專利名稱：高質(zhì)量提取酸性土壤基因組dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及針對(duì)酸性土壤樣品進(jìn)行一定的處理以 提取得到高質(zhì)量土壤微生物基因組DNA。
背景技術(shù)：
不依賴培養(yǎng)的分子生態(tài)學(xué)技術(shù)逐漸成為解析和認(rèn)識(shí)土壤微生物的多樣性以及原 位條件下的生理特征的有力手段。目前分子生態(tài)學(xué)已經(jīng)涉足多個(gè)研究領(lǐng)域，對(duì)原位條件下 研究環(huán)境微生物群落多樣性和生態(tài)生理功能提供了大量的有價(jià)值的信息。分子生態(tài)學(xué)的基 礎(chǔ)依賴于高質(zhì)量的DNA模板。目前提取土壤微生物基因組DNA的方法很多，主要包括商品 化的試劑盒方法(例如FastDNA 等)以及文獻(xiàn)中的方法(例如周氏方法等)等。酸性土壤 中含有腐殖酸物質(zhì)、重金屬等，這些物質(zhì)的存在會(huì)強(qiáng)烈抑制PCR擴(kuò)增，影響內(nèi)切酶消化等、 以及一些下游分析相應(yīng)的分子生物學(xué)操作。針對(duì)酸性土壤樣品，上述提到的提取土壤基因 組DNA的方法存在一些不足，要么提到的土壤基因組DNA的量不大，要么提取的土壤基因組 DNA中含有大量抑制PCR擴(kuò)增等的重金屬離子等污染物，使得PCR擴(kuò)增難以成功。這些不利 因素嚴(yán)重影響到對(duì)土壤微生物的生態(tài)多樣性、種群結(jié)構(gòu)分布等的正確認(rèn)識(shí)。因而有必要改 進(jìn)現(xiàn)有的土壤微生物基因組的提取方法，以解決在提取酸性土壤時(shí)出現(xiàn)的一些問(wèn)題，得到 適用于下游分析的高質(zhì)量土壤微生物基因組DNA。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在通過(guò)預(yù)處理技術(shù)，預(yù)先去除酸性土壤中的腐殖酸物質(zhì)、重金屬等干擾 物，提取并獲得高質(zhì)量的土壤微生物基因組DNA，為更好的開展土壤微生物分子生態(tài)學(xué)研究 提供方便。本發(fā)明所述的高質(zhì)量提取酸性土壤基因組DNA的方法如下(1)樣品的處理待提取基因組DNA的酸性土壤樣品與1 2倍體積的0. 1 0. 3%的無(wú)菌焦磷酸鈉溶液混勻，室溫溫育10 30min，間歇搖勻。(2)樣品的收集處理過(guò)的樣品，8000 12000Xg離心10 20min，收集沉淀物。(3)收集的土壤沉淀物作為提取基因組DNA的材料。提取的方法選用任意一種，包 括商品化的試劑盒方法、周氏方法以及由周氏方法衍生的提取方法。本發(fā)明依據(jù)物理化學(xué)以原理利用焦磷酸鈉處理樣品以除去酸性土壤中的腐殖酸， 置換土壤中含有的重金屬離子，處理后再提取土壤基因組DNA。本發(fā)明的酸性土壤的處理技 術(shù)簡(jiǎn)單可行，成本低廉，提取的基因組DNA質(zhì)量高，可以直接應(yīng)用于下游分析。


圖1提取獲得的土壤基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳照片其中1，土壤樣品經(jīng)過(guò)焦磷酸鈉處理；2，土壤樣品不經(jīng)處理。Marker是分子量標(biāo) 記，購(gòu)自寶生物公司，數(shù)字表示DNA的大小，單位是bp。
具體實(shí)施例方式以下將將結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，目的在于幫助讀者更好的理 解本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)，但不作為對(duì)本發(fā)明實(shí)施范圍的限定。實(shí)施例選取中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所桃源站為研究地點(diǎn)，采集5 15cm的稻田 土壤樣品為研究對(duì)象，土壤的理化等性質(zhì)測(cè)定結(jié)果(PH為4. 96，總有機(jī)碳含量2. 37%)。稱 取5g 土壤樣品，置于50ml離心管中，加入5ml焦磷酸鈉溶液(0. 1% )，顛倒數(shù)次混勻后，置 于室溫條件下20min，間隔IOmin輕柔顛倒混勻。然后在10000 X g室溫條件下離心lOmin， 稱取0. 5g沉淀物采用FastDNA 試劑盒抽提土壤基因組DNA，提取方法參照生產(chǎn)商隨同試劑 盒提供的方案。對(duì)照實(shí)驗(yàn)，直接稱取0. 5g未經(jīng)任何處理的土壤樣品，采用FastDNA 試劑盒 抽提土壤基因組DNA。圖1說(shuō)明兩種方法提取的土壤微生物基因組DNA大約在231Λ的位 置，但焦磷酸鈉處理過(guò)的土壤樣品，提取得到的DNA相對(duì)更完整。焦磷酸鈉處理后DNA的產(chǎn) 量(54. 2 μ g DNA/g 土)高于未經(jīng)過(guò)處理的土壤樣品(34. 2 μ g DNA/g 土)。選擇細(xì)菌16S rDNAV3 區(qū)的通用引物;357f-GC(5' -CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGCGGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3‘)禾口518r(5' -ATT ACCGCG GCT GCT GG-3')作為PCR擴(kuò)增的引物。PCR擴(kuò)增體系選用ExTaq體系(寶生物公司)。擴(kuò) 增條件為95°C預(yù)變性5min ；95°C變性30sec，55°C退火45sec，72°C延伸45sec，30個(gè)循環(huán)； 72°C延伸IOmin ；4°C保持。采用伯樂公司的Dcode系統(tǒng)進(jìn)行變性梯度凝膠電泳，變性梯度 為40 60%，60v電壓，電泳時(shí)間17h。借助Quantity one軟件分析DGGE凝膠圖譜，并計(jì) 算香農(nóng)指數(shù)。 H、J； (A)(lnA) 上式為香農(nóng)指數(shù)的計(jì)算公式，其中Pi值是每條DNA條帶亮度密度與每個(gè)電泳泳道 中包含總的s個(gè)DNA條帶亮度密度總和的比值；Inpi是Pi的自然對(duì)數(shù)。香農(nóng)指數(shù)的計(jì)算結(jié) 果表明焦磷酸鈉處理(香農(nóng)指數(shù)3. 1)大于不經(jīng)處理(香農(nóng)指數(shù)2. 9)，說(shuō)明焦磷酸鈉處理后 的土壤樣品提取得到的DNA含有的微生物多樣性信息量大。
權(quán)利要求
1.高質(zhì)量提取酸性土壤基因組DNA的方法，其特征在于，提取獲得高質(zhì)量土壤基因組 DNA的步驟包括土壤樣品的處理、土壤樣品基因組DNA提取。
2.權(quán)利要求1中所述的高質(zhì)量提取酸性土壤基因組DNA的方法，其特征在于，土壤樣品 的處理是1 IOg 土壤與1 2倍體積的0. 1 0. 3%的無(wú)菌焦磷酸鈉溶液混勻，室溫溫育 10 30min，間歇搖勻。
3.權(quán)利要求1中所述的高質(zhì)量提取酸性土壤基因組DNA的方法，其特征在于，離心收集 處理過(guò)的樣品，提取基因組DNA。提取的方法選用任意一種，包括商品化的試劑盒方法、周 氏方法以及由周氏方法衍生的提取方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及預(yù)先處理酸性土壤樣品再提取獲得高質(zhì)量土壤基因組DNA。本發(fā)明用焦磷酸鈉溶液處理待提取基因組DNA的土壤樣品，提取的DNA濃度高，完整性好，可以直接用于PCR擴(kuò)增。香農(nóng)指數(shù)解析DGGE凝膠圖譜表明擴(kuò)增產(chǎn)物的多樣性大可以有效的反應(yīng)土壤微生物群落的微生物多樣性。本發(fā)明的處理技術(shù)簡(jiǎn)單可行，成本低廉，提取的基因組DNA質(zhì)量高，涵蓋酸性土壤微生物種群的大量信息。
文檔編號(hào)C07H21/04GK102080077SQ200910237938
公開日2011年6月1日 申請(qǐng)日期2009年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月26日
發(fā)明者呂迪, 莊國(guó)強(qiáng), 馬安周 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心