專利名稱：：花生健康組織和病組織簡(jiǎn)便快速dna提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物組織的DNA提取范疇，具體涉及花生健康組織和病組織簡(jiǎn)便快速DNA提取方法。
背景技術(shù)：
：現(xiàn)有技術(shù)中，普遍采用黃化苗葉片、整?；虬肓７N子為起始材料、液氮研磨提取花生組織的DNA，其至少包括10個(gè)步驟，多耗時(shí)2h以上(Kochertetal.1991；Choietal.1999；Burrowetal.2001；王傳堂等·2002；陳靜等·2008)。在處理大量樣品時(shí)，即使利用球磨儀也是十分不便的，不能滿足分子標(biāo)記輔助育種、圖譜構(gòu)建和轉(zhuǎn)化體篩選等高通量研究的要求。如果不是直接用于酶切和Southern雜交，DNA提取步驟可以大大簡(jiǎn)化。PCR技術(shù)已成為現(xiàn)代分子生物學(xué)研究不可或缺的重要手段。為便于試驗(yàn)的整年進(jìn)行，建立一套利用不同起始材料快速提取花生DNA用于PCR的技術(shù)流程是極為必要的。在花生生長(zhǎng)季節(jié)直接從室外生長(zhǎng)的植株上取樣，可以省去發(fā)芽、暗培養(yǎng)的麻煩；利用種子胚芽直接提取DNA，可以滿足基因克隆、種子檢驗(yàn)、遺傳多樣性分析之需；在轉(zhuǎn)基因和分子標(biāo)記輔助育種等研究中，如果以種子為起始材料提取DNA，在北方花生產(chǎn)區(qū)無(wú)溫室可用的情況下，可至少提早半年時(shí)間進(jìn)行，從而節(jié)省人力和土地資源，但這樣的DNA提取方法對(duì)種子必須是非破壞性的。迄今利用花生種子提取DNA的報(bào)導(dǎo)較少，耗時(shí)較長(zhǎng)。Chenault等(2007)研究建立了一種非破壞性花生子仁DNA提取方法，需要20mg花生樣品即可制備PCR模板，有20個(gè)步驟，需要2.5h。胡曉輝等(2009)改進(jìn)了Kang(1998)等的方法，通過(guò)10個(gè)步驟，耗時(shí)1.5h從半片花生子葉中提取花生DNA，經(jīng)試驗(yàn)此法影響種子萌發(fā)。與其他植物病害上所采用的傳統(tǒng)研究方法類似，花生真菌病害的研究一般采用分離培養(yǎng)病原菌的辦法進(jìn)行。從病組織中直接提取DNA，可用于已知病原或未知病原的分子鑒定，推斷其分類地位，為分離培養(yǎng)病原提供參考。
發(fā)明內(nèi)容本申請(qǐng)的發(fā)明目的是彌補(bǔ)現(xiàn)行DNA提取方法的不足，提供一種花生健康組織和病組織簡(jiǎn)便快速DNA提取方法。該方法對(duì)于花生健康組織及花生病組織同樣適用。本申請(qǐng)的DNA提取方法是一套成熟的技術(shù)體系，以田間生長(zhǎng)的花生葉片、莖組織、成熟的果殼組織、種子胚芽、子葉為起始材料均可進(jìn)行DNA提取，不受花生生長(zhǎng)期的限制，隨時(shí)都可以進(jìn)行DNA提取，快速有效的可加速研究進(jìn)程。本發(fā)明通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)研究一種花生健康組織和病組織簡(jiǎn)便快速DNA提取方法，包括準(zhǔn)備樣本材料和制備DNA提取液步驟，其特征是所述的準(zhǔn)備樣本材料，是指試驗(yàn)取的樣本材料是重量在3IOmg的葉片、莖組織、果殼組織或花生子葉；樣本材料加入預(yù)置有堿裂解液或酶解液的離心管，以研磨棒研磨至無(wú)可視顆粒物，備用；所述的制備DNA提取液，是指使用堿煮法或酶解法對(duì)上述研磨好的樣本材料進(jìn)行處理，獲得樣本的DNA提取液，其中所述的堿煮法，是每個(gè)樣品在2060μ1的堿裂解液中研磨后，沸水煮1040sec，加入4倍體積的Tris-HCl，煮沸12min后，IOOOOrpm離心5lOmin，取上清液，加入等體積TE緩沖液即為DNA提取液；所述的酶解法，是樣品在100200μ1酶解液中研磨后，置5558°C水浴20min，加入同體積的體積比為25241的苯酚氯仿異戊醇，IOOOOrpm離心5min，上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中，加入同體積異丙醇，IOOOOrpm離心25min，棄上清液，沉淀于室溫晾干，加入100150μ1TE緩沖液即為DNA提取液。上述的花生組織的DNA提取方法，其特征是所述的堿裂解液是0.10.5ΜNaOH溶液。上述的花生組織的DNA提取方法，其特征是所述的Tris-HCl緩沖液含58mg/mlPVP40。上述的花生組織的DNA提取方法，其特征是所述的酶解液是含IOmMTris-HCl,5mMEDTA、58mg/mlPVP40、50100μg/ml蛋白酶K的溶液。上述的花生組織的DNA提取方法，其特征是所述的TE緩沖液是20ml0.IMTris-HCI和0.4ml5mMEDTA定容200ml配制而成。上述的花生組織的DNA提取方法的應(yīng)用，其特征是該方法對(duì)于花生健康組織及花生病組織同樣適用。兩種方法所得到的DNA提取液，以15μ1反應(yīng)體系加入2μ1模板計(jì)算足夠50次PCR反應(yīng)使用。本發(fā)明的取樣方法獨(dú)特，在以葉片為起始材料取樣時(shí)只需以相應(yīng)內(nèi)徑的管狀物(例如，普通中性筆筆芯的后端)按壓葉片，使其與周圍葉片組織分離即得到直徑約1.12mm的葉盤；在以子葉為起始材料時(shí)則以普通剃須刀刀片為工具，固定住花生，在遠(yuǎn)離胚的一端切下重約5mg大小一片即可。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)與現(xiàn)有DNA提取方法相比，本發(fā)明耗時(shí)短，樣品用量少，費(fèi)用低，可以滿足花生分子標(biāo)記輔助育種和轉(zhuǎn)基因育種的要求。堿煮法單個(gè)樣品用時(shí)不超過(guò)20min，酶解法單個(gè)樣品不超過(guò)0.5h，而以往的方法至少需要1.5h且研磨時(shí)須用液氮。本發(fā)明DNA提取每個(gè)樣品僅需3IOmg即可；無(wú)需液氮研磨，對(duì)植株生長(zhǎng)或種子萌發(fā)沒(méi)有影響，對(duì)于花生分子育種技術(shù)實(shí)用化，具有重要意義。本發(fā)明不但可用于花生健康組織的DNA提取，而且適用于花生病組織的DNA提取。圖1是以花生葉片提取的DNA為模板用引物rDNAa/rDNAb擴(kuò)增出的花生ITS電泳圖；圖2是野生種A.duranensisITS測(cè)序圖。圖3是以花生胚芽提取的DNA為模板采用引物TBPfexl/TBPrexl獲得的PCR產(chǎn)物電泳圖4是以花生病組織提取的DNA為模板擴(kuò)增出的瘡痂病原18srDNA電泳圖；圖5是以花生果腐病受害果殼提取的DNA為模板，用引物ITS1/ITS4作PCR擴(kuò)增獲得的產(chǎn)物電泳圖；圖6是引物對(duì)IT-ISJ29R/IT-ISJ3F擴(kuò)增產(chǎn)物6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜。圖7是以花生子葉提取的DNA為模板，用引物FL1/FR1擴(kuò)增獲得的花生FAD2基因電泳圖；圖8是以花生子葉提取的DNA為模板用引物rDNAa/rDNAb擴(kuò)增出的花生ITS電泳圖；圖9中1-8是以待檢測(cè)的花生材料子葉提取的DNA為模板用EGFP引物EGPF-Fl/EGPF-Rl作PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖(P為陰性對(duì)照)。具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步闡述。圖1中，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，1為栽培種與野生種雜交后代，2為化學(xué)突變體。圖3中，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，1、2、3為不同的栽培品種，4為A.rigonii雜種后代，5為A.glabrata的雜種后代。圖4中，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，L為從病葉制備DNA擴(kuò)增出的18srDNA,S為莖部病斑制備DNA擴(kuò)增出的18SrDNA。圖5中，M為TakaraDL2000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，13為3個(gè)不同的果腐病莢果。圖6中，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，120分別為B4、Valencia101、08-29、08-30、08_31、花育16、08測(cè)-A2、A6、A7、A8、A10,A30、獅頭企、伏花生、常青一叢生、沂北一窩猴、汶上爬蔓生、三莢公、睢寧二窩、興城紅崖伏大。圖7中，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，17分別為泉花646、泉花10、粵油256、JYHUCTffE,FB4、遠(yuǎn)雜9307的PCR產(chǎn)物。圖8中，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，17分別為泉花646、泉花10、粵油256、JYHUCTffE,FB4、遠(yuǎn)雜9307的PCR產(chǎn)物。圖9中，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，18分別為通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得的待檢測(cè)種子8粒。實(shí)施例一從花生葉片中提取DNA一、試驗(yàn)材料及試劑材料本試驗(yàn)采用3個(gè)基因型，包括野生種(Arachis.duranensis)、1個(gè)栽培種與野生種A.glabrata的雜交后代，1個(gè)化學(xué)突變體材料。試劑堿裂解液，含58mg/mlPVP40的Tris-HCl緩沖液。二、試驗(yàn)方法1.模板制備A、在花生植株上選取一片小葉，用中性筆芯在主脈一側(cè)打孔，獲取直徑約1.12mm葉盤。當(dāng)花生材料比較珍貴或花生生長(zhǎng)早期葉片數(shù)目較少時(shí)為盡量減少對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育的影響，可直接在植株上打孔取樣。B、將葉盤置于加有60μ1堿裂解液的1.5ml離心管中(可冷凍保存?zhèn)溆?，用研磨棒研磨無(wú)肉眼可見的顆粒。C、煮沸30sec，加入4倍體積Tris-HCl緩沖液。D、煮沸2min，12000rpm離心5min。Ε、取上清液，加入等體積的TE緩沖液即為DNA提取液。2.PCRPCR體系12·5μ12XTiangenTaqPCRMasterMix、10μM引物弓丨物序列由我們?cè)诰W(wǎng)上找到已經(jīng)公開的特異性引物，然后由GenSCript(金思特)公司合成的，一般是一管20D。(rDNAaGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG/rDNAbCCTCCTCCGCTTATTGATATGC)各0.5μ1、2μIDNA模版，9.5μ1無(wú)菌去離子水。PCR條件94°C預(yù)變性3min，94°C50sec，55°Clmin，72°C1.5min，35個(gè)循環(huán)，72°C延伸7min。3.PCR產(chǎn)物回收純化、測(cè)序PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，100V，30min，電泳圖片顯示得到目的片段，進(jìn)一步將PCR產(chǎn)物回收(Tiangen，普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒)，按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作?；厥蘸蟮哪康钠芜B接于PBS-T載體，轉(zhuǎn)化(Tiangen，pBS-T克隆試劑盒)，按照克隆試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，挑取白色陽(yáng)性單菌落接種于Iml含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C倒置培養(yǎng)過(guò)夜，送Genscript公司測(cè)序。三、結(jié)果電泳圖片(說(shuō)明書附1)顯示目的DNA片段清晰，在另一項(xiàng)研究中顯示即使蠟質(zhì)層很厚的野生種花生也適用此方法提取DNA，其測(cè)序結(jié)果良好(說(shuō)明書附2)，3個(gè)材料均得到了目的片段，證實(shí)此方法簡(jiǎn)單可靠，適用于不同類型花生栽培種材料葉片DNA的提取，且不需刻意選擇幼嫩葉片。實(shí)施例二從花生胚芽中提取DNA一、試驗(yàn)材料及試劑材料本實(shí)驗(yàn)采用5個(gè)基因型材料，包括1個(gè)栽培種與野生種A.rigonii的雜種后代，1個(gè)化學(xué)突變體，3個(gè)花生栽培品種。試劑堿裂解液，含58mg/mlPVP40的Tris-HCl緩沖液。二、試驗(yàn)方法1.模板制備取一?；ㄉN子，剝開兩片子葉，用小刀切取胚芽部分，即幾片未成熟葉片。以下步驟同方案一B、C、D、E。2.PCRPCR體系12·5μ12XTaqPCRMasterMix、IOnM引物(TBPfexl/TBPrexl)各0.5μL、2yLDNA模版，9.5μL無(wú)菌去離子水。PCR條件94°C預(yù)變性3min，94°C50sec，55°Clmin，72°C1.5min，35個(gè)循環(huán)，72°C延伸7min。3.PCR產(chǎn)物電泳分離PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，100V,30min。三、結(jié)果PCR產(chǎn)物電泳圖片(說(shuō)明書附圖3)顯示目的DNA提取效果較好，5個(gè)材料均得到了目的基因片段，證實(shí)此方法簡(jiǎn)單可靠，可適用于不同類型材料胚芽DNA提取。實(shí)施例三從瘡痂病病組織中克隆真菌18SrDNA一、試驗(yàn)材料及試劑材料花生瘡痂病病組織。試劑堿裂解液，含58mg/mlPVP40的Tris-HCl緩沖液。二、試驗(yàn)方法1.模板制備在花生植株上選取一片瘡痂病病葉，用中性筆芯在主脈一側(cè)打孔，獲取直徑約1.12mm葉盤；莖部病害組織則以剃須刀片切取直徑約4mm的薄片。以下步驟同實(shí)施例一中“模板制備”的B、C、D、E步驟。2.PCRPCR體系:25μ12XTiangenTaqPCRMasterMix、10μM真菌特異性引物(NS265’-CTGCCCTATCAACTTTCGA-3’/R518:5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’)各2μ1、1μLDNA模版，20μ1無(wú)菌去離子水。PCR條件95°C預(yù)變性6min，94°Clmin，55°C50sec,72°Clmin，32個(gè)循環(huán)，72°C延伸6min。3.PCR產(chǎn)物回收純化、測(cè)序PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，100V,30min,以下步驟同實(shí)施例一。三、結(jié)果PCR反應(yīng)后凝膠電泳(說(shuō)明書附圖4中)證實(shí)從病葉和病莖種提取的病原菌ISsDNA完全一致，表明此方法簡(jiǎn)單可靠，重復(fù)性強(qiáng)。進(jìn)一步測(cè)序得到的花生瘡痂病病原菌的18SrDNA序列如下TGCCCTATCAACTTTCGATGGTAGGATAGTGGCCTACCATGGTGGTGACGGGTGACGGAGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTGACACGGGGAGGTAGTGACAATAAATAACAATACCGGGCTCATAGAGTCTGGTMTTGGMTGAGTACAATCTAAATCCCTTAACGAGGATCCATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAAT。表明堿裂解法完全適用于花生真菌病原研究。實(shí)施例四花生果腐病組織中提取真菌DNA，鑒定病原菌一、試驗(yàn)材料及試劑材料花生果腐病受害果殼。試劑堿裂解液，含58mg/mlPVP40的Tris-HCl緩沖液。二、試驗(yàn)方法1.模板制備取受害果殼的中間層約6.5mm2的薄片，以下步驟同實(shí)施例一。2.PCRPCR體系12·5μ12XTiangenTaqPCRMasterMix、10μM通用真菌特異性引物(ITS1:5，-tccgtaggtgaacctgcgg-3‘/ITS4:5，_tcctccgcttattgatatgc_3，)各1μ1、1μ1DNA模版，4.5μ1無(wú)菌去離子水。PCR條件95°C預(yù)變性5min，95°C30sec,50°C30sec,72°Clmin，35個(gè)循環(huán)，72°C延伸5min。3.PCR產(chǎn)物回收純化、測(cè)序PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，100V，30min，回收測(cè)序等試驗(yàn)方法同實(shí)施例ο三、結(jié)果PCR產(chǎn)物凝膠電泳(說(shuō)明書附圖5中)證實(shí)有目的片段，進(jìn)一步測(cè)序得到的病原菌ITS序列與GenBank中收錄的鐮孢菌序列高度同源。表明此方法適用于果腐病真菌病原研究。具體序列如下TCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTATACAACTCATCAACCCTGTGAACATACCTAAAACGTTGCTTCGGCGGGAACAGACGGCCCTGTAACAACGGGCCGCCCCCGCCAGAGGACCCCTAACTCTGTTTTTATAATGTTTTTCTGAGTAAACAAGCAAATAAATTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTACAACCCTCAGGCCCCCGGGCCTGGCGTTGGGGATCGGCGGAAGCCCCCTGTGGGCACACGCCGTCCCTCAAATACAGTGGCGGTCCCGCCGCAGCTTCCATTGCGTAGTAGCTAACACCTCGCAACTGGAGAGCGGCGCGGCCATGCCGTAAAACACCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGAATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA。實(shí)施例五從葉片中提取DNA，進(jìn)行IT-ISJ標(biāo)記研究一、試驗(yàn)材料及試劑材料如下表。表2.花生材料來(lái)源編樣品名稱備注編號(hào)樣品名稱備注號(hào)1B4作圖親本，栽培種與A.glabrata11AlOA.pusilla<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>試劑堿裂解液，含58mg/mlPVP40的Tris-HCl緩沖液。二、試驗(yàn)方法1.模板制備同實(shí)施例一。2.PCRPCR體系7·5μ12XTaqPCRMasterMixUOnM引物各(IT-ISJ29RGGAATTCCACCTGCACTA/1T-1SJ3FGCATGCCAGGTAAGTAAG)各0.75μ1、2μIDNA模版，6μ1無(wú)菌去離子水。PCR條件94°C預(yù)變性5min，94°C45sec，50°C45sec，72°Clmin，40個(gè)循環(huán)，72°C延伸IOmin003.PCR產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠電泳6%聚丙烯酰胺凝膠電泳30min，快速銀染法染色。三、結(jié)果PCR反應(yīng)后聚丙烯酰胺凝膠電泳(電泳圖在說(shuō)明書附圖6中)，根據(jù)凝膠圖統(tǒng)計(jì)其多態(tài)性情況見表3，顯示材料條帶多態(tài)性較好。本試驗(yàn)進(jìn)行了3次重復(fù)，帶型沒(méi)有發(fā)生變化，說(shuō)明此方法簡(jiǎn)單可靠，所提取的DNA可用于分子標(biāo)記的研究。表3.引物對(duì)IT-ISJ29R/IT-ISJ3F對(duì)20份花生樣品的擴(kuò)增效果材料名稱條帶總數(shù)多態(tài)性條帶數(shù)目多態(tài)性率(％)B413323.1Valencia1011119.108-291300.008-301417.108-311100.0花育161300.008測(cè)-A21417.1A611436.4A714750.0A811436.4AlO10330.0A3015853.3獅頭企18211.1伏花生1715.9常青一叢生18211.1沂北一窩猴1600.0汶上爬蔓生1715.9三莢公1715.9睢寧二窩1600.0興離崖舦1715.9實(shí)施例六從子葉中提取DNA一、試驗(yàn)材料及試劑表1花生材料來(lái)源編號(hào)基因型備注1泉花646審(認(rèn))定品種2泉花10審(認(rèn))定品種3粵油256審(認(rèn))定品種<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>試劑含IOmMTris-HCl、5mMEDTA、58mg/mlPVP40,50100μg/ml蛋白酶K的酶解液、TE緩沖液。二、試驗(yàn)方法1.模板制備A、取一?；ㄉN子，用剃須刀片切取約0.40mm厚一薄片子葉，盡量減少對(duì)子葉的損傷。B、將其置于加有200μ1酶解液的1.5ml離心管中(可冷凍保存?zhèn)溆?，用研磨棒研磨無(wú)肉眼可見的顆粒。C、55°C水浴20min，加入等體積苯酚/氯仿/異戊醇。DUOOOOrpm離A、5min。Ε、取上清液，加入等積異丙醇，IOOOOrpm離心2_5min。F、棄上清液，沉淀于室溫晾干，加入與上清等體積的TE緩沖液即為DNA提取液。2.PCRPCR體系7.5μ12XTaqPCRMasterMix、IOnM引物各(FLl5'-AAGGGTTCCACATTCAAACCCTCCATT_3，，F(xiàn)R15'-CAATGCTTTGTAAACTGGGGTGCCATC-3，以及rDNAa/rDNAb)各0.6μ1、2μ1ΝΑ模版，4.3μ1無(wú)菌去離子水。PCR條件引物FL1/FR1對(duì)應(yīng)條件94°C預(yù)變性3min,94°Clmin,67°C30sec,72°Clmin，35個(gè)循環(huán)，72°C延伸2min；引物rDNAa/rDNAb對(duì)應(yīng)條件94°C預(yù)變性3min，94°C50sec,55°Clmin，72°CImin30sec，35個(gè)循環(huán)，72°C延伸7min。3.PCR產(chǎn)物電泳FLl/FRUrDNAa/rDNAb引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物分別經(jīng)2%、0.8%瓊脂糖凝膠電泳，30mino三、結(jié)果PCR產(chǎn)物凝膠電泳(電泳圖在說(shuō)明書附圖7、8中)顯示此方法適用于不同基因型花生材料子葉DNA的提取。實(shí)施例七從子葉中提取DNA鑒定轉(zhuǎn)基因種子一、試驗(yàn)材料及試劑材料通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得的待檢測(cè)篩選種子8份。試劑含IOmMTris_HCl、5mMEDTA、58mg/mlPVP40,50100μg/ml蛋白酶K的酶解液、TE緩沖液。二、試驗(yàn)方法1.模板制備同實(shí)施例六的模板制備。2.PCRPCR體系12·5μ12XTaqPCRMasterMix、10nM引物各(EGPF-F1ACCCTCGTGACCACCCTGACCTAC/EGPF-R1GACCATGTGATCGCGCTTCTCGTT)各0.5μ1、1μIDNA模版，10.5μ1無(wú)菌去離子水。PCR條件94°C預(yù)變性3min，94°Clmin，61.6°C40sec，72°Clmin，35個(gè)循環(huán)，72°C延伸5min。3.PCR產(chǎn)物凝膠電泳1.0%瓊脂糖凝膠電泳，30min。三、結(jié)果PCR產(chǎn)物凝膠電泳(電泳圖在說(shuō)明書附圖9中)顯示有6份陽(yáng)性材料。說(shuō)明此方法適用于轉(zhuǎn)基因材料的篩選鑒定研究。參考文獻(xiàn)王傳堂，黃粵，楊新道等.改良CTAB法和高鹽低pH值法提取花生DNA的效果[J].花生學(xué)報(bào)，2002，31(3):20-23。陳靜，胡曉輝，苗華榮等.CTAB法提取花生總DNA在SSR和SRAP中的擴(kuò)增效果[J].花生學(xué)報(bào)，2008，37(1):29-31。胡曉輝，苗華榮，石運(yùn)慶等.花生干花生子DNA提取研究[J].海峽兩岸花生學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集/中國(guó)農(nóng)業(yè)科技出版社，2009293-296BUROffM.D.；SIMPSONC.Ε.；STARRJ.L.andPATERSONΑ.H.Transmissiongeneticsofchromatinfromasyntheticamphidiploidtocultivatedpeanut(ArachishypogaeaL.):broadeningthegenepoolofamonophyleticpolyploidspecies[J].Genetics2001,159:823-837.CHOIK.；BUROffΜ.D.；CHURCHG.；BUROffG.；PATERSONΑ.Μ.；SIMPSONC.Ε.andSTARRJ.L.GeneticsandmechanisimofresistancetoMeloidogynearenariainpeanut[J].JournalofNematology1999,31:283-290.CHU,Y.；RAMOS,L.；H0LBR00K,C.C.and0ZIAS-AKINS,P.Frequencyofaloss-of-functionm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