專利名稱：一種基于抗菌肽的雙功能融合蛋白及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及具有生物活性的多肽的人工設(shè)計(jì)和合成，特別涉
及一種基于抗菌肽的雙功能融合蛋白及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
1、抗菌肽研究進(jìn)展 隨著"傳統(tǒng)抗生素"的廣泛使用，導(dǎo)致大量的抗藥菌株的產(chǎn)生，并且在病原菌感染時(shí)，如果用抗生素進(jìn)行治療，會剌激機(jī)體內(nèi)毒素的釋放，對機(jī)體造成傷害。因此，尋找新一代抗菌劑成為新藥開發(fā)的熱點(diǎn)，而抗菌肽(antimicrobial p印tides)的發(fā)現(xiàn)克服了傳統(tǒng)抗生素的以上缺陷。 抗菌肽是一類具有抗菌活性短肽的總稱，最早是由Boman等從惜古比天蠶蛹中誘導(dǎo)分離得到的，目前為止已經(jīng)明確的抗菌肽已不下幾百種，其來源、抗菌譜、結(jié)構(gòu)均不盡相同。其中，昆蟲抗菌肽具有一些共同的特點(diǎn)，如分子量小，為堿性肽類物質(zhì)，具有熱穩(wěn)定性，具有兩親性的分子結(jié)構(gòu)。昆蟲抗菌肽按照其分子結(jié)構(gòu)，可以分為四類第一類為不含半胱氨酸殘基的、具有兩個(gè)雙親a螺旋結(jié)構(gòu)的抗菌肽；第二類為富含半胱氨酸殘基的抗菌肽；第三類為富含脯氨酸殘基的抗菌肽；第四類為富含甘氨酸殘基的抗菌肽。其中，第一類以天蠶素(Cecropin)為代表，它含有31-39個(gè)氨基酸，分子量約為4kD，分子內(nèi)具有兩個(gè)雙親a螺旋結(jié)構(gòu)，N端區(qū)帶高度正電荷，C端區(qū)帶高度負(fù)電荷，抗菌譜包括革蘭氏陽性菌和陰性菌。
與青霉素等傳統(tǒng)抗生素對細(xì)菌作用機(jī)制不同，抗菌肽分子通過其兩親a -螺旋上正電荷與細(xì)菌細(xì)胞膜磷脂分子上負(fù)電荷之間的靜電吸引而結(jié)和聚集在質(zhì)膜上，抗菌肽的疏水端C端a-螺旋插入到疏水的細(xì)菌細(xì)胞膜中央，雙親的a-螺旋留在質(zhì)膜表面，打亂了質(zhì)膜上蛋白和脂質(zhì)原有的排列秩序，使得膜外正電荷增多，超過閾值時(shí)導(dǎo)致膜去極化，雙親的a _螺旋形成離子通道，使陽離子外流，作用結(jié)果是使細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜通透性增大而導(dǎo)致細(xì)菌的死亡。 因?yàn)榭咕谋旧淼奶烊划a(chǎn)量很低，合成或從機(jī)體中提取的步驟復(fù)雜、產(chǎn)率低、成本高，所以利用基因工程方法生產(chǎn)抗菌肽具有重要意義，但是，抗菌肽分子對表達(dá)系統(tǒng)的宿主細(xì)胞具有毒性，因此，選擇適和的表達(dá)形式和系統(tǒng)已成為實(shí)現(xiàn)抗菌肽能否廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵性問題。原核表達(dá)系統(tǒng)與真核表達(dá)系統(tǒng)相比，具有產(chǎn)量高成本低的優(yōu)點(diǎn)。因此，在原核表達(dá)系統(tǒng)中以融合蛋白的形式表達(dá)抗菌肽成為研究的熱點(diǎn)。
2、表皮生長因子研究進(jìn)展 表皮生長因子(EGF)是是一種非常重要的多肽類生長因子，它是存在于表皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞的一種有效的促分裂劑。20世紀(jì)60年代初由美國的Vanderbilt大學(xué)醫(yī)學(xué)院生化系的Stanley Cohen等從小鼠頜下腺中分離純化得到的。自EGF發(fā)現(xiàn)以來，先后發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)化生長因子a (TGF-a)、結(jié)和肝素的EGF樣生長因子(h印arin-bingingEGF-likegrowth factor, HB-EGF)、雙向調(diào)節(jié)素(arnphireguli， AR)等。它們在一級結(jié)構(gòu)上具有一定的保守性，其中保守的三對二硫鍵使EGF家族具有相似的空間構(gòu)象，能夠與EGF受體結(jié)和。其中人表皮生長因子(human印ider mal growth factor, hEGF)是由53個(gè)氨基酸組成的單鏈多肽，鏈中含有6個(gè)半胱氨酸分子，形成3個(gè)穩(wěn)定的分子內(nèi)二硫鍵(6-20，14-31,33-42)，分子量為6040Da，等電點(diǎn)為4. 6，消光系數(shù)(280nm) 30. 9，沉淀常數(shù)1. 25S。
EGF能夠?qū)Ｒ恍缘呐c細(xì)胞表面受體結(jié)和，使受體自身磷酸化，EGF與受體結(jié)和后將細(xì)胞外信息傳遞至細(xì)胞內(nèi)，從而改變細(xì)胞內(nèi)的鈣濃度，促進(jìn)糖酵解、蛋白質(zhì)合成、RNA和DNA的合成，從而剌激細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)細(xì)胞分化。EGF在疾病的治療上有廣泛的用途，它能夠剌激外胚層、中胚層和內(nèi)胚層細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)組織成熟和再生，因而能夠促進(jìn)外科手術(shù)傷口及其他創(chuàng)面的愈和，如皮膚的擦傷、創(chuàng)傷和燒傷等；EGF還能夠促進(jìn)胃腸粘膜的增殖與分化，研究發(fā)現(xiàn)給予外源性EGF能夠減輕阿司匹林及其他藥物引起的急性胃粘膜損傷；給慢性實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍大鼠皮下注射EGF，可使?jié)冇退俣燃涌?；此外，EGF在化妝品領(lǐng)域也有廣泛的應(yīng)用，起到延緩皮膚細(xì)胞衰老，使皮膚滋潤光滑的作用。 目前人表皮生長因子生產(chǎn)方法主要有三種，包括化學(xué)合成、生物來源提取以及基因工程技術(shù)生產(chǎn)，但是化學(xué)合成的產(chǎn)物產(chǎn)量和純度不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)需求，生物提取又存在原料中有效成份含量低，提取工藝復(fù)雜等缺陷，使得人表皮生長因子的廣泛應(yīng)用受到了限制。因此利用基因工程方法生產(chǎn)人表皮生長因子成為研究的熱點(diǎn)。目前國內(nèi)仍無原核表達(dá)的人表皮生長因子上市應(yīng)用于臨床治療。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問題在于提供一種基于抗菌肽的雙功能融合蛋白，以及其制備方法和用途，該融合蛋白是基于天蠶素B和人表皮生長因子融合，通過原核系統(tǒng)表達(dá)制備、純化，具有抗菌和促表皮細(xì)胞生長的雙功能。
本發(fā)明通用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn) —種基于抗菌肽的雙功能融合蛋白，通過連接蛋白將天蠶素B的C端與人表皮生長因子的N端連接。 所述的天蠶素B的氨基酸序列如SEQ ID NO. l所示，人表皮生長因子的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。 所述的人表皮生長因子其C端之后還插入了 6個(gè)組氨酸殘基。
所述的連接蛋白為能夠被凝血酶識別的多肽。 所述的能夠被凝血酶識別的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
所述的包含凝血酶識別多肽的基于抗菌肽的雙功能融合蛋白，從N端到C端依次為抗菌肽蛋白序列-凝血酶切割位點(diǎn)-人表皮生長因子蛋白序列-e個(gè)His殘基；其氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。 —種表達(dá)基于抗菌肽的雙功能融合蛋白的人工重組核苷酸序列，包含SEQ IDN0.5所示的核苷酸序列。 上述基于抗菌肽的雙功能融合蛋白的制備方法，包括以下步驟 1)構(gòu)建包含SEQ ID NO. 5所示核苷酸序列的重組原核表達(dá)載體； 2)將構(gòu)建好的重組原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出陽性克隆的重組細(xì)胞，并
對其進(jìn)行增殖培養(yǎng)；當(dāng)菌液濃度A6。。為0. 3 0. 6時(shí)，用終濃度為0. 1 lmmol/L的IPTG
誘導(dǎo)3 5h，離心收集重組細(xì)胞。
3)雙功能融合蛋白的純化 將重組細(xì)胞裂解后離心分離得到沉淀，將其溶解于上樣緩沖液中，4t:溶解過夜；
所述的上樣緩沖液為8mol/L尿素、10mmol/L Tris和0. lmol/L NaCl， pH7. 0 ; 過夜后離心棄沉淀，保留上清得到雙功能融合蛋白的包涵體溶解上清； 對包涵體溶解上清進(jìn)行鎳離子親和層析柱分離，以咪唑梯度溶液洗脫層析柱得到
包含雙功能融合蛋白的洗脫峰； 調(diào)整收集的洗脫峰的雙功能融合蛋白濃度至0. 1 0. 2g/L，加入|3 _巰基乙醇至終濃度為10 20mmol/L，然后分別依次用復(fù)性緩沖液1、復(fù)性緩沖液II和復(fù)性緩沖液III進(jìn)行梯度透析復(fù)性，最終離心收集得到包含復(fù)性的雙功能融合蛋白的上清；
所述的復(fù)性緩沖液I為:2mol/L尿素、lOmmol/L Tris和5,1/L P -巰基乙醇，pH7. 0 ;復(fù)性緩沖液II為10mmol/L Tris和5mmol/L P -巰基乙醇，pH7. 0 ;復(fù)性緩沖液III為PBS緩沖液，pH7.0。 所述的重組原核表達(dá)載體為pET22b-Cecropin B_EGF，所述的宿主細(xì)胞為Rosetta-gami 2 (DE3)。 上述SEQ ID N0.4所示的包含凝血酶識別多肽的基于抗菌肽的雙功能融合蛋白，應(yīng)用于制備治療表皮創(chuàng)傷的藥物。 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果 1、本發(fā)明構(gòu)建的雙功能融合蛋白，將天蠶素B(CecropinB)和人表皮生長因子(hEGF)通過連接蛋白融合而成，克服了抗菌肽在表達(dá)時(shí)對宿主細(xì)胞的毒害作用，使得能夠通過基因工程方法獲得；而且天蠶素B和人表皮生長因子蛋白的分子量都不大，蛋白不易純化，將兩者進(jìn)行融合表達(dá)，分子量較大，解決了純化困難的問題；而且以融合蛋白的形式用藥也能夠延長蛋白在體內(nèi)的半衰期，減少用藥次數(shù)； 而且融合蛋白的設(shè)計(jì)還基于以下考慮以前研究表明在天蠶素B的N末端加上多余的氨基酸會使抗菌肽的活性完全喪失，而在C末端加入氨基酸，抗菌肽仍可保持活性；因此，本發(fā)明將表皮生長因子融合在天蠶素B的C末端進(jìn)行表達(dá)，不僅克服了抗菌肽對原核細(xì)菌的毒害作用，也保證了凝血酶切割后抗菌肽的活性。 2、鑒于表皮生長因子作用的部位傷口包含了多種凝血酶因子，因此本發(fā)明將連接蛋白設(shè)定為凝血酶能夠識別的序列，當(dāng)融合蛋白用于傷口的治療時(shí)，不需要酶切或化學(xué)方法裂解即可得到雙功能的蛋白，人或哺乳動物自身分泌的凝血酶可以自動識別、切斷CecropinB-hEGF融合蛋白，CecropinB分子和人EGF分子恢復(fù)原有的活性，使CecropinB和人EGF聯(lián)和發(fā)揮自身作用CecropinB可以殺死傷口處的耐藥菌，人EGF可以促進(jìn)傷口快速愈和。 3、本發(fā)明在人表皮生長因子的C端融合了 6個(gè)His標(biāo)簽，克服了融合蛋白難以純化的問題，使純化方法簡單易行。 這樣通過生物工程的方法制備融合蛋白，解決了抗菌肽本身的天然產(chǎn)量低，合成或從機(jī)體中提取的步驟復(fù)雜、產(chǎn)率低、成本高的問題。 4、本發(fā)明對于雙功能融合蛋白設(shè)計(jì)構(gòu)建了其原核表達(dá)載體pET22b-CecropinB-EGF，轉(zhuǎn)染了宿主細(xì)胞R0Setta-gamiTM2，并通過Ni離子親和層析法或分子篩回收整個(gè)融合蛋白；從而實(shí)現(xiàn)了天蠶素B和表皮生長因子在原核表達(dá)系統(tǒng)中的高效表達(dá)。
5、本發(fā)明利用純化的融合蛋白進(jìn)行的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，凝血酶切割后的抗菌肽
能夠抑制周邊細(xì)菌的生長，無菌水和未切割融合蛋白周圍沒有抑菌圈的形成。 6、本發(fā)明利用純化的融合蛋白進(jìn)行的修復(fù)動物創(chuàng)傷及抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，融合蛋
白治療組在7天左右傷口開始縮小，在12 14天左右痊愈，期間并且沒有發(fā)現(xiàn)細(xì)菌感染，
對照組則需要17 20天左右痊愈。 上述生物活性檢測表明本發(fā)明提供的雙功能融合蛋白具有抗菌肽的抑菌、殺菌效果，和人表皮生長因子的剌激細(xì)胞增殖作用，能夠應(yīng)用于制備治療表皮創(chuàng)傷的藥物。
圖1是重組表達(dá)質(zhì)粒pET22b-Cecropin B-EGF的酶切鑒定結(jié)果圖； 圖2是誘導(dǎo)表達(dá)的pET22b-Cecropin B-EGF/Rosetta-gami2的SDS-PAGE分析結(jié)
果圖； 圖3是Cecropin B-EGF的Western Blot鑒定結(jié)果圖; 圖4是Cecropin B-EGF的表達(dá)、純化的SDS-PAGE分析結(jié)果圖； 圖5是不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品rhEGF與Cecropin B-EGF對促Balb/c 3T3細(xì)胞增殖的曲
線圖，其中，橫坐標(biāo)為稀釋倍數(shù)，縱坐標(biāo)為吸光度； 圖6是融合蛋白凝血酶切割產(chǎn)物抑菌活性鑒定。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提供的基于抗菌肽的雙功能融合蛋白，是基于天蠶素B蛋白序列和人表皮生長因子的融合蛋白，并將其連接蛋白特別設(shè)計(jì)為凝血酶能夠識別的位點(diǎn)，并且在融合蛋白上構(gòu)建純化的His標(biāo)簽。 本發(fā)明對于上述融合蛋白采用原核表達(dá)系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)其生物制備，并獲得了純化的融合蛋白。 利用純化的融合蛋白進(jìn)行了抑菌試驗(yàn)和活體動物實(shí)現(xiàn)驗(yàn)證，表明該融合蛋白能夠應(yīng)用于制備治療表皮創(chuàng)傷的藥物，用于表皮的創(chuàng)傷、擦傷、燒傷、燙傷等疾病，并可防止傷口的感染。 下面結(jié)和附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)描述，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。
a、天蠶素B與人表皮生長因子融合蛋白基因的構(gòu)建 將天蠶素B基因和人表皮生長因子基因通過連接基因(DNA linker)連接，在人表皮生長因子基因之后插入6XHis標(biāo)記基因，并且在融合蛋白基因5'端和3'端克隆入酶切位點(diǎn)； 其中，連接基因編碼的氨基酸序列能夠被凝血酶識別，具體采用如下序列作為DNAlinker : ctggttccgc gcggctcc 18 ; 其編碼的氨基酸序列為Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser ; 根據(jù)GenBank中公布的天蠶素(ID :159200)和人表皮生長因子(ID :1950)序列，分別全基因合成天蠶素B和人表皮生長因子融合蛋白基因，合成的基因全長297bp，具體的序列如SEQ ID NO. 5所示；
在該段基因中，天蠶素B基因融合在表皮生長因子的前端，中間連以凝血酶切割位點(diǎn)序列，表皮生長因子的的C端連有6XHis標(biāo)記基因，5'端和3'端為Nde I酶切位點(diǎn)和Sal I酶切位點(diǎn)；融合基因CecropinB-EGF構(gòu)建完成。
b、表達(dá)載體的構(gòu)建 合成上述序列后，通過Nde I酶切位點(diǎn)和Sal I酶切位點(diǎn)將該序列克隆至表達(dá)載體pET22b (+)中，構(gòu)建表達(dá)載體pET22b-CecropinB-EGF ;對重組的表達(dá)載體進(jìn)行酶切電泳鑒定，結(jié)果如圖l所示其中，泳道l為DL2000;泳道2、3為pET22b-Cecropin B-EGF雙酶切結(jié)果；泳道4為對照載體pET22b-X雙酶切的結(jié)果；泳道2、3與泳道4相比，可以清楚的看到300bp左右的目標(biāo)片段，說明表達(dá)載體構(gòu)建成功。
c、重組菌體的構(gòu)建和融合蛋白的表達(dá) CaC12法制備Rosetta-gami2(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，將表達(dá)載體pET22b-CecropinB-EGF加入至Rosetta-gami2(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，42 °C熱激轉(zhuǎn)化，然后在含有氨芐西林、四環(huán)素、氯霉素和鏈霉素的LB平板上進(jìn)行篩選，陽性克隆命名為pET22b-Cecropin B_EGF/Rosetta_gami2(DE3)。 挑取陽性克隆于含有氨芐西林、四環(huán)素、氯霉素和鏈霉素的LB液體培養(yǎng)基中，搖床37t:培養(yǎng)過夜，取培養(yǎng)過夜的菌液1% 5%轉(zhuǎn)接至新鮮的含氨芐西林(50 200 ii g/ml)的LB液體培養(yǎng)基搖培至菌體濃度達(dá)到A6。。為0. 3 0. 6時(shí)，用終濃度為0. 1 lmmo1/L的IPTG誘導(dǎo)3 5h，離心收集菌體。 如圖2所示的誘導(dǎo)和未經(jīng)誘導(dǎo)的重組菌SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果，泳道1為蛋白質(zhì)marker ;泳道2為未經(jīng)誘導(dǎo)的重組菌；泳道3、4、5為經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組菌；對比泳道2與泳道3、4、5，融合蛋白在10kD處有特異的蛋白表達(dá)條帶，說明融合蛋白在宿主細(xì)胞中得到了有效的表達(dá)。 在上述電泳檢測的基礎(chǔ)上，對融合蛋白進(jìn)行Western Blot鑒定， 一抗為小鼠抗EGF單克隆抗體，二抗為羊抗小鼠IgG-AP，檢測結(jié)果如圖3所示其中，泳道1為蛋白質(zhì)marker ;泳道2為未經(jīng)誘導(dǎo)的重組菌pET22b-CecropinB-EGF/Rosetta-gami2 (DE3);泳道3，4為經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組菌pET22b-Cecropin B-EGF/Rosetta-gami2 (DE3);對比泳道2與泳道3、4，可以看到泳道3，4有明顯的特異性條帶，進(jìn)一步說明融合蛋白經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后在宿主細(xì)胞中得到有效表達(dá)。
d、融合蛋白的純化 將誘導(dǎo)表達(dá)的pET22b-Cecropin B-EGF/Rosetta-gami2 (DE3)菌體用裂解緩沖液(10mM Tris，lmM EDTA， pH8. 5)懸浮，溶菌酶裂解，4。C離心得到裂菌上清和沉淀，15 %SDS-PAGE檢測融合蛋白在裂菌上清和沉淀中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示目的蛋白存在于裂菌沉淀中； 將裂菌沉淀溶解于上樣緩沖液(8mol/L尿素，10mmol/L Tris，0. lmol/LNaCl，pH7. 0)中，攪拌1 3h， fC溶解過夜；然后離心棄沉淀，保留上清得到融合蛋白的包涵體溶解上清； 上樣緩沖液平衡鎳離子親和層析柱之后，將包涵體溶解上清上樣，上樣緩沖液沖洗至基線后，分別用含10mmol/L咪唑、200mmol/L咪唑及500mmol/L咪唑的上樣緩沖液梯度洗脫鎳離子親和層析柱，200mmol/L咪唑洗下融合蛋白。
調(diào)整收集的融合蛋白濃度至0. 1 0. 2g/L，加入|3 _巰基乙醇至終濃度為10 20mmol/L，然后分別用復(fù)性緩沖液I (2mol/L尿素、10mmol/L Tris、5mmol/L P -巰基乙醇，pH7.0)，復(fù)性緩沖液11(10mmol/L Tris， 5mmol/L P -巰基乙醇，pH7. 0)以及復(fù)性緩沖液III (PBS， pH7. 0)進(jìn)行依次透析復(fù)性，最終離心收集得到復(fù)性上清。 對于上述純化的不同階段的融合蛋白的表達(dá)和純化進(jìn)行SDS-PAGE檢測，結(jié)果如圖4所示其中，泳道M為蛋白質(zhì)marker ;泳道1為未經(jīng)誘導(dǎo)的重組菌pET22b-CecropinB-EGF/Rosetta-gami2(DE3);泳道2為經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組菌pET22b-Cecropin B-EGF/Rosetta-gami2(DE3);泳道3為溶菌酶裂解pET22b-Cecropin B-EGF/Rosetta-gami2 (DE3)上清；泳道4為溶菌酶裂解pET22b-Cecropin B-EGF/Rosetta-gami2 (DE3)沉淀；泳道5為融合蛋白的包涵體溶解上清；泳道6為經(jīng)過層析柱分離后的純化融合蛋白CecropinB-EGF ;泳道7為融合蛋白Cecropin B-EGF透析復(fù)性產(chǎn)物；對比泳道1 7可以看出，融合蛋白存在于重組菌裂解后的沉淀中，以包涵體形式存在，通過識別6XHis標(biāo)簽的親和層析純化之后，再經(jīng)過透析復(fù)性之后幾乎不存在其他蛋白雜質(zhì)；最終得到純化的融合蛋白。
f、融合蛋白對于促細(xì)胞增殖活性的檢測 MTT法體外測定復(fù)性的融合蛋白Cecropin B-EGF對Balb/c 3T3細(xì)胞株的促生長作用 預(yù)稀釋4000倍復(fù)性的融合蛋白Cecropin B-EGF及10倍rhEGF標(biāo)準(zhǔn)品(效價(jià)為400IU/ml);在含有10X的新生牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)Balb/c 3T3細(xì)胞株24-36h，調(diào)整濃度為104細(xì)胞/1111，轉(zhuǎn)接于96孔板中，37。C，5X C02培養(yǎng)24h ;分別加入梯度濃度稀釋的融合蛋白Cecropin B-EGF和rhEGF標(biāo)準(zhǔn)品，37°〇，5% C02培養(yǎng)64-72h，然后每孔加入MTT溶液20iU，繼續(xù)培養(yǎng)5h，棄去上清，向每孔中加入100 iil 二甲基亞砜(匿S0)，混勻后置于酶標(biāo)儀上，于波長570nm處測定吸光度； 以稀釋倍數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制樣品融合蛋白CecropinB-EGF和
rhEGF標(biāo)準(zhǔn)品的活性曲線，結(jié)果如圖5所示，在低濃度情況下，稀釋倍數(shù)為4X 105 4X 107
時(shí)融和蛋白與標(biāo)準(zhǔn)品rhEGF對促細(xì)胞增殖效果相近；隨著濃度增大，稀釋倍數(shù)為4X101
4乂105時(shí)融和蛋白的促細(xì)胞增殖效果降低，但是最后隨著濃度的增大，融和蛋白的促細(xì)胞
增殖效果又迅速提升，甚至超過標(biāo)準(zhǔn)品； 經(jīng)下述計(jì)算
DsXEs
僕試晶鏡生物學(xué)潘性《IWmI) =PrX - =lJ4XW3IU/ml
DrXRr 融合蛋白的比活性為1.94Xl()SlU/ml，表明融合蛋白Cecropin B-EGF具有表皮生
長細(xì)胞因子的生物活性。 g、融合蛋白的抑菌實(shí)驗(yàn) 用20 50iU活化的E. coli K12D31菌液或藤黃微球菌菌液和20ml 5(TC左右含0. 7% 0. 9%瓊脂的LB培養(yǎng)基充分混和鋪平板，用打孔器打孔，孔中分別加入經(jīng)16t:凝血酶切割20h的融合蛋白(3號孔)，未切割的融合蛋白(4號孔)，無菌水(2號孔)，氨芐青霉素(1號孔)，其中未切割的融合蛋白和無菌水作為陰性對照，氨芐青霉素作為陽性對照，
837t:過夜培養(yǎng)； 結(jié)果如圖6所示，作為陽性對照的氨芐青霉素(1號孔)出現(xiàn)抑菌斑，抑制了細(xì)菌的生長，凝血酶切割后的抗菌肽(3號孔)也出現(xiàn)了抑菌斑，能夠抑制周邊細(xì)菌的生長；無菌水(2號孔)和未切割融合蛋白(4號孔)周圍沒有抑菌圈的形成；說明融合蛋白經(jīng)凝血酶
切割后的抗菌肽片段具有抑菌、殺菌的生物活性。 h、融合蛋白修復(fù)動物創(chuàng)傷及抑菌的活體實(shí)驗(yàn) 小鼠或兔子于實(shí)驗(yàn)前一天脫毛，實(shí)驗(yàn)當(dāng)天麻醉后燙成II度燙傷或在背部做皮膚全層切口 ，去除皮膚塊及筋膜，用無菌紗布壓迫止血，在無菌紗布上滴加溶解的融合蛋白進(jìn)行包扎，同時(shí)以加生理鹽水為對照； 包扎后的動物單籠喂養(yǎng)，自由進(jìn)食，飲水，飼養(yǎng)14 20天海天以同樣的方法進(jìn)行換藥，觀察創(chuàng)口愈和情況； 結(jié)果顯示，融合蛋白治療組在7天左右傷口開始縮小，在12 14天左右痊愈，而
對照組則需要17 20天左右痊愈，并且沒有發(fā)現(xiàn)細(xì)菌感染。 核苷酸序列表 〈110〉陜西省微生物研究所 〈120〉 一種基于抗菌肽的雙功能融合蛋白及其制備方法和用途 〈160>5 〈210>1 〈211>35 〈212>PRT 〈213〉人工合成的天蠶素B 〈400〉 1 Lys Trp Lys Val Phe Lys Lys lie Glu Lys Met Gly Arg Asn lie Arg Asp Gly lie Val 1 5 10 15 20 Lys Ala Gly Pro Ala lie Ala Val Leu Gly Glu Ala Leu Ala Leu 25 30 35 〈210>2 〈211>53 〈212>PRT 〈213〉人工合成的人表皮生長因子 〈400>2 Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His Asp Gly Val Cys 15 10 15 20 Met Tyr lie Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn Cys Val Val Gly Tyr lie Gly Glu 25 3035 40 Arg Cys Gin Tyr Arg Asp Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg 45 50 〈210>3 〈211>6:o川]:0112]:o"3]:o"4]:oii5]
Leu Val Pro Arg Gly Ser
〈212>PRT
〈213〉人工合成
〈400>3
:0116] 〈210>4
:0117] 〈211>111
:0118] 〈212>PRT
:0119] 〈213>人工合成
:0120] 〈400>4
:0121] Lys Trp Lys Val Phe Lys Lys lie Glu Lys Met Gly Arg Asn lie Arg Asp Gly lie Val
:0122] 1510 15 20
:0123] Lys Ala Gly Pro Ala lie Ala Val Leu Gly Glu Ala Leu Ala Leu Asn Gly Leu Val Pro
:0124] 25 30 35 40
:0125] Arg Gly Ser Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His Asp
:0126] 45 50 55 60
:0127] Gly Val Cys Met Tyr lie Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn Cys Val Val Gly Tyr
:0128] 65 70 75 80
:0129] lie Gly Glu Arg Cys Gin Tyr Arg Asp Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg Val Asp Lys Leu
:0130] 85 90 95 100
:0131] Ala Ala Ala Leu Glu His His His His His His
:0132] 105 110
:0133] 〈210>5
:0134] 〈211>297
:0135] 〈212>DNA
:0136] 〈213>人工合成
:0137] 〈400>5
.0138] 3tg3朋tgga朋gtcttc朋g朋朋ttg朋朋朋tgggtc gteatetccg agatggtett 60
.0139] gtcaaggctg gccctgcgat cgcggtttte ggcgaagcca aagcgctgaa cggcctggtt 120
.0140] ccgcgcggct ccaategcga ctctgaatgt cctctgtccc acgatggcte ctgcctccat 180
.0141] gatggtgtgt gcatgtetet tgaagcattg gacaagtetg catgcaactg tgttgttggc 240
.0142] tecatcggcg agcgctgcca gteccgtgac ctgaagtggt gggaactgcg caacggc 29權(quán)利要求
一種基于抗菌肽的雙功能融合蛋白，其特征在于通過連接蛋白將天蠶素B的C端與人表皮生長因子的N端連接。
2. 如權(quán)利要求1所述的基于抗菌肽的雙功能融合蛋白，其特征在于天蠶素B的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，人表皮生長因子的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3. 如權(quán)利要求1所述的基于抗菌肽的雙功能融合蛋白，其特征在于在人表皮生長因 子C端之后還插入了 6個(gè)組氨酸殘基。
4. 如權(quán)利要求1所述的基于抗菌肽的雙功能融合蛋白，其特征在于所述的連接蛋白 為能夠被凝血酶識別的多肽。
5. 如權(quán)利要求4所述的基于抗菌肽的雙功能融合蛋白，其特征在于所述的能夠被凝血酶識別的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
6. 如權(quán)利要求5所述的基于抗菌肽的雙功能融合蛋白，其特征在于該雙功能融合蛋 白從N端到C端依次為抗菌肽蛋白序列-凝血酶切割位點(diǎn)-人表皮生長因子蛋白-6個(gè) His殘基序列；其氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
7. —種表達(dá)權(quán)利要求1所述的基于抗菌肽的雙功能融合蛋白的人工重組核苷酸序列， 其特征在于包含SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列。
8. —種基于抗菌肽的雙功能融合蛋白的制備方法，其特征在于，包括以下步驟1) 構(gòu)建包含SEQ ID N0.5所示核苷酸序列的重組原核表達(dá)載體；2) 將構(gòu)建好的重組原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出陽性克隆的重組細(xì)胞，并對其 進(jìn)行增殖培養(yǎng)；當(dāng)菌體濃度達(dá)到A6。。為0. 3 0. 6時(shí)，用終濃度為0. 1 lmmol/L的IPTG 誘導(dǎo)3 5h，離心收集重組細(xì)胞；3) 雙功能融合蛋白的純化將重組細(xì)胞裂解后離心分離得到沉淀，將其溶解于上樣緩沖液中，4t:溶解過夜；所述的上樣緩沖液為8mol/L尿素、10mmol/L Tris和0. lmol/L NaCl， pH7. 0 ;過夜后離心棄沉淀，保留上清得到雙功能融合蛋白的包涵體溶解上清；對包涵體溶解上清進(jìn)行鎳離子親和層析柱分離純化，以咪唑梯度溶液洗脫層析柱得到 包含雙功能融合蛋白的洗脫峰；調(diào)整收集的洗脫峰的雙功能融合蛋白濃度至0. 1 0. 2g/L，加入13 -巰基乙醇至終濃 度為10 20mmol/L，然后用復(fù)性緩沖液1、復(fù)性緩沖液II和復(fù)性緩沖液III依次進(jìn)行透析 復(fù)性，最終離心收集得到包含復(fù)性的雙功能融合蛋白的上清；所述的復(fù)性緩沖液I為2mol/L尿素、10mmol/L Tris和5mmol/L P-巰基乙醇，pH7. 0 ; 復(fù)性緩沖液II為:10,1/L Tris和5mmol/L P -巰基乙醇，pH7. 0 ;復(fù)性緩沖液III為: PBS緩沖液，pH7. 0。
9. 如權(quán)利要求8所述的基于抗菌肽的雙功能融合蛋白的制備方法，其特征 在于所述的重組原核表達(dá)載體為pET22b-CecropinB-EGF，所述的宿主細(xì)胞為 Rosetta-gami 2 (DE3)。
10. 如權(quán)利要求6所述的雙功能融合蛋白應(yīng)用于制備治療表皮創(chuàng)傷的藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于抗菌肽的雙功能融合蛋白及其制備方法和用途，所述的基于抗菌肽的雙功能融合蛋白，是基于天蠶素B蛋白序列和人表皮生長因子的融合蛋白，并將其連接蛋白特別設(shè)計(jì)為凝血酶能夠識別的位點(diǎn)，并且在融合蛋白上構(gòu)建純化的His標(biāo)簽。本發(fā)明對于上述融合蛋白采用原核表達(dá)系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)其生物制備，并獲得了純化的融合蛋白。利用純化的融合蛋白進(jìn)行了抑菌試驗(yàn)和活體動物實(shí)現(xiàn)驗(yàn)證，表明該融合蛋白能夠應(yīng)用于制備治療表皮創(chuàng)傷的藥物，用于表皮的創(chuàng)傷、擦傷、燒傷、燙傷等疾病，并可防止傷口的感染。
文檔編號C07K19/00GK101698682SQ20091020994
公開日2010年4月28日 申請日期2009年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月26日
發(fā)明者萬一, 孫曉宇, 張?jiān)戮? 張琨, 李玥, 沈衛(wèi)榮, 韓麗萍 申請人:陜西省微生物研究所