專利名稱：H5亞型禽流感病毒保守中和表位模擬肽及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及H5亞型禽流感病毒中和表位模擬肽，及其保守性變異體或活性片段， 或模擬肽及其類似物的相關(guān)編碼序列，及應(yīng)用該模擬肽或類似物于預(yù)防或診斷的用途。
背景技術(shù)：
自H5型禽流感于1996年首先在我國廣東省農(nóng)場的鵝群暴發(fā)以來(Xu X et al.， 1999，Virology)，由此病毒演生出來的另一株H5病毒在香港的禽鳥農(nóng)場(1997年4月)及 市場(1997年11月)暴發(fā)，引起了歷史上禽流感病毒第一次直接由禽傳人事件，前后共18 例確診病例中有6人死亡。2003年以來，H5病毒株在整個東亞及東南亞國家的相繼暴發(fā)， WHO及流感專家預(yù)測H5禽流感病毒將最有可能成為下一次人類大流感暴發(fā)的流行株。2004 年初，H5型高致病性禽流感也先后在我國十幾個省暴發(fā)，并在中國香港、泰國、荷蘭等發(fā)現(xiàn) H5型禽流感傳染雞、鴨、蒼鷺、虎、貓等多種動物的事件。更令人擔(dān)憂的是，在泰國已經(jīng)出現(xiàn) 疑似人傳染人事件，馬來西亞也有多例報道。進入2005年，羅馬尼亞、俄羅斯、土耳其等歐 洲國家相繼發(fā)現(xiàn)禽類感染H5型禽流感病毒致死事件，專家認(rèn)為此乃帶毒候鳥遷移的結(jié)果， 這使得控制高致病性H5型禽流感病毒的進一步擴散傳播變得更為困難。專家預(yù)測，隨著侯 鳥的傳播，H5型禽流感病毒有可能通過歐亞、亞非大陸橋進一步傳播到衛(wèi)生條件極差的非 洲國家，使得H5型禽流感病毒獲得和其它人流感病毒充分重組的機會和時間，屆時將很可 能形成一種對人類高度致命的全新流感病毒，其給人類帶來的各種損失將難以估計。根據(jù) WHO統(tǒng)計結(jié)果，截止2006年1月19日，全球因感染H5W病毒死亡的人類個案已達(dá)80例，給 全球公共衛(wèi)生安全帶來極大的考驗。本實驗室利用不同時間、不同地點、不同宿主分離到的多個禽流感病毒H5m代表 株免疫小鼠，持續(xù)進行單克隆抗體的制備，已制備出了包含400多株具有血凝抑制(HI)活 性的H5特異性單克隆抗體的H5單抗庫。根據(jù)對近千株全球各地H5m病毒基因組序列進行的系統(tǒng)進化分析，我們篩選出 34株不同地域、不同進化分支、不同宿主來源的H5W代表株，加上2006年最新分離出的7 個毒株共41個毒株組成代表性H5W病毒庫。對這41株H5W病毒進行各單抗的HI活性 測定，可根據(jù)HI活性的差異將這400多株單抗分為10個類型，同時可將這41株代表性病 毒分為八個HI活性分支。初步篩選出17株單抗對2002以來的H5W病毒株的抗原多樣性 進行分析。根據(jù)血凝抑制實驗和細(xì)胞中和實驗的結(jié)果，可將7種H5W亞型分成4個抗原 群。其中13D4、16F13等單抗均可對絕大部分毒株具有很高的中和活性，為治療性抗體研究 奠定了基礎(chǔ)(Wu，W. L.，Chen, Y.，Wang, P.，Song, W.，Lau, S. Y.，Rayner, J. M.，Smith, G. J.， Webster, R. G.，Peiris, J. S.，Lin, Τ.，Xia, N.，Guan, Y. and Chen, H. 2008，J Virol. 82 (4)， 1798-1807)。血凝素(HA)抗原是禽流感病毒疫苗的最主要靶標(biāo)，但同時也是病毒變異最活躍 的抗原?，F(xiàn)有流感疫苗必須不斷根據(jù)最新的病毒流行株的抗原變異特征的變化而更新用于 疫苗制備的毒株，而且由于各地流行病毒株并不一定完全一致，造成疫苗株選擇的巨大困難。同時，由于新疫苗的制備必須經(jīng)一定的時間，為應(yīng)對流感疫情，必須提前對病毒流行趨 勢進行預(yù)測，這種預(yù)測也不能保證每次都正確。因此，發(fā)現(xiàn)禽流感病毒高保守中和表位并進 行針對性的通用疫苗研究開發(fā)具有極大的吸引力。在我們制備的H5m單抗庫中，已發(fā)現(xiàn)有4株單抗對目前所檢測的全部H5m變異 株都有很強的中和活性，提示H5m病毒HA上可能存在重要的高保守性中和位點，從而提供 了一個克服H5m禽流感病毒高變異這一巨大障礙的重要突破口。我們利用其中的1個保 守中和單抗(13D4)，從噬菌體肽庫中篩選特異結(jié)合的表位模擬肽。多肽表面展示是一種新的基因操作技術(shù)，它使表達(dá)的多肽以融合蛋白形式展現(xiàn)在 噬菌體，細(xì)胞或某些載體表面，保持相對獨立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性。該技術(shù)可用于研究多 肽(蛋白質(zhì))的性質(zhì)、相互識別和作用，并據(jù)此從巨大展示庫中選擇特定靶功能的多肽結(jié) 構(gòu)。表面展示技術(shù)可用于人工抗體和疫苗的制備、抗原決定簇的定位、蛋白質(zhì)相互作用位點 的確定、特異調(diào)節(jié)分子的分離、細(xì)胞表面工程的研究、多肽藥物的研制，以及生物分子實驗 定向進化等研究。近年來噬菌體肽庫技術(shù)應(yīng)用范圍很廣，日益受到人們的重視，此肽庫技術(shù)也日趨 成熟，根據(jù)應(yīng)用目的不同而構(gòu)建了各種不同的肽庫，且成功地應(yīng)用到了很多領(lǐng)域(Parmley， S. F. and Smith，G. F.，1988，Gene ；Cwirla，S. Ε. et al.，1990，Proc Natl Acad Sci USA ； Scott, J. K. andSmith，G. P.，1990，Science ；Smith，G. P. and Scott, J. K.，1993，Methods Enzymol)。如根據(jù)載體種類可分為絲狀噬菌體肽庫、T4噬菌體肽庫、λ噬菌體肽庫；根據(jù) 用途不同可分為隨機短肽庫、天然肽庫、多肽構(gòu)象庫、cDNA展示庫和基因突變體展示庫。用噬菌體隨機肽庫從事蛋白質(zhì)抗原表位的分析，在研究線性短肽、折疊的蛋白質(zhì)， 甚至非蛋白質(zhì)分子等受體的相應(yīng)配體時，噬菌體隨機肽庫被認(rèn)為是配體的“萬能庫”。這些 配體不一定和天然的配體完全相同，但它能模擬天然配體的結(jié)合特性?；诖死碚?，在抗 原-抗體的識別研究中，人們不必使用天然抗原，就可以從隨機肽庫里直接篩選出能和抗 體結(jié)合的表位。這些表位既可以是線性表位，也可以是構(gòu)象型表位，而且不必預(yù)先確定蛋白 質(zhì)的氨基酸序列。噬菌體隨機肽庫是模擬肽篩選技術(shù)中的強有力的武器。它由特定長度的隨機短肽 序列組成，理論上文庫中包括某一固定長度短肽所有的氨基酸排列組合方式，即這一長度 的所有表位。用抗體篩選隨機肽庫得到與其高親和力結(jié)合的小分子模擬肽，進行短肽的序 列確定后，可根據(jù)此序列進行短肽重組合成和進一步修飾，以獲得最佳的抗原呈遞，得到高 特異性的新型疫苗，刺激機體產(chǎn)生有效的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)。但應(yīng)避免用某一單克隆抗 體篩選隨機肽庫，那樣雖可得到具有與目標(biāo)蛋白相同抗原性的表位模擬肽(mimotope)，但 該表位模擬肽也可能結(jié)合于同一抗體中的不同CDR區(qū)。所以，可視為候選疫苗的模擬表位 肽必須具有與識別天然表位的抗體結(jié)合的抗原性及誘導(dǎo)與天然表位有交叉反應(yīng)的抗體的 免疫原性。

發(fā)明內(nèi)容
在第一方面，本發(fā)明提供了能特異性結(jié)合禽流感病毒血凝素蛋白廣譜中和單克隆 抗體的表位模擬肽，其氨基酸序列為SEQ ID NOs :1-211之一，或者所述模擬肽經(jīng)氨基酸插 入、延伸、替換、刪除而得到的保守性變異體或活性片段，所述變異體或活性片段仍保持與
4禽流感病毒血凝素蛋白廣譜中和性單克隆抗體特異結(jié)合的能力。在第二方面，本發(fā)明提供上述禽流感病毒血凝素蛋白廣譜中和單克隆抗體，是由 保藏號為CCTCC-C200721的雜交瘤細(xì)胞系所分泌的抗H5亞型禽流感病毒血凝素蛋白單克 隆抗體13D4，或其抗體片段，如Fab、Fab'或F(ab)2。在第三方面，本發(fā)明提供的禽流感病毒血凝素蛋白廣譜中和單克隆抗體可以是其 基因工程抗體形式，如小分子抗體、嵌合抗體、人源化抗體。在第四方面，本發(fā)明提供了包含上述模擬肽或其保守性變異體或活性片段或突變 序列的融合蛋白，其具有與禽流感病毒血凝素蛋白廣譜中和單克隆抗體特異結(jié)合的能力。 優(yōu)選地，其中所述模擬肽或保守性變異體或活性片段與其它蛋白或毒素等載體融合。更優(yōu) 選地，所述其它蛋白為239蛋白或HBc。在第五方面，本發(fā)明提供了展示上述模擬肽或保守性變異體或活性片段或類似物 或突變序列的類病毒顆粒，仍具有與禽流感病毒血凝素蛋白廣譜中和單克隆抗體特異結(jié)合 的能力。在第六方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明核苷酸序列的核酸載體。在第七方面，本發(fā)明提供了上述模擬肽及其保守性變異體或活性片段或類似物或 突變序列、上述融合蛋白或類病毒顆粒用于制備預(yù)防禽流感疾病的疫苗的用途。在第八方面，本發(fā)明提供了上述模擬肽及其保守性變異體或活性片段或類似物或 突變序列、上述融合蛋白或類病毒顆粒在制備用于診斷禽流感疾病的組合物中的用途。在第九方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，包含本發(fā)明所述模擬肽或保守性變異體 或活性片段或其類似物或突變序列，或所述融合蛋白或所述類病毒顆粒。在第十方面，本發(fā)明提供了抗體，其特異于本發(fā)明的模擬肽或保守性變異體或活 性片段或其類似物或突變序列。本發(fā)明也提供了所述特異性抗體在制備用于診斷和治療禽 流感疾病的組合物中的用途。在本發(fā)明任何方面或者實施方案中，如果適用的話，優(yōu)選地，所述禽流感病毒是H5 亞型禽流感病毒，特別是H5m禽流感病毒。本發(fā)明還涉及上述表位模擬肽用于預(yù)測禽流感病毒廣譜中和表位的用途。本發(fā)明還涉及基于上述表位模擬肽預(yù)測到的禽流感病毒廣譜中和表位，優(yōu)選SEQ ID NO :212所示的中和表位，或者SEQ ID NO :212的經(jīng)一個或者幾個(例如1-5個，1-4個， 1-3個，1-2個，或1個)氨基酸的插入、延伸、替換、和/或刪除(例如保守替換)而得到的 變異體。本發(fā)明還涉及包含該禽流感病毒廣譜中和表位的多肽或融合蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及所述廣譜中和表位、多肽或融合蛋白質(zhì)用于制備預(yù)防禽流感疾病的 疫苗的用途。本發(fā)明還涉及藥物組合物或診斷用組合物，包含本發(fā)明的表位模擬肽包，含該表 位模擬肽的多肽、本發(fā)明所述融合蛋白或復(fù)合物、或本發(fā)明廣譜中和表位、多肽或融合蛋白 質(zhì)。本發(fā)明還涉及抗體，其特異結(jié)合權(quán)利要求本發(fā)明的廣譜中和表位。本發(fā)明還涉及編碼廣譜中和表位、多肽或融合蛋白質(zhì)的分離的多核苷酸、包含該 多核苷酸的核酸構(gòu)建體、包含該多核苷酸或核酸構(gòu)建體的載體、或者包含該載體的分離的 細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及抗體，其是由單克隆抗體13D4、8H5、8G9、20H2、17E6、或4A7，或其 (抗原結(jié)合性)抗體片段，如Fab、Fab'或F (ab) 2，或者單克隆抗體13D4、8H5、8G9、20H2、 17E6、或4A7的基因工程抗體形式，如小分子抗體、嵌合抗體、人源化抗體，或者單克隆抗體 13D4、8H5、8G9、20H2、17E6、或 4A7 經(jīng)一個或者幾個(例如 1-5 個，1-4 個，1-3 個，1-2 個，或 1個)氨基酸的插入、延伸、替換、和/或刪除(例如保守替換)而得到的變異體。本發(fā)明還涉及抗體13D4、8H5、8G9、20H2、17E6、或4A7 的 CDRl、CDR2、或 CDR3 或者 重鏈可變區(qū)或者輕鏈可變區(qū)或它們經(jīng)一個或者幾個(例如1-5個，1-4個，1-3個，1-2個，或 1個)氨基酸的插入、延伸、替換、和/或刪除(例如保守替換)而得到的變異體。本發(fā)明還涉及抗體，其包含13D4、8H5、8G9、20H2、17E6、或4A7 的 CDR1、CDR2、或 ⑶R3或它們經(jīng)一個或者幾個(例如1-5個，1-4個，1-3個，1-2個，或1個)氨基酸的插入、 延伸、替換、和/或刪除(例如保守替換)而得到的變異體。本發(fā)明還涉及抗體，包含13D4、8H5、8G9、20H2、17E6、或4A7的CDRl (或其變異 體)、CDR2 (或其變異體)和CDR3 (或其變異體)，其中所述變異體是經(jīng)一個或者幾個(例 如1-5個，1-4個，1-3個，1-2個，或1個)氨基酸的插入、延伸、替換、和/或刪除(例如保 守替換)而得到的變異體。本發(fā)明還涉及抗體，其包含13D4、8H5、8G9、20H2、17E6、或4A7的重鏈可變區(qū)(或 其變異體)和/或輕鏈可變區(qū)(或其變異體)，其中所述變異體是經(jīng)一個或者幾個(例如 1-5個，1-4個，1-3個，1-2個，或1個)氨基酸的插入、延伸、替換、和/或刪除(例如保守 替換)而得到的變異體。本發(fā)明申請中涉及的有關(guān)術(shù)語的定義如下本發(fā)明中的“血凝素”一詞指禽流感病毒的包膜糖蛋白。血凝素蛋白介導(dǎo)流感病毒 針對宿主細(xì)胞的吸附和進入。禽流感病毒的血凝素蛋白有16個血清學(xué)亞型，即HA1-HA16， 分別對應(yīng)于16個病毒亞型，即H1-H16。本發(fā)明中的“抗體” 一詞指任意一種免疫球蛋白，包括能結(jié)合特異性抗原的單抗、 多抗、雙特異性或多特異性抗體。一個完整的抗體包含兩條重鏈和兩條輕鏈。每條重鏈含有 一個可變區(qū)和第一、第二、第三等三個恒定區(qū)；每條輕鏈包含一個可變區(qū)和一個恒定區(qū)?？?體呈“Y”型，“Y”型結(jié)構(gòu)的頸部含有兩條重鏈的第二和第三恒定區(qū)，其通過二硫鍵結(jié)合形成。 “Y”型結(jié)構(gòu)的每條臂含有其中一條重鏈的第一恒定區(qū)和可變區(qū)，和一條輕鏈的可變區(qū)和恒 定區(qū)。輕鏈和重鏈的可變區(qū)決定抗原的結(jié)合；每條鏈的可變區(qū)均含有三個高變區(qū)，稱互補決 定區(qū)(CDR)(輕鏈(L)的 CDR 包含 LCDR1、LCDR2、LCDR3，重鏈(H)的 CDR 包含 HCDR1、HCDR2、 HCDR3 (其由 Kabat 等人命名，見 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition (1991)，第 1-3 卷，NIHPublication 91-3242，Bethesda Md)。其中，三個 CDR 由構(gòu)架區(qū)(FR)間隔開。構(gòu)架區(qū)比CDR區(qū)更保守并形成一個架子狀結(jié)構(gòu)支撐超變區(qū)。重鏈和 輕鏈的恒定區(qū)與抗原結(jié)合無關(guān)，但具有多種效應(yīng)功能?？贵w依據(jù)重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列 可以分成幾類，主要是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些類還進一步分成亞類，如IgGl、 IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 或 IgA2 等。本發(fā)明中的“抗體”一詞，除特指完整的免疫球蛋白外，也指免疫球蛋白的片段 (如至少是免疫球蛋白分子的一個免疫活性區(qū)段)，如Fab、Fab'、F(ab' )2、Fv片段、單鏈 抗體分子或由含有一個或多個CDR區(qū)的免疫球蛋白分子的任意片段形成的多特異性抗體。
6另外，本發(fā)明涉及的抗體也可以是由一個特定的人免疫球蛋白中的一個或多個CDR區(qū)結(jié)合 一個或多個不同的人免疫球蛋白的構(gòu)架區(qū)形成的抗體?？贵w相關(guān)的“Fab”片段是指含有一條輕鏈的可變區(qū)和恒定區(qū)和一條重鏈的可變區(qū) 和恒定區(qū)經(jīng)二硫鍵結(jié)合起來的抗體分子的一部分。本發(fā)明中的“抗原決定簇”(或稱表位)指的是抗原分子中與抗體結(jié)合的那部分氨
基酸或原子基團。本發(fā)明中的“單抗”一詞指的是來自一群高度同源的抗體分子中的一個抗體或抗 體的一個片斷，也即除僅在少數(shù)情況下可能出現(xiàn)的自然突變外，一群完全相同的抗體分子。 單抗對抗原上的單一表位具有高特異性。單抗與多抗不同，多抗是包含了識別抗原上的不 同表位的抗體分子。雖然傳統(tǒng)的單抗是由雜交瘤細(xì)胞分泌的，但本發(fā)明涉及的單抗并不 僅限于此制備方法。如，本發(fā)明涉及的單抗可采用Kohler等首次報道的雜交瘤技術(shù)獲得 (Nature, 256 :495，1975)，也可采用重組 DNA 技術(shù)獲得(如參見 U. S. P 4，816，567)。本發(fā)明中“載體”一詞指的是，可將編碼某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白獲 得表達(dá)的一種核酸運載工具。載體可通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，使其攜帶的遺傳物質(zhì) 元件在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)得以表達(dá)。舉例來說，載體包括質(zhì)粒；噬菌粒；柯斯質(zhì)粒；人工染色 體如酵母人工染色體(YAC)、細(xì)菌人工染色體(BAC)或Pl來源的人工染色體(PAC)；噬菌體 如λ噬菌體或Μ13噬菌體及動物病毒等。用作載體的動物病毒種類有逆轉(zhuǎn)錄病毒(包括 慢病毒)、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒(如單純皰疹病毒)、痘病毒、桿狀病毒、乳頭瘤病 毒、乳頭多瘤空泡病毒(如SV40)。一種載體可能含有多種控制表達(dá)的元件，包括啟動子序 列、轉(zhuǎn)錄起始序列、增強子序列、選擇元件及報告基因。另外，載體還可含有復(fù)制起始位點。 載體還有可能包括有協(xié)助其進入細(xì)胞的成分，如病毒顆粒、脂質(zhì)體或蛋白外殼，但不僅僅只 有這些物質(zhì)。本發(fā)明中“宿主細(xì)胞”一詞指的是導(dǎo)入載體的細(xì)胞，包括如下許多細(xì)胞類型，如大 腸桿菌或枯草菌等原核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞或曲霉菌等真菌細(xì)胞，如S2果蠅細(xì)胞或Sf9等昆 蟲細(xì)胞，或者如纖維原細(xì)胞，CHO細(xì)胞，COS細(xì)胞，NSO細(xì)胞，HeLa細(xì)胞，BHK細(xì)胞，HEK 293細(xì) 胞或人細(xì)胞的動物細(xì)胞?！爸泻涂贵w”一詞指的是能清除或顯著降低目標(biāo)病毒抗原結(jié)合毒力的抗體或抗體 片段。“特異性結(jié)合”一詞指的是，兩分子間的非隨機結(jié)合反應(yīng)，如抗體和產(chǎn)生該抗體的 抗原間的反應(yīng)。此處，結(jié)合第一種抗原的抗體對第二種抗原的結(jié)合親和力是檢測不到或很 弱。在某些實施方式中，一個某抗原特異性抗體是指以親和力(KD) <10_5M(如10_6M、10_7M、 10_8M、KT9MUCTkiM等)結(jié)合該抗原，其中KD指解離率與結(jié)合率的比值(koff/kon)，其可以 采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的方法進行測定。本發(fā)明在如下段落中進行舉例說明^^本發(fā)明所述單抗能夠特異性結(jié)合H5亞型禽流感病毒。本發(fā)明的一個方面涉及能 特異性結(jié)合H5亞型禽流感病毒血凝素蛋白的單抗及其相應(yīng)的抗原結(jié)合片段。本發(fā)明所述H5亞型禽流感病毒廣譜中和單抗是指這樣一種單克隆抗體，其針對 多種(至少兩種)不同亞型的H5禽流感病毒株都具有中和活性。
本發(fā)明所述抗H5單抗是由小鼠雜交瘤細(xì)胞株13D4所分泌的。單抗的名稱以其 相應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞株進行命名。也就是，抗H5單抗由雜交瘤細(xì)胞株13D4產(chǎn)生，并命名為 13D4。單抗13D4能特異性結(jié)合H5亞型禽流感病毒血凝素蛋白。小鼠雜交瘤細(xì)胞株13D4 已在2007年5月29日于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，位于武漢的武漢大學(xué))進行保 藏，保藏號是CCTCC-C200721 (雜交瘤細(xì)胞株13D4)。可以采用Kohler等在Nature 256 495 (1975)中報道的雜交瘤制備方法來制備單 抗。首先將免疫原(必要時候添加佐劑)免疫注射小鼠或其它合適的宿主動物。免疫原或 佐劑的注射方式通常為皮下多點注射或腹腔注射。免疫原預(yù)先偶聯(lián)到某些已知蛋白，如血 清白蛋白或大豆胰酶抑制劑上，可能會有助于增強抗原在宿主內(nèi)的免疫原性。佐劑可以利 用弗氏佐劑或MPL-TDM等。動物受免疫后，體內(nèi)會有分泌特異性結(jié)合免疫原的抗體的淋巴 細(xì)胞產(chǎn)生。另外，淋巴細(xì)胞也可以利用體外免疫獲得。收集目的淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞并 用合適的融合劑，如PEG，進行融合以獲得雜交瘤細(xì)胞(Goding，Monoclonal Antibodies Principles andPractice, pp. 59-103, Academic Press,1996)。上述制備的雜交瘤細(xì)胞可以接種到合適的培養(yǎng)液中生長，培養(yǎng)液中最好含有一種 或多種能夠抑制未融合的、母體骨髓瘤細(xì)胞生長的物質(zhì)。例如，對缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸 轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)的母體骨髓瘤細(xì)胞，在培養(yǎng)液中添加次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧 啶(HAT培養(yǎng)基)等物質(zhì)將可以抑制HGPRT-缺陷細(xì)胞的生長。利用傳統(tǒng)的免疫球蛋白純化方法，如蛋白A瓊脂糖凝膠、羥基磷灰石層析、凝膠電 泳、透析或親和層析等，可以將亞克隆細(xì)胞分泌的單抗從細(xì)胞培養(yǎng)液、腹水或血清中分離出來。本發(fā)明所述單抗還可以是通過基因工程重組技術(shù)獲得。利用特異性結(jié)合單抗重鏈 和輕鏈基因的核酸引物進行PCR擴增，可以從雜交瘤細(xì)胞中分離得到編碼單抗重鏈和輕鏈 基因的DNA分子。所得DNA分子插入表達(dá)載體內(nèi)，然后轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，如大腸桿菌細(xì)胞、猿 猴COS、CHO細(xì)胞、或其它不產(chǎn)生免疫球蛋白的骨髓瘤細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后的宿主細(xì)胞在特定條件 下培養(yǎng)并表達(dá)目標(biāo)抗體。本發(fā)明的單抗可以是包含兩條重鏈和兩條輕鏈的傳統(tǒng)的“Y”型結(jié)構(gòu)狀的抗體。另 外，所述抗體也可以是保持了對血凝素蛋白親和力的傳統(tǒng)的“Y”型結(jié)構(gòu)狀的抗體上的Fab 片段、Fab'、F(ab)2, Fv、或其它類型的部分片段，其結(jié)合血凝素蛋白的親和力可以高于或 低于傳統(tǒng)的“Y”型結(jié)構(gòu)狀的抗體。本發(fā)明的抗體片段可以利用水解完整的抗體分子獲得(參見Morimoto et al., J.Biochem. Biophys. Methods 24 107-117(1992)and Brennan et al. , Science 229 81(1985))。另外，這些抗體片段也可以直接由重組宿主細(xì)胞產(chǎn)生(綜述見Hudson，Curr. Opin. Immunol. 11 :548_557 (1999) ；Little et al.，Immunol. Today,21 :364_370 (2000))。 比如，F(xiàn)ab'片段可以直接從大腸桿菌細(xì)胞中獲得或化學(xué)偶聯(lián)形成F(ab' )2片段(Carter et al. ,Bio/Technology, 10 163-167 (1992))。再如，F(xiàn)(ab‘ ) 2片段可以用亮氨酸拉鏈GCN4 連接獲得。另外，F(xiàn)v、Fab或F(ab' )2片段也可以直接從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)液中直接分離 得到。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員完全知曉制備抗體片段的其它技術(shù)。中和抗體另一方面，本發(fā)明提供了能夠中和H5亞型禽流感病毒之病毒活性的抗H5抗體。在
8一實施方式中，這種中和抗體能夠中和H5亞型禽流感病毒之病毒活性的至少60%，或至少 70 %，或優(yōu)選至少75 %，或優(yōu)選至少80 %，或優(yōu)選至少85 %，或優(yōu)選至少90 %，更優(yōu)選至少 95%，最優(yōu)選至少99%。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員完全知曉利用傳統(tǒng)的技術(shù)方法可以測定抗體中和H5亞型禽 流感病毒的病毒活性。如本發(fā)明的實施例1中所描述的中和試驗的方法即可用于測定本發(fā) 明中的某一個特定H5單抗的中和活性。表位樽擬肽本發(fā)明還提供了一種模擬單克隆抗體識別表位的模擬肽。本發(fā)明還提供了 88個與單克隆抗體13D4結(jié)合有特異性的含12或7個氨基酸的 短肽即模擬肽(表1，SEQ ID NOs 188)。通過動物免疫實驗，從這些通用突變序列中可以篩選出能誘導(dǎo)產(chǎn)生與13D4單抗 功能類似抗體的模擬肽，這些模擬肽即可以進一步作為通用禽流感表位疫苗的研究基礎(chǔ)。本發(fā)明所指的肽含有天然或非天然氨基酸，包括D型氨基酸及氨基酸衍生物及氨 基酸類似物，只要肽保持帶有希望的活性和功能。肽也可以被環(huán)化。肽骨架及肽鍵也可以 被修飾。氨基酸及其衍生物都可以被修飾。非天然氨基酸及氨基酸類似物的替換可能增強 肽的活性或特征，比如增強肽的穩(wěn)定性和生物學(xué)活性。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以很容易地對模擬肽進行多種方法的修飾，以獲得最佳的抗 原呈遞，有效刺激機體產(chǎn)生細(xì)胞或體液免疫反應(yīng)。此近幾年對重組肽疫苗的研究主要著重 于通過構(gòu)型的改建、增添分子等修飾，以提高其免疫原性及在體內(nèi)的穩(wěn)定性。其中一種方法是將模擬肽連接到大分子載體上，一般用MBS法、戊二醛法、碳二亞 胺法、活潑酯法、亞胺酸脂法及鹵代硝基苯法等偶聯(lián)載體與重組肽疫苗。蛋白類載體有人血 清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)、牛甲狀腺球蛋白(BTG)、鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)或其他 Y球蛋白。重組載體有多聚賴氨酸、二軟脂酰賴氨酸、三軟脂酸2S甘油半胱氨酰2絲氨酰 基絲氨酸、多聚谷氨酸及多聚混合氨基酸等。也可以修飾模擬肽的空間結(jié)構(gòu)以增強免疫原性，如將抗體重鏈第三互補決定區(qū) (CDR 3)用外源小肽替代，借助CDR3環(huán)結(jié)構(gòu)兩側(cè)的β片層的空間限構(gòu)作用，成功實現(xiàn)了原 表位的空間限構(gòu)，使具有抗原性的外源小肽獲得與相應(yīng)天然蛋白相似的穩(wěn)定構(gòu)象，增強了 抗原呈遞效率和誘導(dǎo)機體免疫應(yīng)答的能力。還可以用化學(xué)方法將模擬肽構(gòu)建成四價多抗原 性肽。對模擬肽進行修飾可以降低蛋白酶的水解。提高重組肽免疫原性的另一方法是構(gòu)建表達(dá)出融合蛋白，作為載體的大蛋白分子 可以作為免疫載體，提供T細(xì)胞位點。一些病毒衣殼蛋白在原核或者真核系統(tǒng)中表達(dá)后， 在一定條件下形成的類病毒顆粒(virus-like particles，VLPs)?？梢訴LP作為表位展示 載體上，即將模擬肽融合表達(dá)到病毒衣殼蛋白上。將模擬肽融合到環(huán)區(qū)，就能很好的展示在 VLP表面。再通過一個柔性的氨基酸連接體序列，模擬肽就能不受病毒衣殼蛋白的約束，自 由的形成構(gòu)像。乙肝HBcAg、苜?；ㄈ~病毒、煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus, TMV)、 人乳頭瘤病毒HPV衣殼蛋白Li、L2等都可以作為展示模擬肽的蛋白載體。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以很容易地合成本發(fā)明的模擬肽。制備合成肽的標(biāo)準(zhǔn)過程為 本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉。檢測方法可以使用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)、酶免疫檢測、化學(xué)發(fā)光免疫檢測、放射免疫檢測、熒光免疫檢測、免疫色譜法、競爭法及類似檢測方法。利用競爭法或夾心法方式， 上述檢測方法可以用于檢測目標(biāo)抗原或抗體。競爭法是比較樣品中抗原和一種已知量的標(biāo)記抗原競爭結(jié)合本發(fā)明所述單克隆 抗體的數(shù)量關(guān)系。開展基于競爭法的免疫學(xué)檢測是將含有未知數(shù)量的目標(biāo)抗原的樣品加入 到事先用已知的物理或化學(xué)方法把本發(fā)明所述單抗包被到固相支持物上而得以進行的。同 時加入預(yù)定量的標(biāo)記后的目標(biāo)抗原進行反應(yīng)。孵育后，沖洗固相支持物，檢測結(jié)合到該支持 物上的標(biāo)記物的活性。治療方法和藥物組合物本發(fā)明提供了一種預(yù)防和治療禽流感病毒相關(guān)病毒感染患者的方法，包括對患者 施用一定量的包含了一種或多種本發(fā)明所述模擬肽的有藥物活性的藥物成分。本發(fā)明還提 供了一種含有本發(fā)明所述的一種或多種模擬肽的藥物成分或在此基礎(chǔ)上得到的鹽類藥物。本發(fā)明所述藥物成分的干預(yù)方式可以是傳統(tǒng)的干預(yù)途徑，包括口服、口腔、舌下、 眼球、局部、腸胃外、直腸、葉鞘內(nèi)、內(nèi)胞漿網(wǎng)槽內(nèi)、腹股溝、膀胱內(nèi)、局部(如，粉劑、藥膏或 滴劑)，或鼻腔途徑，但不僅局限于此。適合腸胃外途徑注射的藥物成分可能含有符合藥物制備要求的無菌水或非水溶 液、氣霧劑、懸浮液或乳劑，可在臨用時重懸成可注射的溶液或氣霧劑的無菌粉劑。如適合 的水性和非水性載體，工具和各種稀釋液如水、乙醇、多羥基化合物(如丙烯乙二醇、聚乙 二醇、丙三醇及其類似物)，合適的混合物，菜油(如橄欖油)，和可用于注射的有機脂，如乙 烷油酸。如使用卵磷脂衣殼維持藥物的合適流動性。如使用氣霧劑、表面活性劑以維持合 適的顆粒尺寸。本發(fā)明所述的藥物組合物還可含有一些起保護性、保濕、乳化和氣霧化的佐劑，也 可以含有預(yù)防微生物污染的速溶成分，如各種抗細(xì)菌試劑、抗真菌試劑，如對羥基苯甲酸酯 類，氯丁醇，苯酚，山梨酸及類似物。也可以包括維持滲透壓的試劑，如糖、NaCl及其類似物。 可使用延長吸附的試劑來延長注射用藥物成分吸附時間，如單硬脂酸鹽和凝膠等?？诜滔鄤┬桶z囊、片劑、粉劑、顆粒劑等。這些固相劑型中的活性成分至少 混有一種傳統(tǒng)的惰性藥物賦形劑(或載體)如檸檬酸鈉、磷酸鈣，或(a)填充劑或添加劑如 淀粉、乳糖、蔗糖、甘露糖和硅酸；(b)粘合劑，如羧甲基纖維素、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯 烷酮、蔗糖和阿拉伯樹膠；(C)濕潤劑，如甘油；(d)碎裂劑，如瓊脂，碳酸鈣，馬鈴薯粉或木 薯粉；(e)緩凝劑，如石蠟；(f)促吸收劑，如四氨基混合物；(g)保濕劑，如十六烷基醇和單 硬脂酸甘油酯；(h)吸附劑，如高嶺土和斑脫土；(i)潤滑劑，如滑石，硬脂酸鈣，硬脂酸鎂， 固體聚乙二醇，硫酸十二烷醇鈉，或其上述物質(zhì)的混合物。在片劑和膠囊劑型中，可能還含 有緩沖劑。固相劑型可以通過做成改良釋放或脈沖釋放劑型，是在上述提到的各種直接釋放 賦形劑中添加一些能改變藥物釋放速率的賦形劑而形成，可以包含在劑型中也可以做成外 衣的形式。速率釋放改造劑包括羧丙基甲基纖維素，甲基纖維素，碳甲基纖維素鈉，纖維素 乙烷，醋酸纖維素，聚乙烯氧化物，黃原膠糖，異丙烯酸氨共聚物，氫化調(diào)味油，巴西棕櫚蠟， 石蠟，鄰苯二酸醋酸纖維素，鄰苯二甲酸羧丙基甲基纖維素，甲基丙烯酸共聚物或上述物質(zhì) 的混合物。改良釋放和脈沖釋放劑型可能含有一種或一組具有改良釋放速率的賦形劑。本發(fā)明所述藥物成分還可由快速的霧化劑或消溶劑(FDDFs)組成，包含如下成
10分天冬氨酰苯丙氨酸甲酯，磺胺鉀，檸檬酸，交聯(lián)羧甲基纖維素鈉，交聚維酮，抗壞血酸，乙 烷基丙烯酸鹽，乙烷基纖維素，明膠，氫氧基丙基甲基纖維素，硬脂酸鎂，甘露醇，甲基乙丁 烯酸鹽，調(diào)味薄荷，聚乙二醇，氣化硅膠，二氧化硅，乙醇酸淀粉鈉，硬脂酸延胡索酸鈉，山梨 醇，木糖醇。這里用于描述FDDFs的“霧化和消溶” 一詞，依賴于所用藥物的溶解性，如藥物 是不可溶的，可制成快速的霧化劑型，如藥物是可溶的，則可制成快速的溶劑型。類似形式的固相成分也使用諸如乳糖或牛奶糖或其它高分子量的聚乙二醇及類 似的賦形劑制成軟明膠或硬明膠的填充劑型。諸如片劑、糖衣劑、膠囊劑和顆粒劑等之類的固體劑型可以通過諸如腸衣或其它 本領(lǐng)域普通人員均知曉的外包衣殼的方式制成。也可以是含有乳濁劑、也可以是含有能起 緩慢、延遲、控制活性藥物釋放的類似的成分。也可以使用多聚物和石蠟等成分進行包埋。 如果合適，也可用上述一種或多種賦形劑把活性成分制成微囊的形式的劑型。用于口服的液體劑型，包括符合藥物要求的乳狀劑、溶液、懸浮液、糖漿和酏劑等。 除了活性成分，液體劑型也可含有本領(lǐng)域常用的一些惰性溶液，如水或其它溶劑，可溶性試 劑和乳化劑，如乙烷基醇，異丙基醇，乙烷基碳酸鹽，苯基安息香酸鹽，丙烯乙二醇，1，3- 丁 烯乙二醇，油，特別是，棉籽油，落花生油，玉米油，橄欖油，調(diào)味油和芝麻油，甘油，氫糠基 醇，聚乙二醇和脂肪酸山梨醇酯，以及上述物質(zhì)的混合物或類似的物質(zhì)。除了這些惰性稀釋液，藥物成分也可包括保濕劑、乳化劑、懸浮劑、糖化劑、調(diào)味劑 和香味劑等佐劑。另外，藥物成分還可包括乙氧基化均聚乙醇，聚氧乙烯烷基山梨醇和山梨 聚糖脂，微晶纖維素，間氫氧化鋁，膨潤土，瓊脂聚合物和黃芪膠，或這些物質(zhì)的混合物之類 的懸浮劑。本發(fā)明所述藥物成分也制成適合獸用治療的混合物，或符合獸用的鹽類，或符合 獸用的溶劑或初成藥，并根據(jù)普通獸醫(yī)和獸醫(yī)從業(yè)者的要求制成一種最適合某種特定動物 的給藥劑量和途徑藥物的合適劑型。本發(fā)明所述一個或多個模擬肽可以結(jié)合其它抗病毒試劑用于預(yù)防和/或治療H5 禽流感病毒感染相關(guān)疾病。模擬肽可以和這些抗病毒試劑同時、分開或連續(xù)給藥。其它抗 病毒試劑包括利巴韋林，金剛烷，羧基脲，IL-2，IL-12和五羧鏈胞酸，但不僅限于這些。多肽篩選方法和抗體識別的多肽及疫苗本發(fā)明提供了一種篩選本發(fā)明所述單抗識別的表位模擬肽的檢測方法。而且，本 發(fā)明也提供了本發(fā)明所述單抗識別的表位模擬肽。一方面，本發(fā)明公布的模擬肽含有氨基 酸序列SEQ ID Nos:l-88。這些模擬肽能夠結(jié)合本發(fā)明所述單抗。因此，這些模擬肽擁有 和H5血凝素相同的抗原特異性。這些模擬肽也可用于制備H5亞型禽流感疫苗，也可以用 于診斷抗H5血凝素抗體的存在。另一方面，本發(fā)明所述的篩選方法包括如下步驟(i)在特定條件下培養(yǎng)一個適合 多肽表達(dá)的多肽展示文庫；(ii)把培養(yǎng)溶液和本發(fā)明的單抗混合；(iii)篩選特異性結(jié)合上 述單抗的噬菌體克隆。用于篩選的單克隆抗體不僅限于單抗13D4。本申請實施例1中詳細(xì) 描述了一種利用噬菌體展示多肽文庫成功篩選結(jié)合本發(fā)明所述單抗的模擬肽檢測方法。


圖1-3為噬菌體多肽的ELISA檢測值OD (450/620)的矩形圖。圖1顯示的是ELISA檢測展示12肽的噬菌體與抗體的反應(yīng)。圖2顯示的是ELISA檢測展示環(huán)七肽的噬菌體與 單抗的反應(yīng)。圖3顯示的是ELISA檢測展示七肽的噬菌體與單抗的反應(yīng)。圖4顯示10組噬菌體肽抗血清與H5m禽流感病毒的Dot blot反應(yīng)結(jié)果。13D4 為陽性對照，control (-)為Ml3噬菌體陰性對照，control (0)為未加血清的陰性對照。有 3組抗血清(P1、P5和P10)顯示出較明顯的特異性與H5病毒的結(jié)合反應(yīng)。圖5顯示3組噬菌體肽抗血清與不同亞型禽流感病毒的Dot blot反應(yīng)結(jié)果。 Pl-I和P1-2為來自兩只不同小鼠的Pl組抗血清，同樣P5-1和P5-2為來自兩只不同小 鼠的P5組抗血清，P10-1和P10-2為來自兩只不同小鼠的PlO組抗血清。P6-1和P6-2 為來自兩只不同小鼠的P6組抗血清，作為陰性對照。Hl mAb和H3 mAb分別為Hl和H3 禽流感病毒的單抗，13D4為H5亞型禽流感病毒的單抗。M13-1和M13-2為M13噬菌體的 陰性對照血清。Control serum為未經(jīng)免疫的陰性對照鼠血清。No serum為未加血清的 陰性對照。有兩種Hl亞型的禽流感病毒ST/517/2005/2 (517)和ST/104/2005/2 (104)， 有兩種H3亞型的禽流感病毒ST/798/2005/2 (798)和ST/177/2005/2 (177)。六種H5亞 型禽流感病毒 DK/FJ/897/05 (897)、VNM/1194/04 (1194)、CK/Malang/BBVet-I/04 (Yl)、 Shenzhen/406H/06 (406H)、Ck/Jx/6151/03 (6151)、A/Ck/HK/Yu22/02 (Yu22)。結(jié)果顯示 3 組 抗血清(P1、P5和P10)有明顯的特異性與Η5亞型病毒的結(jié)合反應(yīng)。圖6顯示P印-3D_Seaerch預(yù)測區(qū)域在HAl上的空間位置。圖7顯示交叉反應(yīng)的模擬肽。圖8顯示Mapitope預(yù)測的“Cluster 300”交叉表位。A :“cluster300”的空間結(jié) 構(gòu)；B :"cluster 300，，的在HA上的位置；C :“cluster300，，的突變位點選擇。
實施例下面結(jié)合具體實施例與附圖，對本發(fā)明進一步加以描述，但這些描述并不構(gòu)成對 本發(fā)明的限制。實施例1從噬菌體12肽庫、七肽庫和環(huán)七肽庫中篩選模擬13D4識別表位的短肽選用New England Biolabs公司的12肽噬菌體展示文庫(ph. D. 12p印tide library)、七肽噬菌體展示文庫(ph. D. 7p印tide library)及環(huán)七肽噬菌體展示文庫(ph. D.C7C peptide library)篩選與單克隆抗體13D4結(jié)合的模擬肽，按操作說明書進行篩選。吸取50μ1 Protein A-瓊脂糖介質(zhì)(50%的水懸液)于微量離心管中，加Iml TBS+0. 1% Tween(TBST)溶液。輕彈管壁或溫和震蕩重懸介質(zhì)。低速離心30秒，沉淀介質(zhì)， 小心吸去上清。介質(zhì)重懸于Iml封阻緩沖液中，4°C作用60分鐘，偶爾混勻。在此期間，用 TBS緩沖液將2X IO11個噬菌體粒子(相當(dāng)于10 μ 1的原始文庫)和300ng抗體稀釋至終 體積200 μ 1，抗體終濃度為ΙΟηΜ。室溫作用20分鐘。封阻反應(yīng)后，低速離心沉淀介質(zhì)，并 用Iml TBS洗4次，每次均需沉淀介質(zhì)。將噬菌體-抗體混合物加入洗過的介質(zhì)中，溫和 混勻，室溫作用15分鐘并不時混勻。低速離心沉淀介質(zhì)，棄上清，用Iml TBTS洗10次。重 懸沉淀介質(zhì)于Iml 0. 2M的Glycine-HCl (pH 2. 2)，lmg/ml BSA中，室溫作用10分鐘，洗脫 結(jié)合的噬菌體。離心洗脫混合液1分鐘，小心將上清轉(zhuǎn)入另一新的微量離心管中。立即用 150 μ 1 IM Tris-HCl，ρΗ9. 1的緩沖液中和洗脫液。取出約1 μ L滴定噬菌體滴度。將剩 余的噬菌體溶液加入20mL對數(shù)生長前期的ER2738宿主菌液中，37°C震蕩培養(yǎng)4. 5h。將菌液移入50mL離心管中，IOOOOrpm離心lOmin。吸取上部80%上清，加入1/6體積的PEG/ NaCl (20% PEG-8000,2. 5M NaCl)溶液，4°C靜置過夜。IOOOOrpm 4°C離心 15min。倒掉上 清，用ImL PBS溶解沉淀噬菌體。4°C離心5min，吸取上清，加入1/6體積的PEG/NaCl溶液， 4°C靜置lh。IOOOOrpm 4°C離心15min。倒掉上清，用200 μ L PBS溶解沉淀噬菌體，4°C保
存。重復(fù)上述步驟，進行再一輪的篩選。第三輪篩選后，取出約Iul洗脫下來的噬菌體進行滴定。挑取單一噬菌體空斑至 對數(shù)期的ER2738菌中，37°C培養(yǎng)4. 5_5h，離心收集噬菌體上清進行ELISA檢測。包被IOug/ ml濃度的鼠單抗13D4，以噬菌體上清為一抗，Anti-M13/HRP抗體(Amersham Phmarcia Biotech, UK)以1 5000稀釋為二抗，取禽流感相關(guān)單克隆抗體8G9、8H5、9B2、10F7以及 抗HEV E2蛋白的不相關(guān)抗體8(11、8!13、1607為鼠單抗對照。圖1-3顯示噬菌體多肽的檢測結(jié)果。由圖中結(jié)果可知，大部分噬菌體肽針對目標(biāo) 抗體13D4的讀值高于對照抗體3倍以上，有較好的特異性。根據(jù)噬菌體ssDNA抽提試劑盒(Omega，USA)的常規(guī)操作抽提DNA，以該DNA模板 進行測序(Invitrogen，Shanghai, China)，獲得以上噬菌體展示肽的核苷酸及推測的氨基 酸序列(見表1)。表1與單抗隆抗體13D4特異結(jié)合的模擬肽氨基酸序列
權(quán)利要求
一種能特異性結(jié)合禽流感病毒血凝素蛋白廣譜中和單克隆抗體的表位模擬肽，其包含如下氨基酸序列或其氨基酸序列為(1)SEQ ID NOs1 211所示的氨基酸序列之一，或者(2)(1)中所述氨基酸序列經(jīng)一個或者幾個(例如1 5個，1 4個，1 3個，1 2個，或1個)氨基酸的插入、延伸、替換、和/或刪除(例如保守替換)而得到的變異體，或者(3)(1)或(2)所述氨基酸序列的活性片段，所述變異體或活性片段仍保持與禽流感病毒血凝素蛋白廣譜中和性單克隆抗體特異結(jié)合的能力。
2.權(quán)利要求1所述的肽，其中所述廣譜中和單克隆抗體是由保藏號為CCTCC-C200721 的雜交瘤細(xì)胞系所分泌的抗H5亞型禽流感病毒血凝素蛋白單克隆抗體13D4、或者單克隆 抗體8H5、8G9、20H2、17E6、或4A7，或其(抗原結(jié)合性)抗體片段，如Fab、Fab ‘或F(ab)2。
3.權(quán)利要求1所述的肽，其中廣譜中和單克隆抗體可以是單克隆抗體13D4、8H5、8G9、 20H2、17E6、或4A7的基因工程抗體形式，如小分子抗體、嵌合抗體、人源化抗體。
4.包含權(quán)利要求1-3任一項的肽的多肽，優(yōu)選其具有與禽流感病毒血凝素蛋白廣譜中 和單克隆抗體特異結(jié)合的能力。
5.編碼權(quán)利要求1-4任一項的肽或多肽的分離的多核苷酸、包含該多核苷酸的核酸構(gòu) 建體、包含該多核苷酸或核酸構(gòu)建體的載體、或者包含該載體的分離的細(xì)胞。
6.包含權(quán)利要求1-4任一項的肽或多肽的融合蛋白，其具有與禽流感病毒血凝素蛋白 廣譜中和單克隆抗體特異結(jié)合的能力。
7.權(quán)利要求1-4任一項的肽或多肽與其它蛋白或毒素或脂類等大分子載體或重組載 體偶聯(lián)或融合而得到的復(fù)合物。
8.權(quán)利要求1-3任一項所述肽，權(quán)利要求4的多肽，權(quán)利要求6-7任一項所述融合蛋白 或復(fù)合物用于制備預(yù)防禽流感疾病的疫苗的用途。
9.權(quán)利要求1-3任一項所述肽，權(quán)利要求4的多肽，權(quán)利要求6-7任一項所述融合蛋白 或復(fù)合物在制備用于診斷禽流感疾病的組合物或診斷劑或試劑盒中的用途。
10.權(quán)利要求1-3任一項所述肽用于禽流感病毒廣譜中和表位預(yù)測的用途。
11.基于權(quán)利要求1-3任一項所述肽預(yù)測到的禽流感病毒廣譜中和表位，優(yōu)選SEQID NO :212所示的中和表位，或者SEQ ID NO :212的經(jīng)一個或者幾個(例如1-5個，1-4個，1_3 個，1-2個，或1個)氨基酸的插入、延伸、替換、和/或刪除(例如保守替換)而得到的變異 體；或者包含該表位的多肽或融合蛋白質(zhì)。
12.權(quán)利要求11所述廣譜中和表位、多肽或融合蛋白質(zhì)用于制備預(yù)防禽流感疾病的疫 苗的用途。
13.一種藥物組合物或診斷用組合物，包含權(quán)利要求1-3任一項所述肽，權(quán)利要求4的 多肽，或權(quán)利要求6-7任一項所述融合蛋白或復(fù)合物，或權(quán)利要求11所述的廣譜中和表位、 多肽或融合蛋白質(zhì)。
14.一種抗體，其特異結(jié)合權(quán)利要求1-3和11任一項所述的肽或表位。
全文摘要
本發(fā)明提供了可特異性結(jié)合H5亞型禽流感病毒血凝素(HA)蛋白中和表位模擬肽，及其保守性變異體或活性片段或突變序列，及其相關(guān)編碼序列，及應(yīng)用該模擬肽或保守性變異體或活性片段或突變序列于預(yù)防或診斷的用途。
文檔編號C07K17/00GK101979404SQ20091022519
公開日2011年2月23日 申請日期2009年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月9日
發(fā)明者夏寧邵, 宋慧娟, 張軍, 羅文新, 陳毅歆, 陳瑛煒, 陳鴻霖 申請人:廈門大學(xué)