專(zhuān)利名稱(chēng)：用于治療炎性關(guān)節(jié)障礙的鈣黏著蛋白-11 ec1結(jié)構(gòu)域拮抗劑的制作方法
用于治療炎性關(guān)節(jié)障礙的鈣黏著蛋白-11EC1結(jié)構(gòu)域拮抗
劑相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求了于2008年1月11日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/010，734的權(quán)益。以 上申請(qǐng)的全部傳授內(nèi)容都通過(guò)弓I用結(jié)合在此。
背景技術(shù)：
患有晚期慢性關(guān)節(jié)炎癥的患者忍受著嚴(yán)重的關(guān)節(jié)退化(包括骨和軟骨破壞)，這 導(dǎo)致長(zhǎng)期疼痛、畸形、關(guān)節(jié)功能損失、運(yùn)動(dòng)減少、并且縮短的壽命。關(guān)節(jié)炎癥與關(guān)節(jié)中細(xì)胞 和炎性物質(zhì)的數(shù)量增加相關(guān)聯(lián)，這引起了刺激、軟骨的磨損、以及關(guān)節(jié)內(nèi)層(joint lining) 的腫脹。已知幾種不同的自身免疫障礙在關(guān)節(jié)中觸發(fā)了不適當(dāng)?shù)幕蝈e(cuò)誤導(dǎo)向的炎癥，在遭 受這些疾病的個(gè)體的關(guān)節(jié)中導(dǎo)致了慢性炎癥。常見(jiàn)的炎性關(guān)節(jié)障礙(inflammatory joint disorder)包括類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、萊特爾氏綜合征、以及強(qiáng)直性脊柱炎。類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是最常見(jiàn)的炎性關(guān)節(jié)炎形式，并且據(jù)估計(jì)影響美國(guó)大約 的人口、或大約210萬(wàn)美國(guó)人。RA是一種慢性病，其特征在于關(guān)節(jié)的內(nèi)層、或滑膜的炎癥，并 且隨著時(shí)間可以導(dǎo)致顯著的骨和軟骨的損害。與男性相比，RA在女性中更為常見(jiàn)，并且多 達(dá)3%的女性在她們的一生中可能發(fā)展成類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。目前，RA的病因是未知的。RA可以導(dǎo)致長(zhǎng)期的關(guān)節(jié)損害，這造成了慢性疼痛、功能損失以及失能。此外，最近 的研究表明患有RA的人、特別是那些疾病沒(méi)有被很好控制的人，可能具有更高的心臟病和 中風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn)。因此，RA是一種主要的國(guó)家健康負(fù)擔(dān)，并且對(duì)于開(kāi)發(fā)用于防止和治療類(lèi)風(fēng)濕 性關(guān)節(jié)炎、以及其他炎性關(guān)節(jié)障礙的新型藥劑存在著一種迫切的需要。發(fā)明概述在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涵蓋了 一種鈣黏著蛋白-11拮抗劑，該鈣黏著蛋 白-11拮抗劑特異性地結(jié)合到一種哺乳動(dòng)物鈣黏著蛋白-11蛋白的一個(gè)細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域 (ECl)上，并且抑制了表達(dá)該哺乳動(dòng)物鈣黏著蛋白-11的細(xì)胞的聚集。在一個(gè)具體的實(shí)施 方案中，該鈣黏著蛋白-11拮抗劑是一種抗體或抗體片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該鈣黏著 蛋白-11拮抗劑是一種融合蛋白，該融合蛋白包括一種鈣黏著蛋白-11蛋白的ECl結(jié)構(gòu)域 (例如，SEQ ID NO :3)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及治療哺乳動(dòng)物受試者(例如，人)體內(nèi)的炎性關(guān) 節(jié)障礙的多種方法。該方法包括對(duì)該哺乳動(dòng)物受試者給予本發(fā)明的治療有效量的一種鈣黏 著蛋白-11拮抗劑，由此在該哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生一種令人希望的治療效應(yīng)。在一種具體的實(shí) 施方案中，本發(fā)明的這些方法可用于治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涵蓋了一種藥物組合物，該藥物組合物包括本發(fā)明 的一種鈣黏著蛋白-11拮抗劑以及一種藥學(xué)上可接受的載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，該藥物 組合物進(jìn)一步包括一種第二試劑，如，一種緩解疾病(disease-modifying)的抗風(fēng)濕藥或 抗炎劑。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明本專(zhuān)利或申請(qǐng)文件包含至少一個(gè)彩繪的圖。帶有彩圖的本專(zhuān)利或?qū)＠暾?qǐng)公開(kāi)文件的副本在要求和支付必要的費(fèi)用時(shí)將由局方(the Office)將提供。圖IA是一種蛋白質(zhì)印跡，示出了使用抗Cad-Il抗體23C6、13C2、以及27F3來(lái)檢測(cè) 鈣黏著蛋白-ll-ECl-5-Fc融合蛋白(見(jiàn)實(shí)心箭頭)。這些抗體并未識(shí)別也存在于該膜上的 鈣黏著蛋白-Il-ECl-Fc以及鈣黏著蛋白-ll-ECl/2-Fc融合蛋白(見(jiàn)空心箭頭，指出在該 印跡上鈣黏著蛋白-Il-ECl-Fc以及鈣黏著蛋白-ll-ECl/2-Fc蛋白的位置)。圖IB是一個(gè)圖示，描繪了公布的鈣黏著蛋白-11抗體13C2、23C6、以及5F82與人 類(lèi)Cad-ll-ECl-5-Fc融合蛋白(而非Cad-ll-ECl-Fc融合蛋白)的結(jié)合，正如通過(guò)ELISA 所確定。相比之下，ECl抗體HlMl與Cad-Il-ECl-Fc融合蛋白以及Cad-11-ECl_5_Fc融合 蛋白這兩者相結(jié)合。圖2是涉及到鈣黏著蛋白結(jié)合的人類(lèi)Cad-11的ECl結(jié)構(gòu)域的前34個(gè)氨基酸(SEQ ID NO 3) ,MN-Cad 的 ECl 結(jié)構(gòu)域的前 34 個(gè)氨基酸(SEQ ID NO 4)、以及 Cad-8 (SEQ ID NO 5)的ECl結(jié)構(gòu)域的前34個(gè)氨基酸的氨基酸序列比對(duì)。包含延伸至一種鈣黏著蛋白反受體 的口袋中的多個(gè)殘基的供體序列是通過(guò)在序列的左側(cè)一半作下劃線(xiàn)來(lái)表示的，并且該口袋 序列的多個(gè)殘基是通過(guò)在SEQ ID NO :3中的序列的右側(cè)一半作下劃線(xiàn)來(lái)表示的。圖3是一個(gè)圖示，描繪了一種鈣黏著蛋白-11-結(jié)合Fab與一種人類(lèi)Cad-Il-ECl 結(jié)構(gòu)域肽、連同Cad-Il-ECl-Fc融合蛋白(而非Cad_8或MN-Cad ECl結(jié)構(gòu)域肽)的結(jié)合， 正如通過(guò)ELISA所確定?？寺?證明了顯著結(jié)合到Cad-IlECl結(jié)構(gòu)域肽以及融合蛋白上， 而非MN-Cad或Cad-8EC1結(jié)構(gòu)域肽。圖4是一個(gè)圖示，描繪了來(lái)自體外Cad-Il細(xì)胞聚集測(cè)定的數(shù)據(jù)。加入到培養(yǎng)基中 的Cad-Il拮抗劑(如，由抗Cad-Il抗體13C2制備的一種Fab)、或不同濃度的抗鈣黏著蛋 白-IlEClFab (它針對(duì)鈣黏著蛋白-11的ECl結(jié)構(gòu)域的前35個(gè)氨基酸)(被指定為EClFab 克隆7)阻止了 Cad-Il介導(dǎo)的431-D-11細(xì)胞的聚集。抗鈣黏著蛋白-IlEClFab (克隆7) 在所有測(cè)試濃度(在0.3yg/ml至10yg/ml的范圍內(nèi))下抑制了一種431-D-11表皮樣癌 細(xì)胞的聚集。相比之下，由13C2抗鈣黏著蛋白-11抗體制備的Fab僅在10 μ g/ml的濃度 下抑制細(xì)胞的聚集。圖5是一個(gè)圖示，描繪了來(lái)自第二種體外Cad-Il細(xì)胞聚集測(cè)定的數(shù)據(jù)。431_D_11 細(xì)胞的聚集百分率是在加入SME培養(yǎng)基(被指定為對(duì)照)、不同濃度的一種融合蛋白(包 括融合至人類(lèi)IgG2鉸鏈域、CH2以及CH3結(jié)構(gòu)域上的Cad-Il的ECl結(jié)構(gòu)域)(被指定為 Cad-ll-ECl-Fc)、不同濃度的一種抗鈣黏著蛋白-IlEClFab (它針對(duì)鈣黏著蛋白-11的ECl 結(jié)構(gòu)域的前35個(gè)氨基酸)(被指定為Cad-IIEClFab)、或不同濃度的一種對(duì)照抗綠色熒光蛋 白(抗-GFP) Fab (被指定GFPfAb)之后40分鐘示出的?？光}黏著蛋白_1 IEClFab (克隆7) 在3μ g/ml、1 μ g/ml、以及0. 1 μ g/ml的濃度下抑制了表達(dá)Cad-Il的431-D-11細(xì)胞的聚 集。ECl-Fc融合蛋白在3 μ g/ml的濃度下抑制了 431-D-11細(xì)胞的聚集。相比之下，抗-GFP Fab在任何這些測(cè)試濃度下都沒(méi)有顯著地抑制細(xì)胞的聚集。圖6是一個(gè)圖示，描繪了通過(guò)不同的抗鈣黏著蛋白-1 IEClFab來(lái)抑制Cad-11介導(dǎo) 的細(xì)胞聚集，這些抗鈣黏著蛋白-IlEClFab具有對(duì)于單獨(dú)的Cad-ll(EClfAb克隆7以及克 隆 4)、Cad-Il 與 Cad-8 (EClfAb 克隆 6)、或 Cad-Il 與 MN-Cad(EClfAb 克隆 5)的結(jié)合特異 性，這是使用體外細(xì)胞聚集測(cè)定來(lái)進(jìn)行的。相對(duì)于對(duì)照物(D-11SME;左柱)所測(cè)試的所有 Fab抑制了 431-D-11細(xì)胞的聚集。
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圖7是一個(gè)圖示，描繪了通過(guò)抗-Cad-IlFab來(lái)抑制Cad-Il介導(dǎo)的細(xì)胞的聚集，這 些抗-Cad-IlFab 具有對(duì)于單獨(dú)的 Cad-11 (EClfAb 克隆 7)、或 Cad-Il 與 MN-Cad(EClfAb 克 隆8)的結(jié)合特異性，這是使用體外細(xì)胞聚集測(cè)定來(lái)進(jìn)行的。所測(cè)試的這些Fab的特異性在 每種Fab名稱(chēng)旁邊的括號(hào)中示出。相對(duì)于對(duì)GFP特異性的對(duì)照Fab (左柱)，這兩種鈣黏著 蛋白特異性Fab均抑制了細(xì)胞聚集(中間柱和右柱)。圖 8 顯示人類(lèi) Cad-ll-ECl-hIgG2_Fcl 融合蛋白(Cad-11-ECl-Fe)的核苷酸(DNA) 序列(SEQ ID NO :6)。這種人類(lèi)鈣黏著蛋白-11胞外域的序列以斜體字顯示，BglII位點(diǎn)是 加下劃線(xiàn)的，并且對(duì)這種人類(lèi)IgG2-Fcl區(qū)域進(jìn)行編碼的序列以黑體字母顯示。圖9 示出 了人類(lèi) Cad-11-EC 1-hIgG2_Fcl 融合蛋白(Cad-ll-ECl-Fc)的氨基酸序 列(SEQ ID NO :7)。這種人類(lèi)鈣黏著蛋白-11胞外域的序列以斜體字顯示，由BglII位點(diǎn) 編碼的序列是加下劃線(xiàn)的，并且這種人類(lèi)IgG2-Fcl區(qū)的序列以黑體字母顯示。

圖10是已經(jīng)用考馬斯藍(lán)染色的SDS聚丙烯酰胺凝膠的圖像，它對(duì)應(yīng)地示出了對(duì)應(yīng) 于純化的 Cad-I I-EC 1-h I gG2-Fcl (中間泳道)以及 Cad-11-EC l/2_h I gG2_Fcl (右側(cè)泳道) 融合蛋白的單體形式的主導(dǎo)強(qiáng)條帶，之后使用蛋白A柱從細(xì)胞培養(yǎng)基中純化。分子量標(biāo)準(zhǔn) 顯示在左側(cè)泳道中。圖11是蛋白質(zhì)印跡，示出了使用偶聯(lián)辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的抗人IgG抗體來(lái)檢 測(cè)人類(lèi) Cad-I I-EC 1-h I gG2-Fcl (中間泳道)以及 Cad-11-EC l/2_h I gG2_Fcl (右側(cè)泳道)融 合蛋白。在每個(gè)泳道中所觀察到的主導(dǎo)條帶對(duì)應(yīng)于這些融合蛋白的單體形式的位置。這些 融合蛋白的二聚體形式的位置由于不完全的還原條件也是可見(jiàn)的(見(jiàn)不太強(qiáng)的更高的分 子量條帶)。分子量標(biāo)準(zhǔn)顯示在左側(cè)泳道中。圖12是一個(gè)圖示，描繪了與未經(jīng)處理的細(xì)胞相比Cadd-Il-ECl-Fc融合蛋白以及 小鼠抗-Cad-Il抗體13C2在所指示的濃度下抑制了表達(dá)Cad-Il的人類(lèi)成纖維細(xì)胞樣滑膜 細(xì)胞侵入到基質(zhì)膠塞中，標(biāo)記為侵入。數(shù)據(jù)是從兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)匯集的。圖13A和B是圖示，描繪了來(lái)自?xún)煞N體外Cad-Il細(xì)胞聚集測(cè)定的數(shù)據(jù)。表達(dá) Cad-Il的431-D-11細(xì)胞的聚集百分率是在加入SME培養(yǎng)基(被指定為對(duì)照)或一種 Cad-Il融合蛋白之后40分鐘而示出的。圖13A示出了在不同濃度的一種融合蛋白(包 括融合至人類(lèi)IgG 2鉸鏈域、CH2以及CH3結(jié)構(gòu)域上的Cad-Il的5個(gè)胞外域)(被指定為 Cad-Il-ECl-5-Fc)的存在下對(duì)聚集的抑制。圖13B示出了不同濃度的一種融合蛋白(包括 融合至人類(lèi)IgG2鉸鏈域、CH2以及CH3結(jié)構(gòu)域的Cad-Il的N端胞外域(ECl結(jié)構(gòu)域))(被 指定為 Cad-ll-ECl-Fc)、或 Cad-Il-ECl-5-Fc)對(duì)聚集的抑制。圖14A至C示出了人類(lèi)鈣黏著蛋白-IlcDNA序列(SEQ ID NO 1 ；見(jiàn)Genbank登記 號(hào) NM 001797)。圖15示出了人類(lèi)鈣黏著蛋白-11蛋白序列(SEQ ID NO :2 ；見(jiàn)Genbank登記號(hào) NP001788)。圖16是一個(gè)圖示，描繪了在來(lái)自肽4雜交瘤(HL)的培養(yǎng)基、或?qū)φ针s交瘤培養(yǎng)基 (Media)中的抗體與包含Cad-11、Cad_8、或MN-Cad的EC1-2結(jié)構(gòu)域的蛋白的結(jié)合水平，正 如通過(guò)ELISA所確定。圖17A至C是代表性的圖示，描繪了細(xì)胞染色的強(qiáng)度(MFI ；平均熒光強(qiáng)度)作為 H14抗體與表達(dá)Cad-Il-的431-D-11細(xì)胞的結(jié)合的一種量度。
圖17D至F是代表性的圖示，描繪了相對(duì)于圖17A至C、431_D細(xì)胞染色的缺失 (MFI ；平均熒光強(qiáng)度)，這表明H14抗體與Cad-Il陰性細(xì)胞的結(jié)合的缺乏。圖17G至I是代表性的圖示，描繪了細(xì)胞染色的強(qiáng)度(MFI ；平均熒光強(qiáng)度)作為 HlMl抗體與表達(dá)Cad-Il-的431-D-11細(xì)胞的結(jié)合的一種量度。圖18A是一個(gè)圖示，描繪了在不同濃度的抗體下H14抗體與表達(dá)Cad-Il-的細(xì)胞 的結(jié)合、以及H14與Cad-Il陰性對(duì)照細(xì)胞結(jié)合的缺失，正如由細(xì)胞染色的強(qiáng)度(MFI ；平均 熒光強(qiáng)度)所測(cè)量。圖18B是一個(gè)圖示，描繪了在不同濃度的抗體下HlMl抗體與表達(dá)Cad-Il-的細(xì)胞 的結(jié)合、以及HlMl與Cad-Il陰性對(duì)照細(xì)胞結(jié)合的缺失，正如由細(xì)胞染色的強(qiáng)度(MFI ；平均 熒光強(qiáng)度)所測(cè)量。圖19A是一個(gè)圖示，描繪了在不同的抗體濃度下H14抗Cad-Il抗體與Cad-Il以 及Cad-8EC1結(jié)構(gòu)域肽的結(jié)合程度，正如通過(guò)ELISA所確定。圖19B是一個(gè)圖示，描繪了在不同的抗體濃度下H14抗Cad-11抗體與Cad7、 MNCad, Cad9、Cadl8、Cad20、或Cad24ECl結(jié)構(gòu)域肽的結(jié)合的缺失，正如通過(guò)ELISA所確定。圖20是一個(gè)圖示，描繪了在不同的抗體濃度下HlMl抗Cad-Il抗體與Cad-Il以 及Cad-8EC1結(jié)構(gòu)域肽的結(jié)合，正如通過(guò)ELISA所確定。圖21A是一個(gè)圖示，描繪了 HlMl抗Cad-Il抗體與不同的Cad_lIECl結(jié)構(gòu)域肽免 疫原(PEPU PEP2、PEP3、以及PEP4)、連同Cad-IlECl結(jié)構(gòu)域融合蛋白(EFL)以及人類(lèi)IgG 對(duì)照(Fe段)(Fe block)的結(jié)合程度，正如通過(guò)ELISA所確定。圖2IB是一個(gè)圖示，描繪了 H14抗Cad-Il抗體與不同的Cad_l IECl結(jié)構(gòu)域肽免疫 原(PEP1、PEP2、PEP3、以及PEP4)、連同Cad-IlECl結(jié)構(gòu)域融合蛋白(EFL)以及人類(lèi)IgG對(duì) 照(Fe段)的結(jié)合程度，正如通過(guò)ELISA所確定。圖22個(gè)是一種示意圖，描繪了人類(lèi)鈣黏著蛋白-11的ECl結(jié)構(gòu)域的前37個(gè)氨基 酸的序列、以及由肽1-4中的每一個(gè)所涵蓋的這種序列的部分。肽3上游的由肽2和4共 有的氨基酸殘基在加框區(qū)中被加強(qiáng)顯示。直接參與Cad-Il與Cad-Il結(jié)合的多個(gè)氨基酸是 加下劃線(xiàn)的。圖23A是一個(gè)照片，示出了用一種對(duì)照同種型抗體處理的聚集的表達(dá)Cad-Il的細(xì) 胞大塊。圖23B是一個(gè)照片，示出了 HlMl處理的表達(dá)Cad-Il-的細(xì)胞小簇，這些細(xì)胞小簇 未發(fā)展形成在圖23A中所觀察到的大塊。圖23C是一個(gè)照片，示出了未經(jīng)處理的親本Cad-Il陰性細(xì)胞保持為單細(xì)胞群或雙 細(xì)胞群。圖23A是一個(gè)照片，描繪了表達(dá)Cad-Il的細(xì)胞的培養(yǎng)物，該培養(yǎng)物具有聚集的細(xì) 胞大塊。圖23B是一個(gè)照片，描繪了在用HHCad-IlECl結(jié)構(gòu)域抗體處理之后表達(dá)Cad-Il 的細(xì)胞的培養(yǎng)物，該培養(yǎng)物主要具有單細(xì)胞，這些單細(xì)胞相對(duì)于在圖24A中所示的細(xì)胞具 有小而稀少的細(xì)胞簇。圖25是一個(gè)圖示，描繪了與未經(jīng)處理的對(duì)照小鼠相比在用增加劑量的HIM1抗 Cad-Il抗體處理的小鼠中對(duì)與關(guān)節(jié)炎相關(guān)的關(guān)節(jié)腫脹的抑制。
圖26是一個(gè)圖示，描繪了與未經(jīng)處理的對(duì)照小鼠相比在每隔一天用0. 3mg的H14 或HlMl抗Cad-Il抗體處理的小鼠中對(duì)與關(guān)節(jié)炎相關(guān)的關(guān)節(jié)腫脹的抑制。圖27是一個(gè)圖示，示出了與未經(jīng)處理的對(duì)照物相比在小鼠模型中用0. 3mg的HlMl 或H14抗體進(jìn)行處理延遲了關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。圖28是一個(gè)圖示，描述了來(lái)自肽3雜交瘤的培養(yǎng)基(HL)或?qū)φ针s交瘤培養(yǎng)基 (Media)、包含抗體的培養(yǎng)基與Cad-Il、Cad_8、以及MN-鈣黏著蛋白、或Cad_lIECl-Fc融合 蛋白的EC1-2結(jié)構(gòu)域的結(jié)合程度。圖29是一個(gè)圖示，描繪來(lái)自這些肽3雜交瘤的抗Cad-Il抗體與表達(dá)人類(lèi)Cad-Il 蛋白的細(xì)胞(見(jiàn)箭頭)以及表達(dá)Neos、未表達(dá)Cad-Il的對(duì)照細(xì)胞的結(jié)合程度。發(fā)明詳細(xì)說(shuō)明定義如在此所使用的，術(shù)語(yǔ)“鈣黏著蛋白-11”、“Cad-11”、以及“OB-鈣黏著蛋白”是指 一種自然發(fā)生的或內(nèi)源性鈣黏著蛋白-ι ((例如，哺乳動(dòng)物，例如人類(lèi))蛋白，并且指具有一 種氨基酸序列的多個(gè)蛋白，該氨基酸序列與自然發(fā)生的或內(nèi)源性鈣黏著蛋白-11蛋白的氨 基酸序列相同(例如，重組蛋白、合成的蛋白)。因此，術(shù)語(yǔ)“鈣黏著蛋白-ll”、“cad-ll”、以 及“0B-鈣黏著蛋白”(它們?cè)诖耸强苫Q使用的)包括一種鈣黏著蛋白-11蛋白(例如，哺 乳動(dòng)物、人類(lèi))的多態(tài)的或等位基因的變體以及其他同種型，它們是通過(guò)(例如)在哺乳動(dòng) 物(例如人類(lèi)、非人的靈長(zhǎng)類(lèi))中自然發(fā)生的替代性剪接或其他細(xì)胞加工所產(chǎn)生的。優(yōu)選 地，這種鈣黏著蛋白-11蛋白是一種人類(lèi)蛋白，該蛋白具有SEQ IDNO :2的氨基酸序列(見(jiàn) Genbank 登記號(hào) NP001788 和圖 15)。如在此所定義的，一種“鈣黏著蛋白-11拮抗劑”是一種試劑(例如，抗體、融合蛋 白、肽、模擬肽、小分子、核酸)，該試劑特異性地結(jié)合到一種鈣黏著蛋白-11蛋白的一個(gè)ECl 結(jié)構(gòu)域上并且在細(xì)胞中抑制(例如，減少、防止)一種或多種鈣黏著蛋白-Ii-介導(dǎo)的活性。 鈣黏著蛋白-11-介導(dǎo)的活性包括但不限于一種鈣黏著蛋白-11蛋白以一種同型方式與一 種或多種其他鈣黏著蛋白-11蛋白的結(jié)合、表達(dá)鈣黏著蛋白-11的細(xì)胞的聚集、酶(例如， 膠原酶、絲氨酸蛋白酶、MMP1、MMP3、MMP13)的表達(dá)或活性的誘導(dǎo)、以及細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子 (例如，IL-6、IL-8、或RANKL、或TRANCE)的誘導(dǎo)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該鈣黏著蛋白_11拮 抗劑可以抑制一種鈣黏著蛋白-11蛋白與一種或多種其他鈣黏著蛋白-11蛋白的結(jié)合，這 是通過(guò)(例如)阻斷在一種Cad-Il蛋白(例如，在一種細(xì)胞的表面上表達(dá)的一種Cad-Il 蛋白)的ECl結(jié)構(gòu)域中的供體序列與一個(gè)或多個(gè)其他Cad-Il蛋白(例如，在另一種細(xì)胞的 表面上表達(dá)的一種或多種Cad-Il蛋白)的ECl結(jié)構(gòu)域中的口袋序列之間的相互作用來(lái)進(jìn) 行的。如在此所使用的，“特異性地結(jié)合”到一種鈣黏著蛋白-11蛋白的一個(gè)ECl結(jié)構(gòu)域 上的鈣黏著蛋白-11拮抗劑是指一種鈣黏著蛋白-11拮抗劑，該鈣黏著蛋白-11拮抗劑以 一種親和力(例如，一種結(jié)合親和力)結(jié)合到(例如，在生理?xiàng)l件下)一種鈣黏著蛋白-11 蛋白的一個(gè)ECl結(jié)構(gòu)域上，該親和力比該鈣黏著蛋白-11拮抗劑結(jié)合到另一種鈣黏著蛋白 蛋白(例如，MN--鈣黏著蛋白、鈣黏著蛋白-8)的一個(gè)ECl結(jié)構(gòu)域上的親和力大至少約5 倍、優(yōu)選至少約10倍。在一種具體的實(shí)施方案中，特異性地結(jié)合到一種鈣黏著蛋白-11蛋 白的一個(gè)ECl結(jié)構(gòu)域上的鈣黏著蛋白-11拮抗劑以一種親和力與一種表位相結(jié)合，該表位存在于SEQ IDNO :3、人類(lèi)鈣黏著蛋白-11的ECl結(jié)構(gòu)域的N端部分中，該親和力比該鈣黏 著蛋白-11拮抗劑與存在于SEQ ID NO :4、人類(lèi)麗鈣黏著蛋白的ECl結(jié)構(gòu)域的N端部分中 的一種表位相結(jié)合的親和力以及該鈣黏著蛋白-11拮抗劑與存在于SEQ ID N0:5、人類(lèi)鈣 黏著蛋白_8的ECl結(jié)構(gòu)域的N端部分中的一種表位相結(jié)合的親和力大至少約5倍、優(yōu)選至 少約10倍。如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“抗體”旨在涵蓋整個(gè)抗體以及抗體片段(例如，抗體的抗原 結(jié)合片段，例如Fv、FC、Fd、Fab、Fab'、F(ab')、以及dAb片段)?！翱贵w”是指多克隆和單 克隆抗體，并且包括自然發(fā)生的以及工程化處理的抗體。因此，術(shù)語(yǔ)“抗體”包括例如人類(lèi) 的、嵌合的、人源化的、靈長(zhǎng)源化的(primatized)、鑲飾的(veneered)、單鏈的、以及結(jié)構(gòu)域 抗體(dAb) ο (參見(jiàn)例如 Harlow et al. ,Antibodies A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988)。術(shù)語(yǔ)“表位”是指由一種免疫球蛋白VH/\對(duì)常規(guī)地結(jié)合的一種結(jié)構(gòu)單元。一種表 位限定了對(duì)一種抗體的最小結(jié)合部位，并且因此代表一種抗體的靶特異性。術(shù)語(yǔ)“融合蛋白”是指一種自然發(fā)生的、合成的、半合成的、或重組的單一蛋白分 子，該蛋白分子包括兩種或多種異源多肽的的全部或一部分。術(shù)語(yǔ)“多肽”是指一種氨基酸聚合體，而沒(méi)有特定的長(zhǎng)度；因此，肽、低聚肽、以及蛋 白是包括在一種多肽的定義之內(nèi)的。如在此所使用的，術(shù)語(yǔ)“肽”是指一種化合物，該化合物由從大約2個(gè)至大約100個(gè) 氨基酸殘基組成，其中一個(gè)氨基酸的氨基基團(tuán)是通過(guò)一種肽鍵而連接至另一種氨基酸的羧 基基團(tuán)上的。此類(lèi)肽在長(zhǎng)度上典型地是小于約100個(gè)氨基酸殘基，并且優(yōu)選為約10、約20、 約30、約40、或約50個(gè)殘基。如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“模擬肽”是指多種分子，這些分子不是肽或蛋白、但是它們模 擬了這些肽或蛋白的結(jié)構(gòu)的多個(gè)方面。模擬肽拮抗劑可以是通過(guò)常規(guī)的化學(xué)方法來(lái)制備的 (參見(jiàn)，例如 Damewood J. R. “Peptide Mimetic Design with the Aid of Computational Chemistry，，in Reviews in Computational Biology，2007，Vol. 9, pp. 1-80, John Wiley and Sons，Inc.，New York，1996 ；Kazmierski W. K.，“Methods of Molecular Medicine Peptidomimetic Protocols，，，Humana Press, New Jersey，1999)。如在此所定義的、“治療”是將一種具體的治療性或預(yù)防性(prophalytic)試劑給 予受試者(例如，一種哺乳動(dòng)物、人)，這產(chǎn)生了對(duì)于該受試者的一種令人希望的治療性或 預(yù)防性益處。如在此所定義的，一種“治療方案”是一種方案，其中將一種或多種治療性或預(yù)防 性試劑以一種具體的劑量(例如，水平、量值、數(shù)量)并且在一種具體的時(shí)間表上或以具體 的間隔(例如，數(shù)分鐘、數(shù)天、數(shù)周、數(shù)月)給予哺乳動(dòng)物受試者。如在此所定義的，一種“治療有效量”是一種量值，該量值足以在給藥條件下達(dá)到 所希望的治療性或預(yù)防性效應(yīng)，例如足以在一個(gè)關(guān)節(jié)中抑制(即降低、防止)炎癥(例如， 通過(guò)抑制細(xì)胞(例如，表達(dá)鈣黏著蛋白-11的滑膜細(xì)胞)的聚集)的一種量值。一種治療 效力(例如，在一個(gè)關(guān)節(jié)中降低炎癥和/或在一個(gè)關(guān)節(jié)中防止炎癥)可以是通過(guò)適當(dāng)?shù)姆?法(例如，成像方法，如MRI、NMR、CT)來(lái)確定的。鈣黏著蛋白
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鈣黏著蛋白屬于Ca2+依賴(lài)性黏附分子大家族，這些分子以一種同型的方式通過(guò)結(jié) 合到其他鈣黏著蛋白上而介導(dǎo)了細(xì)胞黏附(MJ Wheelock and KR Johnson, Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 19 =207-235 (2003)) 0經(jīng)典的鈣黏著蛋白是單次跨膜蛋白質(zhì)，它們含有五個(gè)細(xì)胞 外鈣黏著蛋白(EC)結(jié)構(gòu)域(每個(gè)的長(zhǎng)度大約為110個(gè)氨基酸)、一個(gè)跨膜區(qū)、以及一個(gè)保守 的胞質(zhì)域。鈣黏著蛋白基于在這些EC結(jié)構(gòu)域之間的同源性程度而被分成I型或II型鈣黏 著蛋白。II型鈣黏著蛋白包括人類(lèi)鈣黏著蛋白-5、_6、-8、-11、以及-12、以及MN-鈣黏著 蛋白。這些胞外域中的每一個(gè)在介導(dǎo)細(xì)胞間結(jié)合中的作用的相對(duì)重要性是不清楚的。鈣黏著蛋白-11在滑膜細(xì)胞中的活性鈣黏著蛋白-11在可活動(dòng)的關(guān)節(jié)的滑液內(nèi)層中介導(dǎo)了滑膜細(xì)胞與滑膜細(xì)胞的 結(jié)合(Valencia et al.，J. Exp. Med. 200(12) 1673-1679 (2004) ；Kiener and Brenner, Arthritis Res Ther. 7 (2) :49_54 (2005))。一種融合蛋白(該融合蛋白包括人類(lèi)鈣黏著蛋 白-11的所有五種細(xì)胞外鈣黏著蛋白結(jié)構(gòu)域、融合至人類(lèi)IgG2的鉸鏈-CH2-CH3結(jié)構(gòu)域上) 在體外抑制了滑膜細(xì)胞內(nèi)層的形成(Kiener et al.，Am. J. Pathol. 168 (2006))。另外，拮 抗性的抗鈣黏著蛋白-11抗體以及一種融合蛋白(包括鼠鈣黏著蛋白-11的EC1-5、融合至 鼠IgG2a的鉸鏈-CH2-CH3結(jié)構(gòu)域上)在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的鼠模型中抑制了炎癥和關(guān)節(jié)腫 脹(Lee et al.，Science 315:1006-1010(2007))。鈣黏著蛋白-11拮抗劑本發(fā)明的一種鈣黏著蛋白-11拮抗劑可以是特異性地結(jié)合到一種鈣黏著蛋白-11 蛋白的一個(gè)ECl結(jié)構(gòu)域上、并且在細(xì)胞中抑制(例如，減少、防止)一種或多種鈣黏著蛋 白-11-介導(dǎo)的活性的任何試劑。鈣黏著蛋白-11-介導(dǎo)的活性包括但不限于在細(xì)胞表面上 表達(dá)鈣黏著蛋白-11的細(xì)胞的聚集、以及多種因子(例如像，膠原酶、絲氨酸蛋白酶、MMP1、 匪 3、11^-6、11^-8、或1^瓶17^1^^^)的表達(dá)或分泌。該試劑除其他之外還可以是一種抗體、 融合蛋白、肽、模擬肽、小分子、或核酸。鈣黏著蛋白-11抗體如在此所說(shuō)明的，與人類(lèi)鈣黏著蛋白-11的ECl結(jié)構(gòu)域的N端部分(它包括Cad-Il 的供體序列和鈣黏著蛋白結(jié)合口袋)(例如SEQ IDNO 3)內(nèi)的一種表位相結(jié)合的抗體與結(jié) 合到這種蛋白的其他區(qū)域中的表位的抗體相比，在體外更加有效地阻斷了鈣黏著蛋白-11 活性(見(jiàn)實(shí)例1和2)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供看一種抗體或它的抗原結(jié)合片段，它與一種 表位相結(jié)合(例如，特異性地結(jié)合)，該表位存在于一種鈣黏著蛋白-11蛋白的ECl結(jié)構(gòu) 域的N端部分中，該部分包括Cad-Il的供體序列和鈣黏著蛋白結(jié)合口袋。術(shù)語(yǔ)“抗體”旨 在涵蓋所有類(lèi)型的多克隆和單克隆抗體(例如，人類(lèi)的、嵌合的、人源化的、靈長(zhǎng)源化的、鑲 飾的、單鏈、結(jié)構(gòu)域抗體(dAb))、以及抗體的抗原結(jié)合片段(例如Fv、Fe、Fd、Fab、Fab'、 F(ab' )、dAb)。(參見(jiàn)，例如 Harlow et al. , Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory，1988)。在一種具體的實(shí)施方案中，這種Cad-IlECl結(jié)構(gòu)域特 異性抗體是一種人類(lèi)抗體或人源化抗體。Cad-IlECl結(jié)構(gòu)域特異性抗體還可以被直接或間 接地連接至一種細(xì)胞毒劑上。特異性地結(jié)合到一種Cad-Il蛋白的ECl結(jié)構(gòu)域的N端部分上并且抑制該Cad-Il 蛋白活性的其他抗體或抗體片段還可以通過(guò)常規(guī)的方法或其他適用的技術(shù)來(lái)進(jìn)行生產(chǎn)、構(gòu)建、工程化處理、和/或分離。例如，對(duì)于一種鈣黏著蛋白-11的ECl結(jié)構(gòu)域特異的抗體可 以對(duì)抗一種適當(dāng)?shù)拿庖咴a(chǎn)生，例如一種重組哺乳動(dòng)物(例如，人類(lèi))鈣黏著蛋白-IlECl 結(jié)構(gòu)域肽(例如SEQ ID NO 3)或它的一部分(包括合成分子，例如合成肽)。已經(jīng)說(shuō)明了不 同的方法(參見(jiàn)，例如Kohler et al. ,Nature, 256 :495_497 (1975)以及Eur. J. Immunol. 6 511-519(1976) ；Milstein et al. , Nature 266 550-552(1977) ；Koprowski et al., U.S.Patent No. 4, 172, 124 ；Harlow, Ε.and D.Lane,1988, Antibodies :A Laboratory Manual,(ColdSpring Harbor Laboratory :Cold Spring Harbor,NY) ；Current Protocols In Molecular Biology,Vol. 2(Supplement 27,Summer' 94),Ausubel,F. M. et al. ,Eds., (John Wiley & Sons =New York, NY)，Chapter 11，(1991))?？贵w還可以通過(guò)用表達(dá)鈣黏 著蛋白-11的ECl結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞(例如，癌細(xì)胞/細(xì)胞系)或被工程化處理為表達(dá)鈣黏著 蛋白-11的ECl結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞(例如，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞)對(duì)一種適當(dāng)?shù)乃拗?例如，小鼠)進(jìn) 行免疫而產(chǎn)生。(參見(jiàn)，例如 Chuntharapai et al. , J. Immunol, 152 1783-1789 (1994)； Chuntharapai等的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，440，021)。為了生產(chǎn)單克隆抗體，可以通過(guò)將一種適當(dāng)?shù)?無(wú)限增殖性細(xì)胞系(例如，一種骨髓瘤細(xì)胞系，如SP2/0或P3X63Ag8. 653)與產(chǎn)生抗體的細(xì) 胞進(jìn)行融合而產(chǎn)生一種雜交瘤。這些產(chǎn)生抗體的細(xì)胞可以是從用所感興趣的抗原進(jìn)行免疫 的人或其他適當(dāng)?shù)膭?dòng)物的外周血、或優(yōu)選脾或淋巴結(jié)而獲得的。這些融合的細(xì)胞(雜交瘤) 可以是使用選擇性培養(yǎng)條件來(lái)分離的，并且通過(guò)有限稀釋而被克隆。具有所希望的特異性 的、產(chǎn)生抗體的細(xì)胞可以通過(guò)一種適當(dāng)?shù)臏y(cè)定來(lái)進(jìn)行選擇(例如，ELISA)?？贵w片段可以是通過(guò)酶促切割或通過(guò)重組技術(shù)而產(chǎn)生的。例如，木瓜蛋白酶或胃 蛋白酶切割可以對(duì)應(yīng)地產(chǎn)生Fab或F(ab' )2片段。具有必要的底物特異性的其他蛋白酶 也可以用于產(chǎn)生Fab或F(ab' )2片段。還可以使用抗體基因來(lái)產(chǎn)生不同的平截形式的抗 體，在這些基因中一種或多種終止密碼子已經(jīng)被引入該自然的終止位點(diǎn)的上游。例如，對(duì)一 個(gè)F(ab' )2重鏈部分進(jìn)行編碼的嵌合基因可以被設(shè)計(jì)成包括對(duì)該重鏈的CH1結(jié)構(gòu)域和絞 鏈區(qū)進(jìn)行編碼的DNA序列。單鏈抗體，以及人類(lèi)的、嵌合的、人源化的、或靈長(zhǎng)源化的(CDR 移植的)、或鑲飾的抗體，連同嵌合的、CDR移植的、或鑲飾的單鏈抗體(包括由不同物種衍 生的部分)，以及類(lèi)似物也由本發(fā)明以及術(shù)語(yǔ)“抗體”所涵蓋。這些抗體的不同部分可以 由常規(guī)技術(shù)通過(guò)化學(xué)方式連接在一起，或可以使用遺傳工程技術(shù)制備為一種連續(xù)蛋白。例 如，可以對(duì)編碼了一種嵌合的或人源化的鏈的核酸進(jìn)行表達(dá)以產(chǎn)生一種連續(xù)蛋白。參見(jiàn)， 例如Cabilly等人，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，816，567 ；Cabilly等人，歐洲專(zhuān)利號(hào)O, 125，023B1 ；Boss 等人，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，816，397 ；Boss等人，歐洲專(zhuān)利號(hào)O, 120，694B1 ；Neuberger, M. S.等 人，WO 86/01533 ；Neuberger, M. S.等人，歐洲專(zhuān)利號(hào) O, 194，276B1 ；Winter，美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 5，225，539 ；Winter,歐洲專(zhuān)利號(hào) O, 239，400B 1 ；Queen 等人，歐洲專(zhuān)利號(hào) O 451 216B1 ；以 R Padlan, Ε. A.等人，EP O 519 596A1。還參見(jiàn) Newman，R. . et al.，BioTechnology, 10 1455-1460 (1992)(關(guān)于靈長(zhǎng)源化的抗體)，以及Ladner等人，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，946，778和 Bird, R. Ε. et al.，Science, 242 :423_426 (1988))(關(guān)于單鏈抗體)。人源化的抗體可以使用標(biāo)準(zhǔn)方法或其他適當(dāng)?shù)募夹g(shù)、使用合成或重組DNA技術(shù) 來(lái)進(jìn)行生產(chǎn)。對(duì)人源化的可變區(qū)進(jìn)行編碼的核酸(例如cDNA)序列還可以使用PCR誘變 方法進(jìn)行構(gòu)建，從而改變對(duì)一種人類(lèi)或人源化的鏈進(jìn)行編碼的DNA序列，例如來(lái)自一種之 前被人源化的可變區(qū)的DNA模板(參見(jiàn)，例如Kamman, M.，et al.，Nucl. Acids Res.，17 5404(1989)) ；Sato, K. ,et al. , Cancer Research，53 :851_856(1993) ；Daugherty,B. L. et al.，Nucleic Acids Res. , 19(9) :2471_2476 (1991)；以及 Lewis，A. P. and J. S. Crowe, Gene,101 =297-302 (1991)) 0使用這些或其他適當(dāng)?shù)姆椒?，還可以容易地產(chǎn)生多種變體。在 一個(gè)實(shí)施方案中，可以對(duì)經(jīng)克隆的可變區(qū)(例如dAb)進(jìn)行突變，并且可以選擇具有令人希 望的特異性的編碼變體的序列(例如，來(lái)自一種噬菌體文庫(kù)；參見(jiàn)，例如Krebber等人，美國(guó) 5，514，548 ；Hoogenboom 等人，WO 93/06213，于 1993 年 4 月 1 日公布)。可以使用產(chǎn)生或分離具有這些必需特異性的抗體的其他適當(dāng)方法，包括例如從 一個(gè)文庫(kù)(例如，噬菌體展示文庫(kù))中選擇一種重組抗體或抗體結(jié)合片段(例如，dAb) 的方法、或依賴(lài)于對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如，小鼠)進(jìn)行免疫的方法。能夠生產(chǎn)人類(lèi)抗體表達(dá) 譜的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在本領(lǐng)域中是眾所周知的(例如，[Xenomouse (Abgenix，F(xiàn)remont, CA))，并且是可以使用適當(dāng)?shù)姆椒▉?lái)生產(chǎn)的(參見(jiàn)，例如Jakobovits et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90 2551-2555(1993) Jakobovits et al. , Nature,362 255-258(1993)； Lonberg等人，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，545，806 ；Surani等人，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，545，807 ；Lonberg等人， WO 97/13852)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涵蓋了一種Cad-Il抗體，該Cad-Il抗體與一種表位相 結(jié)合，該表位存在于人類(lèi)Cad-Il的ECl結(jié)構(gòu)域的前大約37個(gè)氨基酸(SEQ ID NO :13)中。 在一種具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種Cad-Il抗體，該Cad-Il抗體與一種表位相結(jié) 合，該表位存在于SEQ ID N0:10中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種Cad-Il抗體， 該Cad-Il抗體與一種表位相結(jié)合，該表位包括SEQ ID NO=Il0在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā) 明涉及一種Cad-Il抗體，該Cad-Il抗體與一種表位相結(jié)合，該表位存在于SEQ ID NO 12 中。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及由雜交瘤HlMl ( ATCC登錄號(hào)
_)產(chǎn)生的一種Cad-Il抗體，該抗體已經(jīng)于2009年1月8日保存
在美國(guó)種質(zhì)保存中心(ATCC), P. O. Box 1549，Manassas，Virginia 20108, 美國(guó)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了由雜交瘤Η14 (ATCC登錄
號(hào)_)產(chǎn)生的一種Cad-Il抗體，該抗體已經(jīng)于2009年1月8日保
存在美國(guó)種質(zhì)保存中心(ATCC)，P. O. Box 1549，Manassas, Virginia 20108,美國(guó)。本發(fā)明還涵蓋多種抗體，這些抗體與由雜交瘤HlMl產(chǎn)生的一種Cad-Il抗體和/ 或由雜交瘤H14產(chǎn)生的一種Cad-11抗體特異性地競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合到一種人類(lèi)Cad-11蛋白或它的 一種含ECl-結(jié)構(gòu)域的部分上(例如SEQID N0:3、10、12、13)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中， 特異性地與由雜交瘤HlMl和/或雜交瘤H14產(chǎn)生的一種Cad-Il抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)的抗體阻斷 (例如，抑制、減少、防止)由雜交瘤HlMl和/或雜交瘤H14產(chǎn)生的一種Cad-Il抗體與一種 人類(lèi)Cad-Il蛋白或它的含ECl-結(jié)構(gòu)域的部分(例如，SEQ ID NO :3、10、12、13)的結(jié)合。此外，本發(fā)明涵蓋了多種抗體，這些抗體具有對(duì)于一種人類(lèi)Cad-Il蛋白或它的含 ECl-結(jié)構(gòu)域的部分(例如，SEQ ID NO :3、10、12、13)的結(jié)合親和力，該結(jié)合親和力是至少與由雜交瘤HlMl產(chǎn)生的一種Cad-Il抗體和/或由雜交瘤H14產(chǎn)生的一種Cad-Il抗體對(duì)于 一種人類(lèi)Cad-Il蛋白或它的含ECl-結(jié)構(gòu)域的部分的結(jié)合親和力一樣大。鈣黏著蛋白-11融合蛋白此外，與包括Cad-Il的EC區(qū)域的一種更大部分的一種融合蛋白(它包含所有5 個(gè)EC結(jié)構(gòu)域)相比，僅包含人類(lèi)Cad-Il的ECl結(jié)構(gòu)域(例如，與人類(lèi)IgG的一部分相融合 的人類(lèi)Cad-Il的ECl結(jié)構(gòu)域)的免疫球蛋白融合蛋白在體外更加有效地抑制了 Cad-Il活性。鈣黏著蛋白-11拮抗劑還涵蓋了嵌合的、或融合的蛋白，這些蛋白包括可操作地 連接至一種異源蛋白質(zhì)的全部或一部分上的人類(lèi)Cad-Il的ECl結(jié)構(gòu)域的至少約N-端的35 個(gè)氨基酸(SEQ ID NO :2)?！翱刹僮鞯剡B接”是指該Cad-IlECl結(jié)構(gòu)域的部分與該異源蛋白 質(zhì)被框內(nèi)融合(fused in-frame)。該異源蛋白質(zhì)可以被融合至該蛋白的N-端或C-端上。 例如，該融合蛋白可以是一種GST融合蛋白，其中這些蛋白序列被融合到一種GST序列的C 端上。其他類(lèi)型的融合蛋白包括但不限于酶性的融合蛋白，例如半乳糖苷酶融合蛋 白、酵母雙雜交GAL融合蛋白、聚組氨酸融合體、FLAG-標(biāo)記的融合蛋白、GFP融合蛋白、以 及免疫球蛋白(Ig)融合蛋白。這種融合蛋白可以促進(jìn)純化(例如，一種重組融合蛋白的純 化)。在某些宿主細(xì)胞中(例如，哺乳動(dòng)物的宿主細(xì)胞)，可以通過(guò)使用一種異源的信號(hào)序 列來(lái)增加一種蛋白的表達(dá)和/或分泌。因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，該融合蛋白在其N(xiāo)端包 含一種異源的信號(hào)序列。EP-A-0464533披露了多種融合蛋白，這些融合蛋白包括免疫球蛋白恒定區(qū)的不 同部分。該Fc在治療和診斷方面是有用的，并且因此產(chǎn)生了(例如)改進(jìn)的藥物代謝 動(dòng)力學(xué)特性(參見(jiàn)，例如EP-A0232262)。在藥物發(fā)現(xiàn)方面，例如，出于高通量篩選測(cè)定的 目的，已經(jīng)將人類(lèi)蛋白與Fc部分進(jìn)行融合以識(shí)別拮抗劑(Bennett et al. , Journal of Molecular Recognition 8:52-58(1995) ； Johanson et al. , J. Biol. Chem. , 270 (16) 9459-9471(1995))。因此，這項(xiàng)發(fā)明還涵蓋了可溶的融合蛋白，這些融合蛋白包含本發(fā)明的 一種蛋白Cad-Il拮抗劑、以及不同子類(lèi)的免疫球蛋白的重鏈和/或輕鏈的恒定區(qū)的不同部 分(例如，IgG, IgM, IgA, IgE)。本發(fā)明的免疫球蛋白融合蛋白的優(yōu)點(diǎn)包括以下各項(xiàng)中的一 個(gè)或多個(gè)(1)由于得到的二價(jià)的二聚融合蛋白，對(duì)于多價(jià)配體的增加的親合力，(2)更長(zhǎng) 的血清半衰期，(3)經(jīng)由該Fc結(jié)構(gòu)域激活效應(yīng)細(xì)胞的能力，(4)易于純化(例如，通過(guò)蛋白 A層析)、(5)對(duì)于Cad-Il的親和力以及，(6)阻斷Cad-Il介導(dǎo)的活性的能力。因此，在具體的實(shí)施方案中，該Cad-Il拮抗劑是一種融合蛋白，該融合蛋白包括 一種鈣黏著蛋白-11蛋白的胞外區(qū)的一部分，它包括可操作地連接至一種哺乳動(dòng)物免疫球 蛋白的全部或一部分上的ECl結(jié)構(gòu)域的N-端部分(SEQ ID NO 2的氨基酸54-90)。在一 個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的這些免疫球蛋白融合蛋白并不包括鈣黏著蛋白-11的胞外 區(qū)的一部分，該部分包括在SEQ ID NO 2的氨基酸1-609內(nèi)所包含的全部5個(gè)EC結(jié)構(gòu)域。 在某些實(shí)施方案中，該人類(lèi)鈣黏著蛋白-11胞外區(qū)的部分可以包括例如SEQ ID N0:2的氨 基酸1-160、氨基酸1-259、或氨基酸1-269。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，該融合蛋白缺乏人 類(lèi)鈣黏著蛋白-11的前導(dǎo)序列和前體區(qū)域(pro-region) (SEQ ID NO 2的氨基酸1-53)，并 且使用了一種異源性(heterogologous)前導(dǎo)序列。該免疫球蛋白部分可以來(lái)自任何脊椎 動(dòng)物來(lái)源，如鼠類(lèi)，但優(yōu)選地是一種人類(lèi)免疫球蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，該哺乳動(dòng)物免疫球蛋白是一種人類(lèi)IgG2蛋白或它的一部分，例如人類(lèi)IgG2的鉸鏈-CH2-CH3部分。本發(fā)明的一種嵌合的或融合的蛋白可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)。例 如，對(duì)不同的蛋白序列(例如，一種Cad-IlECl結(jié)構(gòu)域肽以及一種哺乳動(dòng)物免疫球蛋白)進(jìn) 行編碼的DNA片段按照常規(guī)的技術(shù)一起進(jìn)行框內(nèi)連接在另一個(gè)實(shí)施方案中，該融合基因可 以通過(guò)多種常規(guī)技術(shù)(包括自動(dòng)化的DNA合成儀)進(jìn)行合成。可替代地，可以使用錨定引物 進(jìn)行核酸片段的PCR擴(kuò)增，這些錨定引物在兩個(gè)連續(xù)的核酸片段之間產(chǎn)生互補(bǔ)的突出端， 這些核酸片段隨后可以進(jìn)行退火和再擴(kuò)增從而產(chǎn)生一種嵌合的核酸序列(參見(jiàn)，Ausubel et al. , Current Protocols in Molecular Biology, 1992)。此夕卜,許多表達(dá)載體是可商 購(gòu)獲得的，它們已經(jīng)編碼了一個(gè)融合部分(例如，一個(gè)GST部分、一個(gè)Fc部分)?？梢詫⒕?碼了蛋白Cad-Il拮抗劑的一種核酸分子克隆到這種表達(dá)載體中，這樣使得該融合部分(例 如，免疫球蛋白)被框內(nèi)連接至該蛋白上。本發(fā)明的免疫球蛋白融合蛋白可以作為單體、二聚體、四聚體、或其他多聚體(例 如，聚合體)進(jìn)行提供。例如，該融合蛋白的免疫球蛋白部分的可變域可以通過(guò)以下方式連 接在一起以形成多價(jià)配體，例如在每個(gè)V結(jié)構(gòu)域的C端提供一種絞鏈區(qū)以及在這些絞鏈區(qū) 中的半胱氨酸之間提供二硫鍵；或提供多種重鏈，這些重鏈中的每一個(gè)在該結(jié)構(gòu)域的C端 上具有一個(gè)半胱氨酸，這些半胱氨酸由二硫鍵連接在一起；或產(chǎn)生V-CH和V-CL以產(chǎn)生一種 Fab形式；或使用肽接頭(例如，Gly4Ser接頭)從而產(chǎn)生二聚體、三聚體、以及其他多聚體。 例如，這類(lèi)配體可以與一種抗體Fc區(qū)相連接，該Fc區(qū)域包括CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或這 兩者、以及可任選的一個(gè)絞鏈區(qū)。例如，對(duì)多種配體進(jìn)行編碼的載體(作為一種單一的核苷 酸序列與一個(gè)Fc區(qū)相連接)可以用于制備此類(lèi)配體(例如，通過(guò)表達(dá))。本發(fā)明的免疫球蛋白融合蛋白可以與其他部分相偶聯(lián)，這些部分包括但不限于 聚乙二醇(PEG)的多聚體或它們的衍生物(例如，聚甲基乙二醇)、放射性核素、細(xì)胞毒性試 劑和藥物，并且隨后用于體內(nèi)治療。放射性核素的例子除其他之外還包括包括212Bi、mI、 186Re,以及9°Y。這些放射性核素通過(guò)局部照射這些細(xì)胞來(lái)發(fā)揮它們的細(xì)胞毒性效應(yīng)，導(dǎo)致 不同的細(xì)胞內(nèi)損害，正如放療領(lǐng)域內(nèi)所已知?？梢耘c這些融合蛋白相偶聯(lián)的細(xì)胞毒性藥物 包括但不限于柔紅霉素、阿霉素、甲氨蝶呤、以及絲裂霉素C。細(xì)胞毒性藥物類(lèi)妨礙了關(guān)鍵 的細(xì)胞加工，包括DNA、RNA、以及蛋白質(zhì)合成。對(duì)于這些類(lèi)別的藥物(它們?cè)诒绢I(lǐng)域中是 已知的)、以及它們的作用機(jī)制的更加充分的展示，參見(jiàn)Goodman，A. G.，et al.，Goodman and Gilman ‘ s The Pharmacological Basis of Therapeutics,8th Ed. , Macmillan Publishing Col,1990,Katzung,ed. ,Basic and Clinical Pharmacology,Fifth Edition, ρ 768-769，808-809，896，Appleton and Lange，Norwalk，Conn。如在此所使用的，術(shù)語(yǔ)“免疫球蛋白融合蛋白，，包括本發(fā)明的這些免疫球蛋白融合 蛋白的片段。此類(lèi)片段旨在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，一旦這些分子被分離，可以用蛋白酶對(duì) 它們進(jìn)行切割從而產(chǎn)生仍然能夠與人類(lèi)Cad-Il的ECl結(jié)構(gòu)域相結(jié)合的片段。肽拮抗劑本發(fā)明的鈣黏著蛋白-11拮抗劑還可以是與一種鈣黏著蛋白-11蛋白的ECl結(jié) 構(gòu)域相結(jié)合的肽。這種肽可以包括任何適當(dāng)?shù)腖-和/或D-氨基酸，例如常見(jiàn)的α-氨基 酸(例如，丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸)、非-α-氨基酸(例如，β-丙氨酸、4-氨基丁酸、6-氨 基己酸、肌氨酸、抑胃酶氨酸(statine))、以及不常見(jiàn)的氨基酸(例如，瓜氨酸、同型瓜氨
16酸(homocitruline)、同型絲氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、鳥(niǎo)氨酸)。在一種肽上的氨基、羧 基和/或其他官能團(tuán)可以是游離的(例如，未被修飾)或用一種適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基團(tuán)進(jìn)行保護(hù) 的。針對(duì)氨基基團(tuán)和羧基基團(tuán)的適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基團(tuán)、以及用于加入或去除保護(hù)基團(tuán)的方法在 本領(lǐng)域內(nèi)是已知的，并且被披露于例如Green and ffuts,"Protecting Groups in Organic Synthesis”，John Wiley and Sons，1991。一種肽的官能團(tuán)還可以使用領(lǐng)域已知的多種方 法進(jìn)行衍生(例如，烷基化)。若希望，這種肽Cad-Il拮抗劑可以包括一種或多種修改(例如，氨基酸接頭、酰化 作用、乙酰化作用、酰胺化作用、甲基化作用、末端修飾劑(例如，環(huán)化修飾作用))。這種肽 還可以含有化學(xué)修飾作用(例如，N-甲基-α-氨基取代)。此外，這種肽拮抗劑可以是一 種已知的和/或自然發(fā)生的肽的類(lèi)似物，例如具有一種或多種保守的氨基酸殘基取代的肽 類(lèi)似物。這些修飾可以改進(jìn)這種肽的不同的特性(例如，溶解度、結(jié)合性)，包括它的鈣黏著 蛋白-11拮抗劑活性。Cad-Il拮抗劑(它們是肽)可以是直鏈的、支鏈或環(huán)狀的，例如具有一種雜原子 環(huán)狀結(jié)構(gòu)(包括若干酰胺鍵)的肽。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，該肽是一種環(huán)肽。此類(lèi)肽 可以由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員使用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)來(lái)進(jìn)行產(chǎn)生。例如，一種肽可以通過(guò)酶促 或化學(xué)切割從一種天然蛋白衍生或去除，或可以通過(guò)適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行合成，例如固相肽合 成(例如，梅里菲爾德型合成(Merrifield-type synthesis)(參見(jiàn)，例如Bodanszky et al. "Peptide Synthesis，，，John Wiley & Sons, Second Edition，1976))。作為鈣黏著蛋 白-11拮抗劑的肽還可以使用(例如)重組DNA方法學(xué)或其他適當(dāng)?shù)亩喾N方法進(jìn)行生產(chǎn) (參見(jiàn)，例如 Sambrook J. and Russell D. W. , Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001)。這些肽可以被合成并且裝配到文庫(kù)種，這些文庫(kù)包括少許至許多離散的分子種 類(lèi)。此類(lèi)文庫(kù)可以使用組合化學(xué)的方法戶(hù)必須報(bào)告制備，并且可以使用任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn) 行篩選以確定該文庫(kù)是否包括具有一種令人希望的生物活性的肽。然后，可以使用適當(dāng)?shù)?方法將此類(lèi)肽拮抗劑分離。模擬肽拮抗劑鈣黏著蛋白-11拮抗劑還可以是模擬肽。例如，可以制備具有與肽類(lèi)具有相同官 能團(tuán)的多糖?？梢詫?duì)多種模擬肽進(jìn)行設(shè)計(jì)，這是(例如)通過(guò)在該環(huán)境中建立一種肽試劑 的三維結(jié)構(gòu)來(lái)進(jìn)行的，其中該試劑結(jié)合到或?qū)⒁Y(jié)合到一種靶分子上。該模擬肽包括至少 兩種組分這種或這些結(jié)合部分以及主鏈或支撐結(jié)構(gòu)。這些結(jié)合部分是以下化學(xué)原子或基團(tuán)，它們將與一種靶分子(例如，與Cad-Il的 ECl結(jié)構(gòu)域中具有氨基酸)進(jìn)行反應(yīng)或與其形成一種復(fù)合物(例如，通過(guò)疏水性或離子相互 作用)。例如，在一種模擬肽中這些結(jié)合部分可以與在一種肽或蛋白拮抗劑中的那些相同。 這些結(jié)合部分可以是一種原子或化學(xué)基團(tuán)，它與該受體按照與該肽拮抗劑中的結(jié)合部分相 同或相似的方式進(jìn)行反應(yīng)。例如，計(jì)算化學(xué)可用于設(shè)計(jì)一種鈣黏著蛋白-11蛋白的ECl結(jié) 構(gòu)域的供體序列的肽模擬物，例如它可以與在Cad-Il蛋白的ECl結(jié)構(gòu)域中的口袋序列相結(jié) 合。適合用于針對(duì)一種肽中的堿性氨基酸進(jìn)行設(shè)計(jì)的模擬肽的結(jié)合部分的例子包括含氮基 團(tuán)，如胺類(lèi)、銨類(lèi)、胍類(lèi)、以及酰胺類(lèi)或磷鐺類(lèi)。適合用于針對(duì)一種酸性氨基酸進(jìn)行設(shè)計(jì)的模擬肽的結(jié)合部分的例子包括例如羧基、低級(jí)烷基羧酸酯、磺酸、一種低級(jí)烷基磺酸酯、或亞 磷酸或它的酯。該支撐結(jié)構(gòu)是以下化學(xué)實(shí)體，該化學(xué)實(shí)體當(dāng)這種或這些結(jié)合部分結(jié)合時(shí)提供了該 模擬肽的三維構(gòu)型。該支撐結(jié)構(gòu)可以是有機(jī)的或無(wú)機(jī)的。有機(jī)支撐結(jié)構(gòu)的例子包括多糖、 聚合物、或有機(jī)合成的聚合物的寡聚體(如聚乙烯醇或聚丙交酯)。優(yōu)選的是該支撐結(jié)構(gòu)基 本上具有與該肽主鏈或支撐結(jié)構(gòu)相同的大小和尺寸。這可以通過(guò)計(jì)算或測(cè)量這種肽和模擬 肽的原子和鍵的大小而確定。在一個(gè)實(shí)施方案中，這種肽鍵的氮可以用氧或硫取代，例如形 成一條聚酯主鏈。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該羰基可以用一種磺?；鶊F(tuán)或亞磺?；鶊F(tuán)取 代，從而形成一種聚酰胺(例如，一種聚磺酰胺)?？梢灾苽溥@種肽的反向酰胺(例如，將一 種或多種-CONH-基團(tuán)置換為一種-NHCO-基團(tuán))。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，這種肽主鏈可以 用一條聚硅烷主鏈取代。可以通過(guò)已知的方法來(lái)制造這些化合物。例如，一種聚酯模擬肽可以通過(guò)將一種 羥基基團(tuán)取代為在多種氨基酸上的對(duì)應(yīng)的α-氨基基團(tuán)來(lái)進(jìn)行制備，由此制備了一種羥 酸，并且將這些羥酸順序地酯化、可任選地將這種堿性和酸性側(cè)鏈阻擋以使副反應(yīng)最小化。 確定一種適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)合成路線(xiàn)大體上很容易在確定該化學(xué)結(jié)構(gòu)時(shí)進(jìn)行鑒定?？梢院铣啥喾N模擬肽并且將其裝配到文庫(kù)中，這些文庫(kù)包括少許至許多離散的分 子種類(lèi)?？梢允褂檬熘慕M合化學(xué)方法來(lái)制備此類(lèi)文庫(kù)，并且可以對(duì)其進(jìn)行篩選以確定該 文庫(kù)是否包括一種或多種模具有所希望的活性的擬肽。然后，可以通過(guò)適當(dāng)?shù)姆椒▽⒋祟?lèi) 模擬肽拮抗劑分離。小分子拮抗劑鈣黏著蛋白-11拮抗劑還可以是多種小分子。多種小分子的例子包括有機(jī)化合 物類(lèi)，有機(jī)金屬化合物類(lèi)，無(wú)機(jī)化合物類(lèi)，以及有機(jī)物的、有機(jī)金屬化合物的或無(wú)機(jī)化合物 的鹽類(lèi)。在一種小分子中的原子典型地通過(guò)共價(jià)的和/或離子鍵連接在一起。在一種小的 有機(jī)分子中原子的安排可以表示一條鏈(例如，一條碳_碳鏈或一條碳_雜原子鏈)、或可 以表示一種包含多個(gè)碳原子的環(huán)，例如苯或一種聚環(huán)的系統(tǒng)、或碳與多個(gè)雜原子的組合，即 多個(gè)雜環(huán)，例如嘧啶或喹唑啉。盡管小分子可以具有任何分子量，它們大體上包括小于約 5，000道爾頓的分子。例如，此類(lèi)小分子可以是小于約1000道爾頓，并且優(yōu)選是小于約750 道爾頓、或更優(yōu)選是小于約500道爾頓。多種小分子以及其他非肽性鈣黏著蛋白-11拮抗劑 可以在自然界中發(fā)現(xiàn)(例如，識(shí)別的、分離的、純化的)和/或合成產(chǎn)生的(例如，通過(guò)傳統(tǒng) 的有機(jī)合成、生物-介導(dǎo)的合成、或它們的一種組合)。參見(jiàn)，例如Ganesan，Drug Discov. Today 7(1) :47_55 (2002 年 1 月)；Lou, Drug Discov. Today, 6 (24) :1288_1294 (2001 年 12 月)。自然發(fā)生的多種小分子的例子包括但不限于激素類(lèi)、神經(jīng)遞質(zhì)類(lèi)、核苷酸類(lèi)、氨基酸 類(lèi)、糖類(lèi)、脂質(zhì)類(lèi)、以及它們的衍生物。根據(jù)本發(fā)明的一種小分子鈣黏著蛋白-11拮抗劑以及它的生理學(xué)可接受的鹽類(lèi) 可以抑制一種鈣黏著蛋白-11蛋白的同型結(jié)合(例如，通過(guò)直接與一種Cad-Il的ECl結(jié)構(gòu) 域中的供體序列競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合到另一種鈣黏著蛋白-11的結(jié)合口袋上，通過(guò)直接與一種Cad-Il 蛋白的ECl結(jié)構(gòu)域中的結(jié)合口袋競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合到另一種鈣黏著蛋白-11的供體序列上)。核酸拮抗劑本發(fā)明的Cad-Il拮抗劑還可以是與一種人類(lèi)鈣黏著蛋白-11的ECl結(jié)構(gòu)域相結(jié)合的核酸分子(例如，寡核苷酸)。適當(dāng)?shù)暮怂酑ad-Il拮抗劑包括適體類(lèi)，它們能夠以高親 和力以及特異性通過(guò)除經(jīng)典的沃森-克里克(Watson-Crick)堿基配對(duì)以外的交互作用結(jié) 合到一種具體的感興趣的分子上(例如，人類(lèi)鈣黏著蛋白-11的ECl結(jié)構(gòu)域)(Tuerk and Gold, Science 249:505(1990) ；Ellington and Szostak, Nature 346:818(1990))。適體類(lèi)，與通過(guò)噬菌體展示或單克隆抗體(MAb)所產(chǎn)生的肽類(lèi)一樣能夠特異性地 結(jié)合到選定的靶標(biāo)上，并且通過(guò)結(jié)合、阻斷它們的靶標(biāo)發(fā)揮作用的能力。已經(jīng)針對(duì)超過(guò)100 種蛋白產(chǎn)生了由一種體外選擇過(guò)程從隨機(jī)序列寡核苷酸的集合體中生成的多種適體，這些 蛋白包括生長(zhǎng)因子類(lèi)、轉(zhuǎn)錄因子類(lèi)、酶類(lèi)、免疫球蛋白類(lèi)、以及受體類(lèi)。一種典型的適體其大 小為10至15kDa (30至45個(gè)核苷酸)、以亞納摩爾的親和力與其靶標(biāo)相結(jié)合、并且與密切相 關(guān)的靶標(biāo)相區(qū)分(例如，將典型地不與來(lái)自相同基因家族的其他蛋白相結(jié)合)。一系列的結(jié) 構(gòu)性研究已經(jīng)顯示多種適體能夠使用在抗體-抗原復(fù)合物中驅(qū)動(dòng)親和力和特異性的相同 類(lèi)型的結(jié)合相互作用(氫鍵、靜電的互補(bǔ)性、疏水性接觸、位阻排阻、等等)。與所感興趣的一種靶標(biāo)相結(jié)合的適體(例如，一種人類(lèi)Cad-Il蛋白的一種ECl結(jié) 構(gòu)域)可以使用一種被稱(chēng)為“通過(guò)指數(shù)富集對(duì)配體的系統(tǒng)進(jìn)化”(SELEX)的標(biāo)準(zhǔn)方法而進(jìn)行 產(chǎn)生和鑒定，該方法說(shuō)明于(例如)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，475，096和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，270，163。鈣黏著蛋白-11拮抗劑的鑒定具有鈣黏著蛋白-11結(jié)合特異性的多種試劑(包括多種小分子)可以在一種篩選 中進(jìn)行鑒定，例如多種化學(xué)化合物和/或文庫(kù)(例如，化學(xué)的、肽、核酸文庫(kù))的高通量篩 選。特異性地結(jié)合到人類(lèi)鈣黏著蛋白-11的ECl結(jié)構(gòu)域上的多種抗體可以(例如)通 過(guò)篩選可商購(gòu)的組合抗體文庫(kù)進(jìn)行鑒定(Dyax Corp. , MorphoSys AG)。篩選這些文庫(kù)的 多種適當(dāng)?shù)慕M合抗體文庫(kù)和標(biāo)準(zhǔn)方法說(shuō)明于Hoet et al. ,Nature Biotechnology 23(3) 344-348(2005)以及 Rauchenberger et al. , J. Biol. Chem. 278(40) :38194_38205 (2003)， 通過(guò)引用將其內(nèi)容結(jié)合在此。此類(lèi)文庫(kù)或多種分子的集合還可以使用熟知的化學(xué)方法進(jìn)行 制備?？商娲?，特異性地結(jié)合到人類(lèi)鈣黏著蛋白-11的ECl結(jié)構(gòu)域上的多種鼠抗體可 以(例如)通過(guò)用多種ECl蛋白結(jié)構(gòu)域或ECl肽連同一種佐劑對(duì)小鼠進(jìn)行免疫從而破壞對(duì) 該抗原的耐受性來(lái)進(jìn)行鑒定?？梢詫?duì)這些抗體篩選所希望的特異性和活性，并接著使用已 知的技術(shù)使其人源化以產(chǎn)生用于治療人類(lèi)疾病的適當(dāng)試劑?？梢詮脑S多可供使用的化學(xué)化合物文庫(kù)中鑒定多種化合物或小分子，這些文庫(kù)例 如來(lái)自國(guó)家癌癥研究所的化學(xué)資料檔案庫(kù)(the Chemical Repository of the National Cancer Institute)、以及分子文庫(kù)小分子資料檔案庫(kù)(the Molecular Libraries Small Molecules Repository) (PubChem)、連同哈佛大學(xué)化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究所文庫(kù)、以及 可以從商業(yè)來(lái)源中獲得的其他文庫(kù)(例如Chembridge, Peakdale, CEREP，MayBridge, Bionet)。此類(lèi)文庫(kù)或多種分子的集合還可以使用熟知的化學(xué)方法(例如，熟知的組合化學(xué) 方法)進(jìn)行制備?？梢詫?duì)這些文庫(kù)進(jìn)行篩選以鑒定結(jié)合并抑制鈣黏著蛋白-11的多種化合 物。經(jīng)鑒定的多種化合物可以充當(dāng)前導(dǎo)化合物用于使用藥物化學(xué)的多種熟知的方法 來(lái)進(jìn)行進(jìn)一步多樣化。例如，可以制備和篩選用于鈣黏著蛋白-11結(jié)合和/或抑制活性的
19多種化合物的集合(它們是該前導(dǎo)物的結(jié)構(gòu)變體)。這可以導(dǎo)致將這些化合物的結(jié)構(gòu)與生 物活性聯(lián)系起來(lái)的一種結(jié)構(gòu)活性關(guān)系的開(kāi)發(fā)。具有適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合和抑制活性的化合物可以被 進(jìn)一步開(kāi)發(fā)用于體內(nèi)用途?？梢詫?duì)于鈣黏著蛋白-11相結(jié)合的試劑進(jìn)一步評(píng)價(jià)鈣黏著蛋白-11拮抗劑活性。 例如，包括一種鈣黏著蛋白-11蛋白的組合物可用于一種篩選或結(jié)合測(cè)定，從而檢測(cè)和/或 鑒定結(jié)合并拮抗該鈣黏著蛋白-11蛋白的多種試劑。適合使用的多種組合物包括，例如自 然表達(dá)一種鈣黏著蛋白-11蛋白的細(xì)胞(例如，一種滑膜細(xì)胞)、此類(lèi)細(xì)胞的提取物、以及重 組鈣黏著蛋白-11蛋白?？梢栽谝环N競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定中鑒定與一種鈣黏著蛋白-11蛋白相結(jié)合的試劑，例 如其中評(píng)估了一種測(cè)試試劑抑制鈣黏著蛋白-11與一種參比試劑進(jìn)行結(jié)合的能力。該參比 試劑可以是一種全長(zhǎng)Cad-Il蛋白或它的包括該ECl結(jié)構(gòu)域的一部分。該參比試劑可以用 一種適當(dāng)?shù)臉?biāo)記物(例如，放射性同位素、表位標(biāo)記物、親和力標(biāo)簽(例如，生物素和抗生物 素蛋白或鏈霉親和素)、自旋標(biāo)簽、酶、熒光基團(tuán)、化學(xué)發(fā)光基團(tuán)、染料、金屬(例如金、銀)、 磁珠)進(jìn)行標(biāo)記，并且可以確定在該測(cè)定中要求對(duì)該鈣黏著蛋白-11蛋白進(jìn)行飽和的經(jīng)標(biāo) 記的參比試劑的量值。在該鈣黏著蛋白-11蛋白與該測(cè)試試劑之間的復(fù)合物的形成的特異 性可以使用一種適當(dāng)?shù)膶?duì)照物(例如，未標(biāo)記的試劑、單獨(dú)的標(biāo)簽)進(jìn)行確定。一種測(cè)試試劑抑制在該參比試劑與一種鈣黏著蛋白-11蛋白之間形成一種復(fù)合 物的能力可以被確定為對(duì)于經(jīng)標(biāo)記的參比試劑的特異性結(jié)合的50%抑制作用(IC5tl值)所 要求的測(cè)試試劑的濃度。特異性結(jié)合被優(yōu)選地定義為總結(jié)合(例如，在復(fù)合物中總標(biāo)簽) 減去該非特異性結(jié)合。非特異性結(jié)合被優(yōu)選地定義為在過(guò)量的未標(biāo)記參比試劑存在下所形 成的仍可在復(fù)合物中檢出的標(biāo)簽的量值。在該方法中適合使用的參比試劑包括多種分子和 化合物，它們特異性地結(jié)合到鈣黏著蛋白-11上，例如與鈣黏著蛋白-11相結(jié)合的抗體。拮抗一種鈣黏著蛋白-11蛋白的試劑可以通過(guò)對(duì)以下試劑進(jìn)行篩選來(lái)鑒定，這些 試劑具有一種拮抗(降低、防止、抑制)鈣黏著蛋白-11的一種或多種活性(例如像一種結(jié) 合活性(例如，同型的Cad-Il結(jié)合))的能力。此類(lèi)活性可以使用一種適當(dāng)?shù)捏w外或體內(nèi) 測(cè)定來(lái)進(jìn)行評(píng)估。對(duì)于鈣黏著蛋白-11活性的示例性測(cè)定之前已經(jīng)進(jìn)行了說(shuō)明(Patel，SD， et al. , Cell 124 _1255-1268(2006) ；Lee et al.，Science 315:1006-1010(2007))。一旦鑒定了一種鈣黏著蛋白-11拮抗劑，可以評(píng)估該鈣黏著蛋白-11拮抗劑在細(xì) 胞中干擾(例如，降低、抑制、防止)與鈣黏著蛋白-11活性相關(guān)聯(lián)的一種或多種生物學(xué)功 能或特性的能力，這是例如使用一種基于細(xì)胞的、被設(shè)計(jì)成測(cè)量與鈣黏著蛋白-11相關(guān)聯(lián) 的一種具體的生物學(xué)功能或特性的測(cè)定來(lái)進(jìn)行的。已知與鈣黏著蛋白-11表達(dá)和/或活性 相關(guān)聯(lián)的多種生物學(xué)功能和特性包括但不限于細(xì)胞黏附、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵入、細(xì)胞分選、 細(xì)胞凝聚、細(xì)胞重排、組織完整性和結(jié)構(gòu)的維持、細(xì)胞增殖的接觸抑制、以及多種癌(例如 腫瘤)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化(Kiener and Brenner, Arthritis Res Ther. 7 (2) 49-54 (2005)) 此外，Cad-Il拮抗劑在此被顯示為抑制由多種滑膜細(xì)胞所產(chǎn)生的活性MMP。用于評(píng)估鈣 黏著蛋白的一種或多種生物學(xué)功能的適當(dāng)測(cè)定對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言是已知的 (參見(jiàn)，例如Patel，SD, et al.，Cell 124 :_1255_1268 (2006))，并且包括例如在此說(shuō)明的 細(xì)胞聚集測(cè)定(見(jiàn)例證、材料和方法部分)。治療的方法
不希望被任何一種理論所束縛，據(jù)信Cad-Il的ECl結(jié)構(gòu)域的前大約35個(gè)氨基酸 (例如，大約33至大約37個(gè)氨基酸)是同型的鈣黏著蛋白結(jié)合所要求的，并且特異性地結(jié) 合到Cad-Il的這個(gè)區(qū)域的多種試劑可以有效地抑制在多個(gè)Cad-Il分子之間的結(jié)合。因此， 此類(lèi)試劑在多種炎性關(guān)節(jié)障礙(例如，類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)的治療和預(yù)防方面是有用的，這些 疾病與發(fā)炎關(guān)節(jié)中的滑膜細(xì)胞以及其他細(xì)胞類(lèi)型中的Cad-Il表達(dá)和活性相關(guān)聯(lián)。因此，本 發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種用于治療哺乳動(dòng)物受試者體內(nèi)的炎性關(guān)節(jié)障礙的方法，包括對(duì)該 受試者給予治療有效量的一種Cad-Il拮抗劑，該Cad-Il拮抗劑結(jié)合到一種人類(lèi)Cad-IlECl 結(jié)構(gòu)域肽(SEQ ID NO 3)上。使用本發(fā)明的這些方法，哺乳動(dòng)物(例如，人)體內(nèi)的炎性關(guān)節(jié)障礙可以通過(guò)給予 一個(gè)量值的本發(fā)明的一種鈣黏著蛋白-11拮抗劑(例如，抗體類(lèi)、融合蛋白類(lèi)、小分子類(lèi)、核 酸類(lèi)、肽類(lèi)、模擬肽類(lèi))來(lái)進(jìn)行治療，該量值足以提供一種治療益處，這是例如通過(guò)抑制細(xì) 胞的聚集、或抑制細(xì)胞的遷移、或抑制由在一個(gè)可活動(dòng)的關(guān)節(jié)中表達(dá)鈣黏著蛋白-11的細(xì) 胞(例如，滑膜細(xì)胞)中所表達(dá)的活性蛋白酶或多種炎性分子來(lái)進(jìn)行。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種用于治療哺乳動(dòng)物受試者體內(nèi)的炎性關(guān)節(jié)障礙 的方法，包括對(duì)該受試者給予本發(fā)明的治療有效量的一種Cad-Il拮抗劑。該炎性關(guān)節(jié)障礙 可以是與一個(gè)可活動(dòng)的關(guān)節(jié)的細(xì)胞(例如，滑膜細(xì)胞)中鈣黏著蛋白-11表達(dá)相關(guān)聯(lián)、或以 其為特征的任何障礙?？梢杂杀景l(fā)明治療的多種炎性關(guān)節(jié)障礙的例子包括但不限于類(lèi)風(fēng) 濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、萊特爾氏綜合征、以及強(qiáng)直性脊柱炎。在一種具體的實(shí)施方案 中，該炎性關(guān)節(jié)障礙是類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。在一個(gè)方面，治療有效量的一種鈣黏著蛋白-11拮抗劑被給予需要它的患者。有 待給藥的鈣黏著蛋白-11拮抗劑的量值(例如，一種治療有效量)可以由臨床醫(yī)生使用在 此提供的指導(dǎo)及在本領(lǐng)域內(nèi)的其他已知的方法來(lái)進(jìn)行確定，并且取決于幾種因素，包括例 如所選定的具體試劑、該受試者的年齡、敏感性、對(duì)藥物的耐受性、以及總體健康狀況。例 如，對(duì)于作為抗體的Cad-Il拮抗劑的適當(dāng)?shù)膭┝靠梢允敲看沃委煆拇蠹s0. 01mg/kg至大 約300mg/kg體重，并且優(yōu)選每次治療從大約0. 01mg/kg至大約100mg/kg、從大約0. Olmg/ kg至大約10mg/kg、從大約lmg/kg至約10mg/kg體重。對(duì)于一種小分子Cad-Il拮抗劑適 當(dāng)?shù)膭┝靠梢允敲看酥委煆拇蠹s0. 00lmg/kg至大約100mg/kg、從大約0. 0lmg/kg至大約 100mg/kg、從大約0. 0 lmg/kg至大約10mg/kg、從大約0. 0 lmg/kg至大約lmg/kg體重。對(duì)于 作為蛋白或肽(直鏈的、環(huán)狀的、模擬的)的鈣黏著蛋白-11拮抗劑的適當(dāng)?shù)膭┝繉?dǎo)致該 肽從大約0. 1 μ g/ml至大約200 μ g/mL的血漿濃度。確定針對(duì)一種具體的試劑、患者以及癌 癥的劑量是完全在本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員的能力之內(nèi)的。優(yōu)選地，該劑量并未引起、或產(chǎn) 生最小限度的不良副作用(例如，免疫原性應(yīng)答、惡心、眩暈、胃部不適(gastric upset)、 高粘稠度綜合征、充血性心力衰竭、中風(fēng)、肺水腫)。治療有效量的一種鈣黏著蛋白-11拮抗劑可以被單獨(dú)給藥、或與一種或多種其他 的治療劑(例如，抗炎性劑)進(jìn)行組合。用于治療多種炎性關(guān)節(jié)障礙(特別是RA)的適當(dāng) 的抗炎劑(它們可以與本發(fā)明的Cad-Il拮抗劑相組合而進(jìn)行給藥)包括但不限于⑴非 甾體抗炎藥物(NSAID;例如，酮洛芬(detoprofen)、雙氯芬酸、二氟尼柳、依托度酸、非諾洛 芬、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、甲氯芬那酸(meclofenameate)、甲芬那酸、美洛 昔康、萘丁美酮(nabumeone)、萘普生鈉、奧沙普秦、吡羅昔康、舒林酸、托美丁、塞來(lái)考昔、羅非考昔、阿司匹林、水楊酸膽堿、雙水楊酸酯(salsalte)、以及水楊酸鈉和水楊酸鎂)； (II)類(lèi)固醇類(lèi)(例如，可的松、地塞米松、氫化可的松、甲潑尼龍、潑尼松龍、潑尼松、曲安西 龍)；(iii)DMARD，即緩解疾病的抗風(fēng)濕性藥物(例如，環(huán)孢霉素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、來(lái) 氟米特、環(huán)磷酰胺、羥氯喹、柳氮磺吡啶、D-青霉胺、米諾環(huán)素、以及金)；或(iv)重組蛋白 質(zhì)類(lèi)(例如，ENBREL (依那西普，一種可溶的TNF受體)、REMICADE (英利昔 單抗，一種嵌合的單克隆抗TNF抗體)、ORENCIA (阿巴西普(abatabac印t)，一種可 溶的CTLA4受體)、ACTEMRA (妥珠單抗，針對(duì)IL-6受體的一種單克隆抗體)、以及 RITUXAN (利妥昔單抗，針對(duì)CD20的一種單克隆抗體)。因此，一種鈣黏著蛋白-11拮抗劑可以作為一種聯(lián)合治療的部分(例如，與一種或 多種其他治療劑一起)進(jìn)行給藥。該Cad-Il拮抗劑可以在一種或多種其他的治療劑之前 或同時(shí)被給藥的。在一些實(shí)施方案中，該鈣黏著蛋白-11拮抗劑以及其他治療劑可以作為 單獨(dú)的配制品或作為一種聯(lián)合配制品被同時(shí)地(例如，共同地)進(jìn)行共同給藥?？商娲?， 這些試劑可以作為單獨(dú)的組合物、在由有經(jīng)驗(yàn)的臨床醫(yī)生所確定的一個(gè)適當(dāng)?shù)臅r(shí)間框(例 如，足以允許這些療法的藥物效應(yīng)的疊加的一段時(shí)間)之內(nèi)進(jìn)行順序地給藥。該鈣黏著蛋 白-11拮抗劑以及一種或多種其他治療劑能夠以一種單一劑量或以多個(gè)劑量、以一種次序 并且在適于達(dá)到一種令人希望的治療效應(yīng)(例如，關(guān)節(jié)炎癥的減少和/或抑制)的時(shí)間表 上進(jìn)行給藥。適當(dāng)?shù)膭┝恳约敖o藥方案可以由臨床醫(yī)生來(lái)確定，并且取決于所選擇的這種 或這些試劑、藥物配制品以及給藥途徑、不同的患者因素以及其他考慮。一種治療效力(例如，關(guān)節(jié)炎癥的減少或消除和/或關(guān)節(jié)炎癥的防止或抑制)可 以通過(guò)任何適當(dāng)?shù)姆椒?例如，成像(MRI、NMR))被確定。根據(jù)本發(fā)明的這些方法，將治療有效量的一種Cad-Il拮抗劑給予哺乳動(dòng)物受試 者以治療一種炎性關(guān)節(jié)障礙。術(shù)語(yǔ)“哺乳動(dòng)物受試者”在此被定義為包括多種哺乳動(dòng)物如 靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物(例如，人類(lèi))、牛、綿羊、山羊、馬、犬、貓、兔子、豚鼠、大鼠、小鼠、或其他的牛、 綿羊、馬、犬科、貓科、嚙齒動(dòng)物以及鼠科物種。作為Cad-Il拮抗劑的試劑可以由不同的途徑給予哺乳動(dòng)物受試者。例如，該試劑 可以由任何適當(dāng)?shù)奈改c外的或非胃腸外的途徑進(jìn)行給藥，包括例如局部的(例如，乳劑、軟 膏)、或鼻的(例如，溶液、懸浮液)。腸胃外給藥可以包括例如關(guān)節(jié)內(nèi)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、心室 內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)、皮下、或腹膜內(nèi)的給藥。該試劑還可以通過(guò)以下途徑進(jìn)行給藥口服(例 如，以膠囊、懸浮液、片劑、或飲食)、經(jīng)皮、真皮內(nèi)、局部、通過(guò)吸入(例如，支氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、 口服吸入或鼻內(nèi)滴劑)、穿粘膜、或經(jīng)直腸。給藥在適當(dāng)時(shí)可以是局部的或全身性的，并且 若希望，可以同時(shí)使用超過(guò)一種途徑。一種Cad-Il拮抗劑的局部化給藥可以通過(guò)關(guān)節(jié)內(nèi)注 射(例如，將該試劑直接注射到一個(gè)關(guān)節(jié)中)而實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選的給藥模式可以根據(jù)所選擇的 具體試劑而發(fā)生變化。然而，全身性靜脈內(nèi)的或皮下的給藥對(duì)于抗體是大體上優(yōu)選的。遞送還可以是通過(guò)注到患者的腦部或體腔內(nèi)、或通過(guò)使用一種定時(shí)釋放或持續(xù)釋 放的基質(zhì)遞送系統(tǒng)、或通過(guò)使用微粒、凝膠以及脂質(zhì)體的原位遞送。霧化裝置、粉末吸入器、 以及氣溶膠化的溶液是代表性的方法，這些方法可以用于將此類(lèi)制備品給予呼吸道。遞送 可以在體外、在體內(nèi)、或離體。作為蛋白(例如，融合蛋白)的多種試劑可以是經(jīng)由重組蛋白的體內(nèi)表達(dá)來(lái)進(jìn)行 給藥的。體內(nèi)表達(dá)可以根據(jù)適當(dāng)?shù)姆椒?、通過(guò)體細(xì)胞表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)(參見(jiàn)，例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，399，346)。此外，還可以將對(duì)該蛋白進(jìn)行編碼的一種核酸結(jié)合到逆轉(zhuǎn)錄病毒的、腺病毒 的、或其他適當(dāng)?shù)妮d體種(優(yōu)選的是，一種復(fù)制缺陷型感染性載體)用于遞送，或可以將其 引入到能夠表達(dá)該蛋白的一種轉(zhuǎn)染的或轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中用于遞送。在后者的實(shí)施方案 中，可以將這些細(xì)胞以一個(gè)量值進(jìn)行植入(單獨(dú)或在一種阻擋裝置中)、注射或以其他方式 引入，該量值對(duì)于以一種治療有效量表達(dá)該蛋白是有效的?；诤怂岬拟}黏著蛋白-11拮抗劑(例如，適體)能夠以多種方式引入到所感 興趣的一種哺乳動(dòng)物受試者中。例如，核酸可以從表達(dá)載體或PCR產(chǎn)物在宿主細(xì)胞中內(nèi) 源性地表達(dá)，或被包裝到合成的或工程化處理的組合物中(例如，脂質(zhì)體、聚合體、納米顆 粒)，然后這些組合物可以被直接引入到哺乳動(dòng)物受試者的血流中(通過(guò)，例如，注射、輸 注)?？光}黏著蛋白-11核酸或核酸表達(dá)載體(例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒的、腺病毒的、腺相關(guān)的 以及單純性皰疹病毒的載體、工程化處理的載體、非病毒介導(dǎo)的載體)還可以使用已建立 的基因治療策略和科學(xué)試驗(yàn)計(jì)劃而直接引入到哺乳動(dòng)物受試者中(參見(jiàn)，例如Tochilin V. P.Annu Rev BiomedEng 8 :343_375，2006 ；Recombinant DNA and Gene Transfer，Office ofBiotechnology Activities, National Institutes of Health Guidelines)。作為鈣黏著蛋白-11拮抗劑的試劑(例如，小分子)可以作為一種藥物的或生理 學(xué)的組合物的一部分來(lái)給予哺乳動(dòng)物受試者，例如作為包括一種鈣黏著蛋白-11拮抗劑以 及一種藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物的一部分。包括一種鈣黏著蛋白-11拮抗劑的配 制品或組合物，或包括一種鈣黏著蛋白-11拮抗劑以及一種或多種其他治療劑(例如，一種 抗炎劑)的組合物將根據(jù)所選擇的給藥途徑(例如，溶液、乳劑、或膠囊)而發(fā)生變化。適 當(dāng)?shù)乃幱幂d體可以含有惰性成份，這些成分并未與這種鈣黏著蛋白-11拮抗劑相互作用。 可以采用多種標(biāo)準(zhǔn)的藥物配制品技術(shù)，如在Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company, Easton, PA中所說(shuō)明的那些方法。用于腸胃外給藥的適當(dāng)?shù)乃幱幂d 體包括，例如無(wú)菌水、生理鹽水、抑菌鹽水(含大約0. 9% mg/ml苯甲醇的鹽水)、磷酸鹽緩 沖鹽水、Hank' s溶液、林格氏乳酸鹽以及類(lèi)似物。配制品還可以包括少量的物質(zhì)，這些物 質(zhì)增強(qiáng)了該活性成分(例如，乳化劑、增溶劑、PH緩沖劑、潤(rùn)濕劑)的效力。膠囊化組合物 的方法(如，在硬明膠或環(huán)葡聚糖的包衣中)在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。為了吸入，可以將該試 劑溶解并且載入到一種適當(dāng)?shù)挠糜诮o藥的分配器中(例如，一種霧化器或噴霧器或加壓氣 溶膠分配器)。該藥用試劑可以作為一種中性化合物或作為一種鹽或酯來(lái)進(jìn)行給藥。藥學(xué)上可接 受的鹽類(lèi)包括與多種游離的氨基基團(tuán)形成的那些鹽，如衍生自鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、或酒 石酸的那些鹽；以及與多種游離的羧基基團(tuán)形成的那些鹽，如衍生自氫氧化鈉、氫氧化鉀、 氫氧化銨、氫氧化鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因、等等的 那些鹽。可以獲得含有一種胺或其他堿性基團(tuán)的化合物的鹽類(lèi)，這是例如通過(guò)與一種適當(dāng) 的有機(jī)酸或無(wú)機(jī)酸(如，氯化氫、溴化氫、乙酸、高氯酸以及類(lèi)似物)反應(yīng)來(lái)進(jìn)行的。具有一 種季銨基團(tuán)的化合物還包含一種反陰離子，如氯離子、溴離子、碘離子、醋酸根、高氯酸根以 及類(lèi)似物。包含一種羧酸或其他酸性官能團(tuán)的化合物的鹽類(lèi)可以通過(guò)與一種適當(dāng)?shù)膲A(例 如，一種氫氧化物堿)反應(yīng)來(lái)制備。酸性官能團(tuán)的鹽類(lèi)包含一種反陽(yáng)離子，如鈉離子或鉀離 子。本發(fā)明現(xiàn)在將通過(guò)以下實(shí)例進(jìn)行說(shuō)明，這些實(shí)例并非旨在以任何方式進(jìn)行限制。
例證實(shí)例1 具有針對(duì)人類(lèi)鈣黏著蛋白-11的ECl結(jié)構(gòu)域的N端35個(gè)氨基酸內(nèi)一種表 位的結(jié)合特異性的Fab的鑒定。材料和方法蛋白質(zhì)印跡法通過(guò)SDS-PAGE將多種蛋白分離，并且使用標(biāo)準(zhǔn)方法將它們轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素 (NC)膜上。簡(jiǎn)言之，用Tris緩沖的-鹽水-吐溫(TBST) (8. 8g/L的NaCUO. 2g/L的KCl、 3g/L的Tris堿、500ul/L的Tween-20、pH至7. 4)漂洗NC膜。將該膜用溶解于TBST中的 4% BSA在22°C下封閉小時(shí)。將該NC膜用TBST漂洗3次，每次5分鐘。將小鼠抗人Cad-Il 抗體在TBST中稀釋至0. 5 μ g/ml，并且在22°C下將該NC孵育達(dá)1小時(shí)。將該NC膜用TBST 漂洗3次，每次5分鐘。將偶聯(lián)著辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的山羊抗小鼠Ig抗體在TBST中 稀釋至1 μ g/ml，并且在22°C下在室溫(RT)下將該NC在第二溶液中孵育最短1小時(shí)。將 該NC膜在TBST中漂洗3次，每次5分鐘。使用標(biāo)準(zhǔn)HRP方法使信號(hào)顯色。ELISA將該抗原(5 μ g/ml或50 μ g的Cad-1 l-EC-l-Fc或5 μ g/ml的鈣黏著蛋白肽)在 一種緩沖液中稀釋并且將其用于在4°C下對(duì)這些板包被過(guò)夜。將這些板洗滌并且用1.5% BSA、5%低脂奶粉(處于PBS稀釋緩沖液中BSA、2. 5%低脂奶粉、0. Tween-20，在 PBS中)封閉。然后，將這些板用包含該抗Cad-Il人fAb或純化的抗Cad-Il人fAb的細(xì)菌 裂解液孵育達(dá)小時(shí)。洗滌之后，將二抗(Cy5-偶聯(lián)的一種人Fab，1/100稀釋)施用達(dá)25分 鐘。然后，洗滌這些板，并接著讀取得到的熒光。結(jié)果對(duì)三組之前報(bào)道的鈣黏著蛋白-11-特異性抗體測(cè)試與人類(lèi)鈣黏著蛋白-11的 ECl結(jié)構(gòu)域相結(jié)合的能力。這些抗體包括對(duì)抗鈣黏著蛋白-11敲除或缺陷的小鼠中的 一種小鼠鈣黏著蛋白-Il-Fc融合蛋白免疫原所產(chǎn)生的抗體(Lee et al. , Science 315 1006-1010(2007))，在鈣黏著蛋白-11野生型小鼠中產(chǎn)生的抗體，這些抗體對(duì)抗已經(jīng)在CHO 細(xì)胞中產(chǎn)生的一種人類(lèi)鈣黏著蛋白-Il-Fc融合蛋白免疫原(Valencia et al. , J Exp. Med. 200 (12) 1673-1679 (2004))，以及在鈣黏著蛋白-11野生型小鼠中產(chǎn)生的抗體，這些 抗體對(duì)抗包含人類(lèi)鈣黏著蛋白-11的EC1-3結(jié)構(gòu)域的一種通過(guò)細(xì)菌產(chǎn)生的蛋白。通過(guò)蛋 白質(zhì)分析對(duì)這些抗體測(cè)試了結(jié)合融合蛋白的能力，這些融合蛋白僅包含人類(lèi)Cad-Il的ECl 結(jié)構(gòu)域(鈣黏著蛋白-11-ECl-Fc)、Cad-Il的ECl以及EC2結(jié)構(gòu)域(Cadll-ECl/2-Fc)、或 Cad-Il的所有5個(gè)EC結(jié)構(gòu)域(鈣黏著蛋白-ll-ECl-5-Fc)。在蛋白質(zhì)印跡上，所測(cè)試的這 些抗體都沒(méi)有識(shí)別ECl-Fc或ECl-2-Fc融合蛋白(圖1A)。然而，來(lái)自所測(cè)試的三組中每一 組的抗體識(shí)別了包括胞外域1至5的人類(lèi)Cad-Il-Fc融合蛋白(圖1B)。這些結(jié)果表明所 測(cè)試的這些抗體并不結(jié)合人類(lèi)Cad-Il的ECl或EC2結(jié)構(gòu)域，但卻識(shí)別在這種蛋白的胞外區(qū) 中其他地方的多種表位。可以獲得的已公布的抗Cadll抗體(這些抗體結(jié)合了表達(dá)Cadll的細(xì)胞)13C2、 23C6、5F82 (Lifespan Science)以及 283416 (R&D Systems)、連同 CadllECl-結(jié)合抗體 HlMl、以及對(duì)照抗體MOPC是通過(guò)ELISA針對(duì)與以下融合蛋白相結(jié)合的能力進(jìn)行測(cè)試，這些 融合蛋白僅包含人類(lèi)Cad-Il的ECl結(jié)構(gòu)域(鈣黏著蛋白-11-ECl-Fc)或Cad-Il的所有5種EC結(jié)構(gòu)域(鈣黏著蛋白-ll-ECl-5-Fc)。所測(cè)試的可以獲得的已公布的抗Cadll抗體都 沒(méi)有識(shí)別ECl-Fc (圖1B，空心柱)(在此沒(méi)有顯示對(duì)于283416的數(shù)據(jù))。然而，CadlIECl結(jié) 合的HlMl抗體結(jié)合了鈣黏著蛋白-Il-ECl-Fc以及鈣黏著蛋白-ll-ECl-5-Fc這兩者(圖 IB實(shí)心柱)。對(duì)照MOPC抗體對(duì)兩種融合蛋白均不結(jié)合。這些結(jié)果表明這些可以獲得的已 公布的抗Cadll抗體沒(méi)有與人類(lèi)Cad-Il的ECl結(jié)構(gòu)域相結(jié)合，但卻在這種蛋白的胞外區(qū)中 的其他地方識(shí)別了多種表位。為了產(chǎn)生對(duì)人類(lèi)鈣黏著蛋白-11的ECl結(jié)構(gòu)域的N端35個(gè)氨基酸之內(nèi)的一種表位 具有特異性的抗體，對(duì)編碼了人類(lèi)Fab的噬菌體展示文庫(kù)(MorphoSys AG)進(jìn)行篩選。使用 兩個(gè)選擇指標(biāo)對(duì)候選的Fab進(jìn)行鑒定針對(duì)與一種肽(該多肽包括人類(lèi)鈣黏著蛋白-IlECl 結(jié)構(gòu)域的前35個(gè)氨基酸)相結(jié)合的一種陽(yáng)性選擇，以及針對(duì)與相應(yīng)肽(來(lái)自?xún)蓚€(gè)密切相關(guān) 的并且高度同源的鈣黏著蛋白(鈣黏著蛋白_8和MN-鈣黏著蛋白)的ECl結(jié)構(gòu)域)相結(jié) 合的一種陰性選擇(圖2)。使用ELISA來(lái)評(píng)估結(jié)合。進(jìn)行兩種篩選。在第一種篩選中，通過(guò)ELISA對(duì)結(jié)合鈣黏著蛋白-IlECl肽的96種 Fab克隆進(jìn)行鑒定。七(7)種候選的Fab結(jié)合了 Cad-IlEC-I肽；然而，這些Fab中僅有兩種 與EC-I肽以及ECl-2-Fc融合蛋白這二者相結(jié)合。這兩種Fab之一還與MN-Cad肽相結(jié)合。 因此，這7種Fab克隆中僅有一種特異性地結(jié)合到ECl-Fc融合蛋白上，但不結(jié)合到MN-Cad 以及鈣黏著蛋白-8EC1結(jié)構(gòu)域肽這兩者上。在第二篩選中，觀察到了相似的結(jié)果，因?yàn)?6 種Fab中僅有1種(克隆F9)顯示對(duì)于鈣黏著蛋白-IlECl肽和ECl_2_Fc融合蛋白的特異 性，不能結(jié)合到MN-Cad和鈣黏著蛋白-8EC1結(jié)構(gòu)域肽上(圖3)。所測(cè)試的結(jié)合Cad-IlECl 結(jié)構(gòu)域的Fab中的大多數(shù)顯示出與MN-Cad肽的交叉反應(yīng)性，這種肽含有與Cad-Il的EEY CAR序列重疊的EEY CAR序列。實(shí)例2 與鈣黏著蛋白-11的ECl結(jié)構(gòu)域相結(jié)合的Fab在體外測(cè)定中抑制了 Cad-Il 介導(dǎo)的細(xì)胞聚集材料和方法體外鈣黏著蛋白-11聚集測(cè)定431-D細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)并且在正常情況下不表達(dá)任何鈣黏附蛋白并且不聚集。已 經(jīng)將431-D-11細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾以表達(dá)Cad-11。431-D-11細(xì)胞在培養(yǎng)基中單獨(dú)孵育，并 且它們開(kāi)始聚集超過(guò)40分鐘，并且這些細(xì)胞簇沉積在孔的底部，并且可以測(cè)量剩余的未 聚集的、處于懸浮狀態(tài)的細(xì)胞，并且計(jì)算聚集的431-D-11的百分?jǐn)?shù)。對(duì)于這項(xiàng)聚集測(cè)定， 431-d-ll細(xì)胞(D-11細(xì)胞)在燒瓶中生長(zhǎng)至亞會(huì)合狀態(tài)，并接著使用0. 05%胰蛋白酶加上 0. 53mM EDTA將其從該燒瓶移出。將大約2xl06個(gè)431-D-11細(xì)胞加到2ml的SME培養(yǎng)基中 (Dulbecco's Modified Eagle’ s 高葡萄糖培養(yǎng)基、0. IM H印es、pH7. 4、以及 5U/mlDNA 酶)， 并且在一種測(cè)試試劑(例如，抗體、Fab、融合蛋白)不存在或存在時(shí)在冰上將其預(yù)孵化15 分鐘。在與該測(cè)試試劑預(yù)孵化之后，將這些細(xì)胞轉(zhuǎn)移至24-孔板上的一種圓底孔中并且在 37°C下進(jìn)行孵育，同時(shí)在旋轉(zhuǎn)搖床上以130rpm進(jìn)行旋轉(zhuǎn)。當(dāng)細(xì)胞聚集時(shí)，它們沉到該孔的 底部。在0分鐘和40分鐘時(shí)，從該孔中、從該樣品的中央去除200 μ 1并且將其與25 μ 1的 8%戊二醛進(jìn)行混合以固定這些細(xì)胞。將200 μ 1的所固定的細(xì)胞樣品加入到9.8ml的庫(kù)爾 特粒度儀等滲鹽水溶液中，并且使用設(shè)置在8 μ m至24 μ m閾值的庫(kù)爾特粒度儀進(jìn)行計(jì)數(shù)。 每個(gè)樣品記錄了 3次細(xì)胞計(jì)數(shù)。計(jì)算了與在0分鐘時(shí)間點(diǎn)相比在40分鐘時(shí)間點(diǎn)時(shí)細(xì)胞減
25少或聚集細(xì)胞的百分比。結(jié)果具有對(duì)于在鈣黏著蛋白-IlECl結(jié)構(gòu)域的N端35個(gè)氨基酸之內(nèi)的一種表位的結(jié)合 特異性的候選Fab (克隆F9)(它不與MN-Cad或Cad_8的ECl結(jié)構(gòu)域相結(jié)合)，是使用一種 體外鈣黏著蛋白-11細(xì)胞的聚集測(cè)定對(duì)于抑制Cad-Il介導(dǎo)的細(xì)胞聚集的能力進(jìn)行測(cè)試。 該候選的Fab在1 μ g/ml或更低的濃度下顯著地抑制了鈣黏著蛋白-11介導(dǎo)的細(xì)胞聚集。 (圖4和5)。相比之下，由13C2抗體(它結(jié)合到EC1/2結(jié)構(gòu)域之外的Cad-Il胞外區(qū)中的 一種表位上)制備的Fab僅僅在10μ g/ml的濃度下就抑制了鈣黏著蛋白_11的聚集，這提 示F9Fab與結(jié)合到Cad-Il胞外域的其他部分上的多種抗體相比以更低的濃度更加有效地 抑制了 Cad-Il活性。Cad-Il介導(dǎo)的細(xì)胞聚集也被不同的抗-鈣黏著蛋白-IlECl結(jié)構(gòu)域Fab抑制，這些 Fab 對(duì)于單獨(dú)的 Cad-11、Cad-Il 與 Cad_8，Cad-Il 與 MN-CacU或 Cad-1 l、Cad_8 與 MN-Cad 是 特異的(圖6和7)。相對(duì)于這些對(duì)照樣品(例如，SME培養(yǎng)基)(圖6))、對(duì)GFP特異的一 種Fab (圖7)，所測(cè)試的所有鈣黏著蛋白-ECl-結(jié)構(gòu)域特異性Fab都在體外抑制了細(xì)胞的聚集。實(shí)例3 包含人類(lèi)鈣黏著蛋白-11的ECl結(jié)構(gòu)域的鈣黏著蛋白-11/免疫球蛋白融 合蛋白的產(chǎn)生。這種鈣黏著蛋白-IlECl區(qū)是從一種載體制備的，該載體編碼了全長(zhǎng)人類(lèi)鈣黏著 蛋白-1 IcDNA (將人類(lèi)Cad-Iι克隆到Invitrogen pCEP4 載體的Noti和κρη-ι位點(diǎn))，這 是在標(biāo)準(zhǔn)條件下使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)進(jìn)行的，使用1以下寡核苷酸引物從而將EcoRl 和BglII位點(diǎn)(參見(jiàn)，對(duì)應(yīng)地在正向和反向引物中的下劃線(xiàn)序列)引入到所擴(kuò)增的產(chǎn)物中 正向引物Tttttttttgaattcatgaaggagaactactgtttacaagc(SEQ ID NO 8)EcoRl反向引物Tttttttttagatctctggaccttgacaatgaattccgacgg(SEQ ID NO 9)BglII用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRl和BglII將所擴(kuò)增的產(chǎn)物消化，并且將這種消化產(chǎn)物分離 并且使用對(duì)應(yīng)的EcoRl和BglII位點(diǎn)將其連接到pFUSE-hIgG2el-Fcl載體中(InvivoGen)。 按照制造商所說(shuō)明的用這種連接產(chǎn)物將TOPlO感受態(tài)細(xì)菌(Invitrogen)轉(zhuǎn)化，并且用新霉 素(zeomycin)選擇具有鈣黏著蛋白-ll-ECl-Fc質(zhì)粒的細(xì)菌。將鈣黏著蛋白-ll-ECl-Fc 質(zhì)粒分離、測(cè)序、并接著用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293F細(xì)胞。收集條件培養(yǎng)基，并且使用切向流過(guò)濾 之后跟隨在50/50混合的A/蛋白G柱(在20mM HEPES、pH7. 4、137mM NaCl、3mM KCl、以及 ImM CaCl2中平衡)上分離而將鈣黏著蛋白-ll-ECl-Fc融合蛋白(SEQ ID NO 9)純化。使 用0. IM甘氨酸(pH 3)和ImM CaCl2將純化的鈣黏著蛋白-Il-ECl-Fc融合蛋白從該柱子 中洗脫，并且進(jìn)入包含200μ 1的IM Tris、pH7.4、以及ImM CaCl2W管中。然后，將這些具 有 Cad-Il 融合蛋白的洗脫液對(duì) 20mM Hepes (pH7. 4) U37mM NaCl、3mM KCl、以及 ImMCaCl2 進(jìn)行透析。通過(guò)SDS PAGE證實(shí)了這種蛋白的大小(圖10)，并且使用識(shí)別這種人類(lèi)Fc區(qū)域 的抗體通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析以及對(duì)N端進(jìn)行測(cè)序(未顯示)證實(shí)了身份(圖11)。使用與如上說(shuō)明的那些相似的技術(shù)和條件產(chǎn)生Cad-I l-ECl-2-Fc。實(shí)例4 =Cad-Il-ECl-Fc免疫球蛋白融合蛋白在體外測(cè)定中抑制了 Cad-Il介導(dǎo)的 細(xì)胞聚集材料和方法細(xì)胞侵入/遷移到基質(zhì)膠塞中在FLS 培養(yǎng)基(Dulbecco，s Modified Eagle's 高葡萄糖培養(yǎng)基[Sigma#D7777]、 10 % 胎牛血清[Benchmark#100-106]、l % 青霉素(Pencillin)-鏈霉素[Gibco 315140-122]、1% L-谷氨酰胺[Gibco#25030]、0. 5%慶大霉素[Gibco#15710-064])中在基 質(zhì)膠ECM包被的轉(zhuǎn)移孔(transwell)中評(píng)定了 FLS的遷移活性。將在包含IxlO4個(gè)細(xì)胞的 FLS培養(yǎng)基中的人類(lèi)FLS細(xì)胞懸液加入到設(shè)置在24孔板的孔中的對(duì)照插入物或基質(zhì)膠包 被的插入物中，該24-孔板含有0. 750mL的FLS培養(yǎng)基。然后，將這些板在37°C下、5% CO2 大氣壓下、在一種增濕的組織培養(yǎng)孵育器中孵育達(dá)22個(gè)小時(shí)。為了計(jì)算遷移的細(xì)胞的數(shù)目，通過(guò)用棉簽擦拭將非侵入性細(xì)胞從對(duì)照插入物的膜 的上表面移出。使用由FLS培養(yǎng)基沾濕的棉簽重復(fù)第二次擦拭。然后，將對(duì)照插入物固定， 并且使用分化染色試劑盒[Fisher#122-911]進(jìn)行染色。插入物允許被干燥，并且使用具有 IOx物鏡的顯微鏡在該對(duì)照插入物的4個(gè)象限中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。對(duì)插入物進(jìn)行計(jì)數(shù)，重復(fù) 三次，并且將總數(shù)進(jìn)行平均。為了計(jì)算侵襲這些基質(zhì)膠插入物的細(xì)胞的數(shù)目，通過(guò)用棉簽進(jìn)行擦拭將非侵入性 細(xì)胞從該基質(zhì)膠插入物的表面輕輕地去除。使用由FLS培養(yǎng)基沾濕的棉拭重復(fù)進(jìn)行第二次 擦拭。然后，將插入物固定，并且使用分化染色試劑盒[Fisher#122-911]進(jìn)行染色。插入 物允許被干燥，并且使用具有IOx物鏡的顯微鏡在該對(duì)照插入物的4個(gè)象限中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行 計(jì)數(shù)。對(duì)插入物進(jìn)行計(jì)數(shù)，重復(fù)三次，并且將總數(shù)進(jìn)行平均。結(jié)果Cad-I I-ECl-Fc在3 μ g/ml的濃度下顯著地抑制了細(xì)胞的聚集，而包含人類(lèi) Cad-Il的全部5個(gè)EC結(jié)構(gòu)域的全長(zhǎng)Cad-Il-ECl-5-Fc蛋白在100 μ g/ml的濃度下抑制了 Cad-Il介導(dǎo)的聚集(圖13)。這些數(shù)據(jù)顯示Cad-Il-ECl-Fc免疫球蛋白融合蛋白在體外測(cè) 定中有效地抑制了 Cad-Il介導(dǎo)的細(xì)胞聚集。此外，體外測(cè)試了 Cad-Il-ECl-Fc免疫球蛋白融合蛋白抑制人類(lèi)成纖維細(xì)胞樣滑 膜細(xì)胞(FLS)侵入基質(zhì)膠塞的能力。FLS侵入到基質(zhì)膠中是一種復(fù)雜的過(guò)程，該過(guò)程涉及 由FLS表達(dá)的MMP1、MMP-3、MMP-13、絲氨酸蛋白酶、及其他蛋白以降解該基質(zhì)膠連同F(xiàn)LS遷 移到基質(zhì)膠中。在一種分開(kāi)的測(cè)定中，我們沒(méi)有看見(jiàn)對(duì)FLSA遷移通過(guò)正常纖維插入物的抑 制。這提示這種EC-Fc或13C2單克隆抗體的作用是抑制該基質(zhì)膠(一種關(guān)節(jié)軟骨的代用 品)的降解。在兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中，Cad-Il-ECl-Fc以及鼠抗Cad-Il單克隆抗體13C2這 兩者均抑制了 FLS侵入到基質(zhì)膠塞中。實(shí)例5 對(duì)抗人類(lèi)鈣黏著蛋白-11的一種ECl結(jié)構(gòu)域肽的抗體的產(chǎn)生。材料和方法用0. Olmg的一種肽在足墊處對(duì)Balb/c小鼠進(jìn)行免疫，每周兩次(bi-weekly)，一 個(gè)月9次，這種肽與人類(lèi)Cad-IlECl結(jié)構(gòu)域的前33個(gè)氨基酸(GWVWN QFFVI EEYTG PDPVL VGRLH SDIDS⑶G(SEQID NO 10))相對(duì)應(yīng)，以共價(jià)鍵與BSA連接。這種肽在此被稱(chēng)為肽4。從經(jīng)免疫的小鼠得到脾，并且將其與一種鼠融合伴侶P3X63-Ag8. 653進(jìn)行融合，從而生 成產(chǎn)生抗體的雜交瘤。以10、3或0.個(gè)5細(xì)胞/孔將這些雜交瘤擴(kuò)展并且亞克隆，并且在 ELISA中對(duì)來(lái)自這些雜交瘤的、含有抗Cad-Il抗體的培養(yǎng)基篩選與在細(xì)菌中產(chǎn)生的、包含 Cad-llECl-2結(jié)構(gòu)域的蛋白特異性地結(jié)合的能力。同時(shí)，對(duì)來(lái)自這些肽4雜交瘤的、包含 抗-Cad-Il抗體的培養(yǎng)基篩選與涵蓋人類(lèi)Cad-8和MN-鈣黏著蛋白的EC1-2結(jié)構(gòu)域的蛋 白相結(jié)合的缺失。在4°C下用0. 05ml的0. 0至0. 3mg/ml的ECl_2Cad蛋白中的每一種將 96-孔EIA板包被過(guò)夜，并接著用鹽水緩沖液洗滌若干次。然后，用0. 25ml的酪蛋白-PBS 緩沖液封閉這些板，并且用鹽水緩沖液洗滌若干次。在22°C下將包含這種抗Cad-Il抗體 的雜交瘤培養(yǎng)基在每個(gè)孔中進(jìn)行未稀釋地孵育達(dá)1小時(shí)，并接著用PBS-Tween(0. 05% )洗 滌兩次。將100 μ 1的一種羊抗小鼠IgG 二抗的1/1000稀釋液加入到每個(gè)孔中，在22°C下 孵育30分鐘，并接著用PBS-Tween (0.05% )洗滌兩次。將100 μ 1/孔的室溫TMB (3，3’，5， 5’-四甲基聯(lián)苯胺)試劑加入到每個(gè)孔中，并且允許在22°C下顯色5分鐘。用100 μ 1的室 溫的2Ν硫酸將該反應(yīng)終止，并且在Wallac 1420酶標(biāo)儀上在450nm下讀取該板。使用ELISA 進(jìn)一步測(cè)試了 HlMl 和 H14 抗 Cad-Il 抗體對(duì)抗 Cad-ll、Cad-7、Cad_8、 Cad-20、Cad-24、Cad-9、Cad-18、以及MN-Cad的ECl結(jié)構(gòu)域的前33個(gè)氨基酸的特異性。合 成了與 Cad-7、Cad-8、Cad-20、Cad-24、Cad-9、Cad-18、MN-Cad 的區(qū)域(該區(qū)域與 Cad-IlECl 結(jié)構(gòu)域的G1-G33區(qū)域重疊)相對(duì)應(yīng)的肽，并且將這些肽與生物素相偶聯(lián)。將100 μ 1的這 些肽中每一種的在PBS-Tween中(0. 05% )的30ng/ml溶液在4°C下在96-孔Netravidin 板的每個(gè)孔中孵育2-3小時(shí)，并接著用PBS-Tween (0. 05% )洗滌兩次。在22°C下將不同濃 度的抗Cad-Il抗體在每個(gè)孔中孵育1小時(shí)，并接著用PBS-Tween(0.05% )洗滌兩次。將 100 μ 1的一種羊抗小鼠IgG 二抗的1/1000稀釋液加入到每個(gè)孔中，在22°C下孵育30分鐘， 并接著用PBS-Tween (0. 05% )洗滌兩次。將IOOul/孔的室溫TMB (3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián) 苯胺)試劑加入到每個(gè)孔中，并且允許在22°C下顯色5分鐘。用100 μ 1的室溫的2Ν硫酸 將該反應(yīng)終止，并且在Wallac 1420酶標(biāo)儀上在450nm下讀取該板。對(duì)來(lái)自含有陽(yáng)性抗Cad-Il抗體雜交瘤的多個(gè)孔的培養(yǎng)基測(cè)試與Cad-Il表達(dá)細(xì)胞 相結(jié)合的能力。使冰凍的表達(dá)Cad-Il的431D細(xì)胞解凍，并且在Hanks平衡鹽水溶液(HBSS) 中洗滌兩次，這種 HBSS 含有 Ca2+(0. 137M NaCl、5. 4mM、KCl 0. 25mM Na2HPO4、0. 44mM KH2PO4, 1. 3mM CaCl2U. OmM MgSO4,以及 4. 2mM NaHCO)，并接著在含有 Ca2+ 的 HBSS 中以 IO6 個(gè)細(xì)胞 /ml進(jìn)行重懸。用50%或16%的抗Cad-Il抗體培養(yǎng)基在冰上將IO5個(gè)細(xì)胞/孔染色45分 鐘，在含有Ca2+的HBSS中洗滌兩次，用一種與藻紅蛋白(phytoerytherin)相偶聯(lián)的羊抗鼠 IgG 二抗(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)以 1 % 的濃度在冰上染色 45 分鐘，并 接著在含由Ca2+的HBSS中再洗滌兩次。然后，在含有Ca2+和甲醛的400 μ 1 HBSS中將 這些細(xì)胞重懸，并且隨后在 FACScalibur (Becton Dickenson, Franklin Lakes, NJ)上對(duì)于 PE陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行分析。結(jié)果來(lái)自這些肽4雜交瘤的、包含抗-Cad-Il抗體的培養(yǎng)基與Cad_l 1EC1-2蛋白相結(jié) 合(圖16，HL對(duì)比Cadll)，但不結(jié)合包含Cad-8和MN-Cad的EC1-2結(jié)構(gòu)域的蛋白(圖16， 對(duì)應(yīng)地為HL對(duì)比CadS以及HL對(duì)比MNCAD)。對(duì)照雜交瘤培養(yǎng)基不與所測(cè)試的鈣黏著蛋白 中的任何相結(jié)合(圖16，Media對(duì)比CADll、Media對(duì)比CAD8、以及Media對(duì)比MNCAD)。這些數(shù)據(jù)證明了在這些雜交瘤中存在針對(duì)肽4的Cad-Il特異性抗體。兩種肽4雜交瘤(在此被稱(chēng)為HlMl和H14)與表達(dá)人類(lèi)Cad-Il蛋白的細(xì)胞相結(jié) 合(圖17A至C和17G至I)，但不與非Cad-Il對(duì)照431-D
細(xì)胞相結(jié)合(圖17D至17F )。被稱(chēng)為HlMl的雜交瘤細(xì)胞系具有Α. T.
C. C.命名號(hào)_，已經(jīng)于2009年1月8日保存。被稱(chēng)為H14的雜交
瘤細(xì)胞系具有A.T.C.C.命名號(hào)_，已經(jīng)于2009年1月9日保存。
這些雜交瘤包含體外識(shí)別肽4以及表達(dá)Cad-Il的細(xì)胞的抗Cad-Il抗體。
這些抗體與表達(dá)Cad-Il-的細(xì)胞的結(jié)合是用所使用的肽4抗體的量進(jìn)行滴定來(lái)顯示的，正 如在HlMl的滴定(圖18A)和H14的滴定(圖18B)對(duì)比來(lái)自平均熒光強(qiáng)度(MFI)的細(xì)胞 染色強(qiáng)度的曲線(xiàn)圖所示。與所測(cè)試的任何其他鈣黏著蛋白(它們包括Cad-7、Cad-8、Cad-20、Cad-24、 Cad-9、Cad-18、以及 MN-Cad)相比，HlMl 和 H14 肽 4 抗-Cad-Il 抗體證明了與 Cad-Il 相結(jié) 合高出超過(guò)100倍。在大多數(shù)情況下，沒(méi)有觀察到HlMl和H14抗Cad-Il抗體與其他鈣黏 著蛋白的結(jié)合?？笴ad-Il抗體H14顯示出對(duì)Cad-Il的強(qiáng)結(jié)合(圖19A)，對(duì)Cad_8的結(jié)合 低 468 倍(圖 19A)，并且?guī)缀醪唤Y(jié)合 Cad-7、MN-Cad、Cad-9、Cad-18、Cad-20、或 Cad-24 (圖 19B)。類(lèi)似的，抗Cad-Il抗體HlMl顯示出對(duì)Cad-Il的強(qiáng)結(jié)合(圖20)，對(duì)Cad_8的結(jié)合 低 365 倍(圖 20)，并且不結(jié)合 Cad-7、MN-Cad、Cad_9、Cad-18、Cad-20、或 Cad_24(數(shù)據(jù)未 顯不)。實(shí)例6 這些抗Cad-IlECl結(jié)構(gòu)域抗體HlMl和H14與包括氨基酸序列GPDP的 Cad-IlECl結(jié)構(gòu)域中的表位相結(jié)合。材料和方法為了確定在肽4Cad_llECl抗體HlMl和H14所結(jié)合的Cad-IlECl結(jié)構(gòu)域內(nèi)的表 位，將跨越ECl區(qū)域的前37個(gè)氨基酸的4種不同的肽(見(jiàn)圖22)以一種ELISA形式進(jìn) 行固定，并且確定了 HlMl和H14抗體與這4種肽中的每一種相結(jié)合的能力。在4°C下用 0. 3ng/孔的肽1 (Cad-IlECl結(jié)構(gòu)域的氨基酸G1-P18)、0. 3ng/孔的肽2 (Cad-llECl結(jié)構(gòu)域 的氨基酸G15-N34)、0. 3ng/孔的肽3 (Cad-IlECl結(jié)構(gòu)域的氨基酸V19-Y37)、0. 3ng/孔的 免疫原肽4(Cad-1 IECl結(jié)構(gòu)域的氨基酸G1-G33)、20ng的一種融合蛋白(包括整個(gè)ECl結(jié) 構(gòu)域(EFL))、或20ng的對(duì)照人類(lèi)Ig(Fe-段)將96-孔再反應(yīng)結(jié)合板包被過(guò)夜。將這些 孔用PBS-Tween(0. 05% )洗滌兩次、在22°C下用在dH20中的酪蛋白封閉3小時(shí)，并接著 用PBS-Tween(0. 05% )再次洗滌兩次。將不同稀釋的這些不同的肽4CAD-11EC1結(jié)構(gòu)域抗 體轉(zhuǎn)移到這些肽或蛋白包被的孔中，在22°C下孵育45分鐘，并接著用PBS-Tween(0. 05% ) 洗滌兩次。將 100 μ 1 的羊抗小鼠 IgG 二抗(Jackson ImmunoResearch, WestGrove, PA)的 1/1000稀釋液加入到每個(gè)孔中，在22°C下孵育30分鐘，并接著用PBS-Tween(0. 05% )洗 滌兩次。將100 μ 1/孔的室溫TMB試劑加入到每個(gè)孔，并且允許在22°C下顯色5分鐘。用 100 μ 1的室溫的2Ν硫酸將該反應(yīng)終止，并且在Wallac 1420酶標(biāo)儀上在450nm的波長(zhǎng)下讀 取該板。結(jié)果在該ELISA中，肽4抗-Cad-Il 抗體HlMl 在 1 11 下(圖 21A)并且H14在 1 23下(圖21B)均與肽4(PEP4)免疫原、連同ECl結(jié)構(gòu)域融合蛋白(EFL)相結(jié)合，正如通過(guò)相 對(duì)于對(duì)照物提高的0D450孔板讀數(shù)所指示。這些抗體中沒(méi)有一種與這種人類(lèi)IgG對(duì)照(Fe 段)相結(jié)合。此外，在該ELISA中這兩種抗體均與肽2 (PEP2)相結(jié)合，但不結(jié)合肽1 (PEPl) 或肽 3 (PEP3)(圖 21A 和 21B)。這些結(jié)果提示這些抗Cad-IlECl結(jié)構(gòu)域抗體(H1M1和H14)與一種常見(jiàn)表位 (common epitope)相結(jié)合，該表位在肽2和4中、但不存在于重疊的肽3中。作為肽3的上 游、由肽2和4共有的氨基酸在圖22所示的加框區(qū)域中被突出顯示。從Cad-IlECl結(jié)構(gòu)域 的G15開(kāi)始，這四個(gè)氨基酸GPDP(SEQ ID NO 11)可能是由HlMl和H14抗體所識(shí)別的表位 的一部分。實(shí)例7 抗Cad-IlECl結(jié)構(gòu)域抗體HlMl和H14體外抑制了表達(dá)Cad-Il的細(xì)胞的聚集。材料和方法為了評(píng)估這些Cad-Il抗體抑制Cad-Il介導(dǎo)的細(xì)胞聚集的能力，將30 μ g/ml的 HlMl肽4抗體與75，000個(gè)表達(dá)Cad-Il的A-431-D表皮樣癌細(xì)胞在24-孔圓底聚丙烯板 中、在0. 5ml的DMEM-高葡萄糖、20mMH印es pH 7. 4、10% FCS、以及10U/ml DNA酶中培養(yǎng)。 將這些24-孔板放置在旋轉(zhuǎn)的平臺(tái)上(以大約60rpm)，并且在37°C下用5% CO2孵育過(guò)夜。 第二天，在IOOx (對(duì)于HlMl實(shí)驗(yàn))或40x (對(duì)于H14實(shí)驗(yàn))放大倍數(shù)下對(duì)這些板拍照之后 評(píng)定細(xì)胞的聚集。結(jié)果在對(duì)照同種型抗體(30 μ g/ml)的存在下，這些表達(dá)Cad-Il的細(xì)胞形成了大塊 (圖23A)，而這些親本的Cad-Il陰性細(xì)胞保持著單細(xì)胞群或雙細(xì)胞群(圖23C)。這些HlMl 處理的Cad-Il細(xì)胞保持為小的細(xì)胞簇(圖23B)，這些細(xì)胞簇沒(méi)有發(fā)展形成使用該對(duì)照抗體 所獲得的大的團(tuán)塊。使用相同的測(cè)定，抗Cad-Il抗體H14還顯示出抑制Cad-Il-介導(dǎo)的聚集。盡管這 些親本的表達(dá)Cad-Il的細(xì)胞形成了大的聚集的細(xì)胞簇(圖24A)，這種H14抗體(圖24B) 在30 μ g/ml的濃度下抑制了聚集，因?yàn)榧?xì)胞簇是小的并且稀少的。這些結(jié)果表明這些抗 Cad-Il抗體(H1M1和H14)在體外抑制了 Cad-Il介導(dǎo)的細(xì)胞聚集。實(shí)例8 抗Cad-IlECl結(jié)構(gòu)域抗體(H1M1和H14)在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的鼠模型中在 體內(nèi)抑制與關(guān)節(jié)炎相關(guān)聯(lián)的關(guān)節(jié)腫脹。材料和方法研究1-在第0天和第2天用150 μ 1的KBN血清注射六周齡的雄性C57/B16小鼠。 經(jīng)KBN血清處理的小鼠接受了鹽水注射液(圖25，空心的三角形)或用不同劑量的HlMl 抗-Cad-IlECl抗體進(jìn)行治療。治療方案包括在第0天用0. 5mg的抗體/小鼠進(jìn)行給藥， 并且在這之后每隔一天(q2d)用0. Img的抗體/小鼠(0. 5mg+0. Img)進(jìn)行給藥(圖25，實(shí) 心三角形)；在第0天用0. 5mg的抗體/小鼠(0. 5mg)進(jìn)行給藥(圖25，菱形)；每隔一天 (q2d)用0. Img的抗體/小鼠(0. lmg+0. Img)進(jìn)行給藥(圖25，正方形)；或每隔一天(q2d) 用0. 3mg的抗體/小鼠(0. 3mg+0. 3mg)進(jìn)行給藥(圖25，圓形)。對(duì)照組由5只小鼠組成， 并且治療組由7只小鼠組成。與關(guān)節(jié)炎相關(guān)聯(lián)的關(guān)節(jié)腫脹是通過(guò)每隔一天采取的卡尺測(cè)量 來(lái)確定的。
研究2-在第0天和第2天用150 μ 1的KBN血清注射六周齡的雄性C57/B16小 鼠，并接著每隔一天(q2d)用鹽水治療(圖26，三角形)、或用抗Cad-Il抗體HlMl (圖26， 正方形)或H14(圖26，圓形)之一以0. 3mg/劑量q2d治療。對(duì)照組由5只小鼠組成，并且 治療組由7只小鼠組成。與關(guān)節(jié)炎相關(guān)聯(lián)的關(guān)節(jié)腫脹是通過(guò)每隔一天采取的卡尺測(cè)量來(lái)確 定的。結(jié)果研究1-相對(duì)于對(duì)照小鼠，HlMl抗-Cad-Il抗體抑制了關(guān)節(jié)腫脹。與關(guān)節(jié)炎相關(guān) 聯(lián)的關(guān)節(jié)腫脹的最大抑制是通過(guò)每隔一天用0. 3mg的HlMl抗體對(duì)經(jīng)KBN處理的小鼠進(jìn)行 給藥來(lái)進(jìn)行觀察的(圖25，圓形)。研究2-相對(duì)于對(duì)照，這兩種抗-Cad-Il抗體均抑制了關(guān)節(jié)腫脹。在這項(xiàng)研究中， 與這些對(duì)照動(dòng)物相比，這種H14抗體顯著地延遲了關(guān)節(jié)炎的發(fā)作(圖27)。在對(duì)照組中所有 小鼠都在第3天發(fā)展成了關(guān)節(jié)炎，而在所有這些動(dòng)物發(fā)展成關(guān)節(jié)炎之前H14治療的小鼠要 求6天。這些研究表明對(duì)抗人類(lèi)Cad-Il的ECl結(jié)構(gòu)域的抗體可以在體內(nèi)抑制關(guān)節(jié)炎的發(fā)
展和嚴(yán)重程度。實(shí)例9 對(duì)抗人類(lèi)鈣黏著蛋白-11的另一種ECl結(jié)構(gòu)域肽的抗體的產(chǎn)生。材料和方法用0. Olmg 的肽 V19_Y37(VL VGRLH SDIDS GDGNI KY (SEQ IDNO 12))在足墊處對(duì) Balb/c小鼠進(jìn)行免疫，一周兩次，一個(gè)月9次，這種肽與人類(lèi)Cad-I IECl結(jié)構(gòu)域的19個(gè)氨基 酸相對(duì)應(yīng)、以共價(jià)鍵與BSA相連接。這種肽在此被稱(chēng)作肽3。從經(jīng)免疫的小鼠中得到脾，并 且將其與一種鼠融合伴侶P3X63-Ag8. 653融合，從而生成產(chǎn)生抗體的雜交瘤。將這些雜交 瘤擴(kuò)展，并且對(duì)來(lái)自這些雜交瘤的、包含抗Cad-Il抗體的培養(yǎng)基篩選與一種蛋白相結(jié)合的 能力，該蛋白對(duì)應(yīng)于在細(xì)菌中產(chǎn)生的Cad-Il的EC1-2結(jié)構(gòu)域。同時(shí)，對(duì)來(lái)自這些肽3雜交 瘤的、包含抗-Cad-Il抗體的培養(yǎng)基篩選與涵蓋Cad-8和MN-鈣黏著蛋白的EC1-2結(jié)構(gòu)域 的蛋白相結(jié)合的缺失。在4°C下用0. 05ml的0至300mg/ml的ECl_2Cad蛋白中每一種蛋 白、或CHO細(xì)胞產(chǎn)生的ECl-Fc融合蛋白將96-孔EIA板包被過(guò)夜，并接著用鹽水緩沖液洗 滌若干次。然后，用0. 25ml的酪蛋白-PBS緩沖液封閉這些板，并且隨后用鹽水緩沖液洗滌 若干次。在22°C下將含有這些肽3抗Cad-Il抗體的雜交瘤培養(yǎng)基在每個(gè)孔中未稀釋地孵 育1小時(shí)，并接著用PBS-Tween (0. 05% )洗滌兩次。將100 μ 1的一種羊抗小鼠IgG 二抗的 1/1000稀釋液加入到每個(gè)孔中，在22°C下孵育30分鐘，并接著用PBS-Tween (0. 05% )洗滌 兩次。將ΙΟΟμΙ/孔的室溫TMB(3，3’，5，5’_四甲基聯(lián)苯胺)試劑加入到每個(gè)孔，并且允許 在22°C下顯色5分鐘。用100 μ 1的室溫的2Ν硫酸將該反應(yīng)終止，并且在Wallac 1420酶 標(biāo)儀上在450nm下讀取該板。還對(duì)來(lái)自這些肽3雜交瘤的培養(yǎng)基測(cè)試了與在細(xì)胞上表達(dá)的人類(lèi)Cad-Il蛋白相 結(jié)合的能力。冰凍的表達(dá)Cad-Il的431D細(xì)胞被解凍，并且在含有Ca2+的HBSS中洗滌兩次， 并接著以IO6個(gè)細(xì)胞/ml在含有Ca2+的HBSS中重懸。用50%或16%抗Cad-Il抗體培養(yǎng)基 在冰上將IO5個(gè)細(xì)胞/孔染色45分鐘，在含有Ca2+的HBSS中洗滌兩次，并接著用一種與藻 紅蛋白相偶聯(lián)的羊抗小鼠IgG 二抗以的濃度在冰上染色45分鐘，并接著在含有Ca2+的 HBSS中再次洗滌兩次。然后，在含有Ca2+和甲醛的400 μ 1 HBSS中將這些細(xì)胞重懸，并且隨后在FACScalibur上對(duì)PE陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行分析。結(jié)果來(lái)自來(lái)自這些肽3雜交瘤的、包含抗-Cad-Il抗體的培養(yǎng)基與Cad_l 1EC1-2蛋白 以及ECl-Fc融合蛋白相結(jié)合(圖28，對(duì)應(yīng)地是HL對(duì)比Cadll以及HL對(duì)比Cadll-ECl)，但 不結(jié)合包含Cad-8和MN-Cad的EC1-2結(jié)構(gòu)域的蛋白(圖28，對(duì)應(yīng)地是HL對(duì)比Cad8、以及 HL對(duì)比MNCAD)。對(duì)照雜交瘤培養(yǎng)基不結(jié)合任何鈣黏著蛋白蛋白(圖28，Media對(duì)比CAD11、 Media 對(duì)比 CAD8、并且 Media 對(duì)比 MNCAD)。來(lái)自這些肽3雜交瘤的抗-Cad-Il抗體還與表達(dá)人類(lèi)Cad-Il蛋白的細(xì)胞相結(jié)合 (圖29，見(jiàn)箭頭)，但未與不表達(dá)Cad-Il的對(duì)照細(xì)胞(表達(dá)Neos)相結(jié)合。這種結(jié)果證實(shí) 在這些雜交瘤中存在體外識(shí)別肽3和表達(dá)Cad-Il-的細(xì)胞的抗Cad-Il抗體。所有專(zhuān)利、公開(kāi)的申請(qǐng)以及參考文獻(xiàn)的有關(guān)傳授內(nèi)容都通過(guò)引用將其全文進(jìn)行結(jié)
權(quán)利要求
一種鈣黏著蛋白 11拮抗劑，該鈣黏著蛋白 11拮抗劑特異性地結(jié)合到一種哺乳動(dòng)物鈣黏著蛋白 11蛋白的一個(gè)EC1結(jié)構(gòu)域上，其中該鈣黏著蛋白 11拮抗劑抑制了表達(dá)所述哺乳動(dòng)物鈣黏著蛋白 11蛋白的細(xì)胞的聚集。
2.如權(quán)利要求1所述的鈣黏著蛋白-11拮抗劑，其中該鈣黏著蛋白-11拮抗劑結(jié)合到 SEQ ID NO 3 上。
3.如權(quán)利要求1所述的鈣黏著蛋白-11拮抗劑，其中該鈣黏著蛋白-11拮抗劑是選自 下組，其組成為一種抗體、融合蛋白、肽、模擬肽、核酸、以及小分子。
4.一種分離的抗體，該分離的抗體特異性地結(jié)合到一種哺乳動(dòng)物鈣黏著蛋白-11蛋白 的一個(gè)ECl結(jié)構(gòu)域上，其中該抗體抑制了表達(dá)所述哺乳動(dòng)物鈣黏著蛋白-11蛋白的細(xì)胞的聚集。
5.如權(quán)利要求4所述的分離的抗體，其中該抗體與一種表位相結(jié)合，該表位存在于SEQ ID NO :3 中。
6.如權(quán)利要求5所述的分離的抗體，其中該表位不包括氨基酸序列EEY。
7.如權(quán)利要求4所述的分離的抗體，其中該抗體是選自下組，其組成為一種單克隆抗 體、多克隆抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、以及抗體片段。
8.如權(quán)利要求7所述的分離的抗體，其中該抗體是一種抗體片段。
9.如權(quán)利要求8所述的分離的抗體，其中該抗體片段是選自下組，其組成為一種Fab、 Fab，、F(ab，)2 以及 ScFv0
10.一種融合蛋白，包括一種哺乳動(dòng)物免疫球蛋白的至少一部分以及一種人類(lèi)鈣黏著 蛋白-11胞外區(qū)的一部分，該部分包括SEQ ID NO :2的氨基酸54-90，其中該人類(lèi)鈣黏著蛋 白-11胞外區(qū)的部分不包括由SEQ IDNO 2的氨基酸1_609組成的整個(gè)人類(lèi)鈣黏著蛋白-11 胞外區(qū)。
11.如權(quán)利要求10所述的融合蛋白，其中該融合蛋白包括SEQID N0:2的氨基酸 1-150。
12.如權(quán)利要求10所述的融合蛋白，其中該融合蛋白包括SEQID NO :2的氨基酸 1-160。
13.如權(quán)利要求10所述的融合蛋白，其中該融合蛋白包括SEQID N0:2的氨基酸 1-259。
14.如權(quán)利要求10所述的融合蛋白，其中該融合蛋白包括SEQID NO :2的氨基酸 1-269。
15.如權(quán)利要求10所述的融合蛋白，其中該融合蛋白缺乏SEQID NO :2的氨基酸1-53。
16.如權(quán)利要求10所述的融合蛋白，其中該哺乳動(dòng)物免疫球蛋白是一種人類(lèi)IgG2蛋白。
17.如權(quán)利要求16所述的融合蛋白，其中該融合蛋白包括人類(lèi)IgG2的鉸鏈-CH2-CH3部分。
18.如權(quán)利要求10所述的融合蛋白，其中該融合蛋白是一種單體、一種二聚體、或一種 四聚體。
19.一種對(duì)有需要的哺乳動(dòng)物受試者體內(nèi)的炎性關(guān)節(jié)障礙進(jìn)行治療的方法，該方法包 括對(duì)該受試者給予治療有效量的一種鈣黏著蛋白-11拮抗劑，該鈣黏著蛋白-11拮抗劑特異性地結(jié)合到一種哺乳動(dòng)物鈣黏著蛋白-11蛋白的一個(gè)ECl結(jié)構(gòu)域上，其中該鈣黏著蛋 白-11拮抗劑抑制了細(xì)胞的聚集，這些細(xì)胞在所述受試者的一個(gè)或多個(gè)關(guān)節(jié)中表達(dá)所述哺 乳動(dòng)物鈣黏著蛋白-11蛋白。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中該鈣黏著蛋白-11拮抗劑結(jié)合到SEQIDN0:3上。
21.如權(quán)利要求19所述的方法，其中該炎性關(guān)節(jié)障礙是選自下組，其組成為類(lèi)風(fēng)濕性 關(guān)節(jié)炎、骨性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、萊特爾氏綜合征、以及強(qiáng)直性脊柱炎。
22.如權(quán)利要求19所述的方法，其中該炎性關(guān)節(jié)障礙是類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
23.如權(quán)利要求19所述的方法，其中該鈣黏著蛋白-11拮抗劑是一種分離的抗體。
24.如權(quán)利要求19所述的方法，其中該鈣黏著蛋白-11拮抗劑是一種融合蛋白，該融合 蛋白包括一種哺乳動(dòng)物免疫球蛋白的至少一部分以及一種人類(lèi)鈣黏著蛋白-11胞外區(qū)的 一部分，該部分包括SEQ ID NO :2的氨基酸54-90，其中該人類(lèi)鈣黏著蛋白-11胞外區(qū)的部 分不包括由SEQ IDNO 2的氨基酸1-609組成的整個(gè)人類(lèi)鈣黏著蛋白-11胞外區(qū)。
25.如權(quán)利要求19所述的方法，其中該哺乳動(dòng)物受試者是人。
26.如權(quán)利要求19所述的方法，其中對(duì)該鈣黏著蛋白-11拮抗劑進(jìn)行全身給藥。
27.如權(quán)利要求19所述的方法，其中對(duì)該鈣黏著蛋白-11拮抗劑進(jìn)行靜脈內(nèi)給藥。
28.如權(quán)利要求19所述的方法，其中將該鈣黏著蛋白-11拮抗劑通過(guò)直接注射到一個(gè) 關(guān)節(jié)中來(lái)進(jìn)行給藥。
29.如權(quán)利要求19所述的方法，其中該鈣黏著蛋白-11拮抗劑抑制了細(xì)胞的遷移、黏 附、侵入到軟骨中、或細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)，這些細(xì)胞在所述受試者的一個(gè)或多個(gè)關(guān)節(jié)中表達(dá)所 述哺乳動(dòng)物鈣黏著蛋白-11蛋白。
30.如權(quán)利要求19所述的方法，其中該鈣黏著蛋白-11拮抗劑抑制了誘導(dǎo)一種酶的 表達(dá)或活性，該酶選自下組，其組成為細(xì)胞中的一種膠原酶、一種絲氨酸蛋白酶、以及一種 基質(zhì)金屬蛋白酶，這些細(xì)胞在所述受試者的一個(gè)或多個(gè)關(guān)節(jié)中表達(dá)所述哺乳動(dòng)物鈣黏著蛋 白-11蛋白。
31.如權(quán)利要求19所述的方法，其中該鈣黏著蛋白-11拮抗劑抑制了誘導(dǎo)一種細(xì)胞 因子或生長(zhǎng)因子的表達(dá)或活性，該細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子選自下組，其組成為細(xì)胞中的一種 IL-6、IL-8、RANKL、以及TRANCE，這些細(xì)胞在所述受試者的一個(gè)或多個(gè)關(guān)節(jié)中表達(dá)所述哺乳 動(dòng)物鈣黏著蛋白-11蛋白。
32.如權(quán)利要求19所述的方法，其中將該鈣黏著蛋白-11拮抗劑與一種緩解疾病的抗 風(fēng)濕藥相組合進(jìn)行給藥。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中該緩解疾病的抗風(fēng)濕藥是甲氨蝶呤。
34.如權(quán)利要求19所述的方法，其中將該鈣黏著蛋白-11拮抗劑與一種抗炎劑相組合 進(jìn)行給藥。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其中該抗炎劑是一種NSAID或類(lèi)固醇。
36.如權(quán)利要求34所述的方法，其中該抗炎劑是一種緩解疾病的抗風(fēng)濕藥物或一種重組蛋白。
37.一種藥物組合物，包括一種鈣黏著蛋白-11拮抗劑，該鈣黏著蛋白-11拮抗劑特 異性地結(jié)合到一種哺乳動(dòng)物鈣黏著蛋白-11蛋白的一個(gè)ECl結(jié)構(gòu)域上，并且抑制了表達(dá)所 述哺乳動(dòng)物鈣黏著蛋白-11的細(xì)胞的聚集；以及一種藥學(xué)上可接受的載體。
38.如權(quán)利要求37所述的藥物組合物，其中該鈣黏著蛋白-11拮抗劑結(jié)合到SEQID NO 3 上。
39.如權(quán)利要求37所述的藥物組合物，其中該鈣黏著蛋白-11拮抗劑是一種分離的抗體。
40.如權(quán)利要求37所述的藥用組合物，其中該鈣黏著蛋白-11拮抗劑是一種融合蛋白， 該融合蛋白包括一種哺乳動(dòng)物免疫球蛋白的至少一部分以及一種人類(lèi)鈣黏著蛋白-11胞 外區(qū)的一部分，該部分包括SEQ ID NO :2的氨基酸54-90，其中該人類(lèi)鈣黏著蛋白-11胞外 區(qū)的部分不包括由SEQID NO 2的氨基酸1-609組成的整個(gè)人類(lèi)鈣黏著蛋白-11胞外區(qū)。
41.如權(quán)利要求37所述的藥物組合物，進(jìn)一步包括一種緩解疾病的抗風(fēng)濕藥。
42.如權(quán)利要求41所述的藥物組合物，其中該緩解疾病的抗風(fēng)濕藥是甲氨蝶呤。
43.如權(quán)利要求37所述的藥物組合物，進(jìn)一步包括一種抗炎劑。
44.如權(quán)利要求43所述的藥物組合物，其中該抗炎劑是一種NSAID或類(lèi)固醇。
45.如權(quán)利要求43所述的藥物組合物，其中該抗炎劑是一種緩解疾病的抗風(fēng)濕藥物或 重組蛋白。
46.如權(quán)利要求4所述的分離的抗體，其中該抗體與一種表位相結(jié)合，該表位存在于 SEQ ID NO 10 中。
47.如權(quán)利要求4所述的分離的抗體，其中該抗體與一種表位相結(jié)合，該表位包括SEQ ID NO :11ο
48.如權(quán)利要求4所述的分離的抗體，其中該抗體與一種表位相結(jié)合，該表位存在于 SEQ ID NO 12 中。
49.如權(quán)利要求23所述的方法，其中該分離的抗體與一種表位相結(jié)合，該表位包括SEQ ID NO :11ο
50.如權(quán)利要求23所述的方法，其中該分離的抗體與一種表位相結(jié)合，該表位存在于 選自下組的至少一種序列中，該組的組成為=SEQ IDNO 10, SEQ ID Ν0:12、以及SEQ ID NO: 13。
51.如權(quán)利要求39所述的藥物組合物，其中該分離的抗體與一種表位相結(jié)合，該表位 包括 SEQ ID NO =Ilo
52.如權(quán)利要求39所述的藥物組合物，其中該分離的抗體與一種表位相結(jié)合，該表位 存在于選自下組的至少一種序列中，該組的組成為SEQ IDNO 10, SEQ ID Ν0:12、以及SEQ ID NO :13。
53.一種分離的核酸，該核酸編碼了如權(quán)利要求4所述的抗體。
54.如權(quán)利要求53所述的分離的核酸，其中所述核酸存在于一種載體中。
55.一種分離的細(xì)胞，該細(xì)胞表達(dá)如權(quán)利要求4所述的抗體。
56.一種雜交瘤HlMl的細(xì)胞(ATCC登錄號(hào)_)。
57.一種雜交瘤Η14的細(xì)胞(ATCC登錄號(hào)_)。
58.一種由雜交瘤HlMl產(chǎn)生的抗體(ATCC登錄號(hào)_)。
59.一種由雜交瘤H14產(chǎn)生的抗體(ATCC登錄號(hào)_)。
60.一種鈣黏著蛋白-11拮抗劑的用途，該鈣黏著蛋白-11拮抗劑特異性地結(jié)合到一種 哺乳動(dòng)物鈣黏著蛋白-11蛋白的一個(gè)ECl結(jié)構(gòu)域上，用于對(duì)有需要的哺乳動(dòng)物受試者體內(nèi)的炎性關(guān)節(jié)障礙進(jìn)行治療。
61. 一種鈣黏著蛋白-11拮抗劑在藥物制造中的用途，該鈣黏著蛋白-11拮抗劑特異性 地結(jié)合到一種哺乳動(dòng)物鈣黏著蛋白-11蛋白的一個(gè)ECl結(jié)構(gòu)域上，用于對(duì)有需要的哺乳動(dòng) 物受試者體內(nèi)的炎性關(guān)節(jié)障礙進(jìn)行治療。
全文摘要
本發(fā)明涉及鈣黏著蛋白-11拮抗劑以及包括鈣黏著蛋白-11拮抗劑的組合物。本發(fā)明還涉及通過(guò)給予治療有效量的一種鈣黏著蛋白-11拮抗劑來(lái)治療哺乳動(dòng)物受試者體內(nèi)的炎性關(guān)節(jié)障礙(例如，類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)的方法。
文檔編號(hào)C07K16/28GK101952316SQ200980101955
公開(kāi)日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2009年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月11日
發(fā)明者J·G·麥卡瑟 申請(qǐng)人:希諾維克斯公司