專利名稱：：一種植物黃矮病抗性相關(guān)蛋白及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種植物黃矮病抗性相關(guān)蛋白及其編碼基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：小麥黃矮病是一種世界性的小麥重要病毒病。小麥一旦感染黃矮病即無藥可治，造成小麥的嚴(yán)重減產(chǎn)和品質(zhì)下降，因此黃矮病也有"小麥癌癥"之稱，且分布廣泛，在世界各麥區(qū)地均有發(fā)生。1978年美國因小麥黃矮病的大爆發(fā)致使小麥減產(chǎn)60%80%，1988年德國冬小麥因黃矮病流行而減產(chǎn)40%。近年來，澳大利亞小麥因此病每年損失約3000萬美元，新西蘭、阿根廷、土耳其、突尼斯等國也有黃矮病的發(fā)生。1966年、1970年、1973年、1978年、1980年、1987年、19981999年我國的西北、華北部分地區(qū)和東北大面積發(fā)生此病害，僅1999年陜西、山西等麥區(qū)因黃矮病造成小麥減產(chǎn)20%30%，個(gè)別嚴(yán)重麥區(qū)減產(chǎn)超過50%，小麥產(chǎn)量損失達(dá)數(shù)億公斤(張?jiān)銎G，辛志勇，抗黃矮病小麥生物技術(shù)育種研究進(jìn)展，作物雜志，2005，5:4-7)。近年來由于暖冬、暖春現(xiàn)象頻繁，降水明顯減少，給蚜蟲越冬、繁殖和毒源保存創(chuàng)造了有利條件，致使黃矮病在我國有擴(kuò)展和危害加重的趨勢，小麥黃矮病流行范圍已遍及陜西、山西、甘肅、四川、寧夏、內(nèi)蒙古、河北和江蘇等多個(gè)小麥產(chǎn)區(qū)。因此，黃矮病的防治對于保證小麥高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)和農(nóng)業(yè)持續(xù)發(fā)展非常重要。小麥黃矮病是由蚜蟲介導(dǎo)的大麥黃矮病毒引起的。根據(jù)不同蚜蟲的傳播特性，把大麥黃矮病毒分為BYDV-PAV、BYDV-MAV、BYDV-GAV、BYDV-GPA、CYDV-RPV和SGV株系及RMV株系。其中BYDV-GPV(我國特有的株系類型)，BYDV-GAV為我國主流株系。選育和推廣應(yīng)用抗黃矮病小麥新品種，是防治小麥黃矮病的最經(jīng)濟(jì)有效途徑。優(yōu)良可利用的抗病基因是抗病育種的前提。然而，迄今，小麥初級基因庫中尚未發(fā)現(xiàn)真正有效的抗性基因，僅鑒定出對BYDV-MAV株系表現(xiàn)一定耐性的Bdvl基因。近年來從偃麥草屬、冰草屬、賴草屬、披堿草屬、鵝冠草屬中鑒定出十幾種小麥遠(yuǎn)源親緣植物免疫或高抗黃矮病，其中以中間偃麥草的研究與利用最多(張?jiān)銎G，辛志勇，抗黃矮病小麥生物技術(shù)育種研究進(jìn)展，作物雜志，2005，5:4-7)。中間偃麥草(Thinopyr咖intermedium)，高抗BYDV-PAV、-GAV、-GPV、-MAV，-RPV等株系，至少含有3個(gè)抗黃矮病基因，分別位于第7同源群染色體7X長臂(7Ai#lL)，7E長臂和第2同源染色體2Ai-2短臂，分別命名為Bdv2、Bdv3、Bdv4。通過小麥X中間偃麥草遠(yuǎn)緣雜交，育成抗黃矮病的部分雙二倍體TAF46、無芒中4(中5)。分別以TAF46、中5做橋梁親本，育成抗黃矮病的二體附加系L1與Z1、Z2、Z6。利用組織培養(yǎng)、中國春ph突變體誘導(dǎo)部分同源染色體配對等途徑，成功地將Ll中攜帶Bdv2等抗黃矮病重要基因的中間偃麥草染色體片段導(dǎo)入小麥，育成一批抗黃矮病的小麥-中間偃麥草易位系，包括TC5-TC10、TC14以及Y怖42(HW642)、YW443、YW243等(張?jiān)銎G，辛志勇，抗黃矮病小麥生物技術(shù)育種研究進(jìn)展，作物雜志，2005，5:4-7)。研究發(fā)現(xiàn)，抗黃矮病的小麥_中間偃麥草易位系YW642、YW443、YW243等，高抗BYDV-GAV、-MAV、-GPV和-PAV等株系，攜帶Bdv2的中間偃麥草染色體7X長臂(7Ai#lL)端部小片段易位到小麥染色體7D長臂端部(張?jiān)銎G，辛志勇，馬有志等，M即pingofaBYDVresistancegenefromThintermediumintermediuminwheatbackgro皿dbymolecularmarkers,ScienceinChina(SeriesC)，1999，42(6):663668)。石開究結(jié)果還表明，抗黃矮病的小麥-中間偃麥草易位系YW642中，抗黃矮病基因作用的結(jié)果，能顯著抑制BYDV的復(fù)制與運(yùn)動(dòng)(XiaodongLiu，ZengYanZhang通訊作者，ZhiyongXin，2005，Molecularevidenceofbarleyyellowdwarfvirusr印lication/movementsuppressedbytheresistancegeneBdv2derivedfromTh.intermedium,遺傳學(xué)報(bào)(JournalofGeneticandGenomics)，32:942-947)。理論上說，YW642、YW443、YW243等應(yīng)該可以做為抗黃矮病小麥育種中易于利用的抗性種質(zhì)。然而，這些易位系雖然高抗黃矮病致病株系但并被沒有成功地應(yīng)用、育成多少抗黃矮病小麥新品種，可能是攜帶抗黃矮病基因Bdv2的染色體7Ai#lL片段存在著不利的連鎖累贅。因此，迫切需要從抗黃矮病的小麥_中間偃麥草易位系YW642(HW642)等材料中分離克隆出Bdv2等抗黃矮病重要基因，研究其抗性作用分子機(jī)制，并應(yīng)用于基因工程育種，以高效地培育抗黃矮病、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的小麥新品種。發(fā)明人所在實(shí)驗(yàn)室和國外學(xué)者，以抗黃矮病小麥-中間偃麥草易位系YW642、TC14等材料，分子標(biāo)記了來自小麥近緣植物中間偃麥草(Thinopyrumintermedium)的攜帶抗黃矮病基因Bdv2的7AiSlL片段(張?jiān)銎G等1999，2001，2004;Stoutjesdijk，P.，Kammholz，S.，Kleven，S.，Matsay，S.，Banks，P.，andLarkin，P.2001，PCR-basedmolecularmarkerfortheBdv2Thinopyrumintermediumsourceofbarleyyellowdwarfvirusresistanceinwheat.Aust.J.Agric.Res.52:383—1388;Ayala，L，Henry，M.，Gonz，N.，Ginkel，M.，Mujeeb-Kazi，A.，Keller,B.，andKhairallah，M.(2001)AdiagnosticmolecularmarkerallowingthestudyofTh.intermedium—derivedresistancetoBYDVinbreadwheatsegregatingpopulations.Theor.Appl.Genet.102,942—949;Ayala，L，Bariana，H.，Singh，R.，Gibson,J.，Gibson,A.，andMechanicos，P.(2007)TrigenomicchromosomesbyrecombinationofThinopyrumintermediumandTh.ponticumtranslocationsinwheat.Theor.Appl.Genet.116,63-75)。但是，由于中間偃麥草與小麥的親緣關(guān)系非常遠(yuǎn)源，攜帶抗黃矮病重要基因的中間偃麥草染色體(7X)片段與小麥部分同源染色體(7D)間很難發(fā)生交換分離，因此，難以通過正常的F2群體精細(xì)定位中間偃麥草染色體(7X)片段上Bdv2等抗黃矮病重要基因與分子標(biāo)記之間的遺傳距離，圖位克隆法不適用于分離克隆7X片段上Bdv2等抗黃矮病重要基因。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種植物黃矮病抗性相關(guān)蛋白及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供的植物黃矮病抗性相關(guān)蛋白(TiNBLl)，來源于小麥_中間偃麥草易位系YW642[具體來自易位于小麥的中間偃麥草(Thinopyrumintermedium)染色體7Ai#lL片段]，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物黃矮病抗性相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。序列表中的序列1由1059個(gè)氨基酸殘基組成。為了使(a)中的TiNBLl便于純化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成4的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表l標(biāo)簽的序列標(biāo)簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個(gè))RRRRRPoly-His2-10(通常為6個(gè))朋朋朋FLAG8DYKDDDDKStr印一tagII8WSHPQFEKc_myc10EQKLISEEDL上述(b)中的TiNBLl可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(b)中的TiNBLl的編碼基因可通過將序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對的錯(cuò)義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表l所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。編碼上述小麥黃矮病抗性重要蛋白的基因(TiNBLl)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述基因可為如下1)或2)或3)或4)的DNA分子1)其編碼序列是序列表中序列2自5'端第538至3717位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼植物黃矮病抗性相關(guān)蛋白的DNA分子；4)與1)或2)或3)限定的DNA序列具有90X以上同源性，且編碼植物黃矮病抗性相關(guān)蛋白的DNA分子。上述嚴(yán)格條件可為在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65。C下雜交，然后用2XSSC，0.1%SDS和1XSSC，0.1%SDS各洗膜一次。序列表中的序列2所示由4105個(gè)核苷酸組成，自5'端第538至1717位核苷酸為編碼序列(3180bp)。含有以上任一所述基因的重組表達(dá)載體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍?？捎矛F(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有所述基因的重組表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3'端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3'端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)?；?如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3'端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。5使用所述基因構(gòu)建重組植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動(dòng)子、玉米的泛素啟動(dòng)子(Ubiquitin)，它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。所述重組表達(dá)載體可將所述基因插入pAHC25載體的多克隆位點(diǎn)得到。具體來說，所述重組表達(dá)載體為將所述基因(TiNBLl)取代pAHC25載體Smal和Sacl位點(diǎn)間的GUS基因得到的。含有以上任一所述基因(TiNBLl)的表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。擴(kuò)增所述基因(TiNBLl)全長或任一片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明所提供的培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，可將編碼所述植物黃矮病抗性相關(guān)蛋白的基因TiNBLl導(dǎo)入目的植物(如植物細(xì)胞或組織)中，得到黃矮病抗性高于目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。具體來說，可以將所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入目的植物中，得到黃矮病抗性高于目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。利用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的載體，將編碼所述蛋白的基因?qū)胫参锛?xì)胞，可獲得黃矮病抗性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及轉(zhuǎn)基因植株。攜帶有所述基因的表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物，如煙草、百脈根、擬南芥、水稻、小麥、玉米、黃瓜、番茄、楊樹、草坪草、苜宿等。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種植物黃矮病抗性相關(guān)蛋白(TiNBLl)及其編碼基因(TiNBLl)。轉(zhuǎn)入TiNBLl基因后，感病小麥的抗病性得到顯著提高。本研究為開展小麥抗黃矮病作用的分子機(jī)制研究和分子育種，高效地培育抗黃矮病、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的小麥新品種奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。圖1為鑒定TiNBLl特異表達(dá)帶的電泳圖譜。Ti0:接種前0小時(shí)的中間偃麥草的cDNA;R0:接種前0小時(shí)的抗黃矮病小麥_中間偃麥草易位系HW642的cDNA;S0:接種前0小時(shí)的感黃矮病中8601的cDNA;RY12、RY48、RY72:接種BYDV12小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)的小麥—中間偃麥草易位系HW642的cDNA;SY12、SY48、SY72:接種BYDV12小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)的中8601的cDNA圖2為3'RACE擴(kuò)增電泳圖譜。1-4:接種前0小時(shí)的中間偃麥草的cDNA;5-8:接種前0小時(shí)的中8601的cDNA;9-12:接種前0小時(shí)的抗黃矮病小麥_中間偃麥草易位系HW642的cDNA;1、5、9:引物P1/AUAP擴(kuò)增;2、6、10:引物P2/AUAP擴(kuò)增;3、7、11:引物P2擴(kuò)增;4、8、12:引物AUAP擴(kuò)增;M:100bpLadder,箭頭示特異擴(kuò)增帶。圖3為TiNBLl的第一次5'RACE擴(kuò)增電泳圖譜。模板為HW642的cDNA;M:100bpladder;1:引物5P2/AUAP;2:引物5P3/AUAP;3:引物5P3;4:引物AUAP;箭頭示特異擴(kuò)增帶。圖4為TiNBLl全長cDNA序列的擴(kuò)增電泳圖譜；1、2:HW642的cDNA;3:中8601的cDNA;M.DL2000marker;箭頭示目標(biāo)擴(kuò)增帶。圖5為RT-PCR分析BYDV對TiNBLl基因表達(dá)影響的電泳圖譜。RY表示被BYDV毒蚜誘導(dǎo)的冊642葉片的cDNA，SY表示被BYDV毒蚜誘導(dǎo)的中8601葉片的cDNA;0、12、24、48、72表示BYDV毒岈誘導(dǎo)0小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)。圖6為RT-PCR分析水楊酸(SA)、茉莉酸(JA)對TiNBLl基因表達(dá)影響的電泳圖譜。材料為抗黃矮病小麥-中間偃麥草易位系冊642的cDNA，0、l、2、6、12、24表示BYDV毒蚜誘導(dǎo)0小時(shí)、1小時(shí)、2小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)。圖7為實(shí)施例2(基因沉默進(jìn)行功能分析)中，利用Q-RT-PCR分析不同植株中BYDV-RDRP基因的相對表達(dá)量；1-6:接種BYDV-GAV毒岈10天的樣品；1_3:實(shí)施TiNBLl基因沉默的冊642(BSMV-y:TiNBLl-HW642);4:接種空載體的HW642(BMSV-y:HW642);5:未實(shí)施BSMV的HW642;6:未實(shí)施BSMV的中8601;7-12:24天后；7_9:實(shí)施TiNBLl基因沉默的HW642(BSMV-y:TiNBLl-HW642);10:接種空載體的HW642(BMSV-y:HW642);11:未實(shí)施BSMV的HW642;12:未實(shí)施BSMV的中8601。圖8為實(shí)施例2(基因沉默進(jìn)行功能分析)中接種BYDV-GAV毒岈35天后，不同植株對BYDV-GAV反應(yīng)型。圖9為實(shí)施例3中部分轉(zhuǎn)化苗的PCR鑒定結(jié)果；N1:水；N2:中8601(陰性對照)；TI-T20:不同轉(zhuǎn)化苗;P:pA25-T濕Ll(陽性對照)。具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。中間偃麥草Z1146，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所資源種質(zhì)庫。小麥-中間偃麥草易位系YW642(HW642)(抗病小麥-中間偃麥草T7DS7DL-7XL易位系)張?jiān)銎G，馬有志，辛志勇等，1998，應(yīng)用基因組原位雜交技術(shù)鑒定抗黃矮病小麥新種質(zhì)，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，31(3):l-4;ZhangZ，XinZ，MaY，ChenX，XuQ，LinZ.1999，M即pingofaBYDVresistancegenefromThinopyrumintermedi咖inwheatbackgroundbymolecularmarkers.SciChinaCLifeSci.42(6):663-668.;該易位系是1991年中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所辛志勇等創(chuàng)制，張?jiān)銎G等1996年鑒定出來；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所。BSMV-y(BMSV病毒的y載體)Burch-SmithTM，AndersonJC，MartinGB，Dinesh—K咖arSP.Applicationsandadvantagesofvirus—inducedgenesilencingforgenefunctionstudiesinplants.ThePlantJournal,2004，39:734_746;中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所。大麥黃矮病病毒(BYDV-GAV株系)購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所。中8601(感病小麥)購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所。楊麥12(感病小麥)購自江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所。植物表達(dá)載體pAHC25:ChristensenandQuail，1996;Ubiquitinpromoter-basedvectorsforhigh-levelexpressionofselectableand/orscreenablemarkergenesinmonocotyledonousplants.TransgenicResearch,5，213-218.;中國農(nóng)業(yè)禾斗學(xué)院作物科學(xué)研究所?？共⌒澡b定采用小麥黃矮病嚴(yán)重度的國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)分級，即IT的標(biāo)準(zhǔn)，見表2，參考文獻(xiàn)"李光博，曾士邁，李振歧主編.小麥病蟲草鼠害綜合治理[M].北京中國農(nóng)業(yè)科技出版社，1990"。表2小麥黃矮病嚴(yán)重度分級標(biāo)準(zhǔn)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實(shí)施例1、TiNBLl基因的發(fā)現(xiàn)—、TiNBLl特異表達(dá)帶的發(fā)現(xiàn)利用cDNA-AFLP技術(shù)，從256對引物組合中篩選出l對引物，可以在抗黃矮病的中間偃麥草(Ti0)、小麥-中間偃麥草易位系HW642(RY)中擴(kuò)增出特異的表達(dá)帶，而感黃矮病的小麥輪回親本中8601(SY)中無此表達(dá)帶(圖1;0、12、48、72表示BYDV毒蚜誘導(dǎo)0小時(shí)、12小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí))。克隆、測序分析小麥_中間偃麥草易位系HW642中特異表達(dá)帶，發(fā)現(xiàn)此特異表達(dá)帶(292bp;抗病功能基因TiNBLl標(biāo)記片段)與水稻中1個(gè)NBS-LRR蛋白的LRR區(qū)段同源。特異表達(dá)帶的核苷酸序列為序列表的序列2自5'末端第2988至3279位核苷酸序列。二、TiNBLl編碼基因全長cDNA序列的獲得在特異表達(dá)帶(292bp)的基礎(chǔ)上，經(jīng)過一次3'-RACE(擴(kuò)增電泳圖見圖2)、五次5'RACE反應(yīng)(第一次5'RACE的擴(kuò)增電泳圖見圖3)、克隆、測序分析及拼接，獲得TiNBLl的全長cDNA序列(見序列表的序列2)。據(jù)全長cDNA序列設(shè)計(jì)一對引物，以HW642的cDNA為模板，進(jìn)行PCR(HW642的擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖見圖4)，回收目標(biāo)片段、克隆到pMD-T18(購自大連寶生物工程有限公司)載體上，測序分析。比對發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)增的cDNA序列與拼接的cDNA序列完全一致，TiNBLl全長cDNA序列為4105bp(見序列表的序列2)，開放閱讀框?yàn)?180bp，編碼由1059個(gè)氨基酸殘基組成的NBS-LRR類蛋白(見序列表的序列1)。將由序列1所示氨基酸殘基組成的蛋白命名為TiNBLl蛋白，將TiNBLl蛋白的編碼基因命名為TiNBLl基因。三、TiNBLl編碼基因的轉(zhuǎn)錄特點(diǎn)利用RT-PCR技術(shù)分析TiNBLl基因的轉(zhuǎn)錄特點(diǎn)。在抗黃矮病小麥易位系HW642(R)葉片中有TiNBLl基因的表達(dá)，在感黃矮病小麥親本中8601(S)葉片中沒有TiNBLl基因的表達(dá)(見圖5)。TiNBLl基因在抗黃矮病小麥易位系HW642葉片中組成型表達(dá)，SA、JA對TiNBLl基因轉(zhuǎn)錄的影響不大(圖6)，也說明TiNBLl基因位于這些激素信號的上游。實(shí)施例2、TiNBLl基因的抗黃矮病功能分析(病毒介導(dǎo)的基因沉默技術(shù))—、沉默HW642中的TiNBLl基因1、制備兩邊分別帶有Pad和Notl酶切位點(diǎn)的TiNBLl基因的特異表達(dá)帶(見序列表的序列3)。Pacl和Notl酶切后，將TiNBLl基因的特異表達(dá)帶(292bp)以反向插入法插入到BSMV-y(BMSV病毒的y載體)上的Pacl和Notl酶切位點(diǎn)之間，使TiNBLl基因被y載體的T7啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，得到重組載體BSMV-y:TiNBLl;2、用重組載體BSMV-y:TiNBLl轉(zhuǎn)化小麥_中間偃麥草易位系HW642的2葉期幼苗的葉片，具體步驟如下(1)采用摩擦法接種重組載體BSMV-y:TiNBLl(或BSMV-y)到第二片葉完全伸展的抗病品種HW642的第一、二片葉上。接種時(shí)，用未接種手固定小麥幼苗的基部，接種手的拇指和食指壓住葉片，沿著葉片伸展的方向，從葉底部連續(xù)摩擦到葉尖，一、二兩片葉子同時(shí)接種。(2)接種完成后，向小麥幼苗噴施DEPC水，保鮮膜覆蓋保濕24h，之后移去保鮮膜，每隔l-2h噴施一次DEPC水。(3)接種第5天取葉片，提取RNA，采用Q-RT-PCR檢測基因沉默情況(YZ-F:5，-CAATGTCCCTCGTGTCGT-3，，YZ-R:5'-CCAGCCGCAGCTCTTCTA-3，)。結(jié)果表明導(dǎo)入BSMV-y:TiNBLl的小麥_中間偃麥草易位系HW642(BSMV-y:TiNBLl-HW642)中，TiNBLl基因5天即被沉默，且沉默一直維持到收獲，得到實(shí)施TiNBLl基因沉默的HW642(BSMV-y:TiNBLl_HW642);導(dǎo)入BSMV-y的小麥-中間偃麥草易位系HW642(BMSV-y-HW642)中，TiNBLl基因的表達(dá)量沒有顯著變化。二、被沉默植株的抗病性鑒定接種重組載體BSMV-y:TiNBLl(或BSMV-y)后第7天，對步驟一制備的BSMV-y:TiNBLl-HW642、BMSV-y:HW642和HW642(Mockl)、中8601(Mock2)(每個(gè)植株設(shè)7-8個(gè)重復(fù))，接種黃矮病病毒(BYDV-GAV株系)。鑷取帶BYDV-GAV蚜蟲的病葉小片置于三葉期小麥植株葉腋間，在籠罩條件下強(qiáng)迫蚜蟲爬至小麥植株上取食，每株接種10-15頭蚜蟲，4-7d后藥劑殺滅毒蚜。接種BYDV-GAV毒蚜第10天和第24天，分別提取HW642(M0CK1)、中8601(M0CK2)、BMSV-y:HW642和BSMV-y:TiNBLl_HW642植株的RNA，進(jìn)行Q-RT-PCR分析，檢測BYDV-GAV的RdRp基因(大麥黃矮病病毒攜帶的基因)的表達(dá)量，以HW642中RdRp基因表達(dá)量為1，計(jì)算相對表達(dá)量。Q-RT-PCR所用的引物為RdRp-DF:5'-CTTTACAGAGGTCAAGAAGGTGG-3';RdRp-DR:5'-GATGGTGGCGAGAGACAGTT-3'。結(jié)果表明接種BYDV-GAV毒岈10、24天后，TiNBLl基因被沉默的HW642植株中BYDV-GAV相對濃度均遠(yuǎn)高于正常HW642(R)葉片，接近中8601葉片中BYDV-GAV相對濃度的2/3、3/4(圖7);轉(zhuǎn)空載體的HW642對照植株中BYDV-GAV相對濃度和正常HW642無顯著差別。接種BYDV-GAV毒蚜35天后，進(jìn)行抗病性鑒定。結(jié)果表明中8601葉片表現(xiàn)感病癥狀(IT7-8);TiNBLl基因沉默的HW642也顯示感病癥狀(IT5-6);而HW642高抗BYDV-GAV(IT0);轉(zhuǎn)空載體的HW642對照植株與正常HW642無顯著差別，無感病癥狀。部分植株照片見圖8。說明TiNBLl基因是抗黃矮病重要基因。實(shí)施例3、轉(zhuǎn)基因植物的獲得和抗病性鑒定—、重組表達(dá)載體pA25-TiNBLl的構(gòu)建pAHC25含有2個(gè)表達(dá)盒；第1個(gè)表達(dá)盒具有玉米Ubiquitin啟動(dòng)子、Exon、Intron、GUS、Nos終止子，GUS兩端具有Smal和Sacl酶切位點(diǎn)；第2個(gè)表達(dá)盒具有玉米Ubiquitin啟動(dòng)子、Exon、Intron、Bar、Nos終止子。以HW642的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增引物TiNBLl-TQSMAI:5'-CCCGGGATGAAAGCTGCCGAGTCTGCATCA-3，；引入Smal酶切位點(diǎn)；TiNBLl-TQSACI:5'-GAGCTCTCTCAACTCTGCCAATGTTGTGTCGTG-3';引入Sacl酶切位點(diǎn)。PCR反應(yīng)程序?yàn)橄?5。C預(yù)變性5min;然后95°C30s，56。Clmin，72。Clmin，35個(gè)循環(huán)；最后72°C，10min補(bǔ)平末端，獲得該基因全長0RF;回收擴(kuò)增產(chǎn)物，與用Smal和EcoRCRI酶切(EcoRCRI酶和Sacl酶具有相同的識別位點(diǎn))的pAHC25大片段連接，形成重組載體。經(jīng)過測序鑒定，重組載體中，含有TiNBLl基因的全長0RF(序列表的序列2自5'末端第538至3717位核苷酸)構(gòu)建到單子葉植物表達(dá)載體pAHC25的Smal和EcoRCRI位點(diǎn)之間，將該重組載體命名為pA25-TiNBLl。二、轉(zhuǎn)基因植物的獲得1、用基因槍法分別將pA25-TiNBLl轟擊到小麥品種中8601、楊麥12幼胚的愈傷組織(對于每個(gè)小麥品種，轟擊30槍，每槍40個(gè)愈傷組織，共計(jì)1200個(gè)愈傷組織塊)(基因槍法參見文獻(xiàn)徐惠君，Steinbiss，H.H.，Sohn，A.，等，云南大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，21:26-27)。2、轟擊后的愈傷組織在滲透壓培養(yǎng)基上后處理16h。將愈傷組織轉(zhuǎn)移到SD2(MS培養(yǎng)基的無機(jī)鹽成分中添加VB工lmg/L，天冬門酰胺150mg/L，2，4_D2mg/L)，26°C，暗培養(yǎng)，恢復(fù)培養(yǎng)2周。3、將恢復(fù)培養(yǎng)后的愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化篩選培養(yǎng)基中(1/2MS培養(yǎng)基附加NAAlmg/L、KTlmg/L、Bial即hos2-5mg/L)，24-26光照培養(yǎng)14d。4、將愈傷組織分化小苗后轉(zhuǎn)移到生長篩選培養(yǎng)基中(1/2MS培養(yǎng)基附加Bial即hos2-3mg/L)，24-26光照培養(yǎng)。5、經(jīng)過2-3次Bial即hos篩選的轉(zhuǎn)化小苗轉(zhuǎn)移到壯苗培養(yǎng)基(1/2MS培養(yǎng)基附加0.5mg/LNAA)上，將苗高7-8cm且根系發(fā)達(dá)的轉(zhuǎn)化苗移栽到花盆，在溫室生長發(fā)育。用植物表達(dá)載體pAHC25轉(zhuǎn)化中8601，方法同上，得到轉(zhuǎn)空載體對照植株甲；用植物表達(dá)載體pAHC25轉(zhuǎn)化楊麥12，方法同上，得到轉(zhuǎn)空載體對照植株乙。在三葉期，每株轉(zhuǎn)化苗取1個(gè)葉片提取基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定(NBL1-TF:5，-GCTCTGCCTTCATACGCTAT-3;NBL1-TR2:5，-GGTATTTACTAATGGCTTGTGC-3，)。結(jié)果表明，得到了轉(zhuǎn)TiNBLl基因中8601陽性植株51株，轉(zhuǎn)TiNBLl基因楊麥12陽性植株53株。PCR檢測轉(zhuǎn)TiNBLl基因中8601部分植株及其對照的電泳圖見圖9。對PCR鑒定陽性的51株轉(zhuǎn)TiNBLl基因中8601陽性植株、53株轉(zhuǎn)TiNBLl基因楊麥12陽性植株、HW642、中8601、楊麥12、轉(zhuǎn)空載體對照植株甲和轉(zhuǎn)空載體對照植株乙接種BYDV-GAV株系，進(jìn)行抗病性鑒定?？共⌒澡b定方法同實(shí)施例2的步驟二。每種植株設(shè)置三個(gè)重復(fù)。接種6周后開始進(jìn)行抗病鑒定。結(jié)果表明有26株過表達(dá)的轉(zhuǎn)TiNBLl基因小麥中8601對BYDV-GAV表現(xiàn)抗性(IT0-2);有20株過表達(dá)的轉(zhuǎn)TiNBLl基因小麥楊麥12對BYDV-GAV表現(xiàn)抗性(IT0-2);中8601葉片表現(xiàn)感病癥狀(IT7-8);楊麥12葉片表現(xiàn)感病癥狀(IT7_8);轉(zhuǎn)空載體對照植株甲表現(xiàn)感病癥狀(IT7-8);轉(zhuǎn)空載體對照植株乙表現(xiàn)感病癥狀(IT7-8);HW642高抗BYDV-GAV(IT0)。再次說明TiNBLl基因是1個(gè)抗黃矮病重要基因。序列表〈110〉中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所〈120〉一種植物黃矮病抗性相關(guān)蛋白及其編碼基因和應(yīng)用〈130>CGGNARY92666〈160>3〈210>1〈211>1059〈212>PRT〈213〉小麥-中間偃麥草易位系YW642〈400>1MetLysAlaAlaGluSerAlaSerTyrSerArglieSerAsnHisMet151015AsnSerSerlieAsnSerSerGinTrpSerAspVallieSerCysGly[O川]202530SerGlyAsnLysSerSerlieAlaGluGluValGluGluLysLeuHis354045GinlieArgAspArgGinLysLysLysArgGluArgSerValGluGin505560ProSerValLeuSerPhePheProGluLysGluValGluLysProTyr65707580GlulieGluTyrArgAsnLysLyslieLysTyrLeuGluGluArgVal859095HisLysProLeuValAsnThrArgTyrValArgLysAspGlyAlaSer100105110ThrProLeuLysHisArgThrGinSerAlaAsnLeuValThrGlyAla115120125PheSerSerLeuLeuProLyslieLeuGluLeuLeuAsnAspLysTyr130135140AspLeuArgMetAsplieLysLysAsnlieGluSerLeuTyrLysGlu145150155160LeuGluGlyMetGinAlaValLeuHisAspLeuAlaArgArgGluGin165170175AlaGinLeuAspAlaValValMetlieTrpAlaLysGluValArgAsp180185190LeuSerTyrAsnValGluAspMetlieAspSerLeuThrGlyGluGlu195200205lieArgGlyLeuSerGluLysThrProPhePhePheLeuValAsnAsp210215220ThrAspPhelieTyrGluAsnArgGluLysVallieAsnGlulieArg225230235240GluLysValLysGlyValAlaSerArgArgGluLysTyrLysValAsp245250255AspArglieValAlaAlaTyrProLysAlaThrAspAsnValAspPro260265270ProLeuLeuAspLeuPheGinGluSerGluGluVallieGlylieGlu275280285AlaGinValGluGluVallieArgGinLeuLysGlyHisAspTrpAsp290295300AsnAsnAsnAsnLysLeuLyslieValSerlieValGlyMetAlaGly305310315320SerGlyLysThrThrLeuAlaLysAlalieAlaLysAlaValProLys325330335GluValLeuHisAspThrValPheValSerValSerGinAspProAsn340345350MetLysArgValLeuMetAsplieLeuLeuGinlieAspGluArgGlu355360365TyrArgSerLeuThrGlySerThrPheAspAlaLysLeuLeulieAsn370375380lielieArgArgVallieGlySerLysGlyTyrPhelieVallieAsp385390395400AsplieTrpAspValLysSerTrpLysPhelieLysAspAlaLeuAsp405410415ThrArgCysGlySerArgValVallieThrThrArgLeuLeuGluVal420425430AlaValAsnAlaGlyAspValTyrLysLeuLysAlaLeuSerHisSer435440445HisSerGlyGluLeuPheAsnThrArgLeuPheGlyGlyLysAspAsn450455460ValProArgValValProGluValProGluLysLeuLeuGinLysCys465470475■GlyGlyValProLeuAlalielieThrMetAlaSerLeuPheAlaArg485490495LysProArgAsnTyrCysSerLysValHisThrAsnValSerPheGly500505510SerAlaValGlyGlyAsnArgAspValAspGluThrArgArglieLeu515520525LeuSerSerTyrTyrAsnLeuProTyrHisLeuArgAlaCysLeuLeu530535540HisLeuGinValPheProGluAspTyrLeulieThrGluGluThrLeu545550555560lieTrpLysTrpAlaAlaGluGlyLeulieValGluGluProGlyArg565570575GlyLeuPheGlulieGlyAspGlyTyrPheLysGluLeulieAspSer580585590SerValValMetProValGluAspAspSerAspTyrGlyThrlieVal595600605GlyCysArgValHisTyrLeuValPheAspMetlieCysSerLeuSer610615620AlalieGluAsnPheValThrlieGluAspGlySerSerGinTyrSer625630635640LeulieGluSerLysGinAlaArgArgLeuGlylieGinLysTrpThr645650655說明書12/15頁0190]ThrGluAsnGlyAspProLeuAlaAsnlieGlySerArgSerLeuArg0191]6606656700192]SerPheAsnThrThrGlyCysArgPheSerValGluLeuSerLeuSer0193]6756806850194]ArgPheLysLeuLeuArgVallieAlalieGluGluCysThrLeuLeu0195]6906957000196]AspGlyAspLeuSerProLeuGlyLysLeulieLeuLeuArgTyrLeu0197]7057107157200198]GlyLeuTyrHisThrLeulieLysLysLeuProGluAsplieGlyGlu0199]7257307350200]LeulieTyrLeuGinThrLeuAspLeuArgGlyThrArgValHisGly0201]7407457500202]LeuProTrpGluValThrGinlieSerGinLeuLysCysLeuArgAla0203]7557607650204]AspGlyAspThrAlaMetProTyrGlyMetGlyLysLeuThrSerLeu0205]7707757800206]GluGluLeuArgLeuGlyAlalieAspThrSerAlaAspPheValAsp0207]785790795■0208]GlyLeuGlyArgLeuThrGluLeuArgGluLeuGlulieArglieAsn0209]8058108150210]GinLeuAspValAsnGluAlaGlyAlaLeuValGinSerLeuLysLys0211]8208258300212]LeuGluLyslieGinValLeuArgLeuValGlyPheProTrpProPro0213]8358408450214]SerArgValAspGluLeuAsnTrpGlyAsnPheAspProProGinGin0215]8508558600216]LeuArgGluLeuHisLeuSerlieProSerThrArgProProAlaTrp0217]8658708758800218]ValHisValSerArgValProMetLeuSerHisLeuValValSerLeu0219]8858908950220]LysSerLysGluAspGinAspLeuAsplieLeuGlyAlaLeuProGlu0221]■9059100222]LeuSerSerLeuGinLeuValLeuProSerLysValValLeuSerlie0223]9159209250224]ThrGlyArgSerGlyAlaPheProArgLeuArgTyrPheArgThrSer0225]9309359400226]ValProAlaLysPheLeuArgGlyAlaMetProThrLeuGluPheLeu0227]9459509559600228]HisPheAspAlaAsnPheAspPheAspProAspPheAlaAlaSerThr14965970975LeuGlyAsnLeuProSerLeuGinLysValGluValGlu:lieThrSer980985990AsnAlaLeuSerPheGluSerMetAsnGluValMetLysArgAlaVal99510001005AspGinHisArgAsnHisProSerLeuArgVallieLysValAsp101010151020HisValHisAlaGlyPheLeuGluGinPheLysTrpProAlaThr102510301035ArgHislieAlaVallieLeuGlyGlySerSerSerArgValThr104010451050ThrGinHisTrpGinSer1055〈210>2〈211>4105〈212>DNA〈213〉小麥-中間偃麥草易位系YW642〈400>2gggcttetteggccacgctggc皿3gatgttcagcgategtggtegc郷ttccagttca60gacgtgte朋cgacggccagtgcagctgcatgctgcagtcgacgatggcaggttcgacte120tecgcgggag￡iggggg￡icg￡itcaccattctgagatgcatcgggggtragc180actcacgtectcagttcatgtgcgctgaaccatgcctgtttttgtecaaggagc皿tgcc240C3g3gtCC朋朋gctcgtgategggttc皿tgg皿3CC3Catecctttgg300aactgctggcttctgtcactteacaggccttecagaggtctctgteaaacttggggcctg360gggtectgatg朋ttgg3C3tteacgatgccgagtcte皿ttggtgaccgcagttegc皿420tcacacgaattctccteteaattcgtegatatgatttcct3tggtgtgga■tgateagagaactgcgactgtggggggggggtgttgateaattcggcatg540a朋gctgccgagtctgcatcatectctcgcateagc皿tcacatgaactc600agttcacaatggtctgatgtgatttcttgtggragtgggaateagagtegcategctg皿660g朋gtgg郷朋朋gctecaccagattcgag3CCg3C3g3皿皿g皿gaggg^agatcg720gtggaacagccatctgttctatctttttttgccatetg皿780attgaatetcgatca^tetttgg郷雄gcgtgcac皿gccattegte840朋teccagat3tgtgag朋3卿tggtgcttccactcctctg皿gcatcg■gccaaccttgtgacgggtgcctttegctccctcctcccca3gatcctggagctcctcaat960gac朋gtecgatctgcggatggacate^aagtccctctec皿ggagctg1020gagggtetgcaagctgtcctccatgacttggcg郷郷g皿C3ggCtC3actggatgct1080gtggtcatgatctgggccaagg皿gteagagacctctcgtateatgtggaggatetgatc1140gattcctteaC3gggg3卿gateagaggcttgtccgagaagaccccgttcttcttcctc1200gtg朋Cg3C3ctgacttcatctetgag皿ctcatcaatgag3tC3ggg皿1260朋ggtca朋ggtgtggccagccgacgtgag皿gtec皿ggttgatgaccggattgttgct1320gcttetccaa皿gCC3C3g3teacgttgatcctcccctgttggatctgttcc皿gagtcg1380g朋g朋gttettggcatcgaagctc皿gtgg皿gaggtgateaggcagctg皿3gg3C3C1440g3ttggg織c皿gctg皿gategtctcc3tegttgg皿tggc郷atcg1500ggc朋gac朋ctcttgcgaaagcaattgccgcttcatgat1560acggttttcgtttccgtetctcaggatcccgagttctcatggacatcctc1620cttcaaattg3Cg3gCggg3gt織ggagtctcactggatcaacgttcgatgc朋agctg1680teatccggag賜t皿ttgggag咖ggggtacttcattgttettgatgat1740atetgggatgtg皿gtcatg皿ggatgctttegatectcgatgtgg皿gt18003g3gtegtcagcttttggaagttgctgtca3tgctggtgatgtttecaag1860cte皿3gcactttctcattcgcactctggagaattgttteatec皿gattatttggtggc1920tccctcgtgtcgtgccggaggtecctga皿agcttttecag腿tgtggt1980ggtgteccattagctetcatcacaatggctagtttgtttgCg3gg皿3CC2040tgctcteaggtgcacaccaatgttegttttgggtctgcagtegagatgtc2100gg郷atectattgtctegctgccttetca2160tgtttettgcatctgcaggtttttccggaggactettteateacgg皿gaaactttgatc2220tgg皿gtgggC3gCCg皿ggttteattgttg3gg朋CC3gga卿gggttatttgagatt2280gg卿tggatactcatagatagragcgtggtcatgccagt2340tcagattatgggac皿ttgttggttgccgtgtccattecttggtttttgatetgatctgt2400tccttetcagttttgtteccat卿ggatgg皿gC3gtC3atectctctt24603gcaggctcgc郷tteggtgg3CC3Cgg3g皿cggcgac2520cctctggcteacattggctcg卿agtctgaggtcattteateccacggggtgtcgtttt2580tatcactttc朋ggttteagctcttgcgtgtcattgctetcg皿g皿tgc2640acattgcttgatggcgatctttctcctctgggg皿gtt皿ttttgttgaggtecctcgga2700ctatetcacacacttetcaag皿gcteccggtgagcteatttetttgcag2760acactggacctg郷gggaccagggtccatggattgccctggg朋gttec2820cagctcaagtgcctgcgagctgatgg卿c3C3gC皿tgCcttecgggatggg朋皿ctt2880acatcctteg朋gagctgcggctgggcgcgattgacacgtcggcagactttgtggatggg2940ttgggc卿cg郷g賜ctcg卿ttcggatteaccagttggatgtg皿c3000g郷cgggagctttggtgcagtctctgaaa3皿cteg3gacctaagactt3060gtgggatttccttggccaccatctcgtgttg3Cg3gCtC33Ctgggg皿3ctttgatccg3120cctc皿c皿ctccgtgagttgcatctaagcatcccatccactcggccgccggcgtgggtt3180cacgtctcccgtgttccaatgctctcacacttegttgtgagcctcaagtcc皿ggaggat3240C郷3tttggatettcttggtgctttgccagagctcagtegtctgcagctggtgctgccg3300tcg腿gtggtcctcagcatcactggtcgttccggtgcattcccgaggttgaggtecttt3360cgcacgtctgteccagccaagtttcteagaggcgctetgcccacactggaattccttcac3420tttgatgccaattttgactttgatcctgactttgctgcatcaacgttggggaacctgcct3480tcacttcaga皿gtgg皿gtgg皿3teac3tcc皿tgctctctcctttgagtcgatgaat3540g郷tgatgaagcgtgragtgg3CC皿C3tcgaaaccatcccagccttcgtgtcatcaaa3600gtegatcatgtgcatgcagggtttttegaacaattcaagtggcccgccacccggcacate3660gcggtgatcctggg3ggC3gctcatcacgagtC3Cg3C3C朋C3ttggC3g3gttg3C3C3720gg3C3tg朋3ccatggccaaagttgcgcccCg3ggCtggC腿g3tggg3gCCg3CggCg3780caatccaagctcacagccgctgcgcgcgatcgccaccatgatgctteccagctcgtcccg3840CCCg朋gg3CatcateactcCgg皿g皿C3ccgg朋ttetgatgtctccc3cagggtg朋3900ggCg朋gC3gaccccggaatttcaaattcaaagtcacctcgteteccgatggatttggcg3960atttggtgtgttttgctectcatttgtgaatgggtgatcttetetggagg4020atgcgtgcgctgcactcaaacttgtctcagactttgactcgtegteacatgctegtgctg4080acgtgate朋4105〈210>3〈211>308〈212>DNA〈213〉小麥--中間偃麥草易位系YW642〈400>3tteatteagttggatgtg皿Cg3ggCggg3gctttggtgcagtctctg朋朋朋ctegag60朋朋tcc朋gtccteagacttgtgggatttccttggccaccatctcgtgttgacgagctc120朋ctgggg朋actttgatccgcctcaacaactccgtgagttgcatcteagcatcccatcc180actcggctgccggcgtgggttcacgtctcccgtgttccaatgctctcacacttegttgte240agcctcaagtcteaggagg3tcaggatttggatettcttggtgctttgccagagctcagt300gcggccgc3081權(quán)利要求一種蛋白質(zhì)，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物黃矮病抗性相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。2.編碼權(quán)利要求l所述蛋白的基因。3.如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下1)或2)或3)或4)的DNA分子1)其編碼序列是序列表中序列2自5'端第538至3717位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼植物黃矮病抗性相關(guān)蛋白的DNA分子；4)與l)或2)或3)限定的DNA序列具有90X以上同源性，且編碼植物黃矮病抗性相關(guān)蛋白的DNA分子。4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。5.如權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體是將權(quán)利要求2或3所述基因插入pAHC25載體的多克隆位點(diǎn)得到的。6.擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述基因的全長及其任意片段的引物對。7.—種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將權(quán)利要求2或3所述基因?qū)肽康闹参镏?，得到黃矮病抗性高于目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于權(quán)利要求2或3所述基因通過權(quán)利要求4或5所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入目的植物中；所述目的植物為小麥。9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述目的植物為小麥品種中8601或小麥品種楊麥12。10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述黃矮病是由黃矮病病毒BYDV-GAV株系引發(fā)的。全文摘要本發(fā)明公開了一種植物黃矮病抗性相關(guān)蛋白及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物黃矮病抗性相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還公開了所述蛋白的編碼基因，以及含有該基因的重組表達(dá)載體。轉(zhuǎn)入所述編碼基因后，感病小麥的抗病性大大提高。本研究為開展小麥抗黃矮病作用的分子機(jī)制研究和分子育種，高效地培育抗黃矮病、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的小麥新品種奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。文檔編號C07K14/415GK101704882SQ20091023736公開日2010年5月12日申請日期2009年11月16日優(yōu)先權(quán)日2009年11月16日發(fā)明者張?jiān)銎G,徐惠君,李寧,杜麗璞,趙丹,辛志勇,黃茜申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所