專利名稱：：能阻斷l(xiāng)ps與md2結(jié)合的抗炎抗菌多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬醫(yī)藥領(lǐng)域，主要是涉及一種能阻斷LPS與MD2結(jié)合的抗炎抗菌多肽及其藥學上的應(yīng)用，用于治療因革蘭氏陰性菌感染，以及由此造成相關(guān)的過度炎癥性損害類疾病。
背景技術(shù)：
：細菌感染，特別是革蘭氏陰性菌感染所導致的膿毒癥已成為當前臨床病人，特別是外科I⑶患者死亡的主要原因。資料表明，住院病人發(fā)生膿毒癥的比例是1/3，ICU病人>50%，而外科I⑶則在80%以上。然而令人遺憾的是，目前盡管高效廣譜抗生素的出現(xiàn)，膿毒癥仍然是臨床ICU病人死亡的重要原因，究其主要原因在于細菌毒素對機體產(chǎn)生的過度刺激所導致的一系列炎癥性損害，抗生素的應(yīng)用雖然可以對病菌具有抑制和殺滅作用，但病菌死亡后其毒素的釋放無疑是導致機體發(fā)生嚴重膿毒癥，膿毒性休克，甚至死亡的主要因素之一。因而，尋找新型的，兼有抗菌作用和抗過度炎癥反應(yīng)的藥物已成為當今重要的藥物研究熱點之一。細菌對機體造成的感染膿毒癥通常由細菌外毒素及內(nèi)毒素對機體的刺激產(chǎn)生。細菌毒素進入體內(nèi)后，首先刺激免疫炎癥細胞，通過機體模式識別受體，主要為TLR2和TLR4受體，啟動機體的感染免疫反應(yīng)，但當機體遭受過度刺激后，大量產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)則可對機體造成一系列過度的炎癥性損害。有鑒于此，采用恰當?shù)拿庖卟呗詫δ摱景Y實施有效防治，已成為免疫學家，臨床學家，以及制藥行業(yè)關(guān)注的重點問題之一。當前對膿毒癥的免疫治療策略可大致分為三個方面，其一，圍繞病原體本身展開，如針對細菌內(nèi)毒素脂多糖(lipopolysacchride，LPS)或其它致病因子制備相應(yīng)的單克隆抗體進行中和作用，但作為LPS表位抗原的決定簇較多，單一的單抗中和難以達到預(yù)期效果；其二，針對前炎癥因子采用單克隆抗體拮抗，如抗腫瘤壞死因子抗體，抗白介素6，白介素8抗體等，但這種對炎癥介質(zhì)逐一對抗的方法無疑事倍功半；其三，近來有報道從控制炎癥細胞受激活化角度切入的研究，即從炎癥細胞被病原體刺激后核轉(zhuǎn)錄因子活化角度進行調(diào)控和干預(yù)，眾所周知，核轉(zhuǎn)錄因子不僅控制著過度炎癥介質(zhì)的釋放，同時也是許多重要生理事件的調(diào)控“閥門”，對其“全或無”的干預(yù)很可能將帶來難以預(yù)料的副作用，此外，針對核轉(zhuǎn)錄因子的藥物還必須能穿過細胞膜，這無疑對藥物的制作工藝提出了更高的要求。近年來，有資料提示，活化蛋白(^activatedproteinC，APC)，可作為控制膿毒癥發(fā)生發(fā)展的一種有效制劑，然而遺憾的是，最近通過美國多中心臨床研究證實，其臨床效果與相應(yīng)的對照治療組無明顯差異。對各種疾病的治療都應(yīng)集中在發(fā)病早期環(huán)節(jié)上。免疫細胞對細菌內(nèi)毒素脂多糖(lipopolysacchride,LPS)的識別是炎癥反應(yīng)發(fā)生的初始環(huán)節(jié)，因此如何調(diào)控免疫炎癥細胞對LPS的識別，抑制LPS所致的過度炎癥反應(yīng)，在減輕炎癥性損害的同時，又不影響機體免疫細胞正常的抗感染免疫功能則應(yīng)是針對膿毒癥實施有效免疫治療的理想策略。在免疫炎癥細胞LPS的膜式識別受體復(fù)合物(TLR4/MD2/⑶14)中，任何一個功能結(jié)構(gòu)域的破壞都導致LPS信號轉(zhuǎn)導障礙。資料證實，CD14與TLR4/MD2的親和力較弱，而TLR4/MD2的親和力較強，并且MD2(myeloiddifferentialprotein2，髓樣分化蛋白2)同TLR4(tolllikerec印tor4，Toll樣受體4)的結(jié)合發(fā)生在同LPS結(jié)合之前，喪失LPS結(jié)合功能的MD2即使結(jié)合在TLR4胞外區(qū)，也不能賦予TLR4對LPS的反應(yīng)性。表明MD2分子中與LPS結(jié)合的結(jié)構(gòu)域?qū)φ麄€復(fù)合體的功能乃至之后的信號轉(zhuǎn)導強度都有決定性的作用。并且MD2與TLP4的胞外區(qū)相偶聯(lián)，是一個只含有160個氨基酸的分泌蛋白，具有分子量小，核算片段短，且可為分泌型等特點，對MD2的調(diào)控更易操作，因而成為治療內(nèi)毒素休克十分有潛力的靶點之一。越來越多的實驗說明，MD2在結(jié)合LPS及誘導其信號的胞內(nèi)傳導中都起著關(guān)鍵的作用。有研究提示，阻斷LPS與MD2的結(jié)合，比阻斷LPS與TLR4/MD2的結(jié)合要容易近100倍1，因而在應(yīng)用前景上給我們以提示，如何開發(fā)一種可以干擾LPS與MD2結(jié)合的藥物，或者是抑制MD2與同TLR4結(jié)合，可能是控制LPS誘導的炎癥反應(yīng)發(fā)展的更為有效、事半功倍的治療策略。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供能模擬MD2與LPS結(jié)合的關(guān)鍵序列，可競爭性地拮抗LPS與MD2發(fā)生的特異性結(jié)合，從而達到減輕LPS對免疫炎癥細胞過度活化，進而緩解由此而導致對機體過度的膿毒性損害的拮抗多肽。該多肽的氨基酸序列為序列1:LysThrValProAspAsnHis序列2:IleGlyLysPheLeuTyrArg由于上述拮抗多肽的功能，本發(fā)明的第二目的還涉及上述氨基酸序列在制備治療由革蘭氏陰性菌所導致的感染，過度炎癥性損傷的生物多肽制劑中的應(yīng)用，及在制備由Toll樣受體所誘導的炎癥性疾病的生物多肽制劑中的用途。為實現(xiàn)上述目的而采用的技術(shù)方案是這樣的第一，首先通過生物信息學技術(shù)，分析MD2蛋白的結(jié)構(gòu)特征，如親水性，柔韌性，可及性等生物信息學參數(shù)，分析MD2與細菌內(nèi)毒素LPS相互作用的關(guān)鍵序列；第二以該氨基酸序列為模板，利用噬菌體肽庫篩選技術(shù)，從隨機的噬菌體肽庫中篩選獲得能與該模板特異結(jié)合的多肽片斷；第三，從眾多候選的拮抗多肽中利用炎癥介質(zhì)產(chǎn)生抑制作用，篩選對MD2具有高度親和作用的拮抗性多肽；第四，利用生物素標記轉(zhuǎn)移實驗證實，篩選出的拮抗多肽可與MD2蛋白發(fā)生直接的結(jié)合作用；第五，采用兩種不同作用濃度，分別在3種細胞模型中驗證所篩選出的2種拮抗多肽，對細菌毒素(LPS)所誘發(fā)的炎癥反應(yīng)的抑制作用；第六，通過活體動物實驗進一步炎癥所篩選出的拮抗多肽對細菌內(nèi)毒素LPS攻擊小鼠的生物保護效應(yīng)。通過上述六步實驗證實，本發(fā)明所述的2條拮抗性多肽對細菌毒素(LPS)攻擊的動物具有明顯的抗炎，抗菌作用，能顯著提高受攻擊小鼠的存活率，從而在特異阻抑LPS對炎癥細胞過度刺激的同時，還能保持機體免疫防御功能?？捎糜谝蚋锾m氏陰性菌所導致的感染，以及與toll樣受體4蛋白相關(guān)的炎癥性疾病的治療。圖1.MD2蛋白的生物信息學分析結(jié)果示意圖；圖中A為親水性預(yù)測、B為柔性預(yù)測、C為抗原性預(yù)測、D為可及性預(yù)測、E為MD2三段序列的親水性預(yù)測。序列A:NH2-FSKGKYKCV-C00H序列B:NH2-FKGIKFSKGKYKCVVEAIS-COOH序列C:NH2-全長MD2分子-C00H綜合生物信息學單參數(shù)指標看，序列A親水性，可及性及柔韌性最好，因此選擇該序列為模板，可用于篩選與MD2特異結(jié)合的拮抗多肽。圖2.MD2與拮抗肽相互作用WesternBlot圖圖中對2條篩選出的多肽分別加用還原和非還原緩沖液，得到4條帶。MD2蛋白的分子量為18.2KD，MD2+拮抗多肽1分子量為1.015KD，MD2+拮抗多肽2，分子量為1.100KD,而Bio-tinylated蛋白標準范圍為10200KD。因此，上述結(jié)果證實所篩選出的2條多肽確實與MD2發(fā)生了直接的相互結(jié)合，這為我們下一步利用細胞模型進一步分析拮抗多肽的生物效應(yīng)，奠定了基礎(chǔ)。相互作用。圖中A為拮抗多肽1，B為拮抗多肽1+MD2，C為拮抗多肽2，D為拮抗多肽2+MD2。加入MD2后陽性蛋白條分子量為多肽+MD2，表明二者發(fā)生了相互結(jié)合作用。圖3為拮抗多肽對LPS所致內(nèi)毒素血癥小鼠的保護作用病理切片圖；A為正常小鼠的肺組織病理切片(HE染色，400倍)，B為僅用LPS的小鼠肺病理切片(HE染色，400倍)，C為無關(guān)多肽干預(yù)的小鼠肺病理切片(HE染色，400倍)，D為MD2拮抗多肽1干預(yù)的小鼠肺病理切片(HE染色，400倍)，E為MD2拮抗多肽2干預(yù)的小鼠肺病理切片(HE染色，400倍)。從圖中可以看出，與正常肺組織切片相比，單純使用LPS組小鼠，表現(xiàn)為肺泡腔出現(xiàn)炎癥滲出，肺泡間隔增寬，大量炎癥細胞浸潤等一系列明顯的炎癥反應(yīng)。LPS+無關(guān)多肽組病理表現(xiàn)與單純LPS組小鼠類似。而在LPS+拮抗多肽處理的小鼠，肺泡腔滲出減少，肺泡間隔炎癥細胞浸潤顯著減弱，炎癥反應(yīng)明顯減輕，表明使用MD2的拮抗多肽后，可顯著改善LPS處理小鼠肺組織的病理變化。具體實施例方式(分六步實驗完成)實驗一.MD2蛋白的生物信息學分析及其可用于篩選拮抗多肽模板的選擇。實驗?zāi)康睦蒙镄畔W技術(shù)，分析MD2蛋白的結(jié)構(gòu)特征，對親水性，可及性，柔韌性等參數(shù)的分析，尋找MD2與細菌毒素LPS相互作用的關(guān)鍵氨基酸序列。并以此序列為模板，為后續(xù)篩選其相應(yīng)的拮抗多肽奠定基礎(chǔ)。實驗方法1.單參數(shù)預(yù)測MD2的親水性(Hydrophilicity)、抗原性(Antigenicity)、可及性(Accessibility)和主鏈柔性(Flexibility)。2.二級結(jié)構(gòu)預(yù)測和其他信息分析在PHD和SOPMA服務(wù)器上完成。3.確定細胞表位將單參數(shù)預(yù)測結(jié)果匯總；排除二級結(jié)構(gòu)位于α-螺旋和β-折疊內(nèi)不易形成表位的序列，將位于β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲處者確定為MD2的候選B細胞優(yōu)勢表位。最后采用吳玉章等報道方法，將平均抗原指數(shù)(Al)最高值對應(yīng)的序列確定為為hMD2的B細胞優(yōu)勢表位。4.MD2的核酸序列分析用DNAclub軟件搜索hMD2編碼序列中的酶切位點。5.MD2蛋白功能預(yù)測在BLAST、PRS和Superfamily服務(wù)器上提交AA序列，以氨基酸序列、組成以及超家族分類等方法進行MID2的功能預(yù)測。6.可以與MD2結(jié)合的AA序列特征分析通過BLAST服務(wù)器，比對和搜尋TLR4/TLR2的相似序列(交叉序列)；再以此序列BLAST，搜索與TLR4/TLR2相似序列同源的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)可能就與MD2的功能有關(guān)。7.蛋白質(zhì)分子量(MW)和等電點(PI)用ExPASy的ComputPI/MW程序計算。8.MD2模擬小肽的合成由生物技術(shù)公司合成。純度>95%，質(zhì)量20mg，成品經(jīng)過HPLC純化，并經(jīng)MS檢測。實驗結(jié)果一、MD2的序列信息1.表位預(yù)測(1)單參數(shù)預(yù)測MD2的親水性、抗原性、主鏈柔韌性和可及性單參數(shù)預(yù)測結(jié)果見圖1.AD(高于基線的AA所對應(yīng)的肽段為表位)；匯總于表5；(2)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測用PHD和SOPMA預(yù)測MID2二結(jié)構(gòu)見表2。表1.MD2單參數(shù)預(yù)測匯總_働憐法__26-33,36-42,51-61,66-74,87-97,97-107,107-115,122-136,140-11728-34,34-45,54-59,65-76,8J-92,97-104,108-115,124-132，139-145，155-160^Mi26-32,53-59,86-93,96-102,108-117,122-133，138-145,156-160WSM.54-63,67-77,86-93,97-110,126-136,151-160表2.二級結(jié)構(gòu)預(yù)測序列QKQYWVCNSSDASISYTYCDKMQYPIS1NVNPCIELKGSKGLLHIFYIPRRDLKQLYF結(jié)構(gòu)TEEEEEECCCCCCEEEEHCCTrCCCEEEECCCEEEETTTTCEEEEEECCCCCHHHHEE序列NLYITWimPKRKEVICRGSDDDYSFCRAHGETVNrnSFSffiGIKFSKGKYKC結(jié)構(gòu)EEEEEEEEECCCCCCEEEEECCCCCCEEmenTCCCEEEEEEEETTEEECITCHHEE序列WEAISGSPEEMLKLEFVILHQPNSN結(jié)構(gòu)EHHHTTCCHHHEEEHmffiEECCCCCC#Alphahelix(14.08%)；Extendedstrand(43.66%)；Betaturn(10.56%)；Randomcoil(31.69%)2.核酸序列分析MD2編碼序列中單酶切位點有BamHI(166)，CfoI/Hhal(267)，DraI(210),HpaI(142)，SacI(317)，VspI(136)。常用的高效率內(nèi)切酶BamHI(GGATCC)位點編碼2個AA(56G，57S)，可以避免移碼突變的產(chǎn)生。3.MD2的AA序列功能位點信息見表3:MD2是致密的球蛋白；很容易在分子內(nèi)和分子間二硫鍵。在96141位AA具有多達5個的功能位點，這段序列是重要序列。表3.MD2蛋白質(zhì)的重要功能位點<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>4.等電點(PI)和分子量(Mw)計算(表4)表4.蛋白質(zhì)等電點和分子量計算<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>GST/MD27.5538.716kDGST/MD2-C7.0545.112kD_二、MID2的功能預(yù)測1.MD2的家族歸屬MD2含有ML功能域(MD2_relatedlipid-reccognition)，與MD-UGM2A、Npc2等蛋白質(zhì)同屬一個家族，與天然免疫和脂質(zhì)代謝有關(guān)；ML功能域位于MD2分子的C-末端。PRS服務(wù)器(按照AA組成)預(yù)測顯示，MD2與細胞色素C氧化酶的氨基酸組成相似，提示它可能與該蛋白質(zhì)功能有關(guān)。PHD服務(wù)器的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測提示，MD2的結(jié)構(gòu)與PHD數(shù)據(jù)庫中編號1B8F的蛋白質(zhì)相似，該蛋白質(zhì)是銅綠假單胞菌組氨酸裂解酶(Histidineammonia-lyase,HLA)。2.可能與MD2結(jié)合的序列和蛋白質(zhì)PSI_BLAST搜索TLR4/TLR2交叉點，得到5個序列片斷，其中1個在細胞內(nèi)區(qū)(PPFQLCLHYRDFIPG)，4個在細胞外區(qū)；以此序列分別進行BLAST搜索，得到可能與MD2結(jié)合的蛋白質(zhì)，其中細胞色素P450因為與炎癥反應(yīng)也有關(guān)而備受關(guān)注。3.Superfamily超家族預(yù)測MD2的143位A可形成Kringle樣結(jié)構(gòu)，31151位AA屬于免疫球蛋白超家族的結(jié)構(gòu)模式。提示MD2在N-末端和C-末端具有兩個相對獨立的功能域，可能是MD2既能與配基結(jié)合也能與TLRs結(jié)合分子基礎(chǔ)。實驗結(jié)論本實驗對MD2的生物信息分析顯示MD2在結(jié)構(gòu)上可能分成兩個相對獨立的功能域，N-末端與相關(guān)蛋白質(zhì)(TLR4或TLR2)結(jié)合，C-末端與脂質(zhì)類配基(LPS)結(jié)合。其中K128/132是與LPS結(jié)合功能域的關(guān)鍵氨基酸，可能是MD2與LPS結(jié)合的分子基礎(chǔ)。根據(jù)親水性預(yù)測，以K128-K132為中心的肽段呈現(xiàn)較強的親水性(見圖1)，即NH2-FSKGKYKCV-C00H，為此，本研究擬以該氨基酸序列作為后續(xù)篩選拮抗多肽的模板，進行實驗。將此段序列作為MD2與LPS結(jié)合的模擬小肽。由生物技術(shù)公司合成，純度>95%，質(zhì)量20mg，成品經(jīng)過HPLC純化，并經(jīng)MS檢測其序列正確。實驗二.利用噬菌體肽庫篩選具有抗炎效應(yīng)MD2候選拮抗多肽實驗?zāi)康睦脤嶒炓凰@取的模板，利用隨機肽庫篩選技術(shù)，篩選出可與該模板發(fā)生特異性，高親和力結(jié)合的拮抗性多肽。實驗方法將噬菌體展示肽庫與包被有靶分子的平板(或磁珠)共溫育，先洗去未結(jié)合噬菌體，然后洗脫特異性結(jié)合的噬菌體。被洗脫的噬菌體進行擴增，然后再進行下一輪的結(jié)合/擴增循環(huán)，以富集那些可結(jié)合序列。經(jīng)3-4輪淘選后，通過DNA測序?qū)γ總€可結(jié)合克隆進行定性。第一天根據(jù)同時要進行文庫淘選的靶分子數(shù)量和種類的不同，淘選試驗可以在單個滅菌聚苯乙烯培養(yǎng)皿、12-、24_孔板或96孔微量板中進行。每種靶分子至少包被一個板(或一個孔)。下述方法中給出的量是60X15mm培養(yǎng)皿的用量，微孔板的用量在括號中注明，其他中等大小尺寸的孔可相應(yīng)調(diào)整用量。但無論用哪種板，加入的噬菌體數(shù)量都應(yīng)是相同的，即2X1011個病毒子。1.準備100μg/ml的靶分子(MD2)溶液(溶于0.IMpH8.6的NaHC03)。2.每板(孔)加入1.5ml(微孔板每孔150μ1)上述溶液，反復(fù)旋轉(zhuǎn)直到表面完全濕潤。3.在增濕容器中4°C輕微震蕩，孵育過夜。平板可在此容器中4°C貯存?zhèn)溆?。第二?.挑ER2738單克隆(噬菌體滴度測定時鋪的板)于IOmlLB液體培養(yǎng)基中。如果同一天擴增洗脫的噬菌體，也可將ER2738接種于20mlLB液體培養(yǎng)基，250ml三角瓶，37°C劇烈震蕩培養(yǎng)。5.棄掉每板中的包被液后，將平板倒置于干凈的紙巾上用力拍甩以去除殘余溶液。在每板或每孔中加滿封阻液，4°C作用至少1小時。6.按5中所述方法除去封阻液。再用TBST(TBS+0.1%[v/v]Tween-20)緩沖液快速洗板6次。每次均旋轉(zhuǎn)以使板或孔的底部及邊緣都被洗到，傾去緩沖液，倒置在干凈紙巾上拍甩以除去殘余溶液(或使用自動洗板機)。此操作要快以避免板干燥。7.用Iml(微孔板則用100μ1)的TBST緩沖液稀釋2XIO11的噬菌體(即10μ1的原始文庫)，然后加到已包被好的板上，室溫溫和搖動10-60分鐘。8.棄掉未結(jié)合噬菌體，將平板倒置于干凈的紙巾上用力拍甩以去除殘余溶液。9.按6中所述方法用TBST緩沖液洗板10次，每次換一干凈紙巾以避免交叉污染。10.根據(jù)所研究的分子間相互作用，用Iml(微孔板則用100μ1)適當?shù)南疵摼彌_液洗脫已結(jié)合的噬菌體。室溫溫和搖動10-60分鐘，然后將洗脫液吸入另一干凈微量離心管中。通常是用競爭法將與靶分子結(jié)合的噬菌體置換出來，競爭物可以是靶分子的已知配體溶液(0.I-ImM溶于TBS溶液)，也可以是游離靶分子溶液(約100μg/ml溶于TBS中)。如果相互作用是依賴于環(huán)化了的多肽，那么，已結(jié)合的多肽也可用溶于TBS的ImMDTT洗脫。IOa另外，也可用非特異性緩沖液如0.2MGlycine-HCl(pH2.2)，lmg/mlBSA來分離已結(jié)合的分子。溫和搖動>10分鐘，洗脫液吸入另一干凈微量離心管中。然后再用150μ1(微量孔則用15μ1)IMHCl(pH9.1)中和上述洗脫液。11.按下述“測定噬菌體滴度”中的程序測定少量(約1μ1)洗脫物的滴度。如需要，可對第一或第二輪洗脫物滴度測定所得的噬菌斑進行測序，方法見下述。必要時可將剩余洗脫物4°C貯存過夜，以便第二天擴增。這時，可將ER2738在LB-Tet培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，第二天將培養(yǎng)物1100稀釋于20mlLB中(用250ml三角瓶盛裝)，然后加入未擴增的洗脫物。37°C劇烈搖動培養(yǎng)4.5小時，繼續(xù)第13步驟。12.剩余洗脫物應(yīng)當被擴增將洗脫物加入到20mlER2738培養(yǎng)物中(菌體應(yīng)當處于對數(shù)前期)，37°C劇烈搖動培養(yǎng)4.5小時13.將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入一離心管中，然后，4°C10，OOOrpm離心lOmin。上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中，再離心。14.將80%的上清液上部轉(zhuǎn)入一新鮮管中，加入1/6體積的PEG/NaCl。讓噬菌體4°C沉淀至少60分鐘，最好過夜。測定噬菌體滴度1.接種ER2738單菌落于5_10mlLB培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)至對數(shù)中期(0D600值約0.5)。2.細胞生長時，微波爐融化上層瓊脂，分成3ml等份于滅菌試管中，每個噬菌體稀釋度一管。保存于45°C備用。3.37°C預(yù)溫LB/IPTG/Xgal平板，每個噬菌體稀釋度取一個平板備用。4.在LB中準備10倍系列稀釋的噬菌體。5.建議稀釋范圍擴增的噬菌體培養(yǎng)物上清=IO8-IO11；未擴增的淘選洗脫物IO1-IO40每個稀釋度換一新鮮吸頭，建議用帶濾芯吸頭以避免交叉污染。6.當菌體培養(yǎng)物達對數(shù)中期，分成200μ1等份于微量離心管中，每個噬菌體稀釋度一管。7.每管加入10μ1不同稀釋度的噬菌體，快速震蕩混勻，室溫溫育1-5分鐘。8.將感染細胞加入45°C預(yù)溫的上層瓊脂培養(yǎng)管中，每次一管，快速混勻，立即傾注于37°C預(yù)溫的LB/IPTG/Xgal平板上。適當傾斜平板將上層瓊脂均勻鋪開。9.待平板冷卻5分鐘后，倒置于37°C培養(yǎng)過夜。10.檢查平板，計數(shù)有約IO2個噬菌斑的平板上的斑數(shù)。然后用此數(shù)目乘以稀釋因子即得到每10μ1噬菌體的空斑形成單位(Pfu)滴度。第三天15.40C10，OOOrpm離心PEG沉淀15分鐘。倒掉上清液，再短暫離心，吸去殘留上清液。16.沉淀物重懸于ImlTBS中，懸液轉(zhuǎn)入微量離心管中，4°C離心5min使殘余細胞沉淀。17.上清轉(zhuǎn)入另一新鮮微量離心管，用1/6體積的PEG/NaCl再沉淀。冰上孵育15-60min。4°C離心10分鐘，棄上清，再短暫離心，用微量移液器吸去殘余上清。18.沉淀物重懸于200μ1TBS,0.02%NaN3中。離心1分鐘，沉淀任何殘余的不溶物。上清轉(zhuǎn)入新鮮管中。此即為擴增后的洗脫物。19.根據(jù)上述“測定噬菌體滴度方法”用LB/IPTG/Xga1平板滴定擴增后的洗脫物。4°C貯存。20.再包被一個板或孔準備第二輪淘選時用，見步驟1-3。第四和第五天21.計數(shù)板上藍斑數(shù)確定滴度。用這個值來計算相應(yīng)于ZxiO11Pfu的加入量。如果滴度太低，接下來的幾輪淘選可用低至IO9Pfu的噬菌體加入量進行試驗。22.進行第二輪淘選用第一輪淘選擴增的洗脫物中2XIO11pfu的噬菌體量重復(fù)步驟4-18，在清洗步驟中將Tween的濃度增至0.5%(ν/ν)。23.在LB/IPTG/Xga1平板上測定第二輪淘選所得洗脫物擴增后的滴度。24.一個板或孔準備第三輪淘選時用，見步驟1-3。第六天25.進行第三輪淘選用第二輪淘選擴增的洗脫物中ZXlO11Pfu的噬菌體量重復(fù)步驟4-11，清洗步驟中同樣用0.5%(ν/ν)的Tween。26.在LB/IPTG/Xga1平板上測定第三輪淘選所得洗脫物未擴增時的滴度。第三輪洗脫物不必再擴增，滴度測定時得到的噬菌斑可做測序用只要注意平板培養(yǎng)時間不要超過18小時，培養(yǎng)時間過長容易出現(xiàn)缺失。其余洗脫物4°C貯存。27.挑一ER2738單克隆于LB-Tet培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜(不要接種稀釋后的鋪板培養(yǎng)物)。對照淘選試驗按照上述程序，以鏈霉親和素作為靶分子，在封阻液中加入0.1μg/ml的鏈霉親和素以結(jié)合BSA中混有的少量生物素。用0.ImM的生物素(溶于TBS中)洗脫結(jié)合噬菌體，至少作用30分鐘。經(jīng)三輪富集/擴增后，得到鏈霉親和素結(jié)合肽的共有序列如下CGXF/Y/ffS/NHPQC，其中HPQ基序最為保守結(jié)合克隆的特征鑒定噬菌斑的擴增1.將ER2738過夜培養(yǎng)物按1100稀釋接種于LB培養(yǎng)基，分Iml到培養(yǎng)管中。每個要鑒定的克隆一管。一般情況下，由第三輪淘選物中取10個克隆便足以檢測結(jié)合肽中的共有序列。2.用滅菌牙簽或吸頭，挑一藍色噬菌斑到上述Iml培養(yǎng)管中。注意要從總量不到100個噬菌斑的平板上挑選，以便保證每個被挑的噬菌斑僅含一個DNA序列。3.37°C搖床培養(yǎng)4.5-5小時。4.備選步驟。除測序單個克隆外，也可以對整個被選噬菌體集合進行測序。這樣只通過一個步驟就可以得到共有結(jié)合序列，但這種情況只是當共有序列重復(fù)出現(xiàn)在每個克隆的7肽“框架”內(nèi)相同位置的時候。加10μ1未擴增的洗脫物到Iml稀釋的過夜培養(yǎng)物中，37°C搖床培養(yǎng)4.5-5小時。5.培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入微量離心管中，離心30sec。上清轉(zhuǎn)入以新鮮管中，再離心。用移液器將80%的上清轉(zhuǎn)入新鮮離心管，此即為擴增噬菌體貯液，可以4°C貯存幾個星期而對滴度影響不大。長期貯存應(yīng)用滅菌甘油11稀釋后，_20°C貯存。測序模板的快速純化(22)1.按上述方法進行噬菌斑擴增，在第一步離心后，將500μ1含噬菌體上清轉(zhuǎn)入一新鮮離心管。2.加200μ1PEG/NaCl，顛倒混勻，室溫放置10分鐘。3.離心10分鐘，棄上清液。4.短暫離心，小心吸去殘余上清。5.沉淀物徹底重懸于100μ1碘化物緩沖液中，加入250μ1乙醇。室溫溫育10分鐘。短時間的室溫溫育使單鏈噬菌體DNA沉淀而大多數(shù)噬菌體蛋白保持在溶液中。6.離心10分鐘，棄上清。用70%的乙醇洗沉淀，短暫真空干燥。7.沉淀重懸于30μ1TE[10mMTris-HCl(ρΗ8.0),ImMEDTA]中。8.5μ1的上述模板溶液足夠進行35S或33Ρ標記的手工雙脫氧測序，或染料標記的自動循環(huán)雙脫氧測序。根據(jù)測序方法的不同，適當增減模板用量。實驗結(jié)果1.肽庫篩選進行3輪篩選，每一輪結(jié)束后均記錄噬菌體投入量及回收量，并計算回收率。結(jié)果見表5。表5用MD2模擬小肽進行3輪親和篩選中噬菌體回收率的改變<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>TUtransducedunit2.測序結(jié)果對照組鏈霉親和素拮抗多肽的測序結(jié)果為ClCTGCGGATGACTCCACGAACCC4CTAAGGATGCCAAAAAGACCCC5CTAAGGATGCCAAAAAGACCC那么，鏈霉親和素拮抗多肽的氨基酸序列為上述從右至左的反義鏈，即ClGGTTCGTGGAGTCATCCGCAGGSffSHPQC4GGGTCTTTTTGGCATCCTTAGGSFffHPQC5GGGTCTTTTTGGCATCCTTAGGSFffHPQ因此，HPQ為強烈保守。實驗結(jié)論通過上述淘選過程，我們獲得了15條候選多肽，但這15條多肽是否具有抗炎抗菌生物學作用，須通過下一步實驗驗證。實驗三利用細胞因子生成抑制實驗篩選具有抗炎效應(yīng)的MD2拮抗多肽實驗?zāi)康膶嶒灦形覀兂醪将@取了15條候選的可能具有抗炎作用的拮抗多肽，在本部分實驗中，我們進一步利用炎癥細胞因子生成抑制實驗，力圖篩選出幾條作用明顯的拮抗性多體。實驗方法1.細胞培養(yǎng)將U937細胞株復(fù)蘇后培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)在25cm2的培養(yǎng)瓶內(nèi)，置37°C，含5%C02的培養(yǎng)箱內(nèi)。經(jīng)過2-3次細胞傳代以后，調(diào)整細胞計數(shù)為0.9X106。U937需經(jīng)佛波醇乙酯(Phorbolmyristateacetate,PMA)刺激后才能分化為單核巨噬樣細胞，加入20ng/mlPMA于U937細胞培養(yǎng)液中，37°C，5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24h。2.大量擴增噬菌體將ER2738過夜培養(yǎng)物按1100稀釋接種于LB培養(yǎng)基，分10ml到培養(yǎng)管中。給每個要護增的克隆準備一管，并編號。取要擴增的噬菌體存儲液200ul(實驗組和對照組共16份樣本，前一實驗準備。)接種于上述10ml的稀釋菌液中(150)。于37°C振蕩培養(yǎng)4.5_5h，時間不能過長。將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)到10ml離心管，10000rpm，4°C離心30S，移上清，再離心30S。將所得上清的80%轉(zhuǎn)移分裝其中7ml轉(zhuǎn)入離心管，4°C保存，以備后面的細胞因子生成抑制實驗用；另外700ul裝入EP管，并加入700ul甘油，備作噬菌體存儲液，-20°C保存。3.細胞因子生成抑制實驗1)將經(jīng)PMA刺激后的U937以Hanks液洗滌3遍后，用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為lX105/ml。2)將U937接種至96孔培養(yǎng)板上，每孔lOOul。3)將擴增的噬菌體離心10000rpm，30S，轉(zhuǎn)移5ml包涵噬菌體的上清至新的離心管。4)加入2mlPEG/NaCl，倒轉(zhuǎn)混勻，室溫放置30_60min。5)離心lOOOOrpm，lOmin，棄上清，再次離心30S，洗盡殘余上清。6)用1.5ml0.9%生理鹽水或者1640培養(yǎng)液懸浮沉淀。7)將上述噬菌體100ul加入96孔細胞培養(yǎng)板上(內(nèi)含U937)，并孵育lh。8)lh后加入100ulLPS(終濃度為100ng/ml)9)將上述細胞培養(yǎng)板放入37°C，5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)。10)2h后收集細胞培養(yǎng)液上清，-20°C保存，待測細胞因子TNF-a；6h后收集細胞培養(yǎng)液上清，-20°C保存，待測細胞因子IL-6。實驗中設(shè)3個對照組1組(U937)、II組(U937+LPS)、III組(U937+LPS+對照組噬菌體)，實驗組為U937+LPS+噬菌體克隆下又分為11個克隆組。各組LPS的終濃度均為100ng/mlo4.按ELISA試劑盒說明書分別測定TNF-a和IL-6的濃度。1)從已平衡至室溫的密封袋中取出所需板條，其它板條請密封放回4°C。2)除空白孔外，分別將標本或不同濃度標準品(lOOul/孔)加入相應(yīng)孔中；用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37°C孵箱孵育90分鐘。3)洗板5次。4)除空白孔外，加生物素化抗體工作液lOOul/孔，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37°C，孵箱孵育60分鐘。5)洗板5次.。I2.,56土0.18II6.98土0.32III7.74±0.18T16.50±0.83T26.32±0.62T35.82±0.30T45.48±0.42T54.38±0.56#*T63.40士0.36#*T75.64±0.44T83.44土0.32#*T96.58士0.86T103.86±0.4M*Til3.96土0.36#*T125.98±0.50T134.58±0.38T146.06土0.56T155.82±0.52#:P<0.01，vsgroupII；氺P<0.01，vsgroupIII6)除空白孔外，加酶結(jié)合物工作液lOOul/孔，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37°C，孵箱孵育30分鐘。7)洗板5次.。8)加入顯色劑lOOul/孔，37°C，避光，孵箱孵育20-25分鐘。(視顯色深淺靈活掌握)9)加入終止液100ul/孔，混勻后即刻測量0D450值(5分鐘內(nèi))。*空白孔僅加入底物和終止液，單波長檢測時用以校準酶標儀的基準點。使用雙波長檢測可以不設(shè)。5.具有抗炎效應(yīng)的MD2拮抗多肽和無關(guān)多肽的合成將具有抗炎效應(yīng)的MD2拮抗多肽以及無關(guān)多肽(將MD2拮抗多肽中無抗炎效應(yīng)的一條作為無關(guān)多肽)委托生物技術(shù)公司進行合成，其純度要求達95%以上，15mg，成品經(jīng)過HPLC純化，并經(jīng)MS檢測。實驗結(jié)果陽性克隆篩選將實驗二中，用于測序的噬菌體儲存液共16個克隆，利用細胞因子生成抑制實驗進行篩選，結(jié)果顯示II組TNFa、IL-6含量顯著高于I組(P<0.01),III組TNFa、IL-6含量與II組無顯著差異(P>0.01)。噬菌體克隆T4、T5、T6、T8、T10和T11組的TNFa、IL-6含量與III組有顯著差別(P<0.01)，見表6。表6噬菌體展示肽對LPS誘導U937分泌TNFa，IL-6的抑制活性(n=6，x士s)~GroupTNFa(pg/ml)GroupIL-6(pg/ml)13.3±0.637.8±1^—_土931土9329.8±2##5229.8±211土7i211土62**##525113.5±328.5±119.3±128.5±33土1.3#*15.2+0.6#*38o33士9od230.2±230.3士32土52_—-IUU123456789111111IlnTTTTTTTTTTTTTTT130189]表中T1-T15分別為實驗二中初步獲取的15條候選多肽0190]2.陽性噬菌體克隆DNA序列確定0191]選取上述細胞因子生成抑制實驗最好并具有統(tǒng)計學意義的3個噬菌體克隆(T6，T8，T11)，查出其DNA序列為0192]T6ATGATTATCCGGCACCGTCTT0193]T8ATTCCTAGTCAACGGAGAATC0194]TilCCTATACAGAAACTTCCCAAT0195]那么，要合成的序列為0199]3.具有抗炎效應(yīng)的MD2拮抗多肽的人工合成0200]由生物技術(shù)公司人工合成上述3條7肽，作為MD2的拮抗多肽；將MD2拮抗多肽中無抗炎效應(yīng)的一條作為無關(guān)多肽(序列為GGTTCGTGGAGTCATCCGCAG)并人工合成。3條多肽各15mg，純度96%以上，成品經(jīng)過HPLC純化，并經(jīng)MS檢測確證。0201]實驗四.具有抗炎效應(yīng)的MD2拮抗多肽與MD2的親和力鑒定0202]實驗?zāi)康耐ㄟ^體外實驗驗證上述3條篩選出的拮抗多肽是否與MD2發(fā)生直接的相互結(jié)合作用，這是拮抗肽發(fā)揮生物活性作用的基礎(chǔ)。0196]T6AAGACGGTGCCGGATAATCATLysThrValProAspAsnHis0197]T8GATTCTCCGTTGACTAGGAATAspSerProLeuThrArgAsn0198]TilATTGGGAAGTTTCTGTATAGGlieGlyLysPheLeuTyrArg020302040205020602070208020902100211021202130214021502160217021802190220022102220223實驗方法利用生物素標記轉(zhuǎn)移驗證兩種蛋白的結(jié)合主要試劑的配制10%SDS(100ml,PH7.2)SDS10g溫熱去離子定容至100ml加熱至68°C助溶，用稀HC1調(diào)PH至7.2。1.5mol/LTris緩沖液PH8.8100mlTris18.165g三蒸水80mlHC1調(diào)pH值為8.8，三蒸水定容至100ml；lmol/LTris緩沖液:PH6.8100mlTris12.114g去離子80mlHC1調(diào)PH值為6.8，三蒸水定容至100ml電轉(zhuǎn)移緩沖液1000ml甘氨酸39mmol/L-----2.9Tris堿48mmol/L-----5.8SDS(電泳級)0.037%-----0.37甲醇20%-----200ml三蒸水定容至1L5XTris甘氨酸電泳緩沖液儲存液1000mlTriS堿15．1g甘氨酸(電泳級，PH8．3)94g溶于900ml去離子水，然后加入SDS(10％，電泳級)50ml儲存液，定容至1000ml。10×TBS緩沖液TriS堿24．2gNaCl80g以HCl調(diào)pH至7．6l×TBST洗脫液三蒸水900ml10×TBS100mlTween一200．5ml30％丙烯酰胺溶液(100m1)丙烯酰胺(29％)29gN，N一一亞甲雙丙烯酰胺(1％)lg溫熱去離子水定容至100ml，0．4Sum濾膜過濾除菌，查證該溶液的PH值應(yīng)不大于7．0，棕色瓶分裝，室溫保存。10％過硫酸胺(APS)過硫酸胺0．1g去離子水定容至lml米現(xiàn)用現(xiàn)配PBS(磷酸鹽緩沖液)1000mlNaCl8gKCl0．2gNa，HPO。1．44gKH，P。。0．24g三蒸水800mlHcl調(diào)節(jié)PH值至7．4，加水定容至lL，151bfTin’(1．034×10‘Pa)高壓蒸汽滅菌20分鐘，室溫保存。5×SDS凝膠加樣緩沖液5mlTriS(PH6．8)0．25molTLlmolTLTriS緩沖液(PH6．8)1．25mlSDS(電泳級)lo％0．5g溴酚藍0．5％0．025g甘油50％2．5ml滅菌水1．25ml混勻后，分裝于1．5ml離心管中，4~C保存。15％SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠10ml水2．3ml30％丙烯酰胺混合液5．Oml1．5m01TLTriS(PH8．8)2．5m110%SDS10%過硫酸胺TEMED聚丙烯酰胺凝膠電泳5%積層膠8ml水30%丙烯酰胺混合液1.Omol/LTris(PH6.8)10%SDS10%過硫酸胺TEMED實驗操作流程用Sulfo-SBED標記誘導蛋白(MD2)a)配制PBS500ml，以超純水稀釋，過濾消毒，4°C貯存。b)以PBS溶解或稀釋MD2蛋白，濃度為500ug/ml，反應(yīng)容積范圍在80ul。將MD2溶液轉(zhuǎn)移到一個琥珀色或鋁箔覆蓋的聚丙烯微量離心管內(nèi)。c)計算Sulfo-SBED的用量，比MD2超出l_5mol數(shù)。d)將裝有Sulfo-SBED并覆蓋箔紙的微量管刺孔，加入lOOulDMF，用移液管尖輕柔混合直到Sulfo-SBED溶解為止。此時Sulfo-SBED的濃度為10ug/ul。e)如果我們需要10ugSulfo-SBED,則加入上述已配好的Sulfo-SBED溶液lul至MD2溶液中，輕柔混合并用鋁箔遮蓋反應(yīng)管或置暗室室溫孵育30min，或者4°C2h。f)準備IX標記轉(zhuǎn)移液將15ml20X標記轉(zhuǎn)移液用285ml超純水稀釋。g)仔細將標記反應(yīng)液80ul移至一個MINIDialysis管(試劑盒提供)內(nèi)并蓋上蓋子。如果反應(yīng)液多于100ul，則移至多個MINIDialysis管。將包含有MD2蛋白的MINIDialysis管插入提供的浮體中，并將浮體放入裝有500mlIX標記轉(zhuǎn)移液的燒杯中。h)用鋁箔遮蓋燒杯并透析5h，以完全去除沒有反應(yīng)的連接物。i)透析完成后，Sulfo-SBED標記的MD2將準備與捕獲蛋白(多肽)通過標記轉(zhuǎn)移液發(fā)生反應(yīng)。按一次量分裝Sulfo-SBED標記的MD2溶液，并避光貯存于-80°C，避免反復(fù)凍融。B.蛋白的相互作用及交聯(lián)1.將標記SBED的MD2蛋白分別加入兩條MD2拮抗多肽中。將標記的MD2(500ug/ml)10ul分別加入兩條多肽中(多肽濃度為250ug/ml，體積為20ul)。將SBED標記的MD2蛋白與多肽室溫下孵育30min。注意避光，直到完成交聯(lián)作用。2.用UV光源(300-370nm)照射激活SBED交聯(lián)復(fù)合物的過程雖然可在室溫下完成，但用高瓦特燈源照射時可使樣品產(chǎn)熱，因此最好將樣品置于冰上。照射時間應(yīng)隨燈源強度的變化而不同，按如下標準180瓦燈照射5min距離樣品10cmC.Westernblot分析1.刺破箔紙覆蓋的二硫蘇糖醇(DTT)微量管，加入50ul超純水達到1MDTT。0.lml0.lml0.004ml5.5ml1.3ml1.0ml0.08ml0.08ml0.008ml2.加入50ulIMDTT至50ul非還原樣品buffer(5XSDS凝膠加樣緩沖液)。3.將15ul樣品分別加入兩個新的微量管中，其中一個加入1/5體積的還原樣品buffer(步驟2準備)，DTT的終濃度必須是IOOmM,以還原二硫鍵。另一個微量管加入1/5體積的非還原樣品buffer(5XSDS凝膠加樣緩沖液)?；煨齼蓚€微量管。4.加熱樣品700C，5min。5.將樣品高速離心10000bpm，30Sec，然后進行上樣。6.將樣品做聚丙烯酰胺凝膠電泳。采用5%積層膠和15%分離膠，先用80V恒壓電泳Ih后，再以150V恒壓電泳約2h，待溴酚藍指示劑進入分離膠的2/3處時(以防小分子的多肽電泳至分離膠外)，停止電泳。7.轉(zhuǎn)移蛋白到PVDF膜上。取與凝膠大小一致的PVDF膜，在甲醇中浸泡15Sec至半透明，用清水沖洗干凈，放入轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡15min；將Whatman濾紙和海綿同樣用轉(zhuǎn)移液浸泡后，按海綿_濾紙_凝膠-PVDF膜-濾紙-海綿依次組合，并排盡各層間的空氣，放入轉(zhuǎn)移槽中，方向為膠面向陰極，膜面向陽極。50V恒壓電轉(zhuǎn)移約12h，4°C。8.取下電轉(zhuǎn)移的PVDF膜，以PBS洗膜5minX3。9.用5%BSA封閉膜，室溫，30min。10.以PBS洗膜5minX3。11.加入鏈親酶素偶聯(lián)的辣根過氧化物酶(4-20ng/ml)作用30min-60min，水浴37°C。用IOOul超純水配制鏈親酶素偶聯(lián)的辣根過氧化物酶的儲存液(lmg/ml)，4°C可保存1月以上，或按1次用量分裝，貯存于-20°C。12.以PBS洗膜IOminX5。13.將PVDF膜放入化學發(fā)光試劑中反應(yīng)l-2min，并用保鮮膜包好，暗室中使用X片暴光，常規(guī)方法顯影、定影。實驗結(jié)果參見附圖2。實驗結(jié)論通過生物素標記轉(zhuǎn)移，結(jié)合WesternBlot實驗證實，只有其中2條拮抗多肽可與MD2發(fā)生直接結(jié)合，分別為T6，Tll0實驗五.MD2拮抗多肽的生物學活性驗證實驗?zāi)康膶嶒炈闹泻Y選出的2條拮抗多肽(T6，T11)，利用3種炎癥細胞模型，分別采用不同的作用濃度，觀察這2條拮抗多肽的抗炎抗菌生物活性實驗方法1.U937和THP-I的細胞培養(yǎng)將U937和THP-I細胞株復(fù)蘇后分別培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)在25cm2的培養(yǎng)瓶內(nèi)，置37°C，含5%CO2的培養(yǎng)箱。經(jīng)過2_3次細胞傳代以后，調(diào)整細胞計數(shù)為0.50.9X106。U937和THP-1均需經(jīng)佛波醇乙酯(Phorbolmyristateacetate,PMA)刺激后才能分化為單核巨噬樣細胞，加入20ng/mlPMA于U937細胞培養(yǎng)液中，37°C，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24h；加入100ng/mlPMA于THP-1細胞培養(yǎng)液中，37°C，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24h。2.分離人外周血單核細胞(PBMC)(密度梯度離心法)1)從血液中心獲取健康成人抗凝全血100ml，與Hank’s液11混合進行稀釋。2)吸取20ml人單核細胞分離液置于50ml離心管中，然后將離心管傾斜45度角，將20ml稀釋后的血液加在單核細胞分離液界面，注意距分離液界面約Icm處沿管壁緩緩加入。3)將離心管置水平式離心機內(nèi)，室溫條件下1500rpm離心20min。4)離心后，管內(nèi)分為三層，上層為血漿和Hank's液，下層主要為紅細胞和粒細胞。中層為單核細胞分離液，在上、中層界面處有一層以單個核細胞為主的白色云霧樣狹窄帶，以無菌吸管輕輕插入此層內(nèi)，吸出該層物。5)將所得懸液盛入含Hank’s液4_5ml的無菌離心管中，充分混勻后，以2000rpm離心lOmin，吸去上清液，沉淀經(jīng)Hank’s液反復(fù)洗2次。6)以IOmlRPMI1640重懸之。7)細胞計數(shù)并檢測細胞活力。8)以1.5XlO6Ail的密度(用含30%人AB血清的1640稀釋)接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，37°C，5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)6-8h。9)將非貼壁細胞組分(淋巴細胞)用不含血清的1640洗滌除去。10)收集貼壁細胞，即得所需的外周血單核細胞(peripheralbloodhistomonocyte)。11)細胞計數(shù)。12)以IX105/ml的密度(用含10%人AB血清的1640稀釋)接種于96孔細胞培養(yǎng)板上。13)37°C,5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)30min。3.分組將上述準備好的3種細胞分別設(shè)3個對照組1組(巨噬細胞)，II組(巨噬細胞+LPS),III組(巨噬細胞+LPS+無關(guān)多肽)；實驗組為(巨噬細胞+LPS+拮抗多肽)，其中拮抗多肽2條，分別采用兩種濃度(T6，Tll:200ug/ml；T6，，Til’100ug/ml)，與巨噬細胞和LPS—起孵育6h，LPS的終濃度為lOOng/ml。培養(yǎng)6h后回收細胞上清液，-20°C冰箱保存待測TNFa和IL-6。4.測定巨噬細胞經(jīng)LPS刺激后的TNFα含量按晶美試劑盒說明書操作，過程如下1)算好需要檢測的樣品個數(shù)及標準品和空白對照的孔數(shù)。2)從已平衡至室溫的密封袋中取出所需板條，其它板條請密封放回4°C。3)除空白孔外，分別將標本或不同濃度標準品(IOOul/孔)加入相應(yīng)孔中；用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37°C孵箱孵育90分鐘。4)洗板4次。5)除空白孔外，加生物素化抗體工作液IOOul/孔，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37°C，孵箱孵育60分鐘。6)洗板5次.。7)除空白孔外，加酶結(jié)合物工作液IOOul/孔，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37°C，孵箱孵育30分鐘。8)洗板5次.。9)加入顯色劑IOOul/孔，37°C，避光，孵箱孵育20-25分鐘。(視顯色深淺靈活掌握)10)加入終止液IOOul/孔，混勻后即刻測量OD45tl值(5分鐘內(nèi))。*空白孔僅加入底物和終止液，單波長檢測時用以校準酶標儀的基準點。使用雙波長檢測可以不設(shè)。注意手工洗板的方法甩盡孔內(nèi)液體，每孔加洗滌液350μ1，靜止30秒后甩盡液體，在厚迭吸水紙上拍干，洗5次。5.測定巨噬細胞經(jīng)LPS刺激后的IL-6含量按晶美試劑盒說明書操作，過程同TNFa。實驗結(jié)果1.外周血單核細胞的分離純化1)抗凝全血經(jīng)單核細胞分離液密度梯度離心后，PBMC的分離效果，如下圖，管內(nèi)可分為四層，上層為血漿、Hank’s液和大部分血小板；下層主要為紅細胞和粒細胞；中層為單核細胞分離液；在單核細胞分離液與血漿交界部位有一層白色云霧樣狹窄帶即為單個核細胞層2)PBMC細胞計數(shù)IOOml抗凝全血分離得到的PBMC細胞總數(shù)為1XIO7,接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔的細胞數(shù)為1X105，以供實驗用。3)細胞活力檢測2%臺酚藍染色結(jié)果示PBMC細胞活力大于95%。2.U937經(jīng)LPS刺激后MD2拮抗多肽的抑炎效應(yīng)兩種濃度的2條MD2拮抗多肽與經(jīng)PMA分化后的U937和LPS培養(yǎng)6h后，測定細胞因子TNFα，IL-6含量，結(jié)果顯示II組TNFα、IL-6含量顯著高于I組(P<0.01)，III組TNFα、IL-6含量與II組無顯著差異(P>0.05)。兩種濃度的3條多肽與II組、III組有非常顯著差別(P<0.01)，并且有劑量依賴關(guān)系，見表7。表72條拮抗多肽對經(jīng)LPS誘導U937分泌TNFa，IL_6的抑制活性(η=6，χ士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>I組(巨噬細胞)，II組(巨噬細胞+LPS)，III組(巨噬細胞+LPS+無關(guān)多肽)；T6拮抗多肽1，200μg;T11拮抗多肽2，200μg；T6，拮抗多肽LlOOyg；Τ1Γ拮抗多肽2，100μg；#P<0.01，vsgroupII；氺P<0.01，vsgroupIII3.THP-I細胞株經(jīng)LPS刺激后MD2拮抗多肽的抑炎效應(yīng)兩種濃度的2條拮抗多肽與經(jīng)PMA分化后的THP-I和LPS培養(yǎng)6h后，測定細胞因子TNFα，IL-6含量，結(jié)果顯示II組TNFα、IL-6含量顯著高于I組(P<0.01)，III組TNFa、IL-6含量與II組無顯著差異(P>0.01)。兩種濃度的3條多肽與II組、III組有顯著差別(P<0.01)，但無劑量依賴關(guān)系，見表8。表82條MD2拮抗多肽對經(jīng)LPS誘導THP-1分泌TNFα，IL-6的抑制活性(η=6，χ士s)_Group_TNFa(pg/ml)_Group_IL-6(pg/ml)_I16.7±0.49和I2.42±0.24#*II39.8±0.82II7.77±0.08III37.1+1.70III7.51+0.39T617.4±0.42#*T64.01±0.25#*Tll18.4±0.54#*Tll3.29土0.S2#*T6'17.3±0.24#*T6'3.43±0.17扣_Tir17.9±1.79和_Τ1Γ3.21土0.27#*_I組(巨噬細胞)，II組(巨噬細胞+LPS)，III組(巨噬細胞+LPS+無關(guān)多肽)；T6拮抗多肽1，200μg；Tll拮抗多肽2，200μg；T6，拮抗多肽LlOOyg；Τ1Γ拮抗多肽2，100μg；#P<0.01，vsgroupII；氺P<0.01，vsgroupIII4.人外周血單核細胞經(jīng)LPS刺激后MD2拮抗多肽的抑炎效應(yīng)兩種濃度的2條拮抗多肽與人外周血單核細胞和LPS培養(yǎng)6h后，測定細胞因子TNFa，IL-6含量，結(jié)果顯示II組TNFa、IL-6含量顯著高于I組(P<0.01)，III組TNFa、IL-6含量與II組無顯著差異(P>0.01)。兩種濃度的2條多肽與II組、III組有顯著差別(P<0.01)，但無劑量依賴關(guān)系，見表9。表92條MD2拮抗多肽對經(jīng)LPS誘導PBMC分泌TNFα，IL-6的抑制作用(η=6，χ士s)GroupTNFa(pg/ml)GroupIL-6(pg/ml)19.1+1.31#*3.16土0.43#*II65.3±2.72II10.8+1.00III65.8±3.23III10.2±0.78T616.4±0.48#*T62.16±0.12#*Tll18.1±1.32#*Tll3.58±0.T6'15.4±1.61#*T6'2.37±0.27#*__Tll'19.1±1.81#*___Tir_3.84土0.48#*_I組(巨噬細胞)，II組(巨噬細胞+LPS)，III組(巨噬細胞+LPS+無關(guān)多肽)；T6拮抗多肽1，200μg；Tll拮抗多肽2，200μg；T6，拮抗多肽LlOOyg；Τ1Γ拮抗多肽2，100μg；#P<0.01,vsgroup11；氺P<0.01,vsgroupIII實驗六MD2拮抗多肽對細菌內(nèi)毒素攻擊小鼠的保護作用實驗?zāi)康倪M一步利用細菌內(nèi)毒素制備感染動物模型，觀察2條拮抗多肽的抗炎抗菌作用材料和方法1.動物來源Balb/c小鼠48只，6_8周齡，雄性，體重20_21g。(來源于重慶醫(yī)科大學實驗動物中心)2.主要試劑小鼠TNF-αELISA試劑盒晶美生物工程小鼠IL-6ELISA試劑盒晶美生物工程LPS(0111:B4)Sigma，美國Triton-XSigma，美國D-PBSSigma，美國蛋白酶抑制劑片Roche，英國戊二醛4%多聚甲醛2條MD2拮抗多肽吉爾生化，上海無關(guān)多肽吉爾生化，上海地塞米松上海3.主要試劑的配制1)PBS(磷酸鹽緩沖液)IOOOmlNaCl8gKCl0.2gNa2HPO41.44gKH2PO40.24g三蒸水800mlHCl調(diào)節(jié)KI值至7.4，加水定容至lL，151bf/in2(1.034X105Pa)高壓蒸汽滅菌20分鐘，室溫保存。2)0.1%Triton-XinD-PBSD-PBS0.96gTriton-X0.Ig溶于IOOml雙蒸水。3)3條多肽的配制200ug/ml，100ug/ml4)陰性對照無關(guān)多肽的配制200ug/ml5)陽性對照地塞米松的配制100ug/ml6)LPS的配制400ug/ml實驗方法1.分組將小鼠分為5組，C組(正常對照組)每只小鼠腹腔注射Iml生理鹽水；I組每只小鼠腹腔注射ImlLPS(400ug/ml)溶液；II組(陰性對照)每只小鼠在用LPS處理前Ih注射Iml無關(guān)多肽溶液；III組(陽性對照)每只小鼠在用LPS處理前Ih注射Iml地塞米松(100ug/ml)；實驗組分為2條多肽，分別采用兩種濃度(T6，Tll:200ug/ml；T6，，Til，:100ug/ml)每只小鼠在用LPS處理前Ih分別注射Iml多肽。2.觀察經(jīng)上述處理后的24h死亡率。3.在LPS注射后6h脫頸處死小鼠。4.摘除小鼠眼球抽取血液，血清貯存于-20°C待測炎癥因子含量。5.切除肺組織、肝組織(冰上操作)，冰凍保存(液氮過一下，再放于-70C)。6.收集組織勻漿液上清1)將勻漿器鉆頭(最小型號)在戊二醛中浸泡30min。2)將Roche公司的蛋白酶抑制劑片放入已配制好的0.l%Triton_XinD-PBS中，每IOml加一片，待其溶解，作為組織勻漿液。3)將一部分肺組織盡量剪碎后，放入IOml離心管，加入上述組織勻漿液，(0.2g組織加Iml勻漿液)，用組織勻漿器研磨。*注意所有操作均在冰上進行；每一標本均勻漿30S左右，保持勻漿時間一定；不同標本，鉆頭均用雙蒸水清洗。4)將肺組織勻漿離心12000g*10min，肺組織勻漿上清回收，貯存于-20°C待測炎癥因子的含量。7.測定小鼠血清和肺組織勻漿的TNFα濃度按晶美試劑盒說明書操作，過程如下1)算好需要檢測的樣品個數(shù)及標準品和空白對照的孔數(shù)。2)從已平衡至室溫的密封袋中取出所需板條，其它板條請密封放回4°C。3)除空白孔外，分別將標本或不同濃度標準品(IOOul/孔)加入相應(yīng)孔中；用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37°C孵箱孵育90分鐘。4)洗板4次。5)除空白孔外，加生物素化抗體工作液IOOul/孔，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37°C，孵箱孵育60分鐘。6)洗板5次·。7)除空白孔外，加酶結(jié)合物工作液IOOul/孔，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37°C，孵箱孵育30分鐘。8)洗板5次·。9)加入顯色劑IOOul/孔，37°C，避光，孵箱孵育20-25分鐘。(視顯色深淺靈活掌握)10)加入終止液IOOul/孔，混勻后即刻測量OD45tl值(5分鐘內(nèi))。8.測定小鼠血清和肺組織勻漿的IL-6濃度按晶美試劑盒說明書操作，過程同TNFα。9.病理形態(tài)學檢查在LPS注射6h后脫頸處死小鼠，立即取肺組織標本，福馬林固定后石蠟包埋、切片行HE染色，然后在光鏡下觀察組織學改變。實驗結(jié)果1.僅注射LPS組，小鼠表現(xiàn)為急性患病的癥狀，出現(xiàn)嗜睡無力，畏寒，皮毛卷曲。但經(jīng)預(yù)先注射MD2拮抗多肽的小鼠明顯癥狀要輕得多。2.肺組織病理學肺大體觀察，正常對照組肺外觀呈粉紅色；內(nèi)毒素血癥組肺體積增大，表面暗紅；MD2拮抗多肽治療組病變較內(nèi)毒素血癥組無明顯區(qū)別。光鏡下，內(nèi)毒素血癥和無關(guān)多肽組肺泡隔增寬，部分肺泡內(nèi)見滲出、水腫、出血，肺間質(zhì)見大量炎癥細胞浸潤；MD2拮抗多肽治療組較內(nèi)毒素血癥肺損傷組明顯減輕。(圖片見部分)3.分別采用不同劑量的拮抗多肽(T6，TlU200yg;T6，，Tll，為100μg)治療后，內(nèi)毒素血癥小鼠血清TNFa，IL-6含量明顯減低。見表10。表102條MD2拮抗多肽對內(nèi)毒素血癥小鼠血清TNFα，IL-6的抑制活性(η=8，χ士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>#:P<0.05，vsgroupII；氺P<0.05，vsgroupIIIC未加入LPS對照組I單純LPS組II無關(guān)多肽+LPS組III地塞米松+LPS組T6結(jié)合肽1(200μg)+LPS組T11結(jié)合肽2(200μg)+LPS組T6，結(jié)合肽1(100μg)+LPS組Til，結(jié)合肽2(100μg)+LPS組4.分別采用不同劑量的拮抗多肽(T6，TlU200yg;T6，，Tll，為100μg)治療后，內(nèi)毒素血癥小鼠肺組織TNFa，IL-6含量明顯減低。見表11表112條MD2拮抗多肽對內(nèi)毒素血癥小鼠肺組織勻漿TNFa，IL_6的抑制活性(η=6,χ士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>C未加入LPS對照組I單純LPS組II無關(guān)多肽+LPS組III地塞米松+LPS組T6結(jié)合肽1(200μg)+LPS組Tll結(jié)合肽2(200μg)+LPS組T6，結(jié)合肽1(100μg)+LPS組Til，結(jié)合肽2(100μg)+LPS組5.內(nèi)毒素血癥小鼠及經(jīng)MD2拮抗多肽干預(yù)后小鼠的死亡率僅注射LPS組，小鼠24h死亡率為100%，而經(jīng)結(jié)合肽1或結(jié)合肽2干預(yù)后，小鼠的死亡率分別下降到55.6%。實驗結(jié)論通過本部分實驗我們可以得出以下結(jié)論1.這2條拮抗肽可顯著降低細菌內(nèi)毒素攻擊小鼠的死亡率，死亡率分別由100%下降至55.6%；2.2條拮抗多肽，可顯著減輕細菌毒素攻擊小鼠肺組織的炎癥性病理反應(yīng)；3.2條拮抗多肽可顯著減低細菌內(nèi)毒素攻擊小鼠肺組織炎癥因子白介素6，腫瘤壞死因子的表達；4.2條拮抗肽可顯著減低細菌內(nèi)毒素攻擊小鼠血液中炎癥因子白介素6，腫瘤壞死因子的產(chǎn)生。因此，上述步驟篩選出的這2條拮抗肽即序列1:LysThrValProAspAsnHis的拮抗多肽和序列2:IleGlyLysPheLeuTyrArg的拮抗多肽具有明顯的抗炎，抗菌活性，并能有效保護細菌毒素對機體的攻擊?？稍谥苽渲委熡筛锾m氏陰性菌所致的感染，過度炎癥性損傷的生物多肽制劑中的應(yīng)用；或在制備治療由Toll樣受體所誘導的炎癥性疾病的生物多肽制劑中的用途。具有非常明顯的臨床應(yīng)用前景。本發(fā)明涉及的多肽序列<110>中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學野戰(zhàn)外科研究所<120>能阻斷LPS與MD2結(jié)合的抗炎抗菌多肽<160>2<170>patentlnVersion2.1<210>1<211>7<212>PRT<213>人(Human.)<220><221>misc_feature<222><223><220><221><222><400>1LysThrValProAspAsnHis15<210>2<211>7<212>PRT<213>A(Human.)<220><221>misc_feature<222><223><220><221><222><400>2lieGlyLysPheLeuTyrArg1權(quán)利要求一種能阻斷LPS與MD2結(jié)合的抗炎抗菌多肽，其特征是在于該多肽的蛋白質(zhì)一級序列為。2.權(quán)利要求1所述的多肽在制備治療革蘭氏陰性菌所致的感染、以及因革蘭氏陰性菌所導致的膿毒癥的生物制劑中的應(yīng)用。3.權(quán)利要求1所述的多肽在制備治療由脂多糖通過TLR4所誘導的炎癥疾病的生物制劑中的用途。全文摘要本發(fā)明提供一種能阻斷LPS與MD2結(jié)合的抗炎抗菌多肽，其氨基酸序列為IleGlyLysPheLeuTyrArg。所述多肽能有效減輕細菌內(nèi)毒素LPS所誘導的膿毒性炎癥損害，顯著提高內(nèi)毒素感染的小鼠的存活率，從而可在特異阻抑LPS對炎癥細胞過度刺激的同時，還能保持機體免疫防御功能。用于制備因革蘭氏陰性菌所導致的感染，以及與TLR4所誘導的炎癥性疾病的治療藥物。文檔編號C07K7/06GK101805392SQ20091022595公開日2010年8月18日申請日期2007年7月10日優(yōu)先權(quán)日2007年7月10日發(fā)明者吳曉華,李磊,胡承香,閆紅,顧長國申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學野戰(zhàn)外科研究所