專利名稱：：人胰島素樣生長因子結合蛋白-1的單克隆抗體、相關的宿主細胞、診斷試劑和診斷試劑盒的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及基因工程和免疫學
技術領域：
，更具體地，涉及單克隆抗體
技術領域：
，特別是指一種人胰島素樣生長因子結合蛋白-1的單克隆抗體、相關的宿主細胞、診斷試劑和診斷試劑盒。
背景技術：
：胎膜在足月產前發(fā)生破裂，稱為胎膜早破(Prematureruptureofmembrane,PROM)；胎膜早破的發(fā)生率約為10%，其中臨床上對30%左右的孕婦進行PROM檢查；目前全國孕婦數量為10001400萬左右。因此，胎膜早破是早產和新生兒并發(fā)癥的最常見原因之一，也是當前產科臨床遇到的最為棘手的治療難點之一。在胎膜破裂發(fā)生24小時之后診斷會增加胎兒患病率和死亡率。PROM—旦發(fā)生，若處理不當可危及母兒生命。由于診斷方法不同，而使診斷率有較大的差異，在處理上給予假陽性病例不必要的干預，可導致早產，反之，讓假陰性者盲目的等待，可引起嚴重感染。尤其是廣大的農村地區(qū)，危害更甚。對胎膜早破進行及時、準確的診斷是預防孕產婦和新生兒感染、死亡的關鍵。當前國內外臨床上主要采用的方法分析如下1)陰道積液(流水)陰道存在可見積液(羊水池)，或者從宮頸到陰道后穹隆有明顯滲流，強烈支持胎膜破裂的診斷。然而，并不是每個患者都有明顯積液。此外，胎膜破裂，特別是胎膜早破，可能持續(xù)數個小時才能看到有明顯滲液?？梢姖B液出現之前羊膜內感染導致新生兒并發(fā)癥甚至胎兒窒息的可能性已經大幅增加。2)羊水結晶方法羊水在玻片上風干后在顯微鏡下呈現羊齒狀結晶。由于在玻片上容易被指紋、精液、和宮頸粘液污染，可能出現假陽性。干燥拭子或標本被血液污染可能造成假陰性(5-10%)03)硝嗪試紙pH試紙在羊水中變藍。敏感性和特異性分別為90.7%和77.2%。陰道中出現堿性尿液、血液、精液、陰道細菌炎癥、或滴蟲炎癥等時，會出現假陽性，假陽性率為-17%。當三種條件均滿足時可以確診為胎膜破裂，如果以上三種情況中任何一種出現，可以懷疑為胎膜破裂。但臨床經驗證明，診斷胎膜破裂并非必須要滿足所有三種條件，當三者中兩者存在時，可認為有臨床相關性。當診斷標準沒有滿足，產生胎膜破裂的假陽性和假陰性時，得出的診斷結果往往是模棱兩可的。診斷不能下結論時，可能需要采用羊膜鏡檢查或羊水穿刺注射染料(伊文斯藍或熒光素)，以確定是否為陽性。4)羊膜鏡檢查對可疑病歷可以在羊膜鏡下直接觀察胎膜情況，但需要一定的設備、技術，并且在某些情況下不能檢測，如胎盤前置時。5)羊水染色注射法是目前唯一能夠達到100%準確性的檢測法，其過程涉及將稀釋靛藍注入羊膜腔內，在20-30分鐘內通過觀察陰道中有無顏色滲出(棉球染色)來確定胎膜是否破裂。羊水染色注射一方面是檢測ROM最準確的方法，但同時卻是有創(chuàng)(需要羊膜腔穿刺)而昂貴的方法。羊膜腔穿刺對孕婦有一定的風險，包括鐘型、感染、醫(yī)源性胎膜破裂、及流產(約1/270)。目前臨床上亟需一種操作簡便、快速、對儀器依賴不大、價格成本較低的PROM診斷方法，大幅降低孕產婦和新生兒死亡率和感染率的危險，提高優(yōu)生優(yōu)育質量。針對傳統(tǒng)方法的局限性，臨床上相繼采用一些免疫檢測指標，如陰道沖洗液人絨毛膜促性腺激素(humanchorionicgonadotropin,hCG)、羊水甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)、宮頸分泌物胎兒型纖維連接蛋白(fetalfibronectin,fFN)、宮頸分泌物胰島素樣生長因子結合蛋白(insulin-likegrowthfactorbindingprotein-l,IGFBP-l)和胎盤α-微球白(PAMG-I)等用于PROM的實驗診斷。具體方法和原理如下1)陰道沖洗液hCG測定hCG是一種糖蛋白激素，羊水中hCG含量很高，而正常妊娠宮頸陰道分泌液中hCG含量很低。假陽性和假陰性均小于10%。但是如果陰道沖洗液中混有血液，則假陽性率將明顯升高，診斷準確率下降，這是本法最大的缺點。2)羊水AFP測定整個妊娠期間羊水中AFP含量在孕1314周時達高峰，隨后減少，并一直持續(xù)至分娩；孕晚期母血和羊水中AFP含量相近，因此本法對孕36周之前的診斷更為敏感。3)宮頸分泌物FFN測定羊水中的FFN濃度比母血和尿中高10倍。胎膜破裂時，FFN即可隨羊水流入陰道。應用雙抗夾心斑點免疫法對正常孕婦及胎膜早破孕婦的官頸分泌物中FFN進行檢測發(fā)現，前者陽性率為6.0%，后者為95.0%，FFN對診斷PROM有較高的敏感性。4)宮頸分泌物胎盤α1微球蛋白(PAMG-I)測定PAMG_1胎膜破裂后就出現在陰道分泌物中，在羊水中的濃度很高(200025000ng/ml)，血液中的濃度低(525ng/ml)，而且當胎膜完好時，宮頸陰道分泌物中的背景濃度極低(約0.050.22ng/ml)。此方法方便快捷，準確性高于99%，假陽性和假陰性均小于1%。5)宮頸分泌物IGFBP-I測定IGFBP_1主要由蛻膜細胞、母兒肝臟、卵巢顆粒細胞合成并分泌，用免疫層析法檢測宮頸分泌物中IGFBP-I的含量來判斷有無胎膜早破，陽性預測值為97.0%，陰性預測值為93.2%。免疫診斷方法診斷PROM準確性高，操作簡便，有望成為胎膜早破診斷的金標準。但是我國目前尚未見有注冊上市的產品。因此，急需開發(fā)新的PROM診斷試劑盒。
發(fā)明內容本發(fā)明的主要目的就是針對以上存在的問題與不足，提供一種人胰島素樣生長因子結合蛋白-1的單克隆抗體、相關的宿主細胞、診斷試劑和診斷試劑盒，該人胰島素樣生長因子結合蛋白-1的單克隆抗體能特異性檢測人胰島素樣生長因子結合蛋白-1，由此制備的診斷試劑胎膜早破診斷特異性高，反應靈敏，成本低、適于大規(guī)模推廣應用。為了解決上述目的，在本發(fā)明的第一方面，提供了一種人胰島素樣生長因子結合蛋白-1的單克隆抗體，其特點是，所述單克隆抗體的抗原是人胰島素樣生長因子結合蛋白-1的抗原決定簇。較佳地，所述抗原決定簇包括SEQIDNO1所示的氨基酸序列。更佳地，所述抗原決定簇是SEQIDNO1所示的氨基酸序列。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種單克隆抗體宿主細胞，其特點是，含有上述的人胰島素樣生長因子結合蛋白-1的單克隆抗體。較佳地，所述單克隆抗體宿主細胞是小鼠雜交瘤細胞。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種診斷試劑，其特點是，含有上述的人胰島素樣生長因子結合蛋白-ι的單克隆抗體。較佳地，所述的人胰島素樣生長因子結合蛋白-1的單克隆抗體的含量是4ug/ml。在本發(fā)明的第四方面，提供了一種診斷試劑盒，其特點是，所述診斷試劑盒是膠體金試紙條，上述的人胰島素樣生長因子結合蛋白-1的單克隆抗體作為膠體金標記抗體/捕獲抗體。較佳地，每條所述膠體金試紙條包含0.l-50ug所述的人胰島素樣生長因子結合蛋白-1的單克隆抗體。在本發(fā)明的第五方面，提供了一種診斷試劑盒，其特點是，所述診斷試劑盒是ELISA試劑盒，根據權利要求1-3任一所述的人胰島素樣生長因子結合蛋白-1的單克隆抗體作為酶標抗體/包被抗體。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明的人胰島素樣生長因子結合蛋白-1的單克隆抗體的抗原是人胰島素樣生長因子結合蛋白-1的抗原決定簇，優(yōu)選包括SEQIDN0:1所示的氨基酸序列，能特異性高檢測人胰島素樣生長因子結合蛋白-1，反應靈敏，成本低，適于大規(guī)模推廣應用。具體實施例方式本發(fā)明人經過廣泛而深入的研究，獲得一種人胰島素樣生長因子結合蛋白-1的單克隆抗體，該單克隆抗體對人胰島素樣生長因子結合蛋白-ι具有優(yōu)異的特異性結合作用。在此基礎上完成了本發(fā)明。為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的技術內容，特舉以下實施例詳細說明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYork=ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1抗原制備(SEQIDNO=I所示的氨基酸序列)將肽合成柱置于Pioneer肽合成儀中，并按照小肽的氨基酸序列順序在氮氣下進行肽的合成。用THF洗滌樹脂約5分鐘。過濾并將濾液在冷乙醚中離心，倒出上清并重復冷乙醚離心直至肽完全沉淀，并將所得肽粗品在制備性C18硅膠柱層析純化，用乙腈梯度洗脫，收集含目標肽的洗脫流分并冷凍干燥，得到目標肽。實施例2動物免疫將實施例1獲得的抗原與KLH偶聯，取偶聯物4mg溶于5ml生理鹽水中，與完全弗氏佐劑11(體積比)混合，取8周齡磁性Balb/c小鼠，按照下面的試驗方案進行動物免疫(1)初次免疫(小肽50μg，加弗氏完全佐劑皮下多點注射，Iml0.2ml/點)；(2)三周后第二次免疫(劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下注射，0.5ml)(3)三周后第三次免疫(劑量同上，不加佐劑皮下注射，7天后采血測其效價，檢測免疫效果)；(4)三周后加強免疫(劑量500μg，不加佐劑皮下注射)；(5)取脾融合。(6)第四周末取血檢測抗體效價，用生理鹽水將血清110000稀釋后，進行ELISA檢測，以顯色陽性為標準。實施例3細胞融合和篩選處死小鼠，制備單個脾細胞懸液，在50ml離心管中混合IO8個脾細胞和IO7個對數期生長的小鼠骨髓瘤細胞(NS-1細胞)，并加入30ml單純培養(yǎng)基，室溫800轉/分鐘離心8分鐘，去上清液，把離心管放于37°C水浴中，緩慢加入0.8ml50%(重量百分比)聚乙二醇-4000，2分鐘加入完畢，邊加入邊搖離心管，然后緩慢加入單純培養(yǎng)基，3分鐘內加入4ml，室溫800轉/分鐘離心8分鐘，去上清液，加入45ml20%(體積百分比)小牛血清的HAT選擇性培養(yǎng)基，吹打后接種于3塊96孔板中，在含有5%CO2的空氣中和37°C的條件下培養(yǎng)，7天后將培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液加密，10天后觀察，用ELISA法檢測雜交瘤細胞培養(yǎng)液的抗體效價。實施例4抗體鑒定1.抗體特異性的鑒定除用免疫原(抗原)進行抗體的檢測外，還應用與其抗原成分相關的其它抗原進行交叉試驗，方法用ELISA法，交叉反應率都低于2%，證實抗體只對SEQIDNO:1所示的小肽和人胰島素樣生長因子結合蛋白-1特異性結合。2.抗體的Ig類與亞類的鑒定用酶標或熒光素標記的第二抗體進行篩選，基本上確定抗體的Ig類型；經測定本發(fā)明的單克隆抗體亞型為IgG1153.抗體相對親和力的鑒定用ELISA競爭結合試驗來確定McAb與相應抗原結合的親和力，測定結果為0.4mg/L。實施例5抗體克隆化①制備飼養(yǎng)細胞懸液(同融合前準備)；②陽性孔細胞的計數，并調細胞數在15X103/ml；③取130個細胞放入6.5ml含飼養(yǎng)細胞完全培養(yǎng)液，即20個細胞/ml，100μ1/孔加Α、B、C三排為每孔2個細胞。余下2.9ml細胞懸液補加2.9ml含飼養(yǎng)細胞的完全培養(yǎng)液，細胞數為10個/ml，100μ1/孔加D、Ε、F三排，為每孔1個細胞。余下2.2ml細胞懸液補加2.2ml含飼養(yǎng)細胞的完全培養(yǎng)液，細胞數5個/ml，100μ1/孔，加G、H兩排，為每孔0.5個細胞。④培養(yǎng)45天后，在倒置顯微鏡上可見到小的細胞克隆，補加完全培養(yǎng)液200μ1/孔。⑤第89天時，肉眼可見細胞克隆，及時進行抗體檢測。實施例6膠體金試紙條在硝酸纖維素膜的T帶區(qū)域分別包埋有人胰島素樣生長因子結合蛋白-1的多克隆抗體，膠體金墊上包被有標記了膠體金的用于捕獲樣本中人胰島素樣生長因子結合蛋白-1的上述單克隆抗體，每條金標試紙條具有4ug單克隆抗體。試紙條檢測端帶有吸水紙，反應時插入樣品中。檢測時如果C區(qū)出現條帶，則T區(qū)出現條帶即表示樣品為陽性；未出現條帶則表示陰性。檢測時如果C區(qū)未出現條帶，則表示試紙條失效。檢測結果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>本膠體金檢測的特異性為97.8%，靈敏度為98.4%。本實驗還分別采用了0.Iug單克隆抗體/每條金標試紙條、50ug單克隆抗體/每條金標試紙條進行了相關實驗，結果與上述結果類似。實施例7ELISA檢測試劑盒將IOOul人胰島素樣生長因子結合蛋白-1的多克隆抗體(4ug/ml)用包被緩沖液在每孔中在4°C包被24小時，然后脫脂奶粉封閉24小時，洗滌，風干，消毒和密封備用。用辣根過氧化物酶標記的抗人IgG或IgM抗體，以TMB作為顯色液的主要成分。試劑盒包裝，檢驗。檢測結果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>本ELISA檢測試劑盒檢測的特異性為98.6%，靈敏度為97.5%。綜上所述，本發(fā)明的人胰島素樣生長因子結合蛋白-1的單克隆抗體能特異性檢測人胰島素樣生長因子結合蛋白-1，由此制備的診斷試劑胎膜早破診斷特異性高，反應靈敏，成本低、適于大規(guī)模推廣應用。在此說明書中，本發(fā)明已參照其特定的實施例作了描述。但是，很顯然仍可以作出各種修改和變換而不背離本發(fā)明的精神和范圍。因此，說明書和附圖應被認為是說明性的而非限制性的。序列表<110>無錫博慧斯生物醫(yī)藥科技有限公司<120>一種人胰島素樣生長因子結合蛋白-1的單克隆抗體、相關的宿主細胞、診斷試劑和診斷試劑盒<160>1<210>1<211>23<212>PRT<213>人類(Homosapiens)<220><221>domain<222>(1)..(23)<223>人胰島素樣生長因子結合蛋白-1的一段氨基酸序列<400>1LysArglieProGlySerProGlulieArgGlyAspProAsnCys151015GlnlieTyrPheAsnValGlnAsn20權利要求一種人胰島素樣生長因子結合蛋白-1的單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體的抗原是人胰島素樣生長因子結合蛋白-1的抗原決定簇。2.根據權利要求1所述的人胰島素樣生長因子結合蛋白-1的單克隆抗體，其特征在于，所述抗原決定簇包括SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。3.根據權利要求2所述的人胰島素樣生長因子結合蛋白-1的單克隆抗體，其特征在于，所述抗原決定簇是SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。4.一種單克隆抗體宿主細胞，其特征在于，含有根據權利要求1-3任一所述的人胰島素樣生長因子結合蛋白-1的單克隆抗體。5.根據權利要求4所述的單克隆抗體宿主細胞，其特征在于，所述單克隆抗體宿主細胞是小鼠雜交瘤細胞。6.一種診斷試劑，其特征在于，含有根據權利要求1-3任一所述的人胰島素樣生長因子結合蛋白-1的單克隆抗體。7.根據權利要求6所述的診斷試劑，其特征在于，所述的人胰島素樣生長因子結合蛋白-1的單克隆抗體的含量是4ug/ml。8.—種診斷試劑盒，其特征在于，所述診斷試劑盒是膠體金試紙條，根據權利要求1-3任一所述的人胰島素樣生長因子結合蛋白-1的單克隆抗體作為膠體金標記抗體/捕獲抗體。9.根據權利要求8所述的診斷試劑，其特征在于，每條所述膠體金試紙條包含0.l_50ug所述的人胰島素樣生長因子結合蛋白-1的單克隆抗體10.一種診斷試劑盒，其特征在于，所述診斷試劑盒是ELISA試劑盒，根據權利要求1-3任一所述的人胰島素樣生長因子結合蛋白-1的單克隆抗體作為酶標抗體/包被抗體。全文摘要本發(fā)明提供了一種人胰島素樣生長因子結合蛋白-1的單克隆抗體，其抗原是人胰島素樣生長因子結合蛋白-1的抗原決定簇，較佳地，抗原決定簇包括SEQIDNO1所示的氨基酸序列，還提供了一種單克隆抗體宿主細胞，其含有上述的人胰島素樣生長因子結合蛋白-1的單克隆抗體，還提供了含有上述的人胰島素樣生長因子結合蛋白-1的單克隆抗體的診斷試劑和診斷試劑盒，本發(fā)明的人胰島素樣生長因子結合蛋白-1的單克隆抗體能特異性檢測人胰島素樣生長因子結合蛋白-1，由此制備的診斷試劑胎膜早破診斷特異性高，反應靈敏，成本低、適于大規(guī)模推廣應用。文檔編號C07K16/18GK101805406SQ20091022464公開日2010年8月18日申請日期2009年11月17日優(yōu)先權日2009年11月17日發(fā)明者劉麗,張麗新,李雅麗,雷震,韋彥余申請人:無錫博慧斯生物醫(yī)藥科技有限公司