專利名稱：：從藏藥綿參中提取具有抗氧化活性的化合物及其提取方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種從藏藥綿參中提取新化合物的方法，特別涉及一種從藏藥綿參中提取具有抗氧化活性的化合物及其提取方法。
背景技術：
：藏醫(yī)藥學是我國藏族人民在長期與自然環(huán)境斗爭的過程中形成的獨特的醫(yī)療保健方法，是祖國傳統(tǒng)醫(yī)藥學的瑰寶。西藏是一個高寒、缺氧、輻射強、無污染的高原環(huán)境，因此藏藥具有生長周期長、療效獨特、活性物質累積高等特點。雖然市場上已有藏藥保健品，但品種比較單一，且功效因子及其構效量效關系都不明確，這不利于開發(fā)第三代保健品和走向國際市場，因此，深入研究藏醫(yī)藏藥在保健品方面的應用，確定藏藥保健品的功效因子及其構效量效關系，是開發(fā)第三代藏藥保健品和走向國際市場的一個關鍵。綿參(EriophytonwallichiiBenth.)，藏藥名榜參布茹，是唇形科植物，全草或根入藥，生于海拔4500-5300km的冰澤亂石堆，碎石帶，產于西藏、青海、甘肅南部、四川西部、云南西北部，花盛期采集，去凈泥土，曬干。味苦性涼，調氣和血、提升中氣、滋補、潤肺。治氣虛體弱、氣血虧損、肺膿腫、肺結核、肺熱咳嗽、咳血、胸痛。綿參在藏藥名著《晶珠本草》中早有記載，目前，只有中科院成都生物所曾經從綿參的月旨溶性部位中分到28-印i-cyaste皿e，Eriophytonoide，Cyaste皿e，ajuforrestinsAandB，20—hydroxyecdysone，polypodinB，ajugalactone，8_0_3cetylharp3gid，即igenin，-sitosteroldaucosterol，MidN_[2_hydroxy_(nori3decanoyl-tricosanoyl)]-4-hydroxytr雄-8-sphingenine等化合物，而對其月旨溶性部位禾口水溶性部位的系統(tǒng)研究還沒有報道，同時，對其活性物質基礎的研究國內外也沒有報道。因此，為了深入研究綿參的化學成分及其藥理活性，明確其功效因子及其構效量效關系，為開發(fā)綿參系列保健品提供理論依據(jù)，利用現(xiàn)代分離分析技術和藥理實驗技術對綿參的生物活性成分進行了研究。即提供一種從藏藥綿參中提取具有抗氧化活性的化合物及其提取方法，即成為該領域技術人員急待著手解決的問題之一。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足之處，提供一種從藏藥綿參中提取具有抗氧化活性的化合物及其提取方法。為實現(xiàn)上述目的本發(fā)明所采用的技術方案是一種從藏藥綿參中提取具有抗氧化活性的化合物，其特征在于所獲得的具有抗氧化活性的化合物化學結構式為3該化合物為無色結晶，由ESI-MSm/z:803[M+Na]+，825[M+45]—，可知其分子量為780，結合^-NMROy^N)和13C-NMR(C5D5N)數(shù)據(jù)，確定其分子式為C34H5202。，不飽和度為9;S93.7、S96.1、S97.3是三個縮醛碳信號，HMQC顯示Sc140.6/SH6.38和Sc104.3/SH4.82是雙鍵的碳氫信號，結合HMQC和HMBC譜，苷元的NMR信號顯示存在兩個環(huán)戊烷型環(huán)烯醚萜骨架，一個骨架與ajugoside相同，另一個則與ajugoside骨架相似，SH5.85/Sc97.3、SH2.02/SC31、SHl.52/Sc31顯示C3'-C4'上的雙鍵變成單鍵，HMBC譜顯示相關信號SH6.42/Sc99.8、SH5.37/Sc93.7和SH6.38/Sc99.8、SH5.51/Sc96.1，表明兩個環(huán)烯醚萜骨架C-l羥基各連了一個葡萄糖基，而相關信號SH5.85/Se69.7、SH4.98/Sc97.3、SH4.44/Sc97.3和SH5.37/Sc93.7顯示兩個環(huán)烯醚萜骨架并沒有直接相連，而是通過一個(1—6)葡萄糖基相連，該化合物是一個新的環(huán)烯醚萜苷，命名為wallchiisideE?！N從藏藥綿參中提取具有抗氧化活性的化合物的提取方法，其特征在于實施步驟如下首先，將10Kg干燥的綿參全草，粉碎，以50-95%乙醇室溫浸泡提取3次，每次7-10天，將提取液合并減壓濃縮，得流浸膏970g密度1.15g/ml，用水混懸分散后得3L;依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚部位200g、乙酸乙酯部位33g、正丁醇部位255g;然后，將正丁醇部位255g經D-1400型大孔吸附樹脂柱，徑高比l:5，以水-乙醇系統(tǒng)洗脫分為4個部分10%，30%，60%，90%;30X洗脫部分，74g，經MCI-GELCHP20P大孔樹脂柱層析，徑高比1:8，以10-60%甲醇_水洗脫，按10%遞增分為Al-A6共6個部分；A4再經反相ODS-A柱層析，徑高比1:8，按10%遞增以10-60X甲醇-水洗脫，各洗脫5個柱體積，分為Bl-B6共6個部分，B2再反復S印hadexLH-20凝膠柱層析，徑高比1:30，以50%甲醇洗脫得wallchiisideE25mg。本發(fā)明的有益效果是從藏藥綿參中提取分離到一個新的環(huán)烯醚萜類化合物，提取分離過程簡便，經過試驗證明該化合物具有清除自由基的能力，為開發(fā)具有抗氧化作用的藥物提供了先導化合物。圖1是本發(fā)明wallchiisideE提取分離流程圖。具體實施例方式以下附圖及較佳實施例，對依據(jù)本發(fā)明提供的具體實施方式及特征詳述如下本發(fā)明所獲得的具有抗氧化活性的化合物化學結構式為該化合物為無色結晶，由ESI-MSm/z:803[M+Na]+，825[M+45]—，可知其分子量為780，結合^-NMROy^N)和13C-NMR(C5D5N)數(shù)據(jù)，確定其分子式為C34H52020，不飽和度為9;S93.7、S96.1、S97.3是三個縮醛碳信號，HMQC顯示Sc140.6/SH6.38和Sc104.3/SH4.82是雙鍵的碳氫信號，結合HMQC和HMBC譜，苷元的NMR信號顯示存在兩個環(huán)戊烷型環(huán)烯醚萜骨架，一個骨架與ajugoside相同，另一個則與ajugoside骨架相似，SH5.85/Sc97.3、SH2.02/SC31、SHl.52/Sc31顯示C3'-C4'上的雙鍵變成單鍵，HMBC譜顯示相關信號SH6.42/Sc99.8、SH5.37/Sc93.7和SH6.38/Sc99.8、SH5.51/Sc96.1，表明兩個環(huán)烯醚萜骨架C-l羥基各連了一個葡萄糖基，而相關信號SH5.85/Se69.7、SH4.98/Sc97.3、SH4.44/Sc97.3和SH5.37/Sc93.7顯示兩個環(huán)烯醚萜骨架并沒有直接相連，而是通過一個(1—6)葡萄糖基相連，該化合物是一個新的環(huán)烯醚萜苷，命名為wallchiisideE。如圖1所示，一種從藏藥綿參中提取具有抗氧化活性的化合物的提取方法，實施步驟如下首先，將10Kg干燥的綿參全草，粉碎，以50-95%乙醇室溫浸泡提取3次，每次7-10天，將提取液合并減壓濃縮，得流浸膏970g密度1.15g/ml，用水混懸分散后得3L;依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚部位200g、乙酸乙酯部位33g、正丁醇部位255g;然后，將正丁醇部位255g經D-1400型大孔吸附樹脂柱，徑高比l:5，以水-乙醇系統(tǒng)洗脫分為4個部分10%，30%，60%，90%;530X洗脫部分，74g，經MCI-GELCHP20P大孔樹脂柱層析，徑高比1:8，以10-60%甲醇_水洗脫，按10%遞增分為Al-A6共6個部分；A4再經反相ODS-A柱層析，徑高比1:8，按10%遞增以10-60X甲醇-水洗脫，各洗脫5個柱體積，分為Bl-B6共6個部分，B2再反復S印hadexLH-20凝膠柱層析，徑高比1:30，以50%甲醇洗脫得wallchiisideE25mg。通過DPPH法測定wallchiisideE具有較強的抗氧化活性。表lwallchiisideE在C5D5N中的核磁共振數(shù)據(jù)wallchiisideE<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>采用儀器與材料質譜MAT_95型質譜儀，Kratos1H型質譜儀；核磁共振譜BruckAM-400核磁共振儀；反相硅膠ODS-A(120nm，S-50iim)，YMCCO.，LTD.，JapanS印hadex111LH-20:GEHealthcareBio_ScoencesAB，Uppsala，Sweden;大孑L吸附樹月旨D-1400，揚州制藥廠；MCI-GELCHP20P(75-150iim)，MitsubishiChemicalCorporation,Tokyo,Japan5比旋光度Perkin-Elmer241MCpolarimeter或Perkin-Elmer341polarimeter;紅外光譜NicoletMagna750FTIR型紅外分光光度計；TLC薄層板HSGF254，可采用煙臺化工研究院；顯色劑10%硫酸香蘭素乙醇溶液；植物材料綿參(EriophytonwallichiiBenth.)全草采自西藏自治區(qū)；DPPH:sigma公司。wallchiisideE抗氧化活性的試驗方法以水為溶劑，準確的將wallchiisideE和標準品配成以下濃度10、20、40、80、160、320mg/L。稱取20mg的DPKl用無水乙醇溶解定容于250mL容量瓶中，則DPKl的濃度為2X10—4mol/L。測定方法向九十六孔板中加入150iiL的樣品溶液和150yL的DPra溶液，搖勻，于室溫中放置30min后，在517nm(最大吸收波長處)測定其吸光度。樣品對DPm的清除率K可用下式計算k=[l-(A「Aj)/Ac]X100%式中Ai=150iiLDPPH溶液+150iiL樣品溶液的吸光度值；Aj=150iiL樣品溶液+150iiL水的吸光度值；Ac=150iiLDPPH溶液+150iiL水的吸光度值。試驗結果表2wallchiisideEDPPH的清除率，％<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>從表2可以看出，隨著濃度的增加wallchiisideE的自由基清除率也逐漸升高，通過分析ICs。值發(fā)現(xiàn)，wallchiisideE的自由基清除能力明顯強于山奈酚-3_0_蕓香苷，說明其具有顯著的抗氧化能力。環(huán)烯醚萜苷類化合物的藥理活性環(huán)烯醚萜類化合物作為眾多植物藥中的有效成分之一，具有廣泛的生物活性，如抗病毒、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、保肝利膽、解痙鎮(zhèn)痛、增強免疫、降糖降脂等多種活性，并且對神經系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和消化系統(tǒng)具有有益的作用。有實驗表明梔子中京尼平苷、梔子苷能抑制鼠白血病P388細胞的生長，其中苷元的半縮醛結構是抗腫瘤所必需的。而梔子酸(GA)和梔子苷(GP)對大鼠腫瘤模型的抗癌作用是作為對亞致死的X射線輻射作用的防護劑來實現(xiàn)的。同時發(fā)現(xiàn)GA比GP具有更高防護活性?？勾笫笏难踵奏ぬ悄虿〉膶嶒烇@示，從玄參屬植物Scrophulariadeserti中發(fā)現(xiàn)的scropoliosideD和8_0_乙酰基哈帕酸有較強活性；C_3肉桂?；鶊F使環(huán)烯醚鵬苷活性增強，而C-8上的乙酰基對抗糖尿病活性是必需的。山茱萸環(huán)烯醚萜總苷對由糖尿病血管并發(fā)癥引起的氧化應激損傷具有保護作用。另有實驗表明山茱萸環(huán)烯醚萜總苷能使糖尿病大鼠胸主動脈血管內皮細胞損傷得到明顯改善，且能抑制糖尿病大鼠腎皮質AGEs的形成，使其受體mRNA表達水平下降，具有減輕糖尿病腎病變的作用。梔子果仁中的京尼平苷具有軟化大便的作用，其苷元經藥理實驗證明具有顯著的促進膽汁分泌作用。車前草清濕熱、利小便作用的有效成分是環(huán)戊烷結構的桃葉珊瑚苷。梓醇是地黃中降血糖作用的有效成分，并有很好的利尿作用和遲發(fā)性緩下作用。梓實用于治療腎炎浮腫等疾病，其中的梓苷的藥理作用和梓醇相似。洋橄欖中的油洋橄欖苦苷和洋橄欖內酯具有降血壓的作用。筋骨草苷(Ajugoside)具有抗感染作用，100yM時，可以抑制人血小板中75%的TXB2的釋放，IC5。為9.5iimol/L。血栓烷素B2(TXB2)增高見于動脈粥樣硬化、心肌梗死、血栓性疾病、糖尿病、高脂血癥、惡性腫瘤等。lOOyM時，可以抑制NMPI小鼠腹膜巨噬細胞中42%的前列腺素E2(PGE2)的釋放。8-乙?；淋?8-0-acetyl-harpagide)的藥理活性研究得比較多，主要有抗腫瘤、抗病毒、抗炎等作用。在用二甲基苯并蒽(匿BA)和腫瘤細胞生長促進劑(TPA)有道德大鼠乳頭瘤的實驗中，以甘草次酸為陽性對照藥，大鼠在用匿BA和TPA誘導8周后，荷瘤率為80%，給以8-乙?；淋蘸螅谙嗤臈l件下，荷瘤率只有8%。8-乙?；淋諏τ蒚PA誘導的大鼠皮膚癌比甘草次酸具有更好的治療效果。該化合物還有一定的抑制肺癌的作用。8-乙?；淋盏目鼓[瘤作用與其較強地抑制愛-巴病毒(EBV)有關。EBV屬于皰疹病毒，可以使人及靈長類動物的B淋巴細胞轉化成無限生長的癌變細胞，其在口咽部的非淋巴細胞中也能復制，包括唾液腺管及口咽部的其他上皮細胞。8-乙?；淋諏τ蒚PA誘導的Raji細胞(Barkitt—s淋巴瘤細胞)中EBV的DNA表達具有很強的抑制作用，在20g/mL是抑制率是100%，在10g/mL時抑制率是80%，其抑制效果比陽性對照藥甘草次酸、視黃酸都要好。8-乙?；淋?8-0-acetyl-harpagide)具有抗感染作用，能強烈抑制人血小板中TXB2的釋放，IC5。為19.5iimol/L。藏醫(yī)藥學是我國藏族人民在長期與自然環(huán)境斗爭的過程中形成的獨特的醫(yī)療保健方法，是祖國傳統(tǒng)醫(yī)藥學的瑰寶。西藏是一個高寒、缺氧、輻射強、無污染的高原環(huán)境，因此藏藥具有生長周期長、療效獨特、活性物質累積高等特點。雖然市場上已有大量的藏藥保健品，但品種比較單一，且功效因子及其構效量效關系都不明確，這不利于開發(fā)第三代保健品和走向國際市場，因此，深入研究藏醫(yī)藏藥在保健品方面的應用，確定藏藥保健品的功效因子及其構效量效關系，是開發(fā)第三代藏藥保健品和走向國際市場的一個關鍵。特別是本發(fā)明首次從藏藥綿參中提取分離并鑒定了所述的新化合物，并對其功效成分進行了系統(tǒng)研究，根據(jù)現(xiàn)代藥理學研究的結果，我們認為綿參具有抗病毒、抗菌消炎、抗腫瘤、抗氧化、保8肝利膽、解痙鎮(zhèn)痛、增強免疫、降糖、降脂、降壓、抗血小板凝集和血栓、清除氧自由基、抗菌消炎等作用，隨著研究的進一步深入，相信綿參在保健品應用方面具有廣闊的前景。上述參照實施例對該從藏藥綿參中提取具有抗氧化活性的化合物及其提取方法進行的詳細描述，是說明性的而不是限定性的；因此在不脫離本發(fā)明總體構思下的變化和修改，應屬本發(fā)明的保護范圍之內。權利要求一種從藏藥綿參中提取具有抗氧化活性的化合物，其特征在于所獲得的具有抗氧化活性的化合物化學結構式為該化合物為無色結晶，由ESI-MSm/z803[M+Na]+，825[M+45]-，可知其分子量為780，結合1H-NMR(C5D5N)和13C-NMR(C5D5N)數(shù)據(jù)，確定其分子式為C34H52O20，不飽和度為9；δ93.7、δ96.1、δ97.3是三個縮醛碳信號，HMQC顯示δC140.6/δH6.38和δC104.3/δH4.82是雙鍵的碳氫信號，結合HMQC和HMBC譜，苷元的NMR信號顯示存在兩個環(huán)戊烷型環(huán)烯醚萜骨架，一個骨架與ajugoside相同，另一個則與ajugoside骨架相似，δH5.85/δC97.3、δH2.02/δC31、δH1.52/δC31顯示C3′-C4′上的雙鍵變成單鍵，HMBC譜顯示相關信號δH6.42/δC99.8、δH5.37/δC93.7和δH6.38/δC99.8、δH5.51/δC96.1，表明兩個環(huán)烯醚萜骨架C-1羥基各連了一個葡萄糖基，而相關信號δH5.85/δC69.7、δH4.98/δC97.3、δH4.44/δC97.3和δH5.37/δC93.7顯示兩個環(huán)烯醚萜骨架并沒有直接相連，而是通過一個(1→6)葡萄糖基相連，該化合物是一個新的環(huán)烯醚萜苷，命名為wallchiisideE。F2009102284153C0000011.tif2.—種根據(jù)權利要求1所述的從藏藥綿參中提取具有抗氧化活性的化合物的提取方法，其特征在于實施步驟如下首先，將lOKg干燥的綿參全草，粉碎，以50-95%乙醇室溫浸泡提取3次，每次7-10天，將提取液合并減壓濃縮，得流浸膏970g密度1.15g/ml，用水混懸分散后得3L;依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚部位200g、乙酸乙酯部位33g、正丁醇部位255g;然后，將正丁醇部位255g經D-1400型大孔吸附樹脂柱，徑高比l:5，以水-乙醇系統(tǒng)洗脫分為4個部分10%，30%，60%，90%;30X洗脫部分，74g，經MCI-GELCHP20P大孔樹脂柱層析，徑高比1:8，以10_60%甲醇-水洗脫，按10X遞增分為Al-A6共6個部分；A4再經反相0DS-A柱層析，徑高比1:8，按10%遞增以10-60%甲醇-水洗脫，各洗脫5個柱體積，分為Bl-B6共6個部分，B2再反復S印hadexLH-20凝膠柱層析，徑高比1:30，以50%甲醇洗脫得wallchiisideE25mg。全文摘要本發(fā)明涉及一種從藏藥綿參中提取具有抗氧化活性的化合物及其提取方法，該化合物經現(xiàn)代光譜分析確定為環(huán)烯醚萜類新化合物，分子量為780，分子式為C34H52O20。其提取方法包括綿參全草粉碎，乙醇提取，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，正丁醇部位進行大孔吸附樹脂層析，30％洗脫部分依次經MCI-GELCHP20P、ODS-A、SephadexLH-20柱層析，得wallchiisideE。本發(fā)明新化合物制備方法簡單，成本低廉，活性顯著，為開發(fā)具有抗氧化作用的藥物提供了新的化合物。文檔編號C07H1/08GK101704859SQ20091022841公開日2010年5月12日申請日期2009年11月16日優(yōu)先權日2009年11月16日發(fā)明者范秋領,趙明明申請人:天津天獅生物發(fā)展有限公司;天津天獅生物工程有限公司;天津天獅生命源有限公司;天津天獅集團有限公司