專利名稱：：一種分泌表達(dá)人Kallistatin的重組酵母菌株及生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分子藥物學(xué)，生物技術(shù)和疾病防治，具體地說是采用酵母菌株生產(chǎn)人Kallistatin(Kal)的生產(chǎn)工藝，分泌表達(dá)載體的構(gòu)建，發(fā)酵條件和純化方法。
背景技術(shù)：
：目前惡性腫瘤已經(jīng)成為發(fā)達(dá)國家和地區(qū)居于前列的致死性疾病。雖然外科手術(shù)，放療和化療作為的常規(guī)治療手段仍在不斷發(fā)展，但由于其固有的局限，其療效已基本達(dá)到極限，因而迫切需要開發(fā)新的治療手段。自從Folkman于1971年首次闡述腫瘤與新生血管依賴關(guān)系，并提出有關(guān)分子機(jī)制假說以來，以腫瘤新生血管為靶點(diǎn)的抗血管生成治療成為抗腫瘤研究的熱點(diǎn)。Kal是一新型的具有抗血管生成作用的內(nèi)源性蛋白(MiaoRQ，etal.Blood2002;100:3245-52)，其抗血管生成作用與內(nèi)皮抑素(endostatin)類似。內(nèi)皮抑素通過其肝素結(jié)合活性介導(dǎo)其對(duì)血管生成的抑制作用。各種生長因子必須結(jié)合細(xì)胞表面兩種不同的受體，才能引發(fā)一個(gè)信號(hào)。硫酸肝素糖蛋白(HSPGs)是最普通的低吸附受體，在調(diào)節(jié)多種生長因子的作用時(shí)，發(fā)揮關(guān)鍵作用。許多生長因子，如VEGF和bFGF是肝素結(jié)合生長因子，VEGF和bFGF與內(nèi)皮細(xì)胞表面的HSPGs結(jié)合，可以調(diào)節(jié)它們與專屬受體的結(jié)合。Kal是肝素結(jié)合蛋白，可以與VEGF和bFGF，以及其它含有肝素結(jié)合區(qū)的生長因子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合HSPGs，因此阻斷了這些生長因子與HSPGs的結(jié)合，阻斷了這些生長因子引發(fā)的血管生成事件。另外，Kal還是絲氨酸蛋白酶抑制劑的一員，最初被認(rèn)為是組織胰激肽原酶結(jié)合蛋白。越來越多的證據(jù)顯示，組織胰激肽原酶在腫瘤相關(guān)事件中非常重要，其中包括腫瘤生長調(diào)節(jié)，血管生成，侵入和轉(zhuǎn)移等。我們的研究發(fā)現(xiàn)，在Kal的作用下，HCC中作為細(xì)胞增殖的標(biāo)志Ki-67染色降低，顯示Kal與組織胰激肽原酶的結(jié)合可能與HCC細(xì)胞增殖抑制有關(guān)。Kal可以從不同途徑抑制血管生成，因此是抗腫瘤血管生成治療的良好候選者。已進(jìn)行的Kal的抗腫瘤作用研究主要采用基因治療手段，而基因治療一般需要采用病毒載體，其長期應(yīng)用的風(fēng)險(xiǎn)是各國衛(wèi)生部門重點(diǎn)關(guān)注的問題，目前尚不明朗，很難在短期內(nèi)實(shí)現(xiàn)上市并廣泛應(yīng)用于腫瘤病人。而多種重組蛋白藥物已廣泛地應(yīng)用于臨床，相關(guān)技術(shù)比較成熟，是開發(fā)基因重組藥物最常規(guī)的手段。所以本領(lǐng)域研究人員試圖建立一種高效生產(chǎn)Kal重組蛋白的方法，研究其蛋白形式對(duì)腫瘤的作用，為新型抗腫瘤藥物的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。Kal的發(fā)現(xiàn)者Chao等曾采用大腸桿菌表達(dá)Kal重組蛋白，但表達(dá)量很低。本課題組也曾用大腸桿菌表達(dá)人Kal蛋白，表達(dá)水平也極低，且雜蛋白多難以純化。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是近年來建立起來的一種真核表達(dá)系統(tǒng)，已成功地表達(dá)了大量的重組蛋白，它既具有原核表達(dá)系統(tǒng)繁殖快、操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)又具有原核表達(dá)系統(tǒng)所沒有的優(yōu)勢(shì)如能對(duì)表達(dá)的目的蛋白進(jìn)行正確加工、折疊及適度糖基化，分泌表達(dá)的雜蛋白少，易于分離純化等，因此越來越廣泛地用于重組蛋白的表達(dá)。國內(nèi)外文獻(xiàn)尚未有利用畢赤酵母表達(dá)Kal蛋白的報(bào)道。本發(fā)明人利用畢赤酵母表達(dá)人Kal蛋白，發(fā)現(xiàn)采用常規(guī)的技術(shù)方法得到的重組菌株表達(dá)水平很低，難以大規(guī)模生產(chǎn)。純化工藝也比較復(fù)雜?，F(xiàn)有市售酵母分泌型表達(dá)載體所用的信號(hào)肽幾乎全是a交配因子信號(hào)肽，重組蛋白的翻譯后加工需要兩種不同的酶參與，往往產(chǎn)生加工不均勻和不正確的現(xiàn)象，得到的重組蛋白的N端序列出現(xiàn)偏差。
發(fā)明內(nèi)容針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問題和缺陷，本發(fā)明對(duì)市售的酵母分泌型表達(dá)載體pPIC9進(jìn)行改造，并從發(fā)酵工藝和純化工藝等多個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行最佳條件的摸索和優(yōu)化，得到了可以高效表達(dá)人Kal的分泌型表達(dá)酵母菌株，并建立了可以用于工業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)酵工藝和純化工藝。信號(hào)肽序列是分泌型酵母表達(dá)載體非常重要的表達(dá)元件，對(duì)于不同的目標(biāo)蛋白，a交配因子信號(hào)肽往往不能有效、正確的轉(zhuǎn)位和加工，因而所得到的目標(biāo)蛋白的N端序列經(jīng)常不是天然序列。本發(fā)明對(duì)多種信號(hào)肽序列進(jìn)行了篩選，從表達(dá)水平高低和N端序列正確與否等多個(gè)方面進(jìn)行了研究，確定了本發(fā)明載體的關(guān)鍵元件構(gòu)成。本發(fā)明采用廉價(jià)的B匪Y培養(yǎng)基即可成功地高水平分泌表達(dá)Kal蛋白。由于分泌的Kal蛋白成分水平高，下游純化非常方便，經(jīng)兩步層析純度即可達(dá)到98%以上，非常便于工藝化生產(chǎn)。圖1發(fā)酵上清液的WesternBlot分析。條帶1為酵母菌株GS115/pPIC9的發(fā)酵上清液，無Kal的陽性反應(yīng)；帶1為酵母菌株Ka102的發(fā)酵上清液，呈現(xiàn)Kal的陽性反應(yīng)。箭頭所指為Kal蛋白。圖2發(fā)酵時(shí)間對(duì)重組Kal蛋白表達(dá)的影響。條帶1為分子量標(biāo)志；條帶2為酵母菌株Kal02的發(fā)酵上清液；條帶3為酵母菌株Kal02的第1天發(fā)酵上清液；條帶4為酵母菌株Kal02的第2天發(fā)酵上清液；條帶5為酵母菌株Kal02的第3天發(fā)酵上清液；條帶6為酵母菌株Kal02的第4天發(fā)酵上清液；條帶7為酵母菌株Kal02的第5天發(fā)酵上清液；條帶7為酵母菌株Kal02的第6天發(fā)酵上清液。箭頭所指為Kal蛋白。圖3各純化步驟產(chǎn)物的SDS-PAGE圖譜。條帶1為分子量標(biāo)志；條帶2為酵母菌株Kal02的發(fā)酵上清液；條帶3為PhenylSuperose疏水層析產(chǎn)物；條帶4為S印haroseFF親和層析產(chǎn)物。具體實(shí)施例方式l含a交配因子信號(hào)肽工程菌株的構(gòu)建1.1表達(dá)載體pPIC9-Ka101的構(gòu)建以含有KalcDNA全長序列的pAAV-Kal為模板，選用上游引物5'-aacctcgagaaaagagatggtgagagttgcagtaacagct-3'弓l入Xho1酶切位點(diǎn)，下游弓l物5'ccagaattcctatggtttcgtggggtcgacgacc-3'引入EcoRI酶切位點(diǎn)，用PyrobestDNA聚合酶，經(jīng)PCR得到人Kal成熟蛋白對(duì)應(yīng)的DNA序列。目的片段回收、酶切后插入至pPIC9載體的Xhol/EcoRI位點(diǎn)之間。轉(zhuǎn)化后經(jīng)菌落PCR、酶切等方法篩選出符合要求的陽性克隆，委托大連寶生物公司對(duì)pPIC9-Ka101進(jìn)行測(cè)序。1.2工程菌株KalOl的構(gòu)建與鑒定4pPIC9-Kal01表達(dá)載體經(jīng)StuI線性化，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115(his4)宿主菌，涂布MD平板，菌落PCR鑒定。將陽性克隆接種于含有3mLB匪Y酵母培養(yǎng)液的試管中，培養(yǎng)24h，用2X甲醇誘導(dǎo)48小時(shí)，ELISA法測(cè)定目的蛋白含量。發(fā)酵上清液經(jīng)SDS-PAGE分離后電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，用封閉液封閉2h，滴加一抗室溫孵育2h，洗滌液洗3次，滴加二抗室溫孵育2h，洗滌液洗3次，最后使用BeyoECL熒光檢測(cè)試劑檢測(cè)目的蛋白，X膠片曝光后顯影、定影。2含人白蛋白信號(hào)肽工程菌株的構(gòu)建2.1表達(dá)載體pPIC9-Ka102的構(gòu)建依據(jù)NCBI中報(bào)道的編碼白蛋白信號(hào)肽(NP_000468)序列以及編碼人成熟Kal蛋白序列設(shè)計(jì)引物，上游引物1:5'-CAGGATCCCAAACGATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCTTCTTTTTCTCTTTAGC-3'，上游引物2:5'-CCCTTCTTTTTCTCTTTAGCTCGGCTTATTCCGATGGTGAGAGTTGCAGTAAC-3'和下游引物5'-CCAGAATTCCTATGGTTTCGTGGGGTCGACGACC-3'，引入BamHI、EcoRI酶切位點(diǎn)。利用合成的引物通過兩次重疊PCR從pAAV-Kal質(zhì)粒中擴(kuò)增出人Kal成熟蛋白對(duì)應(yīng)的DNA序列。目的片段回收、酶切后插入至pPIC9載體的BamHI-EcoRI位點(diǎn)之間。轉(zhuǎn)化后經(jīng)菌落PCR、酶切等方法篩選出符合要求的陽性克隆，委托大連寶生物公司對(duì)pPIC9-Ka102進(jìn)行測(cè)序。2.2工程菌株Kal02的構(gòu)建與鑒定按照1.2步驟同法操作。3含人Kal信號(hào)肽工程菌株的構(gòu)建3.1表達(dá)載體pPIC9-Ka103的構(gòu)建依據(jù)編碼人Kal蛋白序列設(shè)計(jì)引物，上游引物1:5'-CAGGATCCCAAACGATGCATCTTATCGA-3'下游引物5'-CCAGMTTCCTATGGTTTCGTGGGGTCGACGACC-3'，引入BamH1、EcoRI酶切位點(diǎn)。利用合成的弓I物通過兩次重疊PCR從pAAV-Kal質(zhì)粒中擴(kuò)增出人Kal成熟蛋白對(duì)應(yīng)的DNA序列。目的片段回收、酶切后插入至pPIC9載體的BamHI-EcoRI位點(diǎn)之間。轉(zhuǎn)化后經(jīng)菌落PCR、酶切等方法篩選出符合要求的陽性克隆，委托大連寶生物公司對(duì)pPIC9-Ka103進(jìn)行測(cè)序。3.2工程菌株Kal03的構(gòu)建與鑒定按照1.2步驟同法操作。4工程菌株的篩選將從不同工程菌株所得到的Kal表達(dá)水平和N-端序列測(cè)定結(jié)果進(jìn)行分析工程菌株Kal03的表達(dá)產(chǎn)物N-端序列與天然產(chǎn)物一致，但表達(dá)水平很低；工程菌株KalOl的表達(dá)產(chǎn)物N-端序列出現(xiàn)與天然產(chǎn)物不一致現(xiàn)象，但表達(dá)水平高；工程菌株Kal02的表達(dá)產(chǎn)物N-端序列與天然產(chǎn)物一致，表達(dá)水平也很高。工程菌株Kal02發(fā)酵上清液的WesternBlot分析見圖1。5發(fā)酵條件的優(yōu)化5.l培養(yǎng)基選取B匪和B匪Y兩種常用培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，將培養(yǎng)上清直接進(jìn)行電泳分離，B匪Y培養(yǎng)基的上清液可見清晰的Kal條帶，而B匪培養(yǎng)基的上清液中Kal蛋白條帶非常模糊。經(jīng)ELISA測(cè)定B匪、B匪Y培養(yǎng)基中的Kal表達(dá)水平(見表1)，B匪Y培養(yǎng)基中的表達(dá)是B匪的53倍。表1培養(yǎng)基成份對(duì)Kal蛋白表達(dá)i<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表2)。5.2pH值選用不同pH的B匪Y培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，ELISA測(cè)得發(fā)酵上清液中Kal蛋白含量(見可見該菌種最佳表達(dá)的PH值為7.0。表2pH對(duì)Kal蛋白表達(dá)量影響(n=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>5.3甲醇濃度在pH7的B匪Y培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，選用不同濃度的甲醇誘導(dǎo)Kal蛋白的表達(dá)，ELISA法測(cè)得發(fā)酵上清液Kal蛋白含量(見表3)。可見誘導(dǎo)Kal蛋白表達(dá)的最佳甲醇濃度為2%。表3甲醇濃度對(duì)Kal蛋白表達(dá)影響(n=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>5.4發(fā)酵時(shí)間在pH7的BMMY培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，采用2%甲醇誘導(dǎo)，在不同的發(fā)酵時(shí)間取樣，ELISA法測(cè)定發(fā)酵上清中Kal蛋白含量。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，Kal的表達(dá)逐漸增加，產(chǎn)物的時(shí)間積累效果顯著，在第5天達(dá)到最高水平，之后上清中雜蛋白條帶增多，Kal蛋白含量降低(SDS-PAGE圖譜見圖2)。6Kal蛋白的純化Kal蛋白純化過程包括發(fā)酵上清液的硫酸銨預(yù)處理和連續(xù)的兩步層析。預(yù)處理后的上清液經(jīng)過PhenylSuperose介質(zhì)疏水層析，平衡緩沖液為20mmol/LTris-HCl，l.5mol/L硫酸銨，pH6.O，用20,1/LTris-HCl，O.4mol/L硫酸銨，pH6.0緩沖液洗脫；洗脫液透析后經(jīng)過H印arinS印haroseFF介質(zhì)親和層析，用20mmol/LTris-HCl，0.5mol/LNaCl，pH6.0緩沖液洗脫，此步洗脫液經(jīng)過透析后過濾除菌就得到Kal蛋白原液。純化的Kal蛋白經(jīng)Westernblotting鑒定為陽性，用ELISA測(cè)定Kal蛋白原液濃度為0.404mg/mL。通過該純化工藝，可以從每升發(fā)酵上清中獲得7g純度大于98X的的Kal蛋白。不同純化步驟產(chǎn)物的SDS-PAGE見圖3。7對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響將血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC細(xì)胞(lXl()S細(xì)胞/ml)接種至96孔板，每孔100iil，細(xì)胞貼壁后加入重組Kal蛋白，培養(yǎng)48h后MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性。結(jié)果3iimol/LKal蛋白組抑制率為60%±1%，1.5iimol/LKal蛋白組抑制率為25%±1%，0.75踐ol/LKal蛋白組抑制率為15%±2%，表現(xiàn)出量效關(guān)系，陽性對(duì)照藥內(nèi)皮抑素(3iimol/L)抑制率為32%±0.9%。權(quán)利要求一種表達(dá)人kallistatin的分泌型表達(dá)載體，該載體含有一個(gè)重組基因表達(dá)框，其特征在于表達(dá)框中含有去除了原信號(hào)肽序列的人kallistatin的cDNA序列，原信號(hào)肽序列被更換為人白蛋白信號(hào)肽序列，該表達(dá)框被插入至甲醇酵母分泌型表達(dá)載體pPIC9的BamHI和EcoRI位點(diǎn)，構(gòu)建成人kallistatin分泌型表達(dá)載體。2.—種重組酵母菌株，其特征在于由權(quán)利要求1所述的分泌型表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115(his4)宿主菌所得，可以分泌表達(dá)人kallistatin。3.—種重組酵母菌株的培養(yǎng)條件，其特征為采用B匪Y培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的pH范圍為58，甲醇濃度為0.5%3%，培養(yǎng)時(shí)間為25天。4.一種優(yōu)選的重組酵母菌株的培養(yǎng)條件，其特征為采用B匪Y培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的pH范圍為6.57.5，甲醇濃度為2%，培養(yǎng)時(shí)間為5天。5.—種人kal1istatin的純化工藝，其特征為采用權(quán)利要求3或權(quán)利要求4所述的培養(yǎng)條件對(duì)權(quán)利要求2所述的重組酵母菌株進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)上清液經(jīng)硫酸銨預(yù)處理，PhenylSuperose疏水層析，H印arinS印haroseFF親和層析后，除菌過濾得到人kallistatin原液。6如權(quán)利要求5所述的PhenylSuperose疏水層析，其平衡緩沖液為20mmol/LTris-HCl，1.5mol/L硫酸銨，pH6.0;其洗脫液為20mmol/LTris-HC1，0.4mol/L硫酸銨。7.如權(quán)利要求5所述的H印arinS印haroseFF親和層析，其洗脫液為20mmol/LTris-HCl，O.5mol/LNaCl，pH6.0。全文摘要本發(fā)明涉及抗腫瘤藥物人Kallistatin的生產(chǎn)方法和工藝。本發(fā)明涉及分泌表達(dá)人Kallistatin的酵母工程菌株構(gòu)建的關(guān)鍵技術(shù)、構(gòu)建結(jié)果及利用它來生產(chǎn)人Kallistatin的最佳發(fā)酵條件和純化方法。文檔編號(hào)C07K1/20GK101724650SQ20091026322公開日2010年6月9日申請(qǐng)日期2009年12月17日優(yōu)先權(quán)日2009年12月17日發(fā)明者刁勇,李招發(fā),許瑞安,黃曉平申請(qǐng)人:刁勇;許瑞安