專利名稱：一種環(huán)脂肽類化合物制備及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及源于渤海潮間帶植物鹽地堿蓬(Suaeda salsa)的海洋芽孢桿菌 (B. marinus)B-9987產(chǎn)生的具有拮抗植物病原菌活性的新的環(huán)脂肽化合物MaribasinA及 其制備方法和在農(nóng)藥方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
由于海洋環(huán)境的特殊性，海洋微生物具有不同于陸地微生物的一些獨(dú)特的 代謝途徑，因而能產(chǎn)生大量的結(jié)構(gòu)新穎的活性代謝產(chǎn)物。如從海洋真菌頂頭孢霉 (Cephalosporiumacremonium)中分離并成功上市的第一個(gè)海洋新抗生素——頭孢菌素，開(kāi) 創(chuàng)了開(kāi)發(fā)海洋抗生素的先河。海洋芽孢桿菌能產(chǎn)生許多有價(jià)值的物質(zhì)。Carisse等(2003年)從堆肥中(包 括造紙廠淤泥、植物殘?bào)w等成分)分離出海洋芽孢桿菌，平板拮抗實(shí)驗(yàn)和盆栽試驗(yàn)均表明 其對(duì)黃瓜猝倒病菌——終極腐霉(Pythium ultimum)的生長(zhǎng)有較強(qiáng)抑制作用。張海龍等 (2004年)從海洋芽孢桿菌中發(fā)現(xiàn)了 3個(gè)新環(huán)脂肽化合物Mixirin A-C，它們具有細(xì)胞毒 活性。Ashish等(2006年)發(fā)現(xiàn)海洋芽孢桿菌產(chǎn)的纖維素酶在pH6和50°C時(shí)活性較好。 Noureddin等(2006年)發(fā)現(xiàn)海洋芽孢桿菌可以產(chǎn)葡萄糖_6_磷酸脫氫酶和6-磷酸葡萄 糖脫氫酶。田黎等(2007年)報(bào)道了一株海洋芽孢桿菌B. marinus B-9987產(chǎn)生的3個(gè)新 的大環(huán)內(nèi)酯類化合物Macrolactin 0、P和Q，研究發(fā)現(xiàn)，這3個(gè)新化合物對(duì)交鏈孢和稻瘟霉 具有很好的抑制活性。此外，還發(fā)現(xiàn)含有該類物質(zhì)的海洋芽孢桿菌B.marinus B-9987發(fā)酵 濃縮液可有效地抑制植物病原菌的生長(zhǎng)。海洋芽孢桿菌因其具有抑菌作用強(qiáng)、抗逆性強(qiáng)及 易于加工成劑型等諸多優(yōu)勢(shì)，十分適合于開(kāi)發(fā)成微生物農(nóng)藥。發(fā)明人所在課題組成功研發(fā) 的10億CFU/g海洋芽孢桿菌可濕性粉劑作為農(nóng)藥非常安全，屬微毒類農(nóng)藥，初步的盆栽和 田間小區(qū)試驗(yàn)結(jié)果表明該可濕性粉劑對(duì)灰霉病、白粉病、青枯病、軟腐病、早疫病、霜霉病具 有較好的防治效果(中國(guó)發(fā)明專利公開(kāi)號(hào)CN101331881)。脂肽類物質(zhì)主要來(lái)源于微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物，由親水的肽鍵和親油的脂肪烴鏈 兩部分組成，分為線性脂肽和環(huán)狀脂肽兩大類。由于其特殊的兩親分子結(jié)構(gòu)造就了微生物 脂肽具有優(yōu)良的表面活性，在醫(yī)藥、食品、化妝品、生物防治、環(huán)境治理及微生物采油等領(lǐng)域 具有重要的應(yīng)用前景。環(huán)脂肽類化合物多數(shù)具有抗菌活性，其中最為成功的例子是達(dá)托霉素，它是第一 個(gè)應(yīng)用于臨床的環(huán)脂肽類抗生素，用于治療由革蘭陽(yáng)性菌感染所致的并發(fā)性皮膚及皮膚感 染，包括甲氧西林耐藥菌金葡菌及對(duì)萬(wàn)古霉素抗性的糞腸球菌，作用機(jī)制獨(dú)特。枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是一類重要的根際微生物，能夠促進(jìn)植物 抵抗病原菌的侵染，因而被廣泛應(yīng)用于植物病害的生物防治。B. subtilis能夠產(chǎn)生幾十 種不同結(jié)構(gòu)的抗生素，其中非核糖體合成的脂肽類抗生素是其中最常見(jiàn)的一類，主要包括 iturin、surfactin和fengyciM個(gè)家族。脂肽類抗生素由氨基酸鏈和脂肪酸側(cè)鏈組成， 穩(wěn)定性好，對(duì)人畜無(wú)害，不污染環(huán)境，是具有重要開(kāi)發(fā)價(jià)值的新型生物源農(nóng)藥。國(guó)外有報(bào)道iturin成功應(yīng)用于生物防治的例子(KlichMA，1994年)。Catherine等(2001年)發(fā)現(xiàn)脂肽類生物表面活性劑能選擇性除去土壤中的Pb、 ZruCu和Cd等金屬離子，其中Cu2+最易去除。黃現(xiàn)青等(2006年)研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌fmbj株產(chǎn)生的抗微生物脂肽可以直 接作用于體外抗偽狂犬病病毒(Pseudorabies viru)和豬細(xì)小病毒(Porcine parvoviru) 南京株，從而抑制其對(duì)豬腎(Porcine Kidney)細(xì)胞的感染作用。Kim等(2007年)研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)脂肽Surfactin (MW 1036)能夠抑制Lovo細(xì)胞的增 殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能為抑制細(xì)胞生存調(diào)節(jié)信號(hào)通路ERK和PI3K/Akt。王大威等(2008年)研究發(fā)現(xiàn)，從大慶油田中分離到的一株枯草芽孢桿菌 (B. subtilis)ZW-3產(chǎn)生的脂肽類生物表面活性劑具有優(yōu)良的乳化和降低油水界面張力的 能力，并可以適應(yīng)油藏中復(fù)雜的環(huán)境，可提高采收率9.2%，在微生物采油中具有非常好的 應(yīng)用前景。薛春美等(2008年)報(bào)道從海洋芽孢桿菌中分離得到了 Macrolactin T和U以及 已知結(jié)構(gòu)Macrolactin A、B、D、0、S，其中Macrolactin T、B、D對(duì)稻瘟病菌、番茄早疫病菌 及金黃色葡萄球菌具有拮抗作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明者經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，由海洋芽孢桿菌(B. marinus)B-9987產(chǎn)生的1個(gè)新環(huán)脂 肽化合物Maribasin A對(duì)番茄早疫病菌(Alternaria solani)和香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. cuberse)等植物病原菌均具有很好的抑制活性，因此可以用作農(nóng)藥來(lái)防 治由這些病原菌引起的植物病害。本發(fā)明的目的在于提供海洋芽孢桿菌(B. marinus)B-9987產(chǎn)生的一個(gè)新的具有 應(yīng)用價(jià)值的環(huán)脂肽化合物及其制備方法和應(yīng)用。具體地說(shuō)，本發(fā)明第一方面提供具有新結(jié) 構(gòu)環(huán)脂肽化合物MaribasinA，所述化合物結(jié)構(gòu)如附圖所示。當(dāng)用于本發(fā)明時(shí)，術(shù)語(yǔ)"本發(fā)明的化合物"或類似術(shù)語(yǔ)的含義不僅包括了上述結(jié) 構(gòu)式所定義的化合物，還包括了它們的鹽。所述鹽可以是水溶、脂溶或可分散產(chǎn)物的形式， 其可通過(guò)和無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸或堿反應(yīng)形成。這些酸加成鹽的例子包括乙酸鹽、己二酸鹽、藻 酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、丁酸鹽、檸檬酸鹽、十二烷基磺酸鹽、鹽酸鹽、草酸鹽、 丙酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽。堿性鹽包括銨鹽，堿金屬鹽，如鈉鹽和鉀鹽，堿土金屬鹽，如鈣 鹽和鎂鹽，有機(jī)堿的鹽，如二環(huán)己胺鹽等。本發(fā)明的化合物也可以其互變異構(gòu)形式存在。盡管未在這里描述的化合物中明確指出這些形式，但它們也包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。除非另有說(shuō)明，這里所述化合物的化學(xué) 名包括所有可能的、所述化合物可包含的立體化學(xué)異構(gòu)形式的混合物。所述混合物可含有 所述化合物基礎(chǔ)分子結(jié)構(gòu)的所有非對(duì)映異構(gòu)體和/或?qū)τ钞悩?gòu)體。本發(fā)明化合物所有的立 體化學(xué)異構(gòu)形式可以是純化形式，或者是相互混合的形式，這都包含在本發(fā)明范圍之內(nèi)。本發(fā)明第二方面提供了一種制備上述化合物的方法，其特征在于，該方法包括以 下步驟(1)培養(yǎng)海洋芽孢桿菌(Bacillus marinus)B-9987，得到發(fā)酵液；(2)用選自有機(jī)溶劑萃取、酸沉淀、浸提或?qū)游龅姆椒◤乃霭l(fā)酵液中分離獲得所述化合物。本發(fā)明方法所涉及的菌株為海洋芽孢桿菌(B.marinUS)B-9987，該菌株從渤海潮 間帶植物鹽地堿蓬中分離得到，該菌株已于2007年6月18日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏 管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)(北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物 研究所)，保藏號(hào)為CGMCC No. 2095，并公開(kāi)于中國(guó)專利申請(qǐng)CN 101333206A中。 本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“發(fā)酵”或“培養(yǎng)”具有本領(lǐng)域技術(shù)人員通常熟知且承認(rèn)的含 義。所述“發(fā)酵液”或“培養(yǎng)液”可通過(guò)在適合生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的海洋芽孢桿菌 B. marinus B-9987,使其生長(zhǎng)至一定的細(xì)菌濃度來(lái)獲得。 用于培養(yǎng)本發(fā)明菌株的培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)源沒(méi)有特別的限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以 根據(jù)公知的技術(shù)來(lái)選擇合適的碳源、氮源和其它營(yíng)養(yǎng)源。例如，碳源可以是淀粉、糊精、甘 油、葡萄糖、蔗糖、肌醇、甘露醇等。氮源可以是胨、大豆粉、蛋白粉、肉膏、米糖、麥皮、酵母 粉、玉米漿、銨鹽以及其它有機(jī)或無(wú)機(jī)含氮化合物。另外，培養(yǎng)基中還可適當(dāng)加入一些無(wú)機(jī) 鹽類，如氯化鈉、磷酸鹽(如磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀等)、硫酸銨、硫酸錳、硫酸鎂、碳酸鈣 等金屬鹽。通?？刹捎酶鞣N已知的常規(guī)培養(yǎng)基，如LB瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、葡萄糖 酵母膏瓊脂培養(yǎng)基和牛肉浸汁瓊脂培養(yǎng)基等。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，用于培養(yǎng)本發(fā)明菌 株的培養(yǎng)基具有以下組成(％表示質(zhì)量/體積)葡萄糖0. 1%、蔗糖0. 2%、酵 母粉 0.01% 1.5%、蛋白粉 0. l%、MgCl2 0. 001% 0. 1%、KCl 0.01% 0.5%、 KH2PO4 0.01% 0.5%和NaCl 0. 6%、pH 6. 0 7. 0。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理 解，本發(fā)明并不局限于本文中列舉的這些具體培養(yǎng)基配方。培養(yǎng)本發(fā)明中的菌株的溫度、pH、氣液比、罐壓、轉(zhuǎn)速等條件沒(méi)有特別嚴(yán)格的限制， 只要該條件適合該菌的生長(zhǎng)即可。在培養(yǎng)時(shí)可采用豆油、泡敵等消泡劑進(jìn)行消泡。在一些較佳的實(shí)施方案中，pH宜 控制在5. 5 8. 0之間，培養(yǎng)溫度宜在20 35°C之間。培養(yǎng)時(shí)間通常在12h 200h之間， 最終的菌濃度通常可高達(dá)5X 107cfu/ml IX IollCfuAiltj在本發(fā)明的一個(gè)較佳的實(shí)施方案中，通過(guò)以下方法培養(yǎng)所述海洋芽孢桿菌來(lái)得到 發(fā)酵液在含有碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽的培養(yǎng)基中，在通氣量控制在氣液比為0.2 1 2 1、 轉(zhuǎn)速在lOOr/min或以上，培養(yǎng)所述海洋芽孢桿菌24小時(shí)以上，其中所述碳源選自葡萄糖、 蔗糖、淀粉和大米粉中的1種或幾種，所述氮源選自蛋白粉、酵母粉、花生餅粉和大豆粉中 的1種或幾種，所述無(wú)機(jī)鹽包括常規(guī)的無(wú)機(jī)鹽(如MgS04、(NH4)2S04、MgCl2、KCl、KH2P04、NaCl、 K2HPO4 和 CaCO3)。上述列舉的這些參數(shù)只是實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的較佳方案。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員在上述 范圍以外選擇合適的培養(yǎng)條件也能獲得本發(fā)明的發(fā)酵液。在獲得了上述發(fā)酵液后，用選自有機(jī)溶劑萃取、酸沉淀、浸提或?qū)游龅姆椒◤陌l(fā)酵 液中分離獲得目標(biāo)化合物。本發(fā)明的化合物可以從發(fā)酵液的發(fā)酵清液中分離得到，也可以 從發(fā)酵液中的菌體分離得到。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，也可分別從發(fā)酵清液(也稱上清液或 發(fā)酵上清液)和菌體中分離得到含本發(fā)明的化合物的粗品或浸提液，混合后再進(jìn)行進(jìn)一步 的分離純化。因此，作為本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選方案，首先從所述發(fā)酵液分離得到上清液，用選 自乙酸乙酯、氯仿、醋酸丁酯或正丁醇的溶劑萃取，然后用柱層析以氯仿/甲醇梯度洗脫，收集氯仿/甲醇為2 1至O 1的洗脫部位，用HPLC制備得到本發(fā)明所述的化合物。從發(fā)酵液來(lái)分離上清液可采用常規(guī)的分離手段如離心過(guò)濾等。然后，在獲得上清 液后，一種可行的方式是用有機(jī)溶劑(例如，氯仿、乙酸乙酯、醋酸丁酯或正丁醇)進(jìn)行萃 取。優(yōu)選的方案是采用有機(jī)溶劑的組合進(jìn)行所述萃取，例如，依次采用乙酸乙酯和正丁醇萃 取；依次采用氯仿、乙酸乙酯和正丁醇進(jìn)行萃??；依次采用醋酸丁酯和正丁醇進(jìn)行萃取等。 另一個(gè)可行的方案是，先如上所述獲得上清液，然后使上清液酸化沉淀，用無(wú)水甲 醇對(duì)酸化沉淀浸提。具體地說(shuō)，在上清液中加入酸(如鹽酸)，使溶液靜置，然后離心得到酸 化沉淀和酸化上清液。在本申請(qǐng)的一個(gè)方案中，采用5N鹽酸溶液進(jìn)行酸化。本領(lǐng)域技術(shù)人 員也可以適當(dāng)?shù)卣{(diào)整鹽酸濃度同樣可以得到酸化沉淀。隨后，將酸化沉淀的PH調(diào)至中性后 冷凍干燥，用無(wú)水甲醇浸提一次或多次，每次浸提時(shí)間為6-12小時(shí)。還有一種可行的方式是采用諸如離心分離等常規(guī)手段從發(fā)酵液分離得到菌體。然 后，用無(wú)水甲醇浸提所述菌體一次或多次，每次浸提時(shí)間6-12小時(shí)。隨后，用柱層析進(jìn)行氯仿/甲醇梯度洗脫前述步驟得到的正丁醇萃取活性部位或 無(wú)水甲醇浸提物，收集氯仿/甲醇為2 1至0 1的洗脫部位(優(yōu)選氯仿/甲醇1 1 的洗脫部位)。所用的柱層析例如可以是硅膠柱層析。最后，用Sephadex LH-20和/或 HPLC(分析和制備條件均為70%甲醇水溶液)等制備獲得所述化合物。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，完全能夠根據(jù)常規(guī)技術(shù)采用其它的分離手段、溶 劑或洗脫劑來(lái)分離得到本發(fā)明的化合物。因此，本發(fā)明方法的范圍并不局限于說(shuō)明書(shū)實(shí)施 例中所用的具體方法。本發(fā)明另一方面提供了一種農(nóng)藥組合物，其特征在于，所述組合物包含本發(fā) 明所述的化合物作為活性組分，以及農(nóng)藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的農(nóng)藥組合物 可用于抑制番茄早疫病菌(A. solani)、甜瓜果腐病菌(F. oxysporum)、棉花黃萎病菌 (V. alboatrum)、小麥赤霉病菌(F. graminearum)、白術(shù)白絹病菌(Sclerotium sp.)、青霉病 菌(Penicillium sp.)、黃瓜灰霉病菌(B. cinerea)、番爺灰霉病菌(B. cinerea)、玉米小斑 病菌(D. turcica)、水稻紋枯病菌(R. solani)、瓜炭疽病菌(Colletotrichum sp·)、香蕉枯 萎病菌(F. oxysporum f. sp. cuberse)、番爺青枯病菌(R. solanacearum)禾口白菜軟腐病菌 (E. carotovora var. carotovora)本發(fā)明的化合物或農(nóng)業(yè)組合物可以直接以發(fā)酵液形式施用，也可將其適當(dāng)稀釋 (例如稀釋10倍、100倍、1000倍或更高)以稀釋液形式施用。本發(fā)明的化合物或其組合物 可以施加到植物的根、葉、莖等部位上。施加方法是本領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)，例如可以是在播 種時(shí)浸種，移栽前將植物根部浸在發(fā)酵液或其稀釋液中，或者直接將發(fā)酵液或稀釋液潑澆 在苗床上。可定植時(shí)進(jìn)行灌根，也可在植物生長(zhǎng)過(guò)程中灌根。如果所述農(nóng)藥組合物是以載 體形式保存的，則可在臨用前用水稀釋后再進(jìn)行施加。至于本發(fā)明的最適施藥劑量，本領(lǐng)域 技術(shù)人員無(wú)需經(jīng)過(guò)過(guò)多試驗(yàn)即可確定。


附圖所示結(jié)構(gòu)圖即為化合物MaribasinA的結(jié)構(gòu)圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1利用酸沉淀法從海洋芽孢桿菌(Bacillus marinus)B-9987發(fā)酵液中分離得到新環(huán)脂肽化合物Maribasin A本實(shí)施例通過(guò)常規(guī)的分離手段從海洋芽孢桿菌B. marinus B-9987的發(fā)酵液中獲 得了新的環(huán)脂肽化合物Maribasin A。具體分離純化步驟如下(1)將海洋芽孢桿菌(B. marinus) B-9987在合適的條件下培養(yǎng)得到30L發(fā)酵液。海 洋芽孢桿菌B-9987菌種經(jīng)平板活化后接種于一級(jí)種子搖瓶培養(yǎng)12-24h后作為一級(jí)種子， 將該一級(jí)種子接種于二級(jí)種子搖瓶，培養(yǎng)12_24h后接種于50L發(fā)酵罐中。在28°C、300rpm 下培養(yǎng)20h左右即可結(jié)束。(2) 30L發(fā)酵液4000rpm離心后得到發(fā)酵上清液和濕菌體。發(fā)酵上清液加5N鹽酸 溶液酸化并靜置沉淀后離心(4000rpm)得到酸化沉淀和酸化上清液。將酸化沉淀pH調(diào)至 7. 0后冷凍干燥，得到凍干沉淀174. 8g，用無(wú)水甲醇(440mL，220mL，220mL)依次浸提3次， 每次浸提時(shí)間12小時(shí)，將浸提液合并減壓濃縮至干，得到酸化沉淀浸提粗品共10. 2g。將 酸化沉淀浸提粗品經(jīng)硅膠柱層析以氯仿/甲醇10 1-0 1梯度洗脫(500mL/流分)， 對(duì)洗脫的流分進(jìn)行生物活性檢測(cè)，指示菌為番茄早疫病菌(A. solani)，結(jié)果顯示抑菌活性 物質(zhì)主要集中在氯仿/甲醇1 1和甲醇洗脫部位，且以氯仿/甲醇1 1洗脫部位活性 更強(qiáng)，將上述活性流分經(jīng)TLC檢測(cè)后合并。將合并后的活性流分經(jīng)S印hadex LH-20柱層析 以甲醇洗脫，對(duì)洗脫流分進(jìn)行如上的生物活性檢測(cè)，生物活性檢測(cè)后的活性流分經(jīng)TLC檢 測(cè)后合并。將合并后的活性流分經(jīng)HPLC分析并制備(分析和制備條件均為70%甲醇水溶 液)，最終制備得到化合物MaribasinA。實(shí)施例2利用有機(jī)溶劑提取法從海洋芽孢桿菌(Bacillus marinus)B-9987菌體 中分離得到新環(huán)脂肽化合物Maribasin A本實(shí)施例通過(guò)常規(guī)的分離手段從海洋芽孢桿菌B. marinus B-9987菌體中獲得了 新的環(huán)脂肽化合物Maribasin A。具體分離純化步驟如下(1)將海洋芽孢桿菌(B. marinus)B-9987在合適的條件下培養(yǎng)得到30L發(fā)酵液 (具體的培養(yǎng)條件和步驟同實(shí)施例1)。(2)30L發(fā)酵液4000rpm離心后得到發(fā)酵上清液和濕菌體。濕菌體經(jīng)過(guò)水洗離心后 冷凍干燥，得到干菌體92. Og,用無(wú)水甲醇(600mL，300mL, 300mL)依次浸提3次，每次浸提 時(shí)間12小時(shí)，將浸提液合并減壓濃縮至干得到菌體浸提粗品共17. 3g。將菌體浸提粗品經(jīng) 硅膠柱層析以氯仿/甲醇10 1-0 1梯度洗脫(500mL/流分)，對(duì)洗脫的流分進(jìn)行生 物活性檢測(cè)，指示菌為番茄早疫病菌(A. solani)，結(jié)果顯示抑菌活性物質(zhì)主要集中在氯仿 /甲醇1 1和甲醇洗脫部位，且以氯仿/甲醇1 1洗脫部位活性更強(qiáng)，將上述活性流分 經(jīng)TLC檢測(cè)后合并。將合并后的活性流分經(jīng)S印hadex LH-20柱層析以甲醇洗脫，對(duì)洗脫流 分進(jìn)行生物活性檢測(cè)，指示菌為番茄早疫病菌(A. solani)，生物活性檢測(cè)后的活性流分經(jīng) TLC檢測(cè)后合并。將合并后的活性流分經(jīng)HPLC分析并制備(分析和制備條件均為70%甲 醇水溶液)，最終制備得到化合物MaribasinA。實(shí)施例3利用有機(jī)溶劑萃取法從海洋芽孢桿菌(Bacillus marinus)B-9987發(fā)酵 清液中分離得到新環(huán)脂肽化合物Maribasin A本實(shí)施例通過(guò)常規(guī)的分離手段從海洋芽孢桿菌B. marinus B-9987的發(fā)酵清液中獲得了新的環(huán)脂肽化合物Maribasin A。具體分離純化步驟如下(1)將海洋芽孢桿菌(B. marinuS)B-9987在合適的條件下培養(yǎng)得到IOL發(fā)酵液。海 洋芽孢桿菌B-9987菌種經(jīng)平板活化后接種于一級(jí)種子搖瓶培養(yǎng)12-24h后作為一級(jí)種子， 將該一級(jí)種子接種于二級(jí)種子搖瓶，培養(yǎng)12-24h后接種于5L發(fā)酵罐中。在28°C、300rpm 下培養(yǎng)20h左右即可結(jié)束。共發(fā)酵3個(gè)5L罐獲得IOL發(fā)酵液。(2) IOL發(fā)酵液4000rpm離心后得到發(fā)酵上清液和濕菌體。發(fā)酵上清液用等體積乙 酸乙酯分別萃取3次，每次萃取時(shí)間12小時(shí)，將乙酸乙酯萃取相合并減壓濃縮至原發(fā)酵液 體積。再用等體積正丁醇對(duì)乙酸乙酯萃余相分別萃取3次，每次萃取時(shí)間12小時(shí)，將正丁 醇萃取相合并減壓濃縮至原發(fā)酵液體積。對(duì)上述乙酸乙酯萃取相、正丁醇萃取相與萃余相 進(jìn)行生物活性檢測(cè)，指示菌為番茄早疫病菌(A. solani)，確定正丁醇部位為主要抑菌活性 部位。將正丁醇萃取相合并減壓濃縮至干，得到正丁醇萃取物粗品共13. Sg。將正丁醇萃 取物粗品經(jīng)硅膠柱層析以氯仿/甲醇10 1-0 1梯度洗脫(500mL/流分)，對(duì)洗脫的 流分進(jìn)行生物活性檢測(cè)，指示菌為番茄早疫病菌(A. solani)，結(jié)果顯示抑菌活性物質(zhì)主要 集中在氯仿/甲醇1 1和甲醇洗脫部位，且以氯仿/甲醇1 1洗脫部位活性更強(qiáng)，將上 述活性流分經(jīng)TLC檢測(cè)后合并。將合并后的活性流分經(jīng)S印hadex LH-20柱層析以甲醇洗 脫，對(duì)洗脫流分進(jìn)行生物活性檢測(cè)，指示菌為番茄早疫病菌(A. solani)，生物活性檢測(cè)后的 活性流分經(jīng)TLC檢測(cè)后合并。將合并后的活性流分經(jīng)HPLC分析并制備(分析和制備條件 均為70%甲醇水溶液)，最終制備得到化合物MaribasinA。實(shí)施例4新環(huán)脂肽化合物Maribasin A的結(jié)構(gòu)鑒定和分析(I)Maribasin A結(jié)構(gòu)鑒定和分析將實(shí)施例1獲得的新的環(huán)脂肽化合物Maribasin A進(jìn)行分析和鑒定，其結(jié)果如下MaribasinA化學(xué)結(jié)構(gòu)如附圖所示。其為無(wú)色固體粉末，UV254nm下有暗斑，碘蒸汽 顯色下呈黃色。mp > 250 0C ；IR(KBr) vmax (cm-1) :3333，2929，2864，1659，1545，1449，1423， 1247,1128。HRFAB-MS m/z 1079. 6465 [M+Na] + (calcd for C49H76N12O14)。1H^13C NMR 數(shù)據(jù)、 1H-1H COSY 及 HMBC，見(jiàn)表 1。表1化合物Maribasin A的結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)表(DMS0_d6) 實(shí)施例5Maribasin A對(duì)植物病原菌的抑制作用本實(shí)施例考察了實(shí)施例1獲得的化合物MaribasinA對(duì)植物病原菌的抑制作用。采用平板拮抗法考察Maribasin A對(duì)番茄早疫病菌(A. solani)、甜瓜果腐病菌 (F. oxysporum)、棉花黃萎病菌(V. alboatrum)、小麥赤霉病菌(F. graminearum)、白術(shù)白絹 病菌(Sclerotium sp.)、青霉病菌(Penicillium sp.)、黃瓜灰霉病菌(B. cinerea)、番爺灰 霉病菌(B. cinerea)、玉米小斑病菌(D. turcica)、水稻紋枯病菌(R. solani)、瓜炭疽病菌 (Colletotrichum sp.)和香蕉枯萎病菌(F. oxysporum f. sp. cuberse)等植物病原菌的抑 制作用。Maribasin A對(duì)植物病原菌的MIC如表2所示。
表2Maribasin A對(duì)植物病原菌的抑制作用(μ g/ml) 從表2中可以看出MaribasinA對(duì)白術(shù)白絹病菌(Sclerotium sp.)、青霉病菌 (Penicillium sp.)和瓜炭疽病菌(Colletotrichum sp.)等植物病原菌具有較強(qiáng)的抑菌活性。實(shí)施例6含有Maribasin A的海洋芽孢桿菌(Bacillus marinus)B-9987發(fā)酵液 對(duì)植物病原菌的抑制活性本實(shí)施例考察了含有本發(fā)明所述的化合物Maribasin A的海洋芽孢桿菌 (B. marinus) B-9987發(fā)酵液可有效抑制植物病原菌的生長(zhǎng)。本實(shí)施例采用平板拮抗法考察含有Maribasin A的海洋芽孢桿菌(B. marinus) B-9987發(fā)酵液對(duì)植物病原菌的抑制作用。病原真菌抑菌譜的測(cè)定將于4°C斜面中保存的的植物致病真菌接于PDA平板 在28°C的條件下活化培養(yǎng)大約一周，待真菌長(zhǎng)滿整個(gè)平板后結(jié)束培養(yǎng)，用已滅菌的直徑為 14. 50mm的打孔器在活化的病原真菌菌落外緣打一菌餅，將菌餅正面向上放置于對(duì)峙培養(yǎng) 平板的一側(cè)，靠近皿壁約1cm，用接種針取1環(huán)培養(yǎng)獲得的B-9987發(fā)酵液，在對(duì)峙平板內(nèi)平 行于菌塊劃一條菌線，劃線距離視病原真菌的生長(zhǎng)速度而定，將對(duì)峙培養(yǎng)平板放入28°C培 養(yǎng)5d后記錄抑菌帶寬度。病原細(xì)菌抑菌譜的測(cè)定將培養(yǎng)24h的病原菌液混入相應(yīng)半固體培養(yǎng)基中(使含 菌平板達(dá)到IO9CfuAiL)，然后倒在制備好的水瓊脂平板上，冷卻后在半固體平板中央打直 徑為14. OOmm的孔，然后將B-9987發(fā)酵液加入孔中，每孔150 μ L，30°C培養(yǎng)24h后記錄抑菌 圈大小。其結(jié)果如表3所示。表3海洋芽孢桿菌B-9987發(fā)酵液對(duì)植物病原菌的抑制作用 由表3的抑制活性可知，含有化合物Maribasin A的海洋芽孢桿菌(B. marinus) B-9987發(fā)酵液可有效地抑制植物病原菌的生長(zhǎng)。盡管上面已經(jīng)描述了本發(fā)明的具體例子，但是有一點(diǎn)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是 明顯的，即在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的前提下可對(duì)本發(fā)明作各種變化和改動(dòng)。因此，所 附權(quán)利要求覆蓋了所有這些在本發(fā)明范圍內(nèi)的變動(dòng)。
權(quán)利要求
脂肽類化合物Maribasin A，所述化合物分子式C49H76N12O14，是由1個(gè)絲氨酸殘基、1個(gè)脯氨酸殘基、1個(gè)谷氨酰胺殘基、1個(gè)酪氨酸殘基和3個(gè)天冬酰胺殘基以及1個(gè)β-脂肪酸殘基組成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，連接順序?yàn)榄h(huán)(脯氨酸-谷氨酰胺-天冬酰胺-絲氨酸-天冬酰胺-酪氨酸-天冬酰胺-β-脂肪酸)。
2.一種制備權(quán)利要求1所述的化合物的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)培養(yǎng)海洋芽孢桿菌(BacillusmarinuS)B-9987，得到發(fā)酵液；(2)用選自有機(jī)溶劑萃取、浸提或?qū)游龅姆椒◤乃霭l(fā)酵液中分離獲得所述化合物。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)包括以下一個(gè)或多個(gè)步驟(a)從所述發(fā)酵液分離得到上清液，用選自氯仿、乙酸乙酯、醋酸丁酯或正丁醇的溶劑 萃取，然后用柱層析以氯仿/甲醇梯度洗脫，收集氯仿/甲醇為2 1至0 1的洗脫部位， 用S印hadexLH-20和/或HPLC制備得到權(quán)利要求1所述的化合物；(b)從所述發(fā)酵液分離得到上清液，使上清液酸化沉淀，用無(wú)水甲醇對(duì)酸化沉淀浸提， 浸提液用柱層析以氯仿/甲醇梯度洗脫，收集氯仿/甲醇為2 1至0 1的洗脫部位，用 SephadexLH-20和/或HPLC制備得到權(quán)利要求1所述的化合物；(c)從所述發(fā)酵液分離得到菌體，用無(wú)水甲醇浸提，浸提液用柱層析以氯仿/甲醇梯度 洗脫，收集氯仿/甲醇為2 1至0 1的洗脫部位，用S印hadex LH-20和/或HPLC制備 得到權(quán)利要求1所述的化合物。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述柱層析是硅膠柱層析。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述HPLC的制備條件均為70%甲醇水溶液。
6.一種農(nóng)藥組合物，其特征在于，所述組合物包含權(quán)利要求1所述的化合物作為活性 組分，以及農(nóng)藥學(xué)上可接受的載體。
7.權(quán)利要求1所述的化合物在作為農(nóng)藥中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述農(nóng)藥用于抑制番茄早疫病菌 (A. solani)、甜瓜果腐病菌(F. oxysporum)、棉花黃萎病菌(V. alboatrum)、小麥赤霉病菌 (F. graminearum)、白術(shù)白絹病菌(Sclerotium sp.)、青霉病菌(Penicillium sp.)、黃瓜灰 霉病菌(B. cinerea)、番茄灰霉病菌(B. cinerea)、玉米小斑病菌(D. turcica)、水稻紋枯病 菌(R. solani)、瓜炭疽病菌(Colletotrichum sp.)禾口香蕉才古萎病菌(F. oxysporum f. sp. cuberse)等植物病原菌。
9.一種防治植物病害的方法，其特征在于，將權(quán)利要求1所述的化合物或權(quán)利要求6所 述的農(nóng)藥組合物施加到所述植物上。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述植物病害的病原菌選自番茄早疫病 菌(A. solani)、甜瓜果腐病菌(F. oxysporum)、棉花黃萎病菌(V. alboatrum)、小麥赤霉病 菌(F. graminearum)、白術(shù)白絹病菌(Sclerotium sp·)、青霉病菌(Penicillium sp·)、黃 瓜灰霉病菌(B. cinerea)、番茄灰霉病菌(B. cinerea)、玉米小斑病菌(D. turcica)、/K稻 紋枯病菌(R. solani)、瓜炭疽病菌(Colletotrichum sp·)、香蕉枯萎病菌(F. oxysporum f. sp. cuberse)、番爺青枯病菌(R. solanacearum)禾口 白菜軟腐病菌(E. carotovora var. carotovora)等植物病原菌。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的海洋芽孢桿菌B-9987產(chǎn)脂肽類化合物Maribasin A。本發(fā)明還涉及所述化合物Maribasin A的制備方法以及該化合物作為農(nóng)藥的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07K1/36GK101838314SQ200910198819
公開(kāi)日2010年9月22日 申請(qǐng)日期2009年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月16日
發(fā)明者劉榮峰, 張道敬, 李元廣, 李淑蘭, 沈國(guó)敏, 田黎, 羅遠(yuǎn)嬋, 陶黎明, 魏鴻剛 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué);上海澤元海洋生物技術(shù)有限公司