(linker)<400>1GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer151015<210>2〈211〉101<212>PRT<213>人工序列〈220〉<221>PEPTIDE<222>(I)..(IOI)<223>CVN的氨基酸序列<400〉2LeuGlyLysPheSerGinThrCysTyrAsnSerAlalieGinGlySer151015ValLeuThrSer20SerlieAspLeu35TrpGinProSer50GlySerSerGlu65ValSerThrLysThrl>euLysTyr100<210>3〈211>348<212>DNA<213>人工序列<220>〈221〉CDS〈222〉(l)..(348)<223>LCVN的編碼核苷酸序列<400>3ggtggcggagggageggtggagggggcagtggcggaggaggtagectt48GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerLeu151015ggtaaattcteccagacctgctacaactecgetatecagggttctgtt96GlyLysPheSerGinThrCysTyrAsnSerAlalieGinGlySerVal202530ctgacctctacctgcgaacgtaccaacggtggttacaacacctectct144LeuThrSerThrCysGluArgThrAsnGlyGlyTyrAsnThrSerSerThrCysGluArgThrAsnGlyGlyTyrAsnThrSer2530AsnSerVallieGluAsnValAspGlySerLeuLys4045AsnPhelieGluThrCysArgAsnThrGinLeuAla5560LeuAlaAlaGluCysLysThrArgAlaGinGinPhe707580lieAsnLeuAspAspHislieAlaAsnlieAspGly85恥95Glu35ategacctgaaclieAspLeuAsn50cagccgtctaacGinProSerAsn65tectctgaactgSerSerGluLeutctaccaaaateSerThrLyslie100ctgaaatacgaaLeuLysTyrGlu115<210>4<211>116<212>PRT<213>人工序列<400〉4GlyGlyGlyGly1GlyLysPheSer20LeuThrSerThr35lieAspLeuAsn50GinProSerAsn4045tecgttategaaaacgttgacggttctctgaaatgg192SerVallieGluAsnValAspGlySerLeuLysTrp5560ttcategaaacctgccgtaacacccagctggetggt240PhelieGluThrCysArgAsnThrGinLeuAlaGly707580getgetgaatgcaaaacccgtgetcagcagttcgtt288AlaAlaGluCysLysThrArgAlaGinGinPheVal859095aacctggacgaccacategetaacategacggtacc336AsnLeuAspAspHislieAlaAsnlieAspGlyThr105110348SerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerLeu51015GinThrCysTyrAsnSerAlalieGinGlySerVal2530CysGluArgThrAsnGlyGlyTyrAsnThrSerSer4045SerVallieGluAsnValAspGlySerLeuLysTrp5560PhelieGluThrCysArgAsnThrGinLeuAlaGly18SerSerGluLeuSerThrLyslie100LeuLysTyrGlu115<210>5<211>669〈212〉DNA〈213〉人工序列<220>〈221〉CDS<222>(1)..(669)〈223〉pET3c-6His-SUMO-LCVN載體中編碼His-SUMO-LCVN的核苷酸序列〈400〉5atgcatcatcatcatcatcacggcatgteggacteagaagtcaatcaaMetHisHisHisHisHisHisGlyMetSerAspSerGluValAsnGin151015gaagetaagccagaggtcaagccagaagtcaagcctgagactcacateGluAlaLysProGluValLysProGluValLysProGluThrHislie202530aatttaaaggtgtecgatggatctteagagatettcttc肌gateaaaAsnLeuLysValSerAspGlySerSerGluliePhePhe)LyslieLys35404533gaccsetccttt33g3Eiggctgatggaagcgttcget朋a3gaceigLysThrThrProLeuArgArgLeuMetGluAlaPheAlaLysArgGin505560ggtaaggaaatggactecttaagattcttgtacgacggtattagaatt707580AlaAlaGluCysLysThrArgAlaGinGinPheVal859095AsnLeuAspAspHislieAlaAsnlieAspGlyThr105110GlyLysGluMetAspSerLeuArgPheLeuTyrAspGlylieArglie65707580caagetgatcagacccctgaagatttggacatggaggat犯cgatate288GinAlaAspGinThrProGluAspLeuAspMetGluAspAsnAsplie859095attgaggetcelc卿gaacagattggtggtggtggcggagggageggt336lieGluAlaHisArgGluGinlieGlyGlyGlyGlyGlyGlySerGly100105110ggagggggcagtggcgga鵬ggtagecttggtaaattcteccagacc384GlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerLeuGlyLysPheSerGinThr115120125tgctacaactecgetatecagggttctgttctgacctctacctgcgaa432CysTyrAsnSerAlalieGinGlySerValLeuThrSerThrCysGlu130135140cgtacc犯cggtggttac犯cacctectctategacctgaactecgtt480ArgThrAsnGlyGlyTyrAsnThrSerSerlieAspLeuAsnSerVal145150155160ategaaaacgttgacggttctctgaaatggcagccgtctaacttcate528lieGluAsnValAspGlySerLeuLysTrpGinProSerAsnPhelie165170175gaaacctgccgtaacacccagctggetggttectctgaactggetget576GluThrCysArgAsnThrGinLeuAlaGlySerSerGluLeuAlaAla180185190gaatgcaaaacccgtgetcagcagttcgtttctacc犯aateaacctg624GluCysLysThrArgAlaGinGinPheValSerThrLyslieAsnLeu195200205gacgaccacategetaacategacggtaccctgaaatacgaatga669AspAspHislieAlaAsnlieAspGlyThrLeuLysTyrGlu210215220<210〉6<211>222<212>PRT<213>人工序列<400〉6MetHisHisHisHisHisHisGlyMetSerAspSerGluValAsnGin151015GluAlaLysProGluValLysProGluValLysProGluThrHislie202530AsnLeuLysValSerAspGlySerSerGluliePhePheLyslieLys354045LysThrThrProLeuArgArgLeuMetGluAlaPheAlaLysArgGin505560GlyLysGluMetAspSerLeuArgPheLeuTyrAspGlylieArglie65707580GinAlaAspGinThrProGluAspLeuAspMetGluAspAsnAsplie859095lieGluAlaHisArgGluGinlieGlyGlyGlyGlyGlyGlySerGly100105110GlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerLeuGlyLysPheSerGinThr115120125CysTyrAsnSerAlalieGinGlySerValLeuThrSerThrCysGlu130135140ArgThrAsnGlyGlyTyrAsnThrSerSerlieAspLeuAsnSerVal145150155160lieGluAsnValAspGlySerLeuLysTrpGinProSerAsnPhelie165170175GluThrCysArgAsnThrGinLeuAlaGlySerSerGluLeuAlaAla180185190GluCysLysThrArgAlaGinGinPheValSerThrLyslieAsnLeu195200205AspAspHislieAlaAsnlieAspGlyThrLeuLysTyrGlu210215220<210>7<211>45〈212〉麗<213>人工序列<220><221〉misc—feature<222>(l)..(45)<223〉引物F1-CVN<400>7ggagggggcagtggcggaggaggtagccttggtaaattctcccag45〈210〉8<211>49〈212〉DNA<213>人工序列<220><221>misc一feature<222>(l)..(69)<223>引物F2-CVN<220><221>misc—feature<222>(l)..(49)<223>引物F-CVN<400>8cagattggtggtggtggcggagggagcggtgg鄉(xiāng)gggcagtggcggag49<210〉9<211>32<212>DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc—feature<222>(l)..咖<223>引物R-CTN<400〉9agaggatcctcatcattcgtatttcagggtac32<210〉10<211〉22<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc—feature<222>(l)..咖<223>引物F-SUM0<400>10cagcatatgcatcatcatcatc22<210>11<211>33<212>DNA〈213〉人工序列<220〉<221>misc—feature<222>(l)..咖<223>引物R-SUM0<400>11ctccctccgccaccaccaccaatctgttctctg3權(quán)利要求1、一種藍(lán)藻病毒蛋白N突變體，其特征在于其氨基酸序列由序列A和序列B組成，序列A位于序列B的N端，序列A如下述之一a.序列表中的SEQIDNO1；b.將序列表中的SEQIDNO1的氨基酸殘基序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸，其具有親水柔性的特點；序列B如下述之一c.序列表中的SEQIDNO2；d.將序列表中的SEQIDNO2的氨基酸殘基序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸，但不改變其N端的前三個殘基，且其具有特異性地抗HIV病毒活性。2、權(quán)利要求1所述藍(lán)藻病毒蛋白N突變體的編碼核苷酸序列。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述藍(lán)藻病毒蛋白N突變體的編碼核苷酸序列，其特征在于包括下述序列之一e.序列表中的SEQIDNO:3;f.在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQIDNO:3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。4、一種表達(dá)載體，其特征在于含有權(quán)利要求2或3所述的核苷酸序列。5、一種宿主菌，其特征在于含有權(quán)利要求2或3所述的核苷酸序列。6、一種藍(lán)藻病毒蛋白N突變體修飾衍生物，其特征在于是將權(quán)利要求1所述藍(lán)藻病毒蛋白N突變體的N末端進(jìn)行PEG修飾。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述藍(lán)藻病毒蛋白N突變體修飾衍生物，其特征在于所述PEG修飾的修飾劑使用單甲氧基醚PEG-丙醛。8、根據(jù)權(quán)利要求6所述藍(lán)藻病毒蛋白N突變體修飾衍生物，其特征在于:所述mPEG-ALD的分子量為10KD-20KD。9、權(quán)利要求1所述藍(lán)藻病毒蛋白N突變體在制備預(yù)防和/或治療艾滋病的藥物中的應(yīng)用。10、權(quán)利要求6-8中任一項所述藍(lán)藻病毒蛋白N突變體的修飾衍生物在制備預(yù)防和/或治療艾滋病的藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種藍(lán)藻病毒蛋白N突變體、其PEG修飾衍生物和它們在制藥中的應(yīng)用。本發(fā)明的藍(lán)藻病毒蛋白N突變體由兩段序列組成，一段是具有親水柔性的連接肽，一段為藍(lán)藻病毒蛋白N經(jīng)過密碼子優(yōu)化的序列。本發(fā)明的藍(lán)藻病毒蛋白N突變體經(jīng)過PEG修飾成為得到衍生物。該突變體及其衍生物均顯示了較好的抗HIV活性。具有應(yīng)用于制備抗HIV或其他病毒微生物的藥物的前景。文檔編號C07K14/405GK101638435SQ20091019206公開日2010年2月3日申請日期2009年9月4日優(yōu)先權(quán)日2009年9月4日發(fā)明者北里海雄,盛熊,王一飛,錢垂文,偉陳申請人:暨南大學(xué)