專利名稱：：從藏藥綿參中提取具有抗氧化活性的化合物及其提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種從藏藥綿參中提取新化合物的方法，特別涉及一種從藏藥綿參中提取具有抗氧化活性的化合物及其提取方法。
背景技術(shù)：
：藏醫(yī)藥學(xué)是我國藏族人民在長期與自然環(huán)境斗爭的過程中形成的獨特的醫(yī)療保健方法，是祖國傳統(tǒng)醫(yī)藥學(xué)的瑰寶。西藏是一個高寒、缺氧、輻射強、無污染的高原環(huán)境，因此藏藥具有生長周期長、療效獨特、活性物質(zhì)累積高等特點。雖然市場上已有藏藥保健品，但品種比較單一，且功效因子及其構(gòu)效量效關(guān)系都不明確，這不利于開發(fā)第三代保健品和走向國際市場，因此，深入研究藏醫(yī)藏藥在保健品方面的應(yīng)用，確定藏藥保健品的功效因子及其構(gòu)效量效關(guān)系，是開發(fā)第三代藏藥保健品和走向國際市場的一個關(guān)鍵。綿參(EriophytonwallichiiBenth.)，藏藥名榜參布茹，是唇形科植物，全草或根入藥，生于海拔4500-5300km的冰澤亂石堆，碎石帶，產(chǎn)于西藏、青海、甘肅南部、四川西部、云南西北部，花盛期采集，去凈泥土，曬干。味苦性涼，調(diào)氣和血、提升中氣、滋補、潤肺。治氣虛體弱、氣血虧損、肺膿腫、肺結(jié)核、肺熱咳嗽、咳血、胸痛。綿參在藏藥名著《晶珠本草》中早有記載，目前，只有中科院成都生物所曾經(jīng)從綿參的月旨溶性部位中分到28-印i-cyaste皿e，Eriophytonoide，Cyaste皿e，ajuforrestinsAandB，20—hydroxyecdysone，polypodinB，ajugalactone，8_0_3cetylharp3gid，即igenin，-sitosteroldaucosterol，MidN_[2_hydroxy_(nori3decanoyl-tricosanoyl)]-4-hydroxytr雄-8-sphingenine等化合物，而對其月旨溶性部位禾口水溶性部位的系統(tǒng)研究還沒有報道，同時，對其活性物質(zhì)基礎(chǔ)的研究國內(nèi)外也沒有報道。因此，為了深入研究綿參的化學(xué)成分及其藥理活性，明確其功效因子及其構(gòu)效量效關(guān)系，為開發(fā)綿參系列保健品提供理論依據(jù)，利用現(xiàn)代分離分析技術(shù)和藥理實驗技術(shù)對綿參的生物活性成分進行了研究。即提供一種從藏藥綿參中提取具有抗氧化活性的化合物及其提取方法，即成為該領(lǐng)域技術(shù)人員急待著手解決的問題之一。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種從藏藥綿參中提取具有抗氧化活性的化合物及其提取方法。為實現(xiàn)上述目的本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種從藏藥綿參中提取具有抗氧化活性的化合物，其特征在于所獲得的具有抗氧化活性的化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)式為3OH該化合物為為無色結(jié)晶，由ESI-MSm/z:403[M+Na]+，425[M+HC00—]—，其分子量為380，結(jié)合^-NMRO^OD)和13C_NMR(CD30D)數(shù)據(jù)，確定其分子式為C16H2801Q，不飽和度為3;力-NMR譜S4.69(1H，d，J=7.8Hz)和"C-NMR譜S99.6是糖的端基質(zhì)子和端基碳的特征信號,C-NMR譜S63.3是糖6位-CH2信號，結(jié)合^-NMR譜S3.87(1H，dd，J=11.5，1.7Hz)和S3.64(1H，dd，J=11.5，5.5Hz)，表明有一個P_葡萄糖基；13C_NMR譜顯示有16個信號，除去葡萄糖的6個碳，苷元有9個碳和一個_0CH3(S56.7)，有兩個環(huán)，S95.6和S98.7是兩個縮醛碳信號，其骨架與jioglutinE相似，是環(huán)戊烷型環(huán)烯醚萜，HMQC和HMBC譜顯示相關(guān)信號SH4.92/Sc56.9、SH3.44/Sc98.8、SH5.41/Sc99.6和SH4.69/Sc95.7，表明_0CH3連于C-3上，葡萄糖基連在C-l羥基上，該化合物是一個新的環(huán)烯醚萜苷，命名為wallchiisideA?！N從藏藥綿參中提取具有抗氧化活性的化合物的提取方法，其特征在于實施步驟如下首先，將10Kg干燥的綿參全草，粉碎，以50-95%乙醇室溫浸泡提取3次，每次7-10天，將提取液合并減壓濃縮，得浸膏970g，密度1.15g/ml，用水混懸分散后得3L;依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚部位200g、乙酸乙酯部位33g、正丁醇部位255g;然后，將正丁醇部位255g經(jīng)D-1400型大孔吸附樹脂柱，徑高比l:5，以水-乙醇系統(tǒng)洗脫分為4個部分10%，30%，60%，90%;10X洗脫部分，85g，以2L甲醇溶解，過濾，濾液減壓濃縮干燥到70g，此部分經(jīng)硅膠ioo-200目，2Kg，柱層析，徑高比i:5，分別以體積比20:i、8:i、4:i、2:i、i:i的氯仿-甲醇溶劑系統(tǒng)洗脫，各洗脫15L;4:l氯仿-甲醇洗脫部分用反相ODS-A進行柱層析，徑高比1:8，以10-60%甲醇-水洗脫，反復(fù)S印hadexLH-20凝膠柱層析，徑高比1:30，50%甲醇洗脫，得wallchiisideA25mg。本發(fā)明的有益效果是從藏藥綿參中提取分離到一個新的環(huán)烯醚萜類化合物，提取分離過程簡便，經(jīng)過試驗證明該化合物具有清除自由基的能力，為開發(fā)具有抗氧化作用的藥物提供了先導(dǎo)化合物。圖1是本發(fā)明wallchiisideA提取分離流程圖。具體實施例方式以下附圖及較佳實施例，對依據(jù)本發(fā)明提供的具體實施方式及特征詳述如下本發(fā)明所獲得的具有抗氧化活性的化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)式為該化合物為無色結(jié)晶，由ESI-MSm/z:403[M+Na]+，425[M+HC00—]—，其分子量為380，結(jié)合^-NMRO^OD)和13C_NMR(CD30D)數(shù)據(jù)，確定其分子式為C16H2801Q，不飽和度為3;力-NMR譜S4.69(1H，d，J=7.8Hz)和"C-NMR譜S99.6是糖的端基質(zhì)子和端基碳的特征信號,C-NMR譜S63.3是糖6位-CH2信號，結(jié)合^-NMR譜S3.87(1H，dd，J=11.5，1.7Hz)和S3.64(1H，dd，J=11.5，5.5Hz)，表明有一個P_葡萄糖基；13C_NMR譜顯示有16個信號，除去葡萄糖的6個碳，苷元有9個碳和一個_0CH3(S56.7)，有兩個環(huán)，S95.6和S98.7是兩個縮醛碳信號，其骨架與jioglutinE相似，是環(huán)戊烷型環(huán)烯醚萜，HMQC和HMBC譜顯示相關(guān)信號SH4.92/Sc56.9、SH3.44/Sc98.8、SH5.41/Sc99.6和SH4.69/Sc95.7，表明_0CH3連于C-3上，葡萄糖基連在C-l羥基上，該化合物是一個新的環(huán)烯醚萜苷，命名為wallchiisideA。如圖1所示，一種從藏藥綿參中提取具有抗氧化活性的化合物的提取方法，實施步驟如下首先，將lOKg干燥的綿參全草，粉碎，以50-95%乙醇室溫浸泡提取3次，每次7-10天，將提取液合并減壓濃縮，得浸膏970g，密度1.15g/ml，用水混懸分散后得3L;依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚部位200g、乙酸乙酯部位33g、正丁醇部位255g;然后，將正丁醇部位255g經(jīng)D-1400型大孔吸附樹脂柱，徑高比l:5，以水-乙醇系統(tǒng)洗脫分為4個部分10%，30%，60%，90%;10X洗脫部分，85g，以2L甲醇溶解，過濾，濾液減壓濃縮干燥到70g，此部分經(jīng)硅膠ioo-200目，2Kg，柱層析，徑高比i:5，分別以體積比20:i、8:i、4:i、2:i、i:i的氯仿-甲醇溶劑系統(tǒng)洗脫，各洗脫15L;4:l氯仿-甲醇洗脫部分用反相ODS-A進行柱層析，徑高比1:8，以10-60%甲醇-水洗脫，反復(fù)S印hadexLH-20凝膠柱層析，徑高比1:30，50%甲醇洗脫，得wallchiisideA25mg。通過DPra法測定wallchiisideA具有較強的抗氧化活性。表lwallchiisideA在CD30D中的核磁共振數(shù)據(jù)5wallchiisideA_jioglutinEpositionCHCH5.41(1H，d,195.77=3.1Hz)99.34.68(1H，brd,J=5.5Hz)4.92(1H,dd,J=7.6，4.75(1H,線^6.7,4.0,398.83.1Hz)99.50.5Hz)432.41.85(1H,ddd,1.87(1H,ddd,7=13.3,7.6，3.0Hz;■7=13.7,6.7,4.0Hz)1.27(1H,m)1.40(1H,ddd,J43.7,9.9,31.36.9Hz)544.22.47(1H,m)44.32.42(1H,m)677.63.96(lH,m)77.14.03(1H,m)750.92.15(1H,dd,502.09(1H,dd一14-2,6.8Hz)■7=14.3，6.5Hz)1.79(1H,1.77(1H,ddt，《/=14.2,4.4,dd,=14.3，4.1Hz)0.9Hz)88079.62.27(1H,dd，風(fēng)7，2.15(1H,dd,^8.8,952.23.0Hz)53.25.5Hz)1027.61.32(3H,s)26.51.28(3H,s)1156.93.44(3H,s)55.83.43(3H，s)4.69(1H,d,r99.6/=8.0Hz)563.44(3H,s)2,75.33.23(1H,dd,J=8.0,9.2Hz)3，78.73.37(1H,dd,J=9.2,9.1Hz)4,72.23.25(1H,dd,J-9.1,9.4Hz)5,78.73.28(lH,m)6,63.33.87(1H,dd,J=11.5,1.7Hz)3.64(1H,dd,J=11.5,5.5Hz)采用儀器與材料質(zhì)譜MAT-95型質(zhì)譜儀，Kratos1H型質(zhì)譜儀；核磁共振譜BruckAM-400核磁共振儀；層析硅膠硅膠H60及硅膠100-200目，可采用青島海洋化工廠產(chǎn)品；反相硅膠ODS-A(120nm，S-50iim)，YMCCO.，LTD.，JapanS印hadex111LH-20:GEHealthcareBio-ScoencesAB，Uppsala，Sweden;大孔吸附樹脂D-1400，揚州制藥廠；比旋光度Perkin-Elmer241MCpolarimeter或Perkin-Elmer341polarimeter;紅外光譜NicoletMagna750FTIR型紅外分光光度計；TLC薄層板HSGF254，可采用煙臺化工研究院；顯色劑10%硫酸香蘭素乙醇溶液；植物材料綿參(EriophytonwallichiiBenth.)全草采自西藏自治區(qū)；DPPH:sigma公司。wallchiisideA抗氧化活性的試驗方法以水為溶劑，準(zhǔn)確的將wallchiisideA和標(biāo)準(zhǔn)品配成以下濃度10、20、40、80、160、320mg/L。稱取20mg的DPKl用無水乙醇溶解定容于250mL容量瓶中，則DPKl的濃度為2X10—4mol/L。測定方法向九十六孔板中加入150iiL的樣品溶液和150yL的DPra溶液，搖勻，于室溫中放置30min后，在517nm(最大吸收波長處)測定其吸光度。樣品對DPm的清除率K可用下式計算k=[l-(A「Aj)/Ac]X100%式中Ai=150iiLDPPH溶液+150iiL樣品溶液的吸光度值；Aj=150iiL樣品溶液+150iiL水的吸光度值；Ac=150iiLDPPH溶液+150iiL水的吸光度值。試驗結(jié)果表2wallchiisideADPPH的清除率，％<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>從表2可以看出，隨著濃度的增加wallchiisideA的自由基清除率也逐漸升高，通過分析ICs。值發(fā)現(xiàn)，wallchiisideA的自由基清除能力不及蘆丁，但明顯強于山奈酚-3-0-蕓香苷，說明其具有顯著的抗氧化能力。環(huán)烯醚萜苷類化合物的藥理活性環(huán)烯醚萜類化合物作為眾多植物藥中的有效成分之一，具有廣泛的生物活性，如抗病毒、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、保肝利膽、解痙鎮(zhèn)痛、增強免疫、降糖降脂等多種活性，并且對神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和消化系統(tǒng)具有有益的作用。有實驗表明梔子中京尼平苷、梔子苷能抑制鼠白血病P388細胞的生長，其中苷元的半縮醛結(jié)構(gòu)是抗腫瘤所必需的。而梔子酸(GA)和梔子苷(GP)對大鼠腫瘤模型的抗癌作用是作為對亞致死的X射線輻射作用的防護劑來實現(xiàn)的。同時發(fā)現(xiàn)GA比GP具有更高防護活性?？勾笫笏难踵奏ぬ悄虿〉膶嶒烇@示，從玄參屬植物Scrophulariadeserti中發(fā)現(xiàn)的scropoliosideD和8_0_乙?；了嵊休^強活性；C_3肉桂?；鶊F使環(huán)烯醚鵬苷活性增強，而C-8上的乙?；鶎固悄虿』钚允潜匦璧?。山茱萸環(huán)烯醚萜總苷對由糖尿病血管并發(fā)癥引起的氧化應(yīng)激損傷具有保護作用。另有實驗表明山茱萸環(huán)烯醚萜總苷能使糖尿病大鼠胸主動脈血管內(nèi)皮細胞損傷得到明顯改善，且能抑制糖尿病大鼠腎皮質(zhì)AGEs的形成，使其受體mRNA表達水平下降，具有減輕糖尿病腎病變的作用。梔子果仁中的京尼平苷具有軟化大便的作用，其苷元經(jīng)藥理實驗證明具有顯著的促進膽汁分泌作用。車前草清濕熱、利小便作用的有效成分是環(huán)戊烷結(jié)構(gòu)的桃葉珊瑚苷。梓醇是地黃中降血糖作用的有效成分，并有很好的利尿作用和遲發(fā)性緩下作用。梓實用于治療腎炎浮腫等疾病，其中的梓苷的藥理作用和梓醇相似。洋橄欖中的油洋橄欖苦苷和洋橄欖內(nèi)酯具有降血壓的作用。筋骨草苷(Ajugoside)具有抗感染作用，100yM時，可以抑制人血小板中75%的TXB2的釋放，IC5。為9.5iimol/L。血栓烷素B2(TXB2)增高見于動脈粥樣硬化、心肌梗死、血栓性疾病、糖尿病、高脂血癥、惡性腫瘤等。lOOyM時，可以抑制NMPI小鼠腹膜巨噬細胞中42%的前列腺素E2(PGE2)的釋放。8-乙?；淋?8-0-acetyl-harpagide)的藥理活性研究得比較多，主要有抗腫瘤、抗病毒、抗炎等作用。在用二甲基苯并蒽(匿BA)和腫瘤細胞生長促進劑(TPA)有道德大鼠乳頭瘤的實驗中，以甘草次酸為陽性對照藥，大鼠在用匿BA和TPA誘導(dǎo)8周后，荷瘤率為80%，給以8-乙?；淋蘸螅谙嗤臈l件下，荷瘤率只有8%。8-乙酰基哈帕苷對由TPA誘導(dǎo)的大鼠皮膚癌比甘草次酸具有更好的治療效果。該化合物還有一定的抑制肺癌的作用。8-乙?；淋盏目鼓[瘤作用與其較強地抑制愛-巴病毒(EBV)有關(guān)。EBV屬于皰疹病毒，可以使人及靈長類動物的B淋巴細胞轉(zhuǎn)化成無限生長的癌變細胞，其在口咽部的非淋巴細胞中也能復(fù)制，包括唾液腺管及口咽部的其他上皮細胞。8-乙?；淋諏τ蒚PA誘導(dǎo)的Raji細胞(Barkitt—s淋巴瘤細胞)中EBV的DNA表達具有很強的抑制作用，在20iig/mL是抑制率是100%，在lOiig/mL時抑制率是80%，其抑制效果比陽性對照藥甘草次酸、視黃酸都要好。8-乙?；淋?8-0-acetyl-harpagide)具有抗感染作用，能強烈抑制人血小板中TXB2的釋放，IC5。為19.5iimol/L。藏醫(yī)藥學(xué)是我國藏族人民在長期與自然環(huán)境斗爭的過程中形成的獨特的醫(yī)療保健方法，是祖國傳統(tǒng)醫(yī)藥學(xué)的瑰寶。西藏是一個高寒、缺氧、輻射強、無污染的高原環(huán)境，因此藏藥具有生長周期長、療效獨特、活性物質(zhì)累積高等特點。雖然市場上已有大量的藏藥保健品，但品種比較單一，且功效因子及其構(gòu)效量效關(guān)系都不明確，這不利于開發(fā)第三代保健品和走向國際市場，因此，深入研究藏醫(yī)藏藥在保健品方面的應(yīng)用，確定藏藥保健品的功效因子及其構(gòu)效量效關(guān)系，是開發(fā)第三代藏藥保健品和走向國際市場的一個關(guān)鍵。特別是本發(fā)明首次從藏藥綿參中提取分離并鑒定了所述的新化合物，并對其功效成分進行了系統(tǒng)研究，根據(jù)現(xiàn)代藥理學(xué)研究的結(jié)果，我們認(rèn)為綿參具有抗病毒、抗菌消炎、抗腫瘤、抗氧化、保肝利膽、解痙鎮(zhèn)痛、增強免疫、降糖、降脂、降壓、抗血小板凝集和血栓、清除氧自由基、抗菌消炎等作用，隨著研究的進一步深入，相信綿參在保健品應(yīng)用方面具有廣闊的前景。上述參照實施例對該從藏藥綿參中提取具有抗氧化活性的化合物及其提取方法進行的詳細描述，是說明性的而不是限定性的；因此在不脫離本發(fā)明總體構(gòu)思下的變化和修改，應(yīng)屬本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。8權(quán)利要求一種從藏藥綿參中提取具有抗氧化活性的化合物，其特征在于所獲得的具有抗氧化活性的化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)式為該化合物為為無色結(jié)晶，由ESI-MSm/z403[M+Na]+，425[M+HCOO-]-，其分子量為380，結(jié)合1H-NMR(CD3OD)和13C-NMR(CD3OD)數(shù)據(jù)，確定其分子式為C16H28O10，不飽和度為3；1H-NMR譜δ4.69(1H，d，J＝7.8Hz)和13C-NMR譜δ99.6是糖的端基質(zhì)子和端基碳的特征信號，13C-NMR譜δ63.3是糖6位-CH2信號，結(jié)合1H-NMR譜δ3.87(1H，dd，J＝11.5，1.7Hz)和δ3.64(1H，dd，J＝11.5，5.5Hz)，表明有一個β-葡萄糖基；13C-NMR譜顯示有16個信號，除去葡萄糖的6個碳，苷元有9個碳和一個-OCH3(δ56.7)，有兩個環(huán)，δ95.6和δ98.7是兩個縮醛碳信號，其骨架與jioglutinE相似，是環(huán)戊烷型環(huán)烯醚萜，HMQC和HMBC譜顯示相關(guān)信號δH4.92/δC56.9、δH3.44/δC98.8、δH5.41/δC99.6和δH4.69/δC95.7，表明-OCH3連于C-3上，葡萄糖基連在C-1羥基上，該化合物是一個新的環(huán)烯醚萜苷，命名為wallchiisideA。F2009102284219C0000011.tif2.—種根據(jù)權(quán)利要求1所述的從藏藥綿參中提取具有抗氧化活性的化合物的提取方法，其特征在于實施步驟如下首先，將10Kg干燥的綿參全草，粉碎，以50-95%乙醇室溫浸泡提取3次，每次7-10天，將提取液合并減壓濃縮，得浸膏970g，密度1.15g/ml，用水混懸分散后得3L;依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚部位200g、乙酸乙酯部位33g、正丁醇部位255g;然后，將正丁醇部位255g經(jīng)D-1400型大孔吸附樹脂柱，徑高比l:5，以水-乙醇系統(tǒng)洗脫分為4個部分10%，30%，60%，90%;10X洗脫部分，85g，以2L甲醇溶解，過濾，濾液減壓濃縮干燥到70g，此部分經(jīng)硅膠100-200目，2Kg，柱層析，徑高比i:5，分別以體積比20:i、8:i、4:i、2:i、i:i的氯仿-甲醇溶劑系統(tǒng)洗脫，各洗脫15L;4:l氯仿-甲醇洗脫部分用反相ODS-A進行柱層析，徑高比l:8，以10-60X甲醇-水洗脫，反復(fù)S印hadexLH-20凝膠柱層析，徑高比1:30，50%甲醇洗脫，得wallchiisideA25mg。全文摘要本發(fā)明涉及一種從藏藥綿參中提取具有抗氧化活性的化合物及其提取方法，該化合物經(jīng)現(xiàn)代光譜分析確定為環(huán)烯醚萜類新化合物，分子量為380，分子式為C16H28O10。其提取方法包括綿參全草粉碎，乙醇提取，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，正丁醇部位進行大孔吸附樹脂層析，10％洗脫部分依次經(jīng)硅膠、ODS-A、SephadexLH-20柱層析，得wallchiisideA。本發(fā)明新化合物制備方法簡單，成本低廉，活性顯著，為開發(fā)具有抗氧化作用的藥物提供了新的化合物。文檔編號C07H17/04GK101704863SQ20091022842公開日2010年5月12日申請日期2009年11月16日優(yōu)先權(quán)日2009年11月16日發(fā)明者范秋領(lǐng),趙明明申請人:天津天獅生物發(fā)展有限公司;天津天獅生物工程有限公司;天津天獅生命源有限公司;天津天獅集團有限公司