專利名稱：四配位體金屬螯合層析填料乙二胺二乙酸瓊脂糖凝膠制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白純化領(lǐng)域，特別地，本發(fā)明涉及金屬螯合層析填料制備方法。
背景技術(shù)：
金屬螯合層析，也稱固定化金屬親和層析是利用金屬離子與蛋白質(zhì)相互作用，特 別是過渡金屬離子如鎳，銅，鐵，鋅等的離子和蛋白質(zhì)中特定氨基酸如色氨酸組氨酸半胱氨 酸之間的螯合配位作用使蛋白質(zhì)被金屬螯合層析介質(zhì)吸附從而達(dá)到選擇分離純化蛋白質(zhì) 的目的，目前此技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于帶6組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)(6xHiS-tag Protein)純化， 以及其它含有豐富色氨酸組氨酸半胱氨酸的蛋白質(zhì)純化。其中NTA瓊脂糖應(yīng)用最為廣泛。金屬螯合層析填料分兩大部分，1。填料基質(zhì)主要有瓊脂糖凝膠，葡聚糖凝膠等作 為載體，2。填料金屬螯合分子目前在蛋白純化中廣泛應(yīng)用的亞氨基二乙酸(IDA瓊脂糖)， 次甲基三乙酸瓊脂糖凝膠(NTA瓊脂糖)，通過化學(xué)方法使金屬螯合分子與填料基質(zhì)結(jié)合形 成金屬螯合層析填料。亞氨基二乙酸(IDA)的螯合配位特點(diǎn)是兩個(gè)酸基和一個(gè)氮原子(提 供一個(gè)電子對供螯合)與配位金屬離子螯合形成三個(gè)配位體。次甲基三乙酸(NTA)的螯合 配位特點(diǎn)是三個(gè)酸基和一個(gè)氮原子形成四個(gè)配位體(三個(gè)酸帶有三個(gè)負(fù)電荷)與配位金屬 離子螯合。本發(fā)明乙二胺二乙酸瓊脂糖是全新螯合配位物體，特點(diǎn)是乙二胺二乙酸瓊脂糖凝 膠中的乙二胺二乙酸可以提供二個(gè)酸基和二個(gè)氮原子形成四個(gè)配位體(二個(gè)酸帶有二個(gè) 負(fù)電荷)與配位過渡金屬離子Ni，Cu, Mn, Co, Si等作用時(shí)可以形成一個(gè)四配位鰲合中心。 本發(fā)明乙二胺二乙酸瓊脂糖與現(xiàn)在廣泛應(yīng)用的次甲基三乙酸瓊脂糖凝膠(NTA瓊脂糖)同 為四配位金屬鰲合物，但由于配位原子不同和所帶負(fù)電荷量不同故與蛋白質(zhì)結(jié)合能力特點(diǎn) 也有不同，本發(fā)明乙二胺二乙酸瓊脂糖為蛋白質(zhì)純化提供了新的選擇。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明乙二胺二乙酸瓊脂糖是新型金屬螯合層析填料，為蛋白質(zhì)純化提供了新的 層析填料選擇，乙二胺二乙酸瓊脂糖凝(EDDA瓊脂糖凝膠)制備包括下列步驟乙二胺二乙酸制備1)在5_20°C控制溫度下，制備乙二胺10-80%水溶液，然后往10-80%乙二胺水溶 液定量慢慢加入溴乙酸(BrCH2COOH)，攪拌均勻制備成乙二胺與溴乙酸水溶液，乙二胺與溴 乙酸摩爾濃度準(zhǔn)確控制在1 2，溴乙酸摩爾濃度準(zhǔn)確控制非常重要。乙二胺與溴乙酸的化 學(xué)反應(yīng)式為NH2-CH2-CH2-NH2+2BrCH2C00H —NH (CH2COOH) -CH2-CH2-N (CH2COOH) +2Br2)慢慢調(diào)節(jié)乙二胺與溴乙酸混合水溶液PH值至9-11，攪拌，控溫，使乙二胺與入 溴乙酸反應(yīng)生成乙二胺二乙酸，乙二胺與溴乙酸混合水溶液在堿性條件下反應(yīng)激烈，整個(gè)3反應(yīng)應(yīng)當(dāng)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。反應(yīng)完全后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮結(jié)晶。3)反應(yīng)檢測和除去雜質(zhì)，薄膜層析(TLC)和茚三酮(茚三酮Ninhydrin是靈敏 的氨基顯色試劑)可以作為檢測方法，反應(yīng)副產(chǎn)物溴可以化學(xué)方法除去，例如加硝酸銀，沉 淀，過濾。乙二胺二乙酸瓊脂糖凝膠制備方法，包括以下步驟1)制備環(huán)氧活化瓊脂糖凝膠，將購自Novelab. com公司的瓊脂糖CL-4B凝膠放在 沙芯漏斗吸干后放入燒杯內(nèi)，加入2M氫氧化鈉，加入環(huán)氧氯丙烷，混合后在恒溫?cái)嚢杵魃?攪拌加熱保持溫度在45-70°C兩個(gè)小時(shí)，然后添加環(huán)氧氯丙烷保持溫度在45-70°C三個(gè)小 時(shí)，然后將反應(yīng)物放入沙芯漏斗吸干。此吸干反應(yīng)物是環(huán)氧活化瓊脂糖凝膠?；脤⒁叶范宜峤颖鄣江傊荂L-4B凝膠上，將2-3M碳酸鈉溶液加入吸干反應(yīng) 物是環(huán)氧活化瓊脂糖凝膠中，然后加入乙二胺二乙酸溶液，混合后在恒溫?cái)嚢杵魃蠑嚢杓?熱保持溫度在45-70°C十五個(gè)小時(shí)，然后將混合物放在沙芯漏斗吸干，此吸干混合物即為乙 二胺二乙酸瓊脂糖凝，可放在30%乙醇溶液4度下保存。3)加載過渡金屬離子，用PH= 7. 3緩沖溶液洗去乙二胺二乙酸瓊脂糖凝膠上的乙 醇溶液，然后用300mM金屬離子浸泡，再升用pH = 7. 3緩沖溶液洗滌。乙二胺二乙酸瓊脂糖凝的使用范圍主要是用于蛋白質(zhì)提純。1)乙二胺二乙酸與EDTA(乙二胺四乙酸)結(jié)構(gòu)相似差二個(gè)乙酸結(jié)構(gòu)，故金屬螯合 力強(qiáng)但比EDTA弱，乙二胺二乙酸能提供二個(gè)酸基和二個(gè)配位氮原子對進(jìn)行金屬螯合，乙二 胺二乙酸瓊脂糖凝膠作為固相強(qiáng)力金屬螯合合劑。2)乙二胺二乙酸瓊脂糖凝比目前廣泛應(yīng)用的次甲基三乙酸瓊脂糖凝膠(NTA瓊脂 糖凝膠)與金屬離子作用略有不同，次甲基三乙酸瓊脂糖凝膠提供三乙酸和一個(gè)氮原子與 金屬螯合，乙二胺二乙酸瓊脂糖凝膠提供二乙酸和二個(gè)氮原子與金屬螯合，乙二胺二乙酸 瓊脂糖凝膠提供不同的金屬螯合手段供蛋白純化。本發(fā)明采用膠聯(lián)結(jié)構(gòu)的4%瓊脂糖CL-4B為基質(zhì)是從Novelab. com公司購得。環(huán) 氧活化瓊脂糖，次甲基三乙酸瓊脂糖凝膠(NTA瓊脂糖凝膠)和其它原料也是從Novelab. com公司購得。應(yīng)用實(shí)例結(jié)合具體的實(shí)施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但以下僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施實(shí) 例，本發(fā)明內(nèi)容不受下列較佳實(shí)例的限制。實(shí)例一一，制備乙二胺二乙酸取6. 01克乙二胺放入500毫升燒杯內(nèi)，然后慢慢加入50 毫升水，充分溶解，制備成乙二胺水溶液，再取27. 8克溴乙酸放入500毫升燒杯內(nèi)，慢慢加 入100毫升的水，制備成溴乙酸水溶液，將盛有乙二胺水溶液的燒杯保持在4°C冰水中降 溫，然后將溴乙酸水溶液慢慢加入乙二胺水溶液，邊加入邊攪拌，形成乙二胺溴乙酸混合水 溶液。用2摩爾濃度的氫氧化鈉調(diào)整到pH值到9. 5。將2摩爾濃度的氫氧化鈉溶液滴入乙 二胺溴乙酸混合水溶液直至PH = 9. 5，氫氧化鈉溶液滴入速度要慢以免反應(yīng)過熱(此反應(yīng) 應(yīng)當(dāng)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行，操作人員要帶護(hù)目鏡)。將PH = 9. 5乙二胺溴乙酸反應(yīng)混合液慢慢加 熱到50°C兩個(gè)小時(shí)，然后冷卻到室溫，此時(shí)乙二胺已經(jīng)與溴乙酸反應(yīng)生成乙二胺二乙酸水 溶液。二，取購自 Novelab. com公司環(huán)氧活化瓊月旨糖(Epoxy-activated Agarose,Novelab.com)，20克，加入100毫升的2M碳酸鈉水溶液潤濕形成環(huán)氧活化瓊脂糖凝膠，然后將乙二胺 二乙酸水溶液加入到環(huán)氧活化瓊脂糖凝膠，恒溫50°C，緩慢攪拌20小時(shí)，攪拌后，將反應(yīng)產(chǎn) 物轉(zhuǎn)移到沙芯漏斗，用真空泵抽干，依次用1000蒸餾水，5% 500醋酸，蒸餾水1000毫升洗 至中性，此即為制備好的乙二胺二乙酸瓊脂糖凝膠，可在30%乙醇溶液中在4°C保存。實(shí)例二取購自Novelab. com公司的CL-4B瓊脂糖100毫升在沙芯漏斗吸干，稱50克吸干 的CL-4B瓊脂糖放入500毫升的燒杯內(nèi)，加入2M氫氧化鈉100毫升，環(huán)氧氯丙烷10毫升， 混合后在恒溫?cái)嚢杵魃蠑嚢杓訜岜３譁囟仍?5°C，一個(gè)小時(shí)，然后添加10毫升環(huán)氧氯丙烷 保持溫度在45C，半個(gè)小時(shí)，然后將反應(yīng)物放入沙芯漏斗吸干，再將環(huán)氧活化CL-4B瓊脂糖 轉(zhuǎn)移到500毫升的燒杯內(nèi)，加入3M碳酸鈉100毫升，加入按實(shí)例一制備的乙二胺二乙酸混 合后在恒溫?cái)嚢杵魃蠑嚢杓訜岜３譁囟仍?5°C，15個(gè)小時(shí)，將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到沙芯漏斗， 用真空泵抽干，依次用1000蒸餾水，5% 500醋酸，蒸餾水1000毫升洗至中性，此即為制備好的乙二胺二乙酸瓊脂糖凝膠，可在30%乙醇溶液 中在4°C保存。實(shí)例三二胺二乙酸瓊脂糖凝膠加載Ni，Cu和Ag離子，加載Ni離子取制備好的乙二胺二 乙酸瓊脂糖凝膠10毫升，轉(zhuǎn)移至層析柱內(nèi)，用pH7. 3緩沖溶液洗去乙二胺二乙酸瓊脂糖凝 膠上的乙醇溶液，然后用100毫升，300mM硫酸Ni浸泡，300毫升用pH7. 3緩沖溶液洗，此為 Ni 二胺二乙酸瓊脂糖凝膠。加載Cu離子取制備好的乙二胺二乙酸瓊脂糖凝膠10毫升，轉(zhuǎn) 移至層析柱內(nèi)，用PH = 7. 3緩沖溶液洗去乙二胺二乙酸瓊脂糖凝膠上的乙醇溶液，然后用 100毫升，300mM硫酸Cu浸泡，300毫升用pH = 7. 3緩沖溶液洗，此為Cu 二胺二乙酸瓊脂糖 凝膠。加載Ag離子取制備好的乙二胺二乙酸瓊脂糖凝膠10毫升，轉(zhuǎn)移至層析柱內(nèi)，用pH =7. 3緩沖溶液洗去乙二胺二乙酸瓊脂糖凝膠上的乙醇溶液，然后用100毫升，300mM硝酸 Ag浸泡，300毫升用pH = 7. 3緩沖溶液洗，此為Ag 二胺二乙酸瓊脂糖凝膠。參考文獻(xiàn)CN 100389325C 1997. 11. 5CN 1163902A 2002. 5. 10CN1100568C 2001. 1. 17蛋白質(zhì)分離色譜填料及特性，曾慶冰，功能高分子學(xué)報(bào)，第13卷第3期，2000Qiagen Product Guilde 2007, (NTA Agarose, page 272)Michele C. Smith etc. Immobilized Iminodiacetic Acid MetalComplexes, Identification of Chelating Peptide PurificationHandles for Recombinant Proteins, Inorg. Chem. 1987,26, 1965-1969。
權(quán)利要求
1.乙二胺二乙酸快速制備方法，包括以下步驟1)在控制溫度下，往乙二胺10-80%水溶液中定量慢慢加入溴乙酸(BrCH2COOH)，乙二 胺與溴乙酸摩爾濃度準(zhǔn)確控制在1 2，溴乙酸摩爾濃度準(zhǔn)確控制非常重要，應(yīng)當(dāng)準(zhǔn)確的控 制在1摩爾乙二胺與2摩爾溴乙酸的比例。2)慢慢加入30%碳酸鈉或其他堿溶液調(diào)節(jié)pH值至大約9以上，攪拌，控溫，使乙二胺 與入溴乙酸反應(yīng)完全生成乙二胺二乙酸，乙二胺與溴乙酸化學(xué)反應(yīng)式為NH2-CH2-CH2-NH2+2BrCH2C00H — NH (CH2COOH) -CH2-CH2-N (CH2COOH) +2Br3)副產(chǎn)物溴可以用物理或化學(xué)方法除去。例如，加硝酸銀沉淀，過濾。
2.乙二胺二乙酸瓊脂糖凝膠制備方法，包括以下步驟1)首先將瓊脂糖凝膠環(huán)氧活化，向瓊脂糖凝膠加入2M的氫氧化鈉和環(huán)氧氯丙烷，混 合，在30-70°C溫度下恒溫2-9小時(shí)，生成環(huán)氧活化的瓊脂糖凝膠。2)乙二胺二乙酸與瓊脂糖凝膠偶聯(lián)的具體方法是，先將環(huán)氧活化的瓊脂糖凝膠吸干， 然后加2M碳酸鈉溶液，再加適量的乙二胺二乙酸，在50-70°C溫度下恒溫5-15小時(shí)生成乙 二胺二乙酸瓊脂糖凝。3)加載過渡金屬離子，將乙二胺二乙酸瓊脂糖凝用稀醋酸和去離子水洗滌，然后用稀 硫酸鎳，或稀硫酸銅或其它過渡金屬鹽溶液浸泡，然后用pH = 7. 5的緩沖溶液沖洗，可以得 到不同的加載過渡金屬離子的乙二胺二乙酸瓊脂糖凝膠。
3.本發(fā)明乙二胺二乙酸瓊脂糖凝是四配體金屬螯材料，用于純化組胺酸標(biāo)記(His Tag)的蛋白質(zhì)和含組胺酸，賴氨酸豐富的蛋白質(zhì)。1)乙二胺二乙酸與EDTA(乙二胺四乙酸)的結(jié)構(gòu)相似但相差二個(gè)乙酸結(jié)構(gòu).乙二胺二 乙酸比金屬螯合力極強(qiáng)的EDTA的金屬鰲合力弱，乙二胺二乙酸是四配體金屬螯合材料具 有一定的金屬螯合性同時(shí)螯合上的金屬也可以在特定的條件下被洗脫.乙二胺二乙酸可 以提供二個(gè)酸基和由兩個(gè)氮原子提供兩個(gè)配位孤電子對進(jìn)行金屬螯合，本發(fā)明乙二胺二乙 酸瓊脂糖凝膠可以形成穩(wěn)定固相金屬鰲合基質(zhì)從而能夠與蛋白質(zhì)中的組胺酸，賴氨酸半胱 氨酸等形成強(qiáng)烈的鰲合作用。2)在純化蛋白中的應(yīng)用，目前廣泛應(yīng)用的次甲基三乙酸瓊脂糖凝膠(NTA瓊脂糖凝膠) 和亞胺基二乙酸瓊脂糖凝膠(IDA瓊脂糖凝膠)廣泛用于蛋白質(zhì)提純[1，2，3]，本發(fā)明乙二 胺二乙酸瓊脂糖凝膠與次甲基三乙酸瓊脂糖凝膠(NTA瓊脂糖凝膠)在用于蛋白純化時(shí)基 本作用原理一致，但配位體不同，IDA瓊脂糖凝膠提供一個(gè)氮原子和乙二酸根作為三配位體 金屬鰲合基質(zhì)，NTA瓊脂糖凝膠提供一個(gè)氮原子核三酸根作為四配位體金屬鰲合基質(zhì)，本發(fā) 明乙二胺二乙酸瓊脂糖凝膠提供二個(gè)氮原子和二酸根作為四配位體金屬鰲合基質(zhì)，故在蛋 白質(zhì)提純過程中可以展現(xiàn)出新的特異性，從而給蛋白質(zhì)純化工作提供了新的金屬螯合層析 填料選擇。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種金屬螯合層析填料制備方法，是通過4％-6％瓊脂糖凝膠和乙二胺二乙酸結(jié)合而成乙二胺二乙酸瓊脂糖凝膠(Ethylenediamine diacetic acid，EDDA瓊脂糖凝膠)。本發(fā)明首先提供了快速簡單制備乙二胺二乙酸方法，進(jìn)一步提供了乙二胺二乙酸與瓊脂糖凝膠結(jié)合的方法。乙二胺二乙酸瓊脂糖凝膠作為金屬螯合層析填料對過渡金屬有特強(qiáng)的金屬螯合性，能夠與過渡金屬離子強(qiáng)烈結(jié)合，特別適用于以過渡金屬為螯合物的蛋白質(zhì)提純。目前次甲基三乙酸瓊脂糖凝膠(NTA瓊脂糖凝膠)被廣泛用于蛋白質(zhì)提純，本發(fā)明乙二胺二乙酸瓊脂糖凝膠與次甲基三乙酸瓊脂糖凝膠(NTA瓊脂糖凝膠)一樣是四配體金屬螯材料，但是本發(fā)明的配位體的原子與NTA瓊脂糖凝膠不同，本發(fā)明比NTA瓊脂糖凝膠多出一個(gè)氮原子而少一個(gè)乙酸根參加金屬鰲合，故在蛋白質(zhì)提純過程中可以展現(xiàn)出新的特異性，從而給蛋白質(zhì)純化提供了新的金屬螯合層析填料選擇。
文檔編號C07C227/08GK102040674SQ200910196910
公開日2011年5月4日 申請日期2009年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月9日
發(fā)明者宛薇, 馬涌 申請人:宛薇, 馬涌