專利名稱：抗cldn6抗體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種通常的抗體藥物。更具體而言，本發(fā)明涉及一種抗CLDN6抗體及 含有該抗體的細胞生長抑制劑及抗癌劑。
背景技術：
Claudin家族是構成緊密連接的分子量約23kD的4次跨膜的細胞膜蛋白質(zhì)家族， 在人及小鼠中Claudin家族包括24種成員，已知各Claudin在每種上皮細胞中表現(xiàn)出非常 獨特的表達方式(非專利文獻 l(Furuse and Tsukita, TRENDS in Cell Biology 2006，16 : 181)；非專利文獻 2 (Wilcox，et al. ,Cell 2001,104:165)；非專利文獻 3 (Rahner，et al.， GASTROENTEROLOGY 2001，120 411)；非專利文獻 4 (Morita，et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999,96:511))?？芍谏掀ぜ毎麑又校乐辜毎g隙的物質(zhì)泄漏(擴散)的機制發(fā)揮 作用，在上述防止泄漏的機制中被稱作緊密連接的細胞黏附裝置真正地發(fā)揮作為“屏障”的 重要作用。人CLDN6轉(zhuǎn)錄體在癌中高度表達已經(jīng)被非專利文獻5 (Hewitt，et al. ,BMC Cancer
2006.6186)或?qū)＠墨I1(W0 2003/088808)等公開。另外，非專利文獻6 (Osanai，et al. , Cancer Sci. 2007,98 1557)及非專利文獻 7 (Azadeh Arabzadeh,et al.，BMC Cancer
2007.7196)中記載了在癌中人及小鼠CLDN6以蛋白質(zhì)水平進行表達。非專利文獻6中， 通過使用乳腺癌細胞株即MCF7的蛋白質(zhì)印跡解析進行揭示。該文獻主張如其題目所述， 乳腺癌細胞株中的人CLDN6的外遺傳沉默促進癌細胞的錨定非依賴性生長。非專利文獻6 公開了在MCF7細胞株中，作為癌抑制基因的人CLDN6因啟動子區(qū)域的部分甲基化導致表達 降低，結(jié)果細胞凋亡敏感性減少，菌落形成能力降低，癌細胞的侵潤能力提高，金屬蛋白酶 活性升高，癌細胞的遷移(Migration)能力亢進，有助于癌的惡性化。但是，非專利文獻6中實施的對MCF7細胞中的人CLDN6的蛋白質(zhì)印跡，用于進行 利用siRNA的人CLDN6的敲除體系是否發(fā)揮作用的確認實驗，沒有記載關于材料、即使用抗 體或方法的內(nèi)容，另外，沒有進行與正常組織相比，乳腺癌細胞株MCF7中人CLDN6蛋白的表 達量以何種程度變化的實驗。非專利文獻6的作者指出，在此文獻中引用了比此文獻更早 的現(xiàn)有文獻即非專利文獻8 (Quan and Lu，Carcinogenesis2003，24 :1593)，基于非專利文 獻8的記載，進行進一步的研究。上述非專利文獻8考察了下述內(nèi)容，即，人CLDN6與正常 乳腺上皮細胞相比，在乳腺癌細胞株BT-474及MCF7中mRNA的表達減少，所以在乳腺癌中 人CLDN6為癌抑制基因。即，非專利文獻6中，與正常乳腺相比，在乳腺癌細胞株MCF7中人 CLDN6蛋白的表達減少，基于上述觀點進行了研究，并且得到下述結(jié)論乳腺癌細胞株中的 人CLDN6的外遺傳沉默促進癌細胞的錨定非依賴性生長。另外，非專利文獻7僅涉及下述內(nèi)容通過免疫組織染色考察在給與DMBA/TPA的 小鼠化學致癌腫瘤中包括小鼠CLDN6蛋白在內(nèi)的幾個小鼠Claudin蛋白的表達譜的變化， 并指出在正常小鼠中小鼠CLDN6在“上基部層(suprabasal compartment) ”中表達。需要說明的是，對于抗CLDN6抗體來說，能夠通過流式細胞術識別細胞膜表面的人CLDN6的、即能夠識別以天然形態(tài)存在于細胞膜表面的人CLDN6的單克隆抗體還未見報道。[專利文獻 l]W02003/088808[非專利文獻 l]Mikio Furuse and Shoichiro Tsukita :Claudins in occluding junctions of human and flies. TRENDS in Cell Biology 2006，16:181[非專禾U 文獻 2]Edward R. Wilcox, Quianna L. Burton, Sadaf Naz, Saima Riazuddin，Tenesha N. Smith，Barbara Ploplis，Inna Belyantseva, Tamar Ben-Yosef, NikkiA. Liburd, Robert J. Morel1, Bechara Kachar, Doris K. Wu, Andrew J. Griffith, Sheikh Riazuddin, and Thomas B. Friedman :Mutations in the Gene Encoding Tight Junction Claudin—14 Cause Autosomal Recessive Deafness DFNB29. Cell 2001，104 165[非專利文獻 3]Christoph Rahner, Laura LMitic，and James M. Anderson Heterogeneity in表達and Subcellular Localization of Claudin 2，3，4，and 5 in the Rat Liver, Pancreas, and Gut. GASTR0ENTER0L0GY2001,120 411[非專禾丨J 文獻 4]Kazumasa Morita， Mikio Furuse, Kazushi Fujimoto, and Shoichiro Tsukita :Claudin multigene family encoding four—transmembrane domain protein components of tight junction strands. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999，96 511[非專禾"J文獻 5]Kyle J Hewitt，Rachana Agarwal and Patrice J Morin :The claudin gene family 表達 in normal and neoplastic 組織 s· BMCCancer 2006，6 :186[非專禾U 文獻 6]Makoto Osanai, Masaki Murata, Hideki Chiba， Takashi Kojima and Norimasa Sawada :Epigenetic silencing of claudin—6 promotes anchorage-independent growth of breast carcinoma cells. Cancer Sci 2007,98 1557[非專利文獻 7] Azadeh Arabzadeh, Tammy-Claire Troy and Kursad Turksen Changes in the distribution pattern of Claudin tight junction proteins during the progression of mouse skin tumorigenesis. BMC Cancer 2007,7:196[與一專禾U文獻 8]Chengshi Quan and Shi-Jiang Lu !identification of genes preferentially expressed in mammary epithelial cells of Copenhagen rat using subtractive hybridization and microarrays· Carcinogenesis 2003，24:1593[非專利文獻9]Kohls MDiLappi DA :Mab-ZAP :A tool for evaluating antibody efficacy for use in an immunotoxin. BioTechniques 2000，28(1) :162[非專利文獻 10]Nimmerjahn F，Ravetch JV. !Divergent immunoglobulin G subclass activity through selective Fc receptor binding. Science. 2005,310 1510[非專利文獻 11]Nimmerjahn FiRavetch JV. :Fc γ Receptors :01d friends and new family members. Immunity. 2006，24 :19

發(fā)明內(nèi)容
此次，本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)，人CLDN6 mRNA在成人的所有正常組織中均未發(fā)現(xiàn)其表達， 但在腫瘤組織(肺腺癌、胃癌、卵巢癌)中表達亢進。
另外，本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)在多數(shù)癌細胞株中人CLDN6蛋白質(zhì)高度表達，其蛋白表達 與mRNA表達解析結(jié)果一致。進而，本發(fā)明人等成功制備了下述單克隆抗體識別以天然形存在于細胞膜表面 的人CLDN6的單克隆抗體；對高度表達人CLDN6的癌細胞株顯示出由ADCC及/或⑶C活性 產(chǎn)生的細胞毒性的單克隆抗體；通過與毒素的結(jié)合對人CLDN6高度表達的癌細胞株具有細 胞生長抑制作用的單克隆抗體。另外，沒有發(fā)現(xiàn)人CLDN6在正常組織中的表達，表明人CLDN6的腫瘤特異性極高。 因此，推測抗CLDN6抗體高度聚集在人CLDN6高度表達的腫瘤中，并發(fā)現(xiàn)其可以成為非常有 效的抗腫瘤劑。S卩，本發(fā)明提供一種與在細胞膜上表達的ClaUdin6(CLDN6)結(jié)合的抗體。本發(fā)明 還提供一種具有細胞毒性的抗CLDN6抗體。優(yōu)選本發(fā)明的抗CLDN6抗體具有ADCC活性及 /或CDC活性。另外，在優(yōu)選的方案中，本發(fā)明的抗CLDN6抗體與細胞毒性物質(zhì)結(jié)合。在其他方面，本發(fā)明提供以下(a) (j)中任一項所述的抗體(a)抗體(AB3-1重鏈)，包含重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)具有包含序列號24表 示的氨基酸序列的CDR1、包含序列號25表示的氨基酸序列的CDR2、包含序列號26表示的 氨基酸序列的CDR3 ；(b)抗體(AB3-1輕鏈)，包含輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)具有包含序列號27表 示的氨基酸序列的CDR1、包含序列號28表示的氨基酸序列的CDR2、包含序列號29表示的 氨基酸序列的CDR3 ；(c)抗體(AB3-1)，包含(a)所述的重鏈可變區(qū)及(b)所述的輕鏈可變區(qū)；(d)抗體(AE1-16、AE49-11重鏈)，包含重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)具有包含序 列號30表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列號31表示的氨基酸序列的CDR2、包含序列號 32表示的氨基酸序列的CDR3 ；(e)抗體(AE1-16、AE49-11輕鏈)，包含輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)具有包含序 列號33表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列號34表示的氨基酸序列的CDR2、包含序列號 35表示的氨基酸序列的CDR3 ；(f)抗體(AE1-16、AE49-11)，包含(d)所述的重鏈可變區(qū)及(e)所述的輕鏈可變 區(qū)；(g)抗體(AE3-20重鏈)，包含重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)具有包含序列號40表 示的氨基酸序列的CDR1、包含序列號41表示的氨基酸序列的CDR2、包含序列號42表示的 氨基酸序列的CDR3 ；(h)抗體(AE3-20輕鏈)，包含輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)具有包含序列號43表 示的氨基酸序列的CDR1、包含序列號44表示的氨基酸序列的CDR2、包含序列號45表示的 氨基酸序列的CDR3 ；(i)抗體(AE3-20)，包含(g)所述的重鏈可變區(qū)及(h)所述的輕鏈可變區(qū)；(j)抗體，識別與(a) ⑴中任一項所述的抗體所識別的抗原決定部位相同的抗 原決定部位。另外，在其他方面，本發(fā)明提供一種含有抗CLDN6抗體的藥物組合物。優(yōu)選本發(fā)明 的藥物組合物為細胞生長抑制劑。還優(yōu)選本發(fā)明的藥物組合物為抗癌劑。還優(yōu)選本發(fā)明的藥物組合物含有上述本發(fā)明的抗體。進而，在其他方面，本發(fā)明提供一種診斷癌的方法，該方法包括下述步驟(a)步驟，提供從受試者采取的試樣；(b)步驟，檢測(a)的試樣中所含的CLDN6蛋白質(zhì)。優(yōu)選使用抗CLDN6抗體檢測CLDN6蛋白質(zhì)。


[圖1]圖1表示正常組織中的人CLDN6的表達譜。[圖2]圖2表示肺癌中的人CLDN6的表達譜。[圖3]圖3表示胃癌中的人CLDN6的表達譜。[圖4]圖4表示卵巢癌中的人CLDN6的表達譜。[圖5]圖5表示利用抗CLDN6山羊多克隆抗體(Santa Cruz, C-20，Code. sc-17669)進行的蛋白質(zhì)印跡。[圖6]圖6表示抗人CLDN6抗體對人CLDN6強制表達細胞及親本株的結(jié)合性的測 定(流式細胞術解析)。[圖7]圖7表示抗人CLDN6抗體對肺腺癌細胞株ABC-1及胃癌細胞株AGS的結(jié)合 性的測定(流式細胞術解析)。[圖8]圖8表示抗人CLDN6抗體對肺腺癌細胞株ABC-1的ADCC活性。[圖9]圖9表示抗人CLDN6抗體對胃癌細胞株AGS的ADCC活性。[圖10]圖10表示抗人CLDN6抗體對肺腺癌細胞株ABC-I的⑶C活性。[圖11]圖11表示使用Mab-ZAP的抗人CLDN6單克隆抗體對肺腺癌細胞株ABC-I 的抗腫瘤效果。[圖12]圖12表示使用Mab-ZAP的抗人CLDN6單克隆抗體對胃癌細胞株AGS的抗 腫瘤效果。[圖13]圖13表示山羊抗CLDN6多克隆抗體(Santa Cruz, sc-17669)產(chǎn)生的免 疫染色結(jié)果(A 肺腺癌腫瘤組織、B 肺腺癌非腫瘤組織)。[圖14]圖14表示PA-I皮下移植模型中的AE49-11抗體的抗腫瘤活性評價結(jié)果。[圖15]圖15表示NUGC-3皮下移植模型中的AE49-11抗體的抗腫瘤活性評價結(jié) 果(細線載體、iv，粗線低巖藻糖AE49-ll(50mg/kg、iv))。本說明書包含本申請優(yōu)先權基礎即日本專利申請2008-004423號說明書中記載 的內(nèi)容。
具體實施例方式CLDN6Claudin6 (CLDN6)的氨基酸序列及編碼其的基因序列，公開為GenBank注冊號 NP_067018. 1 及NM_021195. 3(序列號22及序列號23)、或者GenBank注冊號NP_067018. 2 及NM_021195. 4(序列號46及序列號47)。本發(fā)明中，所謂CLDN6蛋白質(zhì)，是指包含全長蛋白質(zhì)及其片段二者。所謂片段，是 指包含CLDN6蛋白質(zhì)任意區(qū)域的多肽，也可以不具有天然CLDN6蛋白質(zhì)的功能。作為片段的例子，可以舉出包含CLDN6蛋白質(zhì)的細胞外區(qū)域的片段。抗CLDN6 抗體本發(fā)明的抗CLDN6抗體只要與CLDN6結(jié)合即可，可以為任何抗體，無論其來源(小 鼠、大鼠、人等)、種類(單克隆、多克隆抗體)及形狀(改變抗體、低分子化抗體、修飾抗體 等)等如何。優(yōu)選本發(fā)明中使用的抗CLDN6抗體特異性地與CLDN6結(jié)合。另外，優(yōu)選本發(fā)明中 使用的抗CLDN6抗體為單克隆抗體。作為本發(fā)明中優(yōu)選的抗CLDN6抗體，可以舉出能夠與在細胞膜上表達的CLDN6結(jié) 合的抗體。在細胞膜上表達的CLDN6沒有特別限定，例如可以舉出在強制表達CLDN6的細 胞(例如Ba/F3細胞等)或表達CLDN6的癌細胞(例如肺腺癌細胞株ABC-1、胃癌細胞株 AGS等)的細胞膜上表達的CLDN6?？梢酝ㄟ^流式細胞術等本領域技術人員公知的方法確認抗CLDN6抗體是否與在 細胞膜上表達的CLDN6結(jié)合。作為本發(fā)明的抗CLDN6抗體的其他優(yōu)選方案，可以舉出具有細胞毒性的抗 體。具有細胞毒性的抗體沒有特別限定，可以舉出具有抗體依賴性細胞介導細胞毒性 (antibody-dependent cell-mediatedcytotoxicity :ADCC)的抗體、具有補體依賴性細胞 毒性(complement-d印endent cytotoxicity :CDC)的抗體、與細胞毒性物質(zhì)結(jié)合的抗體。在本發(fā)明中，所謂CDC活性，是指由補體體系產(chǎn)生的細胞毒性。另一方面，所謂 ADCC活性，是指如下活性，即在靶細胞的細胞表面抗原上附著特異性抗體時，具有Fc γ受 體的細胞(免疫細胞等)通過Fc γ受體與其Fc部分結(jié)合，破壞靶細胞。本發(fā)明中，可以通過公知的方法測定抗體是否具有ADCC活性或者是否具有⑶C 活性(例如，Current protocols in Immunology, Chapter 7. Immunologic studies in humans, Editor, John E, Coligan et al.，John Wiley & Sons，Inc.，(1993))。具體而言，首先，配制效應細胞、補體溶液、靶細胞。(1)效應細胞的配制從CBA/N小鼠等中摘出脾臟，在RPMI 1640培養(yǎng)基(Invitrogen公司制)中分離 脾臟細胞。用含有10%胎牛血清(FBS、HyClone公司制)的相同培養(yǎng)基清洗后，將細胞濃 度配制成5 X 106/ml，由此可以配制效應細胞。(2)補體溶液的配制可以將Baby Rabbit Complement (CEDARLANE 公司制)用含有 10% FBS 的培養(yǎng)基 (Invitrogen公司制)稀釋10倍，配制補體溶液。(3)靶細胞的配制將表達CLDN6蛋白質(zhì)的細胞與0. 2mCi的51Cr_鉻酸鈉(GE Healthcare Biosciences公司制)一起在含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中于37°C下培養(yǎng)1小時，由此可 以將該靶細胞進行放射性標記。作為表達CLDN6蛋白質(zhì)的細胞，可以使用用編碼CLDN6蛋 白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)化的細胞、癌細胞(肺腺癌細胞、胃癌細胞等)等。放射性標記后，將細胞用 含有10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基清洗3次，將細胞濃度配制成2X 105/ml，由此可以配制 該靶細胞。ADCC活性、或者⑶C活性可以根據(jù)下述方法測定。測定ADCC活性時，在96孔U底培養(yǎng)板(Becton Dickinson公司制)中加入靶細胞和抗CLDN6抗體各50 μ 1，在冰上使其反 應15分鐘。然后，加入100 μ 1效應細胞，在二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4小時。使抗體的最終 濃度為0或10 μ g/ml。培養(yǎng)后，回收100 μ 1的上清液，用Y計數(shù)器(COBRAII AUTO-GAMMA、 MODEL D5005、Packard Instrument Company公司制)測定放射活性。使用所得的值根據(jù) 計算式(A-C)/(B-C) X 100，計算細胞毒性(％)。A表示各試樣的放射活性(cpm)，B表示加 入1 % NP-40 (nacalai tesque公司制)的試樣的放射活性(cpm)，C表示只含靶細胞的試 樣的放射活性(cpm)。另一方面，測定⑶C活性時，在96孔平底培養(yǎng)板(Becton Dickinson公司制)中加 入靶細胞和抗CLDN6抗體各50 μ 1，在冰上使其反應15分鐘。然后，加入100 μ 1補體溶液， 在二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4小時。抗體的最終濃度為0或3μ g/ml。培養(yǎng)后，回收100 μ 1 的上清液，用Y計數(shù)器測定放射活性?？梢耘cADCC活性測定相同地計算細胞毒性。細胞毒性物質(zhì)結(jié)合的抗CLDN6抗體參入細胞內(nèi)時，通過細胞毒性物質(zhì)，可以誘導 參入了此抗體的細胞凋亡。因此，細胞毒性物質(zhì)結(jié)合的抗體更優(yōu)選具有內(nèi)化活性。在本發(fā) 明中，所謂“具有內(nèi)化活性的抗體”，是指與細胞表面上的CLDN6結(jié)合時可以被運送到細胞 內(nèi)(細胞質(zhì)內(nèi)、小囊泡內(nèi)、其他小器官等)的抗體?？贵w是否具有內(nèi)化活性可以采用本領域技術人員公知的方法確認，例如可以采用 下述方法確認，即，使結(jié)合有標記物的抗CLDN6抗體與表達CLDN6的細胞接觸，確認該標記 物是否參入細胞內(nèi)的方法；使結(jié)合有細胞毒性物的抗CLDN6抗體與表達CLDN6的細胞接觸， 確認是否誘導該CLDN6表達細胞凋亡的方法等。更具體而言，根據(jù)下述實施例中所述的方 法等可以確認抗體是否具有內(nèi)化活性。本發(fā)明中使用的細胞毒性物質(zhì)只要能夠誘導細胞凋亡即可，可以為任何物質(zhì)，例 如可以舉出毒素、放射性物質(zhì)、化療劑等。上述本發(fā)明中的細胞毒性物質(zhì)包括在生物體內(nèi)轉(zhuǎn) 化為活性細胞毒性物質(zhì)的前藥。前藥的活性化可以為酶的轉(zhuǎn)化，也可以為非酶的轉(zhuǎn)化。本發(fā)明中，所謂毒素，是指具有來自于微生物、動物或植物的細胞毒性的各 種蛋白質(zhì)或多肽等。作為本發(fā)明中使用的毒素，例如可以舉出下述毒素白喉毒素A 鏈(Diphtheria toxin A Chain) (Langone J. J. , et al. , Methods in Enzymology, 93,307-308，1983) ； fi 單胞菌夕卜毒素(Pseudomonas Exotoxin) (Nature Medicine, 2， 350-353，1996)；蓖麻毒素鏈(Ricin A Chain) (Fulton R. J.，et al.，J. Biol. Chem.，261， 5314-5319,1986 ；Sivam G.，et al. , Cancer Res. ,47,3169-3173,1987 ；Cumber A. J. et al. , J.Immunol. Methods,135,15-24, 1990 ；WawrzynczakE. J. , et al. , Cancer Res., 50,7519-7562,1990 ；Gheeite V. , et al.，J. Immunol. Methods，142，223-230，1991)；無 糖鏈蓖麻毒素 A 鏈(Deglicosylated Ricin A Chain) (Thorpe P. E.，et al. , Cancer Res.，47，5924-5931，1987)；相思豆毒素 A 鏈(Abrin A Chain) (ffawrzynczak E. J.， et al. , Br. J. Cancer,66,361-366,1992 ；ffawrzynczak E.J. , et al. , Cancer Res. ,50, 7519-7562,1990 ；Sivam G. , et al. , Cancer Res. ,47,3169-3173,1987 ；Thorpe P. Ε., et al.，Cancer Res.，47，5924-5931，1987)；白樹毒素(Gelonin) (Sivam G.，et al.， Cancer Res. ,47,3169-3173,1987 ；Cumber A. J. et al.，J. Immunol. Methods，135，15-24， 1990 ；WawrzynczakE. J. , et al. , Cancer Res. ,50,7519-7562,1990 ；Bolognesi A. , et al.，Clin. exp. Immunol.，89，341-346，1992)；美洲商陸抗病毒蛋白(PAP-s ；Pokeweedanti-viral protein from seeds) (Bolognesi Α. , et al. , Clin. exp. Immunol.,89, 341-346,1992) ；Briodin(Bolognesi A.，et al. ,Clin. exp. Immunol.，89，341—346，1992)； 阜草毒蛋白(Saporin) (Bolognesi Α. , et al. , Clin. exp. Immunol. , 89, 341-346,1992)； 苦瓜毒蛋白(Momordin) (Cumber A. J.，et al.，J. Immunol. Methods, 135，15—24，1990 ； Wawrzynczak Ε. J. , et al. , Cancer Res. ,50,7519-7562,1990 ；Bolognesi Α. , et al., Clin. exp. Immunol.，89，341—346，1992)；木鱉毒蛋白(Momorcochin) (Bolognesi Α.，et al.，Clin. exp. Immunol.，89，341-346，1992)；香石竹毒蛋白 32 (Dianthin 32) (Bolognesi A.，et al.，Clin. exp. Immunol.，89，341-346，1992)；香石竹毒蛋白 30 (Dianthin 30) (Stirpe F. , Barbieri L.，F(xiàn)EBS letter 195，1-8，1986)；塑蓮根毒蛋白 II (Modeccin) (Stirpe F.，Barbieri L.，F(xiàn)EBS letter 195，1-8,1986)；槲寄生毒蛋白(Viscumin) (Stirpe F. , Barbieri L.，F(xiàn)EBS letter 195，1-8，1986)；塑蓮根毒蛋白 I (Volkesin) (Stirpe F.，Barbieri L.，F(xiàn)EBS letterl95,1-8,1986)；商陸毒蛋白(Dodecandrin) (Stirpe F. ,Barbieri L.，F(xiàn)EBSletter 195，1-8，1986)；小麥毒蛋白(Tritin) (Stirpe F.， Barbieri L.，F(xiàn)EBSletter 195，1-8，1986)；軟瓜蛋白(Luffin) (Stirpe F.，Barbieri L.， FEBSletter 195，1-8，1986)；括樓種子毒蛋白(Trichokirin) (Casellas P.，et al.，Eur. J.Biochem. 176,581-588,1988 ；Bolognesi A., et al. , Clin.exp. Immunol. ,89,341-346, 1992)。本發(fā)明中，所謂放射性物質(zhì)，是指含有放射性同位素的物質(zhì)。放射性同位素沒有特 別限定，可以使用任何放射性同位素，例如可以使用32P、14C、125I、3H、131I、186Re、188Re等。本發(fā)明中所謂化療劑，是指除上述毒素、放射性物質(zhì)以外的具有細胞毒性的物質(zhì)， 包括細胞因子、抗腫瘤劑、酶等。本發(fā)明中使用的化療劑沒有特別限定，但優(yōu)選為低分子量 的化療劑。一般認為分子量小時，即使與抗體結(jié)合后，干涉抗體功能的可能性也低。本發(fā)明 中，低分子量化療劑通常具有100 2000的分子量，優(yōu)選具有200 1000的分子量。本發(fā)明 中沒有特別限定，例如可以使用以下化療劑美法侖(Melphalan) (Rowland G. F.，et al.， Nature 255，487—488，1975)；順怕(Cis-platinum) (Hurwitz Ε. and Haimovich J. ,Method In Enzymology 178,369-375,1986 ；Schechter B., et al. , Int.J.Cancer 48,167-172, 1991 ；卡鉬(Carboplatin)(Ota, Y.，et al.，Asia-Oceania J. Obstet. Gynaecol. 19， 449-457,1993) ； ^β C(Mitomycin C) (Noguchi, Α. ， et al. ， Bioconjugate Chem. 3, 132-137，1992)；阿霉素(Adriamycin) (Doxorubicin) (Shih, L. B.，et al.，Cancer Res. 51 4192-4198,1991 ；Zhu, Ζ.，et al.，Cancer Immunol. Immumother 40，257-267，1995 ； Trail, P. Α. , et al. , Science 261,212-215,1993 ；Zhu, Ζ. , et al. , Cancer Immunol. Immumother 40，257-267，1995 ；Kondo,Y.，et al.，Jpn. J. Cancer Res. 861072-1079，1995 ； Zhu, Ζ.，et al.，Cancer Immunol. Immumother 40, 257-267,1995 ；Zhu, Ζ.，et al.，Cancer Immunol. Immumother 40,257-267,1995)；柔紅霉素(Daunorubicin)(DilIman, R. 0., et al. , Cancer Res. 48,6097-6102,1988 ；Hudecz, F. , et al. , Bioconjugate Chem. 1, 197-204，1990 ；Tukada Y. et al.，J. Natl. Cancer Inst. 75,721-729,1984)；博來霉素 (Bleomycin)(Manabe, Y. , et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. 115,1009-1014,1983)； 新制癌菌素(Neocarzinostatin) (Kitamura K. , et al. , Cancer Immunol. Immumother 36，177-184，1993 ；Yamaguchi Τ.，et al.，Jpn. J. Cancer Res. 85，167—171，1994)；甲氨喋呤(Methotrexate) (Kralovec, J. ,et al. , Cancer Immunol. Immumother 29,293-302, 1989 ；Kulkarni, P. N. ， et al. ， Cancer Res. 41,2700-2706,1981 ；Shin, L.B. ， et al.， Int.J. Cancer 41,832-839,1988 ；Gamett Μ. C. , et al. , Int.J.Cancer 31,661-670, 1983) ；5-氟尿苷(5-Fluorouridine) (Shin, L. B.，Int. J. Cancer 46，1101-1106，1990)； 5_ 氟 _2，-脫氧尿苷(5-Fluoro_2，-deoxyuridine) (Goerlach Α. , etal. , Bioconjugate Chem. 2，96-101，1991)；阿糖胞苷(Cytosine arabinoside) (Hurwitz Ε.，et al.，J. Med. Chem. 28，137-140，1985)；氨基蝶呤(Aminopterin) (KaneIlos J.，et al.，Immunol. Cell. Biol. 65,483-493,1987)；長春新堿(Vincristine) (Johnson J. R.，et al.，Br. J. Cancer 42，17，1980)；脫乙酰長春花堿(Vindesine) (Johnson J. R.，et al.，Br. J. Cancer44, 472-475,1981)；白細胞介素-2 (Interleukin-2)；腫瘤壞死因子(TNFa)；干擾素(INF)； 羧肽酶(Carboxyp印tidase)；堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase) ； β -內(nèi)酰胺酶 (β -lactamase)；胞苷脫氨酶(Cytidine deaminase)。本發(fā)明中使用的細胞毒性物質(zhì)可以為一種，也可以組合兩種以上細胞毒性物質(zhì)進 行使用?？笴LDN6抗體與上述細胞毒性物質(zhì)的結(jié)合可以通過共價鍵或非共價鍵進行。結(jié)合 有上述細胞毒性物質(zhì)的抗體的制作方法是公知的?？笴LDN6抗體與細胞毒性物質(zhì)也可以通過它們自身所具有的連接基團等直接結(jié) 合，或者也可以通過連接體或中間支持體等其他物質(zhì)間接結(jié)合?？笴LDN6抗體與細胞毒性 物質(zhì)直接結(jié)合時的連接基團，例如可以舉出使用SH基的二硫鍵。具體而言，用還原劑、例如 二硫蘇糖醇等還原抗體Fc區(qū)的分子內(nèi)二硫鍵，同樣地還原細胞毒性物質(zhì)內(nèi)的二硫鍵，將二 者以二硫鍵結(jié)合。結(jié)合前，也可以使用活化促進劑、例如Ellman試劑(Ellman's reagent) 使抗體或細胞毒性物質(zhì)中的任一方活化，促進二者二硫鍵的形成。作為將抗CLDN6抗體與 細胞毒性物質(zhì)直接結(jié)合的其他方法，例如可以舉出使用Schiff堿的方法、碳二亞胺法，活 性酯法(N-羥基琥珀酰亞胺法)、使用混合酸酐(mixed anhydride)的方法、使用重氮反應 的方法等。抗CLDN6抗體與細胞毒性物質(zhì)的結(jié)合也可以通過其他物質(zhì)間接地結(jié)合。用于 間接地結(jié)合的其他物質(zhì)沒有特別限定，例如可以舉出以任意1種或組合2種以上的方式 具有選自氨基、羧基、巰基等中2個以上基團的化合物；肽連接體；對抗CLDN6抗體具有 結(jié)合能力的化合物等。作為以任意1種或組合2種以上的方式具有選自氨基、羧基、巰 基等中2個以上基團的化合物的例子，例如可以舉出N-琥珀酰亞胺基3-(2_吡啶基二 硫基)丙酸酉旨(SPDP :N-Succinimidyl 3- (2-pyridylditio) propinate) (ffawrzynczak Ε. J. , et al. , Cancer Res. , 50, 7519-7562,1990 ；Thorpe P. Ε. , et al. , Cancer Res., 47，5924-5931，1987)；琥珀酰亞胺基6_3_[2_吡啶基二硫基]丙酰胺)己酸酯(LC-SPDP Succinimidyl 6-3-[2-pyridylditio]propinamide)hexanoate) (Hermanson G. Τ., BIOCONJUGATE Techniques, 230-232,1996)；硫代琥珀酰亞胺基 6_3_[2-吡啶基二硫基]丙 酰胺)己酸酯(Su 1 f o-LC-SPDP Su 1 f ο sue c in imi dy 1 6-3- [2-pyridylditio] propinamide) hexanoate) (Hermanson G. Τ.，BI0C0NJUGATE Techniques，230-232，1996) ；N-琥珀酰亞胺 基 3-(2-吡啶基二硫基)丁酸酯(SPDB :N-Succinimidyl3-(2-pyridylditio)butyrate) (ffawrzynczak Ε. J.，et al.，Br. J. Cancer, 66，361-366，1992)；琥珀酰亞胺基氧基羰基- α - (2-吡啶基二 硫基)甲苯(SMPT =Succinimidyloxycarbonyl- α - (2-pyridyld itio)toruene)(Thorpe P. Ε.，et al.，Cancer Res.，47，5924-5931，1987)；琥珀酰亞 胺基6-(α-甲基-[2-吡啶基二硫基]甲苯甲酰胺)己酸酯(LC-SMPT =Succinimidyl 6-(α -methyl-[2-pyridylditio]toruamide)hexanoate)(Hermanson G. Τ.，BIOCONJUGATE Techniques，232-235，1996)；硫代琥珀酰亞胺基6_( α -甲基-[2_吡啶基二硫基]甲苯 甲酰胺)己酸酯(Sulfo-LC-SMPT :Sulfosuccinimidyl 6-( α -methyl-[2-pyridylditio] toruamide) hexanoate) (Hermanson G. T.，BIOCONJUGATETechniques，232-235，1996)；琥珀 酰亞胺基-4_(對馬來酰亞胺基苯基)丁酸酯(SMPB :Succinimidyl-4-(p-maleimidophen yl)butyrate) (Hermanson G. Τ. , BIOCONJUGATE Techniques，242-243，1996)；硫代琥珀酰 亞胺基-4_(對馬來酰亞胺基苯基)丁酸酯(Sulfo-SMPB :Sulfo-Succinimidyl-4-(p-mal eimidophenyl)butyrate)(HermansonG. Τ. , BIOCONJUGATE Techniques,242-243,1996) ；|1] 馬來酰亞胺基苯甲?；?N-羥基琥珀酰亞胺酯(MBS :m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuc cinimide ester) (Hermanson G. Τ·，BIOCONJUGATETechniques，237-238，1996)；間馬來酰 亞胺基苯甲酰基-N-羥基硫代琥珀酰亞胺酯(Sulfo-MBS :m-Maleimidobenzoyl-N-hydrox ysulfosuccinimide ester)(Hermanson G. Τ. , BIOCONJUGATETechniques,237-238,1996)； S-乙酰基巰基琥珀酸酐(SAMSA S-Acetyl mercaptosuccinic anhydride) (Casellas P.， et al. , Eur. J. Biochem, 176, 581-588,1988) ； 二甲基 3，3，- 二硫雙丙亞酰胺酯(DTBP Dimethyl 3,3' -ditiobisprorionimidate) (Casellas P. , et al. , Eur. J. Biochem,176, 581-588,1988) ；2-亞氨基硫醇(2—Iminotiolane) (Thorpe P. Ε. , et al. , Cancer Res.，47， 5924-5931，1987)等。作為抗CLDN6抗體與細胞毒性物質(zhì)結(jié)合中使用的其他物質(zhì)，例如可以舉出肽、抗 體、聚L-谷氨酸(PGA)、羧甲基葡聚糖、葡聚糖、氨基葡聚糖、親和素·生物素、順烏頭酸、谷 氨酸二酐、人血清白蛋白(HSA)等。進而，蛋白質(zhì)性的細胞毒性物質(zhì)也可以通過基因工程學方法與抗體結(jié)合。具體而 言，例如使編碼上述細胞毒性物質(zhì)肽的DNA與編碼抗CLDN6抗體的DNA框內(nèi)融合，可以構筑 參入表達載體中的重組載體。通過將該載體導入適當?shù)乃拗骷毎麅?nèi)，得到轉(zhuǎn)化細胞，培養(yǎng)該 轉(zhuǎn)化細胞使參入的DNA表達，以融合蛋白質(zhì)的形態(tài)得到結(jié)合了毒性肽的抗CLDN6抗體。得 到與抗體形成的融合蛋白質(zhì)時，通常在抗體的C末端側(cè)配置蛋白質(zhì)性的藥物或毒素。在抗 體與蛋白質(zhì)性藥物或毒素之間也可以通過肽連接體連接。作為本發(fā)明的抗CLDN6抗體的優(yōu)選方案之一，可以舉出與CLDN6結(jié)合而與CLDN9 實質(zhì)上不結(jié)合的抗體。一般認為CLDN9與CLDN6的同源性高，是與CLDN6最接近的分子。因 此，認為與CLDN6結(jié)合而與CLDN9實質(zhì)上不結(jié)合的抗體對CLDN6的特異性非常高，作為藥物 有用。CLDN9的氨基酸序列是公知的，例如人CLDN9的氨基酸序列記載于GenBank注冊號 NP_066192. 1(序列號48)。本發(fā)明中，所謂與CLDN6結(jié)合、而與CLDN9實質(zhì)上不結(jié)合的抗體是指，與對CLDN6 的結(jié)合活性相比，對CLDN9的結(jié)合活性通常為50%以下、優(yōu)選為30%以下、更優(yōu)選為10%以 下的抗體。另外，作為本發(fā)明的抗CLDN6抗體的優(yōu)選方案之一，可以舉出與CLDN6結(jié)合、而與 CLDN3實質(zhì)上不結(jié)合的抗體。CLDN3的氨基酸序列是公知的，例如人CLDN3的氨基酸序列記載于GenBank注冊號NP_001297. 1(序列號49)。本發(fā)明中，所謂與CLDN6結(jié)合、而與CLDN3 實質(zhì)上不結(jié)合的抗體，是指與對CLDN6的結(jié)合活性相比，對CLDN3的結(jié)合活性通常為50%以 下、優(yōu)選為30%、更優(yōu)選為10%以下的抗體。另外，作為本發(fā)明的抗CLDN6抗體的優(yōu)選方案之一，可以舉出與CLDN6結(jié)合、而與 CLDN4實質(zhì)上不結(jié)合的抗體。CLDN4的氨基酸序列是公知的，例如人CLDN4的氨基酸序列記 載于GenBank注冊號NP_001296. 1(序列號50)。本發(fā)明中，所謂與CLDN6結(jié)合、而與CLDN4 實質(zhì)上不結(jié)合的抗體，是指與對CLDN6的結(jié)合活性相比，對CLDN4的結(jié)合活性通常為50 %以 下、優(yōu)選為30%以下、更優(yōu)選為10%以下的抗體。另外，作為本發(fā)明的抗CLDN6抗體的優(yōu)選方案之一，可以舉出與CLDN6結(jié)合、而與 CLDNl實質(zhì)上不結(jié)合的抗體。CUMl的氨基酸序列是公知的，例如人CUMl的氨基酸序列記 載于GenBank注冊號NP_066924. 1(序列號51)。本發(fā)明中，所謂與CLDN6結(jié)合、而與CUMl 實質(zhì)上不結(jié)合的抗體，是指與對CLDN6的結(jié)合活性相比，對CUMl的結(jié)合活性通常為50%以 下、優(yōu)選為30%以下、更優(yōu)選為10%以下的抗體。本發(fā)明中，作為抗CLDN6抗體的優(yōu)選例，可以舉出與人CLDN6結(jié)合、而與人CLDW 及人CLDN3實質(zhì)上不結(jié)合的抗體；與人CLDN6結(jié)合、而與人CUM1、人CLDN3及人CLDN4實 質(zhì)上不結(jié)合的抗體；與人CLDN6結(jié)合、而與人CUM1、人CLDN3、人CLDN4、及人CLDN9實質(zhì)上 不結(jié)合的抗體。作為本發(fā)明的抗CLDN6抗體的優(yōu)選例，例如可以舉出以下(a) (j)中任一項所 述的抗體(a)抗體(AB3-1重鏈)，包含重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)具有包含序列號24表 示的氨基酸序列的CDR1、包含序列號25表示的氨基酸序列的CDR2、包含序列號26表示的 氨基酸序列的CDR3 ；(b)抗體(AB3-1輕鏈)，包含輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)具有包含序列號27表 示的氨基酸序列的CDR1、包含序列號28表示的氨基酸序列的CDR2、包含序列號29表示的 氨基酸序列的CDR3 ；(c)抗體(AB3-1)，包含(a)所述的重鏈可變區(qū)及(b)所述的輕鏈可變區(qū)；(d)抗體(AE1-16、AE49-11重鏈)，包含重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)具有包含序 列號30表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列號31表示的氨基酸序列的CDR2、包含序列號 32表示的氨基酸序列的CDR3 ；(e)抗體(AE1-16、AE49-11輕鏈)，包含輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)具有包含序 列號33表示的氨基酸序列的CDR1、包含序列號34表示的氨基酸序列的CDR2、包含序列號 35表示的氨基酸序列的CDR3 ；(f)抗體(AE1-16、AE49-11)，包含(d)所述的重鏈可變區(qū)及(e)所述的輕鏈可變 區(qū)；(g)抗體(AE3-20重鏈)，包含重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)具有包含序列號40表 示的氨基酸序列的CDR1、包含序列號41表示的氨基酸序列的CDR2、包含序列號42表示的 氨基酸序列的CDR3 ；(h)抗體(AE3-20輕鏈)，包含輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)具有包含序列號43表 示的氨基酸序列的CDR1、包含序列號44表示的氨基酸序列的CDR2、包含序列號45表示的氨基酸序列的CDR3 ；(i)抗體(AE3-20)，包含(g)所述的重鏈可變區(qū)及(h)所述的輕鏈可變區(qū)；(j)抗體，識別與(a) ⑴中任一項所述的抗體所識別的抗原決定部位相同的抗 原決定部位。被檢抗體識別與某抗體所識別的抗原決定部位相同的抗原決定部位，即共有抗原 決定部位，可以通過二者對同一抗原決定部位的競爭來確認?？贵w間的競爭通過交差阻斷 測定(cross-blocking assay)等檢測。例如競爭ELISA測定為優(yōu)選的交差阻斷測定。具體 而言，在交差阻斷測定中，在候選競爭抗體的存在下或不存在下，將涂布在微量滴定板的孔 上的CLDN6蛋白質(zhì)預培養(yǎng)后，添加本發(fā)明的抗CLDN6抗體。與孔中的CLDN6蛋白質(zhì)結(jié)合的 本發(fā)明的抗CLDN6抗體的量，與對相同抗原決定部位的結(jié)合發(fā)生競爭的候補競爭抗體(被 檢抗體)的結(jié)合能力間接相關。即，被檢抗體對同一抗原決定部位的親合性越大，本發(fā)明的 抗CLDN6抗體對涂布了 CLDN6蛋白質(zhì)的孔的結(jié)合量越低，被檢抗體對涂布了 CLDN6蛋白質(zhì) 的孔的結(jié)合量越高。與孔結(jié)合的抗體量可以通過預先標記抗體而容易地測定。例如，生物素標記的抗 體，可以通過使用親和素過氧化物酶綴合物和適當?shù)幕|(zhì)進行測定。將利用過氧化物酶等 酶標記的交差阻斷測定特別地稱作競爭ELISA測定?？贵w可以用能夠檢測或者測定的其他 標記物進行標記。具體而言，公知的有放射標記或者熒光標記等。進而，當被檢抗體具有來自與本發(fā)明抗CLDN6抗體不同的種的恒定區(qū)時，與孔結(jié) 合的抗體的量也可以通過識別此抗體的恒定區(qū)的標記抗體進行測定?；蛘?，為來自相同種 的抗體，但類別不同時，通過識別各類別的抗體，可以測定與孔結(jié)合的抗體的量。如果與在不存在候選競爭抗體的條件下實施的對照試驗中得到的結(jié)合活性相比， 候選抗體能夠以至少20 %、優(yōu)選至少30 %、更優(yōu)選至少50 %阻斷抗CLDN6抗體結(jié)合，則該候 選競爭抗體是結(jié)合與本發(fā)明抗CLDN6抗體實質(zhì)相同的抗原決定部位的抗體、或者是對向相 同的抗原決定部位的結(jié)合產(chǎn)生競爭的抗體。進而，在本發(fā)明中只要與上述(a) (j)的抗體功能等同即可，也可以在上述CDR 序列中取代、缺失、添加及/或插入1個或多個氨基酸。本發(fā)明中，所謂“功能等同”，是指對 CLDN6的結(jié)合活性或細胞毒性等同。本發(fā)明中，所謂“等同”，是指與上述抗體相比，具有至 少50%、優(yōu)選為70%、更優(yōu)選為90%以上的活性?；钚缘纳舷逈]有特別限定，也可以具有 高于上述抗體的活性。結(jié)合活性和細胞毒性的測定可以采用本領域技術人員公知的方法進 行，例如可以根據(jù)實施例中記載的方法進行。作為用于取代、缺失、添加及/或插入氨基酸的本領域技術人員熟知的方法， 例如可以舉出位點定向誘變法(Hashimoto-Gotoh, Τ. et al. (1995)Gene 152,271-275, Zoller，MJ，and Smith,Μ. (1983)Methods Enzymol. 100,468-500, Kramer,W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12,9441-9456,Kramer W,and Fritz HJ(1987)Methods. Enzymol. 154， 350-367，Kunke1, TA (1985)Proc Natl Acad Sci USA. 82，488-492，Kunkel(1988)Methods Enzymol. 85，2763-2766)等。另外，氨基酸的變異也可以在自然界中產(chǎn)生。如上所述，本發(fā) 明的抗體的氨基酸序列中具有1個或多個氨基酸發(fā)生變異的氨基酸序列，與該抗體具有等 同活性的抗體也包括在本發(fā)明的抗體中。一般認為，上述變異體中的變異氨基酸數(shù)，相對于 一個CDR通常為5個氨基酸以內(nèi)，優(yōu)選為4個氨基酸以內(nèi)，更優(yōu)選為3個氨基酸以內(nèi)(例如1個或2個氨基酸)。變異的氨基酸殘基，沒有特別限定，但優(yōu)選變異為保留氨基酸側(cè)鏈性質(zhì)的其他氨 基酸。例如，基于氨基酸側(cè)鏈的性質(zhì)，確立如下分類疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)；親水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)；具有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸(G、A、V、L、I、P)；具有含羥基側(cè)鏈的氨基酸(S、T、Y)；具有含硫原子側(cè)鏈的氨基酸(C、M)；具有含羧酸及酰胺的氨基酸(D、N、E、Q)；具有含堿基側(cè)鏈的氨基酸(R、K、H)；具有含芳香族側(cè)鏈的氨基酸(H、F、Y、W)；(括號內(nèi)均表示氨基酸的單字母符號)。已知通過對某氨基酸序列進行1個或多個氨基酸殘基的取代、缺失、添加及/或 其他氨基酸的取代，對其進行修飾，具有上述被修飾的氨基酸序列的多肽維持其生物學活 性(Mark, D. F. et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666, Zoller, Μ. J. and Smith, Μ. ， Nucleic AcidsResearch(1982) 10,6487-6500, Wang, A. et al. ， Science 224,1431-1433, Dalbadie-McFarland, G. et al. ， Proc.Natl.Acad. Sci. USA(1982) 79, 6409-6413)。即，通常在構成某多肽的氨基酸序列中，被分為各類的氨基酸相互取代時，維 持該多肽的活性的可能性高?？贵w的制造方法本發(fā)明的抗CLDN6抗體可以采用公知的方法獲得。作為本發(fā)明的抗CLDN6抗體， 特別優(yōu)選來自哺乳動物的單克隆抗體。來自哺乳動物的單克隆抗體，包括由雜交瘤產(chǎn)生的 單克隆抗體、以及由宿主產(chǎn)生的單克隆抗體等，所述宿主采用基因工程學方法用含有抗體 基因的表達載體進行了轉(zhuǎn)化。產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤可以使用公知技術、例如如下所示地制作。首先，使用 CLDN6蛋白質(zhì)、表達CLDN6的細胞或編碼CLDN6的基因作為敏化抗原，按照通常的免疫方法 將其免疫。采用通常的細胞融合法使從免疫動物中得到的免疫細胞與公知的親細胞融合， 得到雜交瘤。進而，利用通常的篩選法，從此雜交瘤中篩選產(chǎn)生目標抗體的細胞，由此可以 選擇出產(chǎn)生抗CLDN6抗體的雜交瘤。具體而言，單克隆抗體的制作例如可以如下所示進行。首先，通過表達CLDN6基 因，可以得到CLDN6蛋白質(zhì)，用作獲得抗體的敏化抗原。人CLDN6基因的堿基序列可以使 用被以GenBank注冊號NM_021195. 3 (序列號23)或GenBank注冊號NM_021195. 4 (序列 號47)等公開的序列。即，將編碼CLDN6的基因序列插入公知的表達載體中，轉(zhuǎn)化適當?shù)?宿主細胞后，可以采用公知的方法從此宿主細胞中或培養(yǎng)上清液中純化目標人CLDN6蛋白 質(zhì)。另外，純化的天然的CLDN6蛋白質(zhì)也可以同樣地使用。可以通過組合或者單獨使用1 次或者多次通常的離子層析或親和層析等多種層析法進行生成。另外，也可以將融合蛋白 質(zhì)用作免疫原，所述融合蛋白質(zhì)是將CLDN6蛋白質(zhì)的所期望的部分多肽與不同的多肽融合 得到的。為了制備為免疫原的融合蛋白質(zhì)，例如可以使用抗體的Fc片段或肽標記等。表 達融合蛋白質(zhì)的載體，可以通過使編碼所期望的二種或者二種以上的多肽片段的基因框內(nèi)融合，并如上所述地將該融合基因插入表達載體中，進行制作。融合蛋白質(zhì)的制作方法 記載于 MolecularCloning 2nd ed. (Sambrook, J. et al. , Molecular Cloning 2nd ed., 9. 47-9. 58, Cold Spring Harbor Lab. Press,1989)。如上所示純化的CLDN6蛋白質(zhì)可以用作對哺乳動物進行免疫時使用的敏化抗原。 另外，CLDN6的部分肽也可以用作敏化抗原。用該敏化抗原免疫的哺乳動物沒有特殊的限定。為了通過細胞融合法得到單克隆 抗體，考慮到與細胞融合中使用的親細胞的相容性，優(yōu)選選擇免疫動物。一般情況下，作為 免疫動物優(yōu)選嚙齒動物。具體而言，可以將小鼠、大鼠、倉鼠、或者家兔用作免疫動物。此外， 也可以將猴等用作免疫動物。上述動物可以按照公知的方法通過敏化抗原免疫。例如，作為一般的方法，可以通 過腹腔內(nèi)或皮下注射敏化抗原對哺乳動物進行免疫。具體而言，每隔4至21日向哺乳動物 多次給與該敏化抗原。敏化抗原可以用PBS(Phosphate-Buffered Saline)或生理鹽水等 以適當?shù)南♂尡堵氏♂?，用于免疫。并且，可以與佐劑一起給與敏化抗原。例如可以與弗式 完全佐劑(Freund's complete adjuvant)混合、乳化，形成敏化抗原。另外，用敏化抗原免 疫時可以使用適當?shù)妮d體。特別是分子量小的部分肽用作敏化抗原的情況下，優(yōu)選使該敏 化抗原肽與白蛋白、匙孔血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin)等載體蛋白質(zhì)結(jié)合進行 免疫。如上所述將哺乳動物免疫，確認血清中的所期望的抗體量升高后，從哺乳動物中 采取免疫細胞，進行細胞融合。作為免疫細胞，特別優(yōu)選使用脾細胞。作為與上述免疫細胞融合的細胞，使用哺乳動物的骨髓瘤細胞。骨髓瘤細胞優(yōu)選 具備用于篩選的適當?shù)倪x擇標記。所謂選擇標記，是指在特定的培養(yǎng)條件下能夠生存(或 者不能生存)的特性。選擇標記中公知有次黃嘌呤_鳥嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶缺失(以下簡 稱HGPRT缺失)、或者胸苷激酶缺失(以下簡稱TK缺失)等。HGPRT或TK缺失的細胞，具 有次黃嘌呤_氨基蝶呤_胸苷敏感性(以下簡稱HAT敏感性)。HAT敏感性的細胞在HAT 選擇培養(yǎng)基中不能進行DNA合成而死亡，但如果與正常的細胞融合，則可以利用正常細胞 的補救途徑(salvage pathway)繼續(xù)DNA的合成，因此在HAT選擇培養(yǎng)基中也可以增殖。HGPRT缺失的細胞可以用含有6-巰基鳥嘌呤、8-氮鳥嘌呤(以下簡稱為8AG)的 培養(yǎng)基進行選擇，而TK缺失的細胞可以用含有5’ -溴脫氧尿苷的培養(yǎng)基進行選擇。正 常的細胞因?qū)⑦@些嘧啶類似物參入DNA中而死亡，但是缺失這些酶的細胞由于不參入上 述嘧啶類似物，所以能夠在選擇培養(yǎng)基中生存。另外一個稱為G418耐性的選擇標記，由 于存在新霉素耐性基因而賦予對2-脫氧鏈霉胺(2-deoxystr印tamine)類抗生素(慶 大霉素類似物)的耐性。公知有多種適合細胞融合的多種骨髓瘤細胞。例如，可以使用 P3 (P3 X 63Ag8. 653) (J. Immunol. (1979) 123，1548-1550)、P3 X 63Ag8U. 1 (Current Topics in Microbiology and Immunology(1978) 81,1-7), NS-I(Kohler, G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976)6，511-519)，MPC-11(Margulies，D. H. et al.，Cell(1976)8，405-415)， SP2/0(Shulman, M. et al.，Nature (1978) 276，269-270)，F(xiàn)O (de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35，1-21)，S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148， 313-323)，R210 (Galfre, G. et al.，Nature (1979) 277，131-133)等之類的骨髓瘤細胞。上述免疫細胞和骨髓瘤細胞的細胞融合可以按照公知的方法、例如Kohler和Milstein 等的方法(Kohler. G. and Milstein, C.、MethodsEnzymol. (1981) 73，3-46)等進 行。更具體而言，例如可以在細胞融合促進劑的存在下在通常的營養(yǎng)培養(yǎng)液中進行上 述細胞融合。作為融合促進劑，例如可以使用聚乙二醇(PEG)、仙臺病毒(HVJ)等。進而，根 據(jù)期望也可以加入二甲基亞砜等輔助劑來提高融合效率。免疫細胞和骨髓瘤細胞的使用比例可以任意設定。例如，優(yōu)選使免疫細胞為骨髓 瘤細胞的1至10倍。作為上述細胞融合中使用的培養(yǎng)液，例如，可以使用適用于上述骨髓 瘤細胞株的增殖的RPMI1640培養(yǎng)液、MEM培養(yǎng)液、以及此類細胞培養(yǎng)中使用的常用培養(yǎng)液。 并且，可以向培養(yǎng)液中加入胎牛血清(FCS)等血清補液(serumsupplement)。細胞融合是將規(guī)定量的上述免疫細胞和骨髓瘤細胞在上述培養(yǎng)液中充分混合，混 合預先加熱至37°C左右的PEG溶液，由此形成為目標的融合細胞(雜交瘤)。細胞融合法 中，例如可以以通常30至60% (w/v)的濃度添加平均分子量1000至6000左右的PEG。接 下來，添加上述舉出的適當?shù)呐囵B(yǎng)液，離心，除去上清，重復上述操作，由此除去在雜交瘤的 培養(yǎng)中不優(yōu)選的細胞融合劑等。如上所述得到的雜交瘤，可以利用適合細胞融合中使用的骨髓瘤具有的選擇標記 的選擇培養(yǎng)液進行選擇。例如HGPRT或TK缺失的細胞可以通過在HAT培養(yǎng)液(含有次黃嘌 呤、氨基蝶呤及胸苷的培養(yǎng)液)中培養(yǎng)來進行選擇。即，將HAT敏感性的骨髓瘤細胞用于細 胞融合時，在HAT培養(yǎng)液中，可以選擇性地使成功地與正常細胞進行細胞融合的細胞增殖。 使用上述HAT培養(yǎng)液的培養(yǎng)繼續(xù)進行足以使目標雜交瘤以外的細胞(非融合細胞)死亡的 時間。具體而言，一般情況下，通過數(shù)日至數(shù)周的培養(yǎng)，可以選擇出目標雜交瘤。接下來，通 過實施常用的有限稀釋法，可以進行產(chǎn)生目標抗體的雜交瘤的篩選及單克隆。或者，也可以 按照國際公開W003/104453所述的方法制作識別CLDN6的抗體。目標抗體的篩選及單克隆優(yōu)選采用基于公知的抗原抗體反應的篩選方法實施。例 如，使抗原與用聚苯乙烯等制成的小球或市售96孔微量滴定板等載體結(jié)合，與雜交瘤的培 養(yǎng)上清液反應。接著，清洗載體后，使酶標記的二次抗體等反應。如果培養(yǎng)上清液中含有與 敏化抗原反應的目標抗體，則二次抗體通過此抗體與載體結(jié)合。最終通過檢測與載體結(jié)合 的二次抗體，能夠確定在培養(yǎng)上清液中是否存在目標抗體?？梢酝ㄟ^有限稀釋法等克隆產(chǎn) 生具有抗原結(jié)合能力的所期望的抗體的雜交瘤。此時，作為抗原，可以優(yōu)選使用用于免疫的 蛋白質(zhì)以及實質(zhì)相同的CLDN6蛋白質(zhì)。例如包含CLDN6的胞外域、或者構成該區(qū)域的部分 氨基酸序列的寡肽可以作為抗原使用。另外，除了用抗原對人以外的動物進行免疫由此得到上述雜交瘤的方法之外，也 可以用抗原將人淋巴細胞敏化得到目標抗體。具體而言，首先在體外將人淋巴細胞用CLDN6 蛋白質(zhì)敏化。然后，使免疫敏化的淋巴細胞與適當?shù)娜诤吓渑俭w(fusion partner)融合。 融合配偶體可以使用例如來自人的具有永久分裂能力的骨髓瘤細胞(參見特公平1-59878 號公報)。利用此方法得到的抗CLDN6抗體，是對CLDN6蛋白質(zhì)具有結(jié)合活性的人抗體。進而，通過向具有人抗體基因的全部基因譜的轉(zhuǎn)基因動物給與作為抗原的CLDN6 蛋白質(zhì)也可以得到抗CLDN6人抗體。通過與適當?shù)娜诤吓渑俭w細胞融合或用EB病毒 (Epstein-Barr virus)感染等處理，可以使免疫動物的抗體生成細胞無限增殖化?？梢?從如上所述得到的無限增殖化細胞中分離出針對CLDN6蛋白質(zhì)的人抗體(參見國際公開W094/25585、W093/12227、W092/03918、W094/02602)。進而，通過對無限增殖化細胞進行克 隆，也能夠克隆產(chǎn)生具有目標反應特異性的抗體的細胞。將轉(zhuǎn)基因動物作為免疫動物使用 時，該動物的免疫系統(tǒng)將人CLDN6識別為異物。所以，能夠容易地得到針對人CLDN6的人抗 體。如上所述制作的產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤可以在常用的培養(yǎng)液中傳代培養(yǎng)。另外，該 雜交瘤也可以在液氮中長期保存。另外，也已知有使用人抗體庫，通過淘選得到人抗體的技術。例如，將人抗體的V 區(qū)作為單鏈抗體(scFv)，通過噬菌體展示法使其在噬菌體的表面表達，能夠選擇與抗原結(jié) 合的噬菌體。通過對選擇的噬菌體的基因進行解析，可以確定編碼與抗原結(jié)合的人抗體的V 區(qū)的DNA序列。確定與抗原結(jié)合的scFv的DNA序列后，使該V區(qū)序列與所期望的人抗體C 區(qū)的序列框內(nèi)融合，然后，插入適當?shù)谋磉_載體，由此可以制作表達載體。通過將該表達載 體導入如上述舉出的優(yōu)選的表達細胞中，使編碼該人抗體的基因表達，由此可以獲取該人 抗體。上述方法已經(jīng)公知(國際公開 W092/01047，W092/20791, W093/06213, W093/11236, W093/19172, W095/01438, W095/15388)。將該雜交瘤按照通常的方法進行培養(yǎng)，可以從其培養(yǎng)上清液中得到目標單克隆抗 體。或者也可以將雜交瘤給與與其具有相容性的哺乳動物使其增殖，從其腹水中得到單克 隆抗體。前者的方法適于得到高純度的抗體。重組抗體本發(fā)明的抗體也可以是能夠利用由抗體生成細胞克隆得到的抗體基因制成的重 組抗體。通過將克隆的抗體基因參入適當?shù)妮d體、導入宿主，可以使抗體進行表達。用于抗 體基因的分離、向載體的導入、以及宿主細胞轉(zhuǎn)化的方法已經(jīng)確立(例如，參見Vandamme， Α. Μ. et al.，Eur. J. Biochem. (1990) 192，767—775)。例如，可以由產(chǎn)生抗CLDN6抗體的雜交瘤細胞，得到編碼抗CLDN6抗體的可變區(qū) (V區(qū))的cDNA。為此，通常情況下首先從雜交瘤中提取總RNA。作為用于從細胞中提取 mRNA 的方法，例如，可以采用胍超離心法(Chirgwin，J. Μ. et al.，Biochemistry (1979) 18， 5294-5299)、AGPC 法(Chomczynski, P. et al. , Anal. Biochem. (1987) 162,156-159)等。提取得到的mRNA 可以使用 mRNA Purification Kit (GEHealthcare Biosciences 制)等進行純化?；蛘撸袌錾弦蹭N售用于從細胞中直接提取總mRNA的試劑盒，如 QuickPrep mRNA Purification Kit (GE Healthcare Biosciences 制)等。使用如上所述 的試劑盒，也能夠從雜交瘤中得到總mRNA。使用逆轉(zhuǎn)錄酶由所得的mRNA可以合成編碼抗體 V|K_cDNA。 Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (生化學工業(yè)社制)等合成。另外，為了 cDNA的合成及擴增，可以采用5’ -Ampli FINDERRACE Kit (Clontech 制)及使用 PCR 的 5，-RACE 法(Frohman, M. A. et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002> Belyavsky, A. et al. , Nucleic Acids Res. (1989) 17，2919-2932)。進而，在上述cDNA的合成過程中，可以在cDNA的兩末端導入下述 的適當?shù)南拗泼盖形稽c。從所得的PCR產(chǎn)物中純化目標cDNA片段，然后，與載體DNA連結(jié)。如上所述地制 作重組載體，導入大腸菌等中，選擇菌落后，由形成了該菌落的大腸菌可以配制所期望的重 組載體。接下來，可以通過公知方法、例如雙脫氧核糖核酸鏈終止法等確認該重組載體是否 具有目標cDNA的堿基序列。
為了得到編碼可變區(qū)的基因，也可以采用使用可變區(qū)基因擴增用引物的PCR法。 首先，以提取得到的mRNA作為模板合成cDNA，得到cDNA庫。為了方便，在cDNA庫的合成中 使用市售的試劑盒。實際上，只從少數(shù)的細胞中得到的mRNA極其微量，因此將其直接純化 時收率低。所以，通常情況下在添加明確知道不含抗體基因的載體RNA后進行純化?；蛘撸?在能夠提取一定量的RNA的情況下，即使僅為抗體生成細胞的RNA也可以高效地提取。例 如從10以上、或者30以上、優(yōu)選50以上的抗體生成細胞中提取RNA時，有時不需要添加載 體 RNA。以所得的cDNA庫為模板，通過PCR法擴增抗體基因。用于通過PCR法擴增抗體基 因的引物是公知的。例如，根據(jù)論文(J. Mol. Biol. (1991)222,581-597)等公開的內(nèi)容，可 以設計出人抗體基因擴增用引物。上述引物隨免疫球蛋白的亞類不同而具有不同的堿基序 列。所以，以亞類不明的cDNA庫作為模板時，進行PCR法需要考慮到所有的可能性。具體而言，例如為了獲取編碼人IgG的基因時，可以利用能夠擴增編碼Y 1 Y5 作為重鏈、κ鏈和λ鏈作為輕鏈的基因的引物。為了擴增IgG的可變區(qū)基因，一般情況下 3’側(cè)的引物利用在與鉸鏈區(qū)相當?shù)牟糠滞嘶鸬囊?。另一方面?’側(cè)的引物可以利用適合 各亞類的引物。由重鏈和輕鏈的各亞類的基因擴增用引物產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物，分別形成獨立的基因 庫。利用上述合成的基因庫，能夠重構包含重鏈和輕鏈的組合的免疫球蛋白。以重構的免 疫球蛋白對CLDN6的結(jié)合活性作為指標，能夠篩選出目標抗體。作為以結(jié)合活性為指標的抗體的篩選方法，也可以采用利用噬菌體載體的淘選 法。如上所述作為重鏈和輕鏈的亞類的基因庫獲取抗體基因時，利用噬菌體載體的篩選方 法是有利的。編碼重鏈和輕鏈的可變區(qū)的基因，通過用適當?shù)倪B接體序列連結(jié)可以形成單 鏈Fv (scFv)。如果將編碼scFv的基因插入噬菌體載體，則能夠得到在表面表達scFv的噬 菌體。使此噬菌體與目標抗原接觸，回收與抗原結(jié)合的噬菌體時，能夠回收編碼具有目標結(jié) 合活性的scFv的DNA。通過根據(jù)需要重復此操作，能夠?qū)⒕哂心繕私Y(jié)合活性的scFv濃縮。得到編碼目標抗CLDN6抗體的V區(qū)的cDNA后，該cDNA被識別插入該cDNA兩末端 的限制酶切位點的限制酶消化。優(yōu)選的限制酶識別、消化在構成抗體基因的堿基序列中出 現(xiàn)的可能性低的堿基序列。進而，為了將消化片段的1個拷貝以準確的方向插入載體中，優(yōu) 選提供粘端的限制酶。通過將如上所述被消化的編碼抗CLDN6抗體的V區(qū)的cDNA插入適 當?shù)谋磉_載體中，可以得到抗體表達載體。此時，通過使編碼抗體恒定區(qū)(C區(qū))的基因、和 編碼上述V區(qū)的基因框內(nèi)融合，能夠得到全長抗體。為了制造本發(fā)明的抗CLDN6抗體，可以將抗體基因參入表達載體使其在表達控制 區(qū)的控制下進行表達。所謂用于表達抗體的表達控制區(qū)，例如包括增強子和啟動子。然后， 通過用此表達載體轉(zhuǎn)化適當?shù)乃拗骷毎?，可以得到表達編碼抗CLDN6抗體的DNA的重組細 胞?？贵w基因表達時，編碼抗體重鏈(H鏈)及輕鏈(L鏈)的DNA可以分別參入不同的 表達載體中。通過將參入H鏈和L鏈的載體在相同宿主細胞中同時轉(zhuǎn)化(co-transfect)， 可以使具有H鏈和L鏈的抗體分子表達?；蛘撸部梢詫⒕幋aH鏈及L鏈的DNA參入單一 表達載體，使宿主細胞轉(zhuǎn)化(參見國際公開W094/11523)。已經(jīng)公知多種宿主和表達載體的組合用于將抗體基因暫時分離、導入適當?shù)乃拗髦谱骺贵w。上述表達體系均可以用于本發(fā)明。使用真核細胞作為宿主時，可以使用動物細 胞、植物細胞、或者真菌細胞。具體而言，作為可以用于本發(fā)明的動物細胞，例如可以使用哺 乳類細胞(CH0、COS、骨髓瘤、BHK (baby hamster kidney)、Hela、Vero等)、兩棲動物類細胞 (爪蟾卵母細胞(Xenopus oocytes)等)、昆蟲細胞(sf9、sf21、Tn5等)等。或者作為植物細胞，公知有由來自煙草(Nicotiana tabacum)等煙草 (Nicotiana)屬的細胞產(chǎn)生的抗體基因的表達體系。植物細胞的轉(zhuǎn)化可以利用進行了愈傷 組織培養(yǎng)的細胞。進而，作為真菌細胞，可以使用酵母(釀酒酵母(Saccharomyces serevisiae)等 酵母菌(Saccharomyces)屬、甲醇畢赤酵母(Pichia pastoris)等Pichia屬)、絲狀真菌 (黑曲霉(Aspergillus niger)等曲霉(Aspergillus)屬)等。或者，利用原核細胞的抗體基因的表達體系也是公知的。例如，使用細菌細胞時， 本發(fā)明可以使用大腸桿菌(E. coli)、枯草菌等細菌細胞。使用哺乳類細胞時，可以構筑表達載體，所述表達載體功能性地結(jié)合常用的有效 啟動子、表達的抗體基因、其3’側(cè)下游的polyA信號。例如作為啟動子/增強子，可以舉 出人巨細胞病毒立艮口早其月啟云力子/ ±曾強子(human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer)。另外，除此之外作為在本發(fā)明的抗體的表達中可以使用的啟動子/增強子，可以 舉出病毒啟動子/增強子、或者來自人延伸因子la (HEFla)等哺乳類細胞的啟動子/增 強子等。作為能夠利用啟動子/增強子的病毒，具體而言可以給出逆轉(zhuǎn)錄病毒、多瘤病毒、 腺病毒、猴腎病毒40(SV40)等。使用SV40啟動子/增強子時，可以利用Mulligan等的方法(Nature (1979) 277, 108)。另外，HEFla啟動子/增強子按照Mizushima等的方法(Nucleic Acids Res. (1990) 18,5322)可以容易地用于目標基因表達。大腸桿菌的情況下，功能性地結(jié)合常用的有效啟動子、用于抗體分泌的信號序列 及表達的抗體基因，可以表達該基因。作為啟動子，例如可以舉出IacZ啟動子、araB啟動 子。使用IacZ啟動子時，可以采用Ward等的方法(Nature (1989) 341，544-546 ；FASEBJ. (1992)6, 2422-2427)。或者，araB 啟動子通過 Better 等的方法(Science (1988) 240， 1041-1043)可以用于目標基因的表達。作為用于抗體分泌的信號序列，在大腸菌的周質(zhì)中產(chǎn)生時可以使用pelB信號序 列(Lei, S. P. et al.，J. Bacteriol. (1987) 169,4379)。然后，將在周質(zhì)中產(chǎn)生的抗體分離 后，使用如尿素的鹽酸胍之類的蛋白質(zhì)變性劑，由此改組(重折疊)抗體的結(jié)構使其具有所 期望的結(jié)合活性。作為插入表達載體的復制起源，可以使用來自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳頭瘤 病毒(BPV)等的復制起源。進而，為了在宿主細胞體系中擴增基因拷貝數(shù)，可以向表達載體 中插入選擇標記。具體而言，可以使用氨基糖苷轉(zhuǎn)移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大 腸桿菌黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Ecogpt)基因、二氫葉酸還原酶(dhfr)基因等選 擇標記。將上述表達載體導入宿主細胞，將轉(zhuǎn)化的宿主細胞在體外或體內(nèi)培養(yǎng)，產(chǎn)生目標 抗體。宿主細胞的培養(yǎng)可以按照公知的方法進行。例如，作為培養(yǎng)液，可以使用DMEM、MEM、RPMI 1640、IMDM，也可以并用胎牛血清(FCS)等血清補液。如上所述表達、產(chǎn)生的抗體可以通過單獨使用或者適當?shù)亟M合使用在通常的蛋 白質(zhì)的純化中采用的公知方法進行純化。例如，通過對A蛋白柱等親和柱、色譜柱、過濾、 超濾、鹽析、透析等進行適當選擇、組合，可以分離、純化抗體(Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory,1988)。另外，重組型抗體的生成過程中，除了上述宿主細胞之外，也可以使用轉(zhuǎn)基因動 物。即，由導入了編碼目標抗體的基因的動物可以得到該抗體。例如，抗體基因通過框內(nèi)插 入到編碼在乳汁中固有產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的基因的內(nèi)部，構筑成融合基因。作為乳汁中分泌的 蛋白質(zhì)，例如，可以使用山羊β酪蛋白等。將含有插入了抗體基因的融合基因的DNA片段 注入山羊的胚中，將該注入胚導入雌性山羊中。由接受該胚的山羊生出轉(zhuǎn)基因山羊(或其 子孫)，從該轉(zhuǎn)基因山羊產(chǎn)生的乳汁中能夠作為與乳汁蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)得到所期望的 抗體。另外，為了使由轉(zhuǎn)基因山羊產(chǎn)生的含有所期望抗體的乳汁量增加，可以適當對轉(zhuǎn)基因 山羊使用激素(Ebert, K. M. et al.，Bio/Technology (1994) 12，699-702)。糖鏈修飾抗體本發(fā)明的抗CLDN6抗體也可以為被糖鏈修飾的抗體。已知通過修飾抗體的糖鏈能 夠增強抗體的細胞毒性。作為被糖鏈修飾的抗體的例子，例如，可以舉出經(jīng)糖基化修飾的抗體(W0 99/54342等)、糖鏈中附加的巖藻糖缺失的抗體(W000/61739、WO 02/31140、WO 2006/067847、WO 2006/067913 等)、具有含有截開型 GlcNAc 的糖鏈的抗體(W0 02/79255
寸J寸°作為本發(fā)明的優(yōu)選糖鏈修飾抗體，可以舉出巖藻糖缺失的抗體。與抗體結(jié)合的糖 鏈包括與抗體分子的天冬酰胺的側(cè)鏈的N原子結(jié)合的N-糖基結(jié)合糖鏈、和與抗體分子的絲 氨酸或蘇氨酸的側(cè)鏈羥基結(jié)合的0-糖基結(jié)合糖鏈，本發(fā)明中，巖藻糖是否存在與N-糖基結(jié) 合糖鏈相關。本發(fā)明中，所謂巖藻糖缺失的抗體，是指組合物中的抗體的N-糖基結(jié)合糖鏈中， 20%以上、優(yōu)選50%以上、較優(yōu)選70%以上、更優(yōu)選90%以上的N-糖基結(jié)合糖鏈中巖藻糖 缺失。巖藻糖缺失的抗體可以通過本領域技術人員公知的方法制作，例如，可以通過在 不具有附著α-1，6核心巖藻糖(a-l，6COrefUCOSe)的能力或此能力低的宿主細胞中使抗 體表達，進行制造。不具有附著巖藻糖的能力或此能力低的宿主細胞沒有特殊的限定，例 如，可以舉出大鼠骨髓瘤YB2/3HL. P2. Gil. 16Ag. 20細胞(簡稱YB2/0細胞)(以ATCC CRL 1662 保存)、FTVIII 敲除 CHO 細胞(W0 02/31140)、Lecl3 細胞(W0 03/035835)、巖藻糖轉(zhuǎn) 運蛋白缺失細胞(W02006/067847, W02006/067913)等。糖鏈的解析可以采用本領域技術人員公知的方法進行。例如，使N-糖苷酶 F(Roche)等作用于抗體，使糖鏈與抗體分離。然后，通過使用纖維素柱體的固相提取 (Shimizu Y. et al.，Carbohydrate Research 332 (2001)，381-388)進行除鹽后，濃縮 干固，用 2-氨基吡啶進行熒光標記(Kondo A.et al. , Agricultural and Biological Chemistry 54 8 (1990), 2169-2170)。通過使用纖維素柱體的固相提取將所得的PA化糖鏈 脫去試劑后，離心濃縮，形成純化PA化糖鏈。然后，進行利用ODS柱的反相HPLC分析，由此可以測定。另外，也可以在配制PA化糖鏈后，將利用ODS柱的反相HPLC分析及利用胺柱的 正相HPLC分析組合進行二維作圖，由此進行測定。嵌合抗體及人源化抗體作為本發(fā)明的抗體的其它優(yōu)選方案，可以舉出嵌合抗體或人源化抗體。嵌合抗體 是指來源不同的區(qū)域之間相互連接的抗體。一般情況下，嵌合抗體由來自人以外的動物的 抗體的V區(qū)域和來自人抗體的C區(qū)域構成。例如，包含小鼠抗體的重鏈、輕鏈的可變區(qū)、和 人抗體的重鏈、輕鏈的恒定區(qū)的抗體，為小鼠-人異種嵌合抗體。相對于此，人源化抗體由來自人以外的動物的抗體的互補決定區(qū)域(⑶R: complementarity determining region)、禾口來自人抗體的構架區(qū)(FR :framework region) 及來自人抗體的C區(qū)構成。由于人源化抗體在人體內(nèi)的抗原性低，所以作為本發(fā)明的治療 劑的有效成分有用。人源化抗體也稱作重構(reshaped)人抗體。具體而言，將人以外的動 物、例如小鼠抗體的CDR移植到人抗體中的人源化抗體等是公知的。用于得到人源化抗體 的一般的基因重組方法也是已知的。具體而言，作為用于將小鼠抗體的CDR移植到人的FR中的方法，例如公知重疊延 伸PCR(Overlap Extension PCR)。在重疊延伸PCR中，將編碼應移植的小鼠抗體CDR的堿 基序列附著在用于合成人抗體FR的引物上。針對4個FR分別準備引物。一般情況下，在 將小鼠CDR向人FR的移植中，選擇與小鼠FR同源性高的人FR有利于維持CDR功能。艮口， 一般情況下優(yōu)選利用下述人FR，該人FR包含與應移植的小鼠CDR鄰接的FR的氨基酸序列 同源性高的氨基酸序列。另外，連結(jié)的堿基序列被設計成框內(nèi)相互連接。利用各個引物，分別地合成人FR。 結(jié)果得到了編碼小鼠CDR的DNA附著在各FR上的產(chǎn)物。各產(chǎn)物的編碼小鼠CDR的堿基序 列被設計成相互重疊。接下來，以人抗體基因作為模板合成產(chǎn)物，使該產(chǎn)物的重疊CDR部分 相互退火，進行互補鏈合成反應。禾Ij用此反應，人FR通過小鼠⑶R的序列連結(jié)。最終，3個⑶R和4個FR連結(jié)的V區(qū)基因，通過在5’末端和3’末端退火且附著適 當?shù)南拗泼缸R別序列的引物，將其全長擴增。將如上所述得到的DNA和編碼人抗體C區(qū)的 DNA插入表達載體中使其框內(nèi)融合，由此可以制作人型抗體表達用載體。將該重組載體導入 宿主，建立重組細胞后，培養(yǎng)該重組細胞，通過使編碼該人源化抗體的DNA表達，在該培養(yǎng) 細胞的培養(yǎng)物中產(chǎn)生該人源化抗體(參見歐洲專利公開EP239400、國際公開W096/02576)。定性或者定量地測定、評價如上所述制作的人源化抗體與抗原的結(jié)合活性，由此 能夠適當?shù)剡x擇出在通過CDR連結(jié)時該CDR形成良好的抗原結(jié)合部位的人抗體FR。根據(jù)需 要，也可以取代FR的氨基酸殘基使重構人抗體的CDR形成適當?shù)目乖Y(jié)合部位。例如，應 用在將小鼠CDR向人FR中移植時使用的PCR法，能夠向FR中導入氨基酸序列的突變。具 體而言，能夠向使FR退火的引物中導入部分的堿基序列的突變。在利用上述引物合成的FR 中導入堿基序列的突變。取代氨基酸的突變型抗體與抗原的結(jié)合活性采用上述方法進行 測定、評價，由此能夠選擇具有所期望的性質(zhì)的突變FR序列(Sato，K. et al. ,Cancer Res, 1993，53，851-856)。人源化抗體的C區(qū)，可以使用人抗體的C區(qū)，例如H鏈中，可以使用Cy 1、C γ 2、 Cy3、Cy4、Cp、CS、Ca l、Ca 2、C ε等，L鏈中可以使用C κ、C λ等。另外，為了改善抗 體或其產(chǎn)生的穩(wěn)定性，可以修飾人抗體的C區(qū)。人源化時使用的人抗體也可以是IgG、IgM、IgA、IgE、IgD等任何異型人抗體，但本發(fā)明中優(yōu)選使用IgG。作為IgG，可以使用IgGl、IgG2、 IgG3、IgG4 等。需要說明的是，制作人源化抗體后，也可以將可變區(qū)(例如CDR、FR)或恒定區(qū)中的 氨基酸用其他氨基酸進行取代、缺失、添加及/或插入等，本發(fā)明的人源化抗體中也可以包 括經(jīng)上述氨基酸取代等的人化抗體。二價抗體、低分子化抗體、修飾抗體本發(fā)明的抗CLDN6抗體只要與CLDN6蛋白質(zhì)結(jié)合即可，不僅包括以IgG為代表的 二價抗體，也包括一價抗體、或以IgM為代表的多價抗體。本發(fā)明的多價抗體中包括具有全 部相同的抗原結(jié)合部位的多價抗體、或、具有部分或全部不同的抗原結(jié)合部位的多價抗體。另外，本發(fā)明的抗體不限于全長分子的抗體，只要與CLDN6蛋白質(zhì)結(jié)合即可，也可 以為低分子化抗體或其修飾物。低分子化抗體包括全長抗體(whole antibody、例如whole IgG等)的部分缺失 的抗體片段。只要具有與CLDN6抗原的結(jié)合能力即可，允許抗體分子部分缺失。本發(fā)明的 抗體片段優(yōu)選含有重鏈可變區(qū)(VH)及輕鏈可變區(qū)(VL)中的任一個、或兩者。VH或VL的 氨基酸序列可以包括取代、缺失、添加及/或者插入。并且只要具有與CLDN6抗原的結(jié)合能 力即可，也可以使VH及VL中的任一個或兩者的一部分缺失。另外，可變區(qū)也可以嵌合化或 人源化。作為抗體片段的具體例，例如，可以舉出Fab、Fab，、F(ab，)2、Fv等。另外，作為 低分子化抗體的具體例，例如，可以舉出Fab、Fab，、F (ab，)2、Fv、scFv (單鏈Fv)、雙鏈抗體 (Diabody)、sc (Fv) 2 (單鏈(Fv) 2)等。上述抗體的多聚體(例如，二聚體、三聚體、四聚體、 聚合物)也包含在本發(fā)明的低分子化抗體中?？贵w的片段可以通過用酶處理抗體使抗體片段生成而獲得。作為產(chǎn)生抗 體片段的酶，例如公知木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、或者纖溶酶等?；蛘?，可以構筑編碼 上述抗體片段的基因，將其導入表達載體后，使其在適當?shù)乃拗骷毎斜磉_(例如， 參見 Co，M.S.et al. , J. Immunol, (1994) 152，2968-2976、Better，Μ· & Horwitz， Α. H. Methods in Enzymology(1989) 178，476—496、Plueckthun，A. & Skerra，A. Methods in Enzymology(1989) 178,476-496>Lamoyi,E.，Methods in Enzymology(1989) 121，652—663、 Rousseaux, J. et al. , Methods in Enzymology(1989) 121,663-669、Bird, R. E. et al., TIBTECH(1991)9,132-137)。雙鏈抗體是指通過基因融合構筑的二價(bivalent)的抗體片段(Holliger P et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :6444_6448 (1993)、EP404, 097 號、W093/11161 號等)。 雙鏈抗體是由2條多肽鏈構成的二聚體。通常，構成二聚體的多肽鏈分別在相同的鏈中VL 及VH通過連接體結(jié)合。一般情況下，雙鏈抗體中的連接體在VL和VH不能相互結(jié)合的部位 很短。具體而言，構成連接體的氨基酸殘基例如為5個殘基左右。因此，在同一多肽鏈上編 碼的VL和VH，不能形成單鏈可變區(qū)片段，與其它單鏈可變區(qū)片段形成二聚體。結(jié)果雙鏈抗 體具有2個抗原結(jié)合部位。ScFv通過將抗體的H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)連結(jié)而得到。scFv中，H鏈V區(qū)和L鏈V 區(qū)通過連接體、優(yōu)選通過肽連接體連結(jié)(Huston, J. S. et al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 1988，85，5879-5883.)。scFv中的H鏈V區(qū)及L鏈V區(qū)雖然在本說明書中記載為抗體，但也 可以來自任意的抗體。連結(jié)V區(qū)的肽連接體，沒有特殊的限制。例如可以使用包含3至25
22個殘基左右的任意的單鏈肽作為連接體。SC (Fv) 2是用連接體等將2個VH及2個VL結(jié)合形成單鏈的低分子化抗體(Hudson et al、J Immunol. Methods 1999;231:177-189)。sc (Fv) 2 可以通過例如將 scFv 用連接體 連接來制作。并且，本發(fā)明的抗體也可以以與聚乙二醇(PEG)等各種分子結(jié)合的抗體修飾物的 形式使用。上述抗體修飾物可以通過對本發(fā)明的抗體實施化學修飾而得到?？贵w的修飾方 法在本領域中已經(jīng)確立。并且，本發(fā)明的抗體也可以為雙特異性抗體(bispecific antibody) 0所謂雙特 異性抗體，是指在同一抗體分子內(nèi)具有識別不同抗原決定部位的可變區(qū)的抗體，該抗原決 定部位可以存在于不同的分子中、也可以存在于同一分子中。即，在本發(fā)明中，雙特異性抗 體可以具有識別CLDN6蛋白質(zhì)上的不同抗原決定部位的抗原結(jié)合部位。上述雙特異性抗體 中，相對于1分子的CLDN6，可以結(jié)合2分子的抗體分子。結(jié)果能夠期待更強的細胞毒性。 本發(fā)明中的“抗體”也包括上述抗體。另外，在本發(fā)明中，也可以組合識別CLDN6以外的抗原的雙特異性抗體。例如，可 以組合識別與CLDN6不同的抗原的雙特異性抗體，所述抗原是與CLDN6相同地在靶癌細胞 的細胞表面特異性表達的抗原。用于制造雙特異性抗體的方法是公知的。例如，使識別抗原不同的2種抗體結(jié)合， 可以制作雙特異性抗體。結(jié)合的抗體可以分別為具有H鏈和L鏈的1/2分子、也可以為僅 具有H鏈的1/4分子?；蛘?，也可以使產(chǎn)生不同的單克隆抗體的雜交瘤融合，制作產(chǎn)生雙特 異性抗體的融合細胞。并且，可以利用基因工程學方法制作雙特異性抗體。藥物組合物本發(fā)明提供一種含有上述抗CLDN6抗體作為有效成分的藥物組合物。另外，本發(fā) 明涉及一種含有上述抗CLDN6抗體作為有效成分的抗癌劑。本發(fā)明的抗癌劑，優(yōu)選給與患 有癌癥的對象或可能復發(fā)的對象。另外，本發(fā)明中，除了含有抗CLDN6抗體作為有效成分的抗癌劑之外，還提供了 一 種包含向治療對象給與抗CLDN6抗體的步驟的預防或治療癌癥的方法，或在抗癌劑的制造 中抗CLDN6抗體的應用。利用本發(fā)明的抗癌劑治療的癌癥的種類沒有特殊的限制，通常、為CLDN6蛋白質(zhì) 表達的癌癥，優(yōu)選為肺腺癌、胃癌或卵巢癌。此外，利用本發(fā)明的抗癌劑治療的癌癥沒有特 別限定，但優(yōu)選為CLDN6蛋白質(zhì)高度表達的癌癥。本發(fā)明中，所謂“含有抗CLDN6抗體作為有效成分”，是指含有抗CLDN6抗體作為主 要的活性成分，并不限制單克隆抗體的含有率。并且，本發(fā)明的藥物組合物、細胞生長抑制劑或者抗癌劑中，根據(jù)需要可以配合多 種抗體。例如，通過制成多種抗CLDN6抗體的混合物，可能能夠增強對CLDN6表達細胞的細 胞毒性。或者，除抗CLDN6抗體之外，通過配合識別其它腫瘤相關抗原的抗體，也可以提高 治療效果。本發(fā)明的藥物組合物、細胞生長抑制劑或者抗癌劑可以通過口服、非口服給藥中 的任一種方式給與患者。優(yōu)選非口服給藥。作為相關的給藥方法，具體而言，可以舉出注射 給藥、經(jīng)鼻給藥、經(jīng)肺給藥、經(jīng)皮給藥等。作為注射給藥例，例如，可以通過靜脈內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、腹腔內(nèi)注射、皮下注射等全身或局部地給與本發(fā)明的藥物組合物。另外，可以根 據(jù)患者的年齡、癥狀選擇適當?shù)慕o藥方法。作為給藥量，例如，在每一次給藥每Ikg體重為 0. OOOlmg至IOOOmg的范圍內(nèi)選擇給藥量。或者，例如，在每位患者為0. 001至IOOOOOmg/ body的范圍內(nèi)選擇給藥量。但是，本發(fā)明的藥物組合物并不限定于上述給藥量。本發(fā)明的藥物組合物可以按照常用方法進行制劑化(例如，Remington' s Pharmaceutical Science，Latest edition，Mark Publishing Company, Easton，U. S. A)， 也可以同時含有藥物中允許的載體或添加物。例如可以舉出表面活性劑、賦形劑、著色劑、 香料、防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、懸浮劑、等滲劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑、流動性促進劑、矯 味劑等。并且，并不限定于此，可以適當?shù)厥褂闷渌Ｓ玫妮d體。具體而言，作為載體可以 舉出輕質(zhì)無水硅酸、乳糖、結(jié)晶纖維素、甘露醇、淀粉、羧甲基纖維素鈣、羧甲基纖維素鈉、 羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚乙烯醇縮乙醛二乙氨基乙酸酯(polyvinyl acetal diethylamino acetate)、聚乙烯吡咯烷酮、明膠、中鏈脂肪酸三甘油酯、聚氧乙烯氫化蓖麻 油60、白糖、羧甲基纖維素、玉米淀粉、無機鹽類等。另外，本發(fā)明提供一種通過使CLDN6表達細胞和抗CLDN6抗體接觸來破壞CLDN6 表達細胞的方法或者抑制細胞增殖的方法?？笴LDN6抗體如上所述?？笴LDN6抗體結(jié)合的 細胞只要是CLDN6表達的細胞即可，沒有特別的限制。本發(fā)明的優(yōu)選CLDN6表達細胞為癌 細胞。作為優(yōu)選的癌細胞可以舉出肺腺癌細胞、胃癌細胞、卵巢癌細胞等。本發(fā)明中，“接觸”可以在體外進行，也可以在體內(nèi)進行。例如，通過向在試驗管內(nèi) 培養(yǎng)的CLDN6表達細胞的培養(yǎng)液中添加抗體進行接觸。在此情況下，作為添加的抗體的形 狀，可以適當?shù)厥褂萌芤夯蛘咄ㄟ^凍結(jié)干燥等得到的固體等形狀。在以水溶液形式添加時， 可以是單純地僅含抗體的水溶液，也可以是含有例如如上所述的表面活性劑、賦形劑、著色 齊U、香料、防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、懸浮劑、等滲劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑、流動性促進齊U、 矯味劑等的溶液。添加的濃度沒有特殊的限制，但作為培養(yǎng)液中的最終濃度，優(yōu)選為lpg/ml 至lg/ml的范圍，較優(yōu)選為lng/ml至lmg/ml，更優(yōu)選為1 μ g/ml至lmg/ml。另外，在本發(fā)明中，“接觸”在其它方案中還可以如下進行，S卩，給與將CLDN6表達 細胞移植到體內(nèi)的非人動物、或內(nèi)在地具有表達CLDN6的癌細胞的動物。給藥方法可以通 過口服、非口服給藥中的任意一種實施。特別優(yōu)選為通過非口服給與的給藥方法，作為相關 的給藥方法，具體而言，可以舉出注射給藥、經(jīng)鼻給藥、經(jīng)肺給藥、經(jīng)皮給藥等。作為注射給 藥的例子，例如，可以通過靜脈內(nèi)注射、筋肉內(nèi)注射、腹腔內(nèi)注射、皮下注射等全身或局部地 給與本發(fā)明的藥物組合物細胞增殖抑制劑及抗癌劑。另外，可以根據(jù)受試動物的年齡、癥狀 選擇適當?shù)慕o藥方法。以水溶液形式給藥時，可以為單純地僅含有抗體的水溶液，也可以是 例如含有如上所述的表面活性劑、賦形劑、著色劑、香料、防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、懸浮劑、 等滲劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑、流動性促進劑、矯味劑等的溶液。作為給藥量，例如，可以 在每次給藥每Ikg體重0. OOOlmg至IOOOmg的范圍內(nèi)選擇給藥量?；蛘?，例如，在每位患者 為0. 001至lOOOOOmg/body的范圍內(nèi)選擇給藥量。但是，本發(fā)明的抗體給藥量并不限定于 上述給藥量。診斷方法進而，本發(fā)明提供一種使用抗CLDN6抗體的癌癥的診斷方法。利用本發(fā)明的方法 診斷的癌癥只要表達CLDN6即可，沒有特殊的限制，但優(yōu)選為肺腺癌、胃癌或卵巢癌。
本發(fā)明的診斷方法可以在體外進行，也可以在體內(nèi)進行，但優(yōu)選在體外進行。使用本發(fā)明的抗CLDN6抗體的癌癥的診斷方法，例如，為包含如下步驟的方法。(a)步驟，提供從受試者采取的試樣；(b)步驟，檢測(a)的試樣中所含的CLDN6蛋白質(zhì)。在本發(fā)明中，所謂檢測，包括定量的或定性的檢測。定性的檢測，包括例如是否存 在CLDN6蛋白質(zhì)的測定、CLDN6蛋白質(zhì)是否存在一定量以上的測定、將CLDN6蛋白質(zhì)的量與 其它試樣(例如，對照試樣等)比較的測定等。定量的檢測，包括例如CLDN6蛋白質(zhì)的濃度 的測定、CLDN6蛋白質(zhì)的量的測定等。本發(fā)明的被檢試樣只要是可能含有CLDN6蛋白質(zhì)的試樣即可，沒有特殊的限制。 具體而言，優(yōu)選從哺乳類等生物的身體采取的試樣。更優(yōu)選試樣為從人體采取的試樣。作為 被檢試樣的具體例，例如，可以舉出血液、間質(zhì)液(interstitial fluid)、血漿、血管外液、 腦脊液、滑液、胸膜液、血清、淋巴液、唾液、尿、組織等。優(yōu)選的試樣是由從生物的身體采取 的組織或細胞固定化的標本或者細胞培養(yǎng)液等被檢試樣得到的試樣。CLDN6蛋白質(zhì)的檢測可以通過本領域技術人員公知的方法進行，例如，可以通過 放射免疫測定(RIA)、酶免疫測定(EIA)、熒光免疫測定(FIA)、發(fā)光免疫測定(LIA)、免疫 沉淀法(IP)、免疫比濁法(TIA)、蛋白質(zhì)印跡法(WB)、免疫組織化學(IHC)法、免疫擴散法 (SRID)等進行。本發(fā)明中，檢測到CLDN6蛋白質(zhì)時(例如，與對照試樣相比，被檢試樣中所含的 CLDN6蛋白質(zhì)多的情況、被檢試樣中所含的CLDN6蛋白質(zhì)超過一定量的情況等)可以判斷為 癌、或者癌的可能性高。
實施例以下，通過實施例更詳細地說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限定于這些實施例。「實施例Il利用人Exon 1. OST Array的人CLDN6 mRNA的表達解析為了闡明人CLDN6 mRNA在臨床癌癥、癌細胞株、各種正常臟器中的表達分布，使用 原來為了進行剪接變異體解析而開發(fā)的人Exon LOST Array (Affymetrix公司)來進行表 達解析。使用人Exon 1. OST陣列進行表達解析的優(yōu)點在于，與基本在每一個基因3’側(cè)僅有 一個探針測試器(probe set)的、現(xiàn)有的Affymetrix公司的表達陣列相比，人Exon 1.0ST 陣列在基因的每個外顯子上至少設定一個探針測試器，所以使用此陣列進行每個基因的表 達解析時，對于每個基因，可以得到多個探針測試器的表達數(shù)據(jù)，每個基因的表達數(shù)據(jù)的可 靠性提高。在此次表達解析中，使用的總RNA來自22例肺腺癌摘出組織的腫瘤部位、2例肺 腺癌摘出組織的正常部位、13例胃癌摘出組織的腫瘤部位、20例卵巢癌摘出組織的腫瘤部 位、19種肺腺癌細胞株、4種小細胞肺癌細胞株、10種胃癌細胞株、20種卵巢癌細胞株、及65 種正常組織(購買自 Clontech Laboratories 公司、Ambion 公司、STRATAGENE 公司、Cell APPLICATIONS 公司、Panomics 公司、CHEMICON 公司、Bio 鏈 Institute 公司)。使用Trizol (Invitrogen)按照產(chǎn)品附帶的方法對全部臨床癌癥摘出組織(取 得知情同意)的腫瘤部位、正常部位、及癌細胞株(購買自ATCC、JCRB、理研BI0S0URCE CENTER CELL BANK)進行總RNA的提取。使用上述總RNA 1 μ g,根據(jù)GeneChip WholeTranscript (WT) Sense Target Labeling Assay Manual (Affymetrix)進行基因表達表達 解析實驗，人Exon 1.0 ST Array Date的數(shù)值化使用Affymetrix公司提供的ExACT (Exon Array Computational Tool)軟件進行。針對人CLDN6的人Exon 1.0 ST Array的核心探針測試器存在3個，該核心探針測 試器ID為3677351、3677352、3677353。此3個探針測試器ID在正常組織中的表達數(shù)據(jù)示 于圖1，在肺腺癌細胞株、小細胞肺癌細胞株、肺腺癌摘出組織的腫瘤部位中的表達數(shù)據(jù)示 于圖2，在胃癌細胞株、胃癌摘出組織的腫瘤部位中的表達數(shù)據(jù)示于圖3，在卵巢癌細胞株、 卵巢癌摘出組織的腫瘤部位中的表達數(shù)據(jù)示于圖4。由圖1 4可知，除在胎兒的肺中之外，人CLDN6轉(zhuǎn)錄體在正常組織中均無表達 (與腫瘤組織相比，在此次考察的成人正常組織中基本沒有表達，可以忽視)，雖然頻率低， 但是觀察到在肺癌、胃癌、卵巢癌中高度表達。此結(jié)果表明，為靶的抗腫瘤劑完 全不用擔心在正常組織中的副作用，可以期待使藥物的藥效遠離副作用?！竧施例21癌細胞,株中的人CLDN6蛋白質(zhì)的表汰解析使用對細胞株溶胞產(chǎn)物進行的蛋白質(zhì)印跡，進行癌細胞株中的人CLDN6蛋白質(zhì)的 表達解析。通過人Exon 1.0 ST Array 及人 Genome U133 Set Array 進行人 CLDN6 mRNA 表達解析，根據(jù)此結(jié)果，實驗中使用2株、即肺腺癌細胞株ABC-1、胃癌細胞株AGS作為人 CLDN6 mRNA高度表達的細胞株；使用4株、即肺腺癌細胞株NCI-H2347、肺小細胞肺癌細胞 株NCI-H209、肺小細胞肺癌細胞株NCI-H1672、肺小細胞肺癌細胞株NCI-H1184作為不表 達人 CLDN6 mRNA 表達的細胞株。ABC-1 購自 JCRB Cell Bank，AGS、NCI-H2347、NCI-H209、 NCI-H1672、NCI-Hl 184 購自 ATCC，進行使用。用ImM EDTA/PBS(-)將細胞從器皿中剝離，向1 X IO6個細胞中添加50uL NP40 Lysis Buffer
，通過吸 量管將細胞溶解后，在冰上靜置30分鐘，于4°C以15000rpm進行離心30分鐘，將得到的上 清液作為細胞株溶胞產(chǎn)物。將如上所述制作的溶胞產(chǎn)物用2 X sample buffer (SIGMAS3401-IVL)以1 1進 行配制后，在室溫下培養(yǎng)15分鐘，將10uL(lX IO5份的細胞溶胞產(chǎn)物)用于蛋白質(zhì)印跡。 在蛋白質(zhì)印跡中，使用15 25%的聚丙烯酰胺；1次抗體使用抗claudin-6山羊多克隆抗 體(C-20) (Santa Cruz Code, sc-17669 Lot. H2605)，該抗體是對人 CLDN6 的 C 末端肽的 多克隆抗體，以1/200稀釋進行使用；二次抗體為豬抗山羊Ig’ sHRP綴合物(BI0S0URCE Code. ACI3404 Lot. 4101)，以 1/20000 稀釋進行使用。顯色采用 ECL Plus Western Blotting Detection System(GEHealthcare Code. RPN2132)，使顯色的膜曝光到Hyperfilm ECL(GEHealthcare Corp. Code. 28-9068-36)上。如圖5所示，蛋白質(zhì)表達結(jié)果與[實施例1]所示的轉(zhuǎn)錄譜(transcriptome)的解 析結(jié)果具有良好的關系。根據(jù)此結(jié)果可以推斷，人CLDN6蛋白質(zhì)表達與人CLDN6 mRNA表達 非常一致。使用[實施例1]的Exon Array得到的轉(zhuǎn)錄譜解析結(jié)果與蛋白表達解析結(jié)果基 本一致。根據(jù)上述結(jié)論，首次發(fā)現(xiàn)人CLDN6蛋白質(zhì)在成人的正常組織中基本不表達，在腫瘤中表達升高?！笇嵤├?1識別癌細胞膜表面上的人CLDN6的抗體的制作及此抗體的抗腫瘤活件 的測定如實施例1、2所示，人CLDN6蛋白質(zhì)的表達與mRNA的表達具有良好的相關性，另 外，表明成人正常組織中的人CLDN6 mRNA的表達與腫瘤組織相比，非常少，或者基本沒有。 因此，可以推測，與腫瘤組織相比，人CLDN6蛋白質(zhì)在成人正常組織中也基本不表達。這意 味著識別在癌細胞表面上表達的人CLDN6蛋白質(zhì)的抗體為腫瘤特異性極高的抗體。使用上 述抗體作為抗腫瘤劑時，可以期待將藥效與副作用極大地分離，表明作為抗腫瘤劑的靶，人 CLDN6具有極高的潛力。因此，實際上制作識別在癌細胞膜表面上的人CLDN6的抗體，評價上述抗體的抗 腫瘤效果。3-1.人 CLDN6 cDNA 的克降制作針對人CLDN6的抗體時，克隆包含人CLDN6 (RefseqAccession No. NM_021195. 3)cDNA 的可讀框的序列。以 Marathon-ReadycDNA Fetal Lung(Clontech 公司Code. 639333)為模板，使用序列號1及序列號2表示的引物對人CLDN6的cDNA進 行克隆。具體而言，使用KOD plus DNA polymerase (Τ0Υ0Β0公司)，配制下述溶液，該溶 液含有 5yL 10XK0D Buffer, 5uL 2mM dNTPs、3uL 25mM MgSO4U. 5uL ΙΟμΜ 序列號 1 的 引物、1.5uL 10口] 序列號2的引物、2111^^1^1&{6 fetal lung cDNAUuL KOD plus DNA polymerase、31uL 不含核酸酶的水，以 94 °C 2min、{94 °C、15 秒，58 °C、30 秒，68 °C、1 分 鐘} X 30個循環(huán)的模式進行PCR擴增。接下來，以此擴增產(chǎn)物為模板，使用序列號3及序列 號4表示的引物，也可以使用同一酶，以相同的組成，按照940C 2min、{94°C、15秒，58 °C、30 秒，68°C、1分鐘}20個循環(huán)的模式再次進行擴增。將擴增片段用Hind III、Nhe I進行消 化，克隆到pMCN-flag載體的Hind III、Nhe I位點。3-2.人CLDN6表達CH0(DG44)及人CLDN6-表達Ba/F3細胞的制作使用pC0S2載體作為哺乳動物中的表達載體用于制作人CLDN6表達CHO細胞 (DG44，購買自Invitrogen公司)、及人CLDN6表達Ba/F3細胞。pC0S2載體在載體上參入 EFla啟動子-增強子序列作為用于誘導目標基因表達的啟動子，在此啟動子-增強子作用 下插入目標基因cDNA序列，由此可以在載體導入細胞中誘導目標基因的表達。另外，由于 在此載體中參入新霉素耐性基因，所以可以用新霉素選擇載體導入細胞。使用序列號5表示的引物(EcoRI識別序列-Kozak序列-人CLDN6 (Refseq Accession No. NM_021195. 3)可讀框的5’末端序列)和序列號6表示的引物(Not I識別 序列-人CLDN6可讀框的3’末端序列)，以克隆[實施例3-1]中所述的人CLDN6 cDNA得 到的質(zhì)粒為模板，進行PCR。使用Τ0Ρ0 TA Cloning (Invitrogen公司)將PCR擴增產(chǎn)物克 隆到pCR 2.1-T0P0載體上。將該載體用ECoRI、NotI進行消化，將得到的人CLDN6片段參 入pC0S2載體的EcoRI、NotI位點，由此構筑人CLDN6/pC0S2表達載體。用PvuI消化人CLDN6/pC0S2，將所得的消化產(chǎn)物利用電穿孔法(使用BIO-RAD公 司 GenePulser II)導入 CH0(DG44)細胞及 Ba/F3 細胞中。使用 500ug/mL Geneticin 選拔 導入細胞株，構建人CLDN6恒定表達CH0(DG44)細胞、及人CLDN6恒定表達Ba/F3細胞。另外，此人CLDN6/pC0S2載體也可以用于以下所述的DNA免疫進行。
3-3.抗CLDN6抗體的制作為了制作抗人CLDN6抗體，將利用Helios Gene Gun (BI0-RAD公司)進行的DNA免 疫與人CLDN6強制表達的Ba/F3細胞的細胞免疫組合，對小鼠進行免疫，通過使用人CLDN6 表達CH0(DG44)細胞的流式細胞術篩選單克隆抗體。免疫中使用的小鼠使用購自日本Charles River株式會社的血統(tǒng)名為BALB/ cAnNCrlCrl j、及血統(tǒng)名為 MRL/MpJ_Tnfrsf6<lpr>/Crl j Genotype :lpr/lpr 的小鼠，使用 Gene Gun進行DNA免疫時，使用[實施例3-2.]中所述的人CLDN6/pC0S2載體，按照BIO-RAD 公司的“HELIOS GENEGUN簡易操作指南ver. 2. 1 ”，將質(zhì)粒的DNA涂布在金顆粒上，對小鼠 進行免疫。DNA免疫的過程如下進行對每只小鼠2發(fā)/次，1周1 3次，共計8次 17 次左右。通過流式細胞術，定期測定小鼠血清中的抗體價，所述流式細胞術使用強制表達人 CLDN6的細胞株。確認了由DNA免疫引起抗體價升高后，通過尾靜脈進行人CLDN6強制表 達Ba/F3細胞株的細胞免疫，最終的細胞免疫2 3日后，摘出脾臟細胞，采用與小鼠細胞 株骨髓瘤P3X63Ag8U. 1 (購自P3U1、ATCC)的細胞融合法，制作抗體產(chǎn)生無限增殖化雜交瘤 (antibody-producing immortalizedhybridomas)。小鼠的脾臟細胞與小鼠骨髓瘤細胞株 P3X63Ag8U. 1細胞融合時，以相對于2 4個脾臟細胞、有1個P3X63Ag8U. 1細胞的比例， 將兩細胞混合，向該混合細胞中慎重且緩慢地添加PEG1500(ROCheDiagnostiCS公司)后， 用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋PEG1500，進行離心操作，除去PEG1500。接著，將其懸浮于HAT培 養(yǎng)基(含有10%胎牛血清(Roche Diagnostics公司)、1X青霉素-鏈霉素(Invitrogen 公司)、1XHAT media supplement (Sigma公司)、0· 5x BM-Condimed HlHybridoma Cloning Supplement (Roche Diagnostics ^w] ) ^ RPMI1640 (Invitrogen ^w] )) 合細胞接種至10 30張96孔板上。于37°C，在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 10日后，使用 雜交瘤培養(yǎng)上清液，進行篩選。篩選如下進行，即利用流式細胞儀(Becton · Dickinson公 司)測定抗體對人CLDN6強制表達CHO細胞的結(jié)合活性。對于陽性孔，由于可能存在多個 雜交瘤，所以采用有限稀釋法進行雜交瘤的單克隆。單克隆化后，選擇雜交瘤克隆，該雜交 瘤克隆產(chǎn)生對人CLDN6強制表達CHO細胞、及人CLDN6強制表達Ba/F3細胞的結(jié)合活性強 的抗體，由此構建識別細胞膜表面上的人CLDN6的抗體產(chǎn)生雜交瘤。其中，特別地選擇出18種雜交瘤，所述18種雜交瘤產(chǎn)生的抗體在流式細胞術中對 人CLDN6強制表達細胞株的結(jié)合活性強、且分型的結(jié)果為IgG型。使用代替FBS含有Ultra Low IgG FBS (Invitrogen公司)的HAT培養(yǎng)基對雜交瘤進行培養(yǎng)，從其培養(yǎng)上清液中用 HiTrap ProteinGHP ImL柱(GE Healthcare公司)純化抗體?？贵w的純化度通過SDS-PAGE、 CBB染色可以確認為較充分的水平。需要說明的是，使用IsoStrip (Roche公司)進行抗體 的分型。采用Dc Protein Assay Kit I (BI0-RAD公司)使用附帶的牛Y球蛋白作為對照， 對純化后的抗體的濃度進行測定。將抗體濃度換算為牛Y球蛋白濃度進行表示。根據(jù)附 帶的產(chǎn)品指南進行上述抗體純化、分型、蛋白定量。3-4.抗人CLDN6單克隆抗體對人CLDN6強制表達Ba/F3細胞表面上的人CLDN6的 結(jié)合活件的測定調(diào)節(jié)抗體濃度，通過流式細胞術評價18種[實施例3-3]中所述的純化抗人CLDN6 單克隆抗體對hCLDN6強制表達Ba/F3細胞、及親本株即Ba/F3的結(jié)合性。將懸浮于FACS buffer (0. 5% BSAUPBS (-) ,0. 1 % NaN3)中的 1 X IO5 個細胞分別注
28入96孔U底板(FALCON 353910)中，添加各抗體，使最終濃度為10、2、0. 4、0. 08、0 μ g/mL， 混合后于4°C培養(yǎng)1小時。進行離心操作、通過抽吸除去反應液，及通過添加200uL/孔的 FACSbuffer清洗細胞，之后作為 2次抗體將FITC標記Goat F(ab' )2 FragmentAnti-mouse IgG (Fe y ) (BECKMAN COULTER)用 FACS buffer 稀釋 100 倍添加到細胞中。于 4°C，培養(yǎng) 30 分鐘后，將其懸浮于以10 μ g/mL的濃度含有碘化丙錠(SIGMA)的FACS bufferIOOuL中，用 于流式細胞術。流式細胞術中，X軸前向散射光(forwad scatter)、Y軸側(cè)向散射光(side scatter)的散點圖，及X軸前向散射光(forwad scatter)、Y軸碘化丙錠的熒光(FL-3) 的散點圖中，用門圈出活細胞群體。如圖6所示，本發(fā)明的抗體與作為親本株的Ba/F3細胞不結(jié)合，與人CLDN6強制表 達Ba/F3細胞較強地結(jié)合，為人CLDN6特異性抗體。3-5.杭人CLDN6杭體對癌細胞J草表面卜.的人CLDN6的結(jié)合活t牛的測丨定識別人CLDN6的C末端細胞內(nèi)肽序列的多克隆抗體是已知的，但還不存在識別癌 細胞膜表面上的以天然形存在的人CLDN6的細胞外部分的抗體。因此，使用[實施例3-3] 中制作的本發(fā)明的抗人CLDN6單克隆抗體，利用流式細胞術評價上述抗體是否不僅識別人 CLDN6強制表達細胞株的細胞溶胞產(chǎn)物，實際上也識別癌細胞膜表面上的人CLDN6?；赱實施例1]、[實施例2]的基因及蛋白質(zhì)表達解析結(jié)果，使用肺腺癌細胞株 ABC-1、及胃癌細胞株AGS作為人CLDN6陽性癌細胞株。將懸浮于FACS buffer (0. 5% BSA、1 XPBS(-)、0· NaN3)中的 IX IO5 個各細胞 分別注入96孔U底板(FALCON 353910)中，添加各抗體，使最終濃度為10、1、0 μ g/mL，混合 后于4°C培養(yǎng)1小時。進行離心操作，抽吸除去反應液，通過添加200uL/孔的FACS buffer 清洗細胞，之后作為 2 次抗體將FITC標記Goat F(ab' )2 Fragment Anti-mouselgG(Fe γ ) (BECKMAN COULTER公司)用FACS buffer稀釋100倍添加到細胞中。于4°C，培養(yǎng)1小時 后，用與上述相同的FACS buffer進行清洗，懸浮于120uL FACS buffer中，用于流式細胞 術。流式細胞術中，在X軸前向散射光(forwad scatter)、Y軸側(cè)向散射光(side scatter)的散點圖中用門圈出活細胞群體。如圖7所示，[實施例3-3]中制作的抗體雖然因抗體不同而存在一定差異，但是 18種抗體均濃度依賴性地與人CLDN6表達癌細胞株即ABC-I、及AGS細胞結(jié)合。3-6.抗人CLDN6抗體的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)的測定利用鉻釋放法，研究本發(fā)明的抗人CLDN6單克隆抗體對肺腺癌細胞株ABC-I及胃 癌細胞株AGS的ADCC活性。將ABC-I或AGS接種于96孔板上，使其附著后，添加鉻51，繼 續(xù)培養(yǎng)幾小時。除去培養(yǎng)液，用培養(yǎng)液清洗細胞后，添加新的培養(yǎng)液。接著添加抗體，向各 孔中，添加與靶細胞相比約5倍量的效應細胞(重組細胞(日本專利申請2007-20155)， 使NK-92(ATCC，CRL-2407)中強制表達嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含小鼠Fc γ受體 3(ΝΜ_010188)的細胞外區(qū)域及人Y鏈(ΝΜ_004106)的跨膜區(qū)域和細胞內(nèi)區(qū)域)，在5%二 氧化碳培養(yǎng)箱中于37°C將板靜置4小時。靜置后將板離心，從各孔中回收一定量的上清液， 用Y計數(shù)器Wallac 1480測定放射活性，使用下式確定特異性鉻釋放率(％ )。特異性鉻釋放率(％) = (A-C) X 100/(B-C)
此處，A表示各孔中的放射活性，B表示用終濃度Nonidet P-40進行細胞溶解 釋放到培養(yǎng)基中的放射活性平均值，C表示僅添加培養(yǎng)基的情況下的放射活性平均值。結(jié)果，如圖8、圖9所示，試驗中使用的本發(fā)明的抗人CLDN6單克隆抗體中，特別是 AB3-l、AEl-16、AE49-ll、AE3-20、AC2-40 對 ABC-I 及 AGS 誘導產(chǎn)生非常強的 ADCC 活性。此 結(jié)果表示對以人CLDN6為靶的腫瘤的抗體治療非常有用。3-7.抗人CLDN6抗體的補體依賴件細胞毒件(⑶C)的測定利用鉻釋放法，研究抗人CLDN6單克隆抗體對肺腺癌細胞株ABC-I的CDC活性。 將ABC-I細胞接種于96孔板上，使其附著后，添加鉻-51，繼續(xù)培養(yǎng)幾小時。除去培養(yǎng)液， 用培養(yǎng)液清洗細胞后，添加新的培養(yǎng)液。接著向其中添加本發(fā)明的抗人CLDN6單克隆抗體 (AB3-1、AC2-40、AD12-47, AE1-16、AE2-4、AE3-20、AE49-11)及對照小鼠 IgGl 抗體(Cat-No. 553453， BD Biosciences Pharmingen)，使其終濃度為10 μ g/mL。接著添加幼兔補體 (Cat. No. CL3441，Cedarlane)，使其終濃度為25%、5%或者為1%。在5%二氧化碳培養(yǎng)箱 中于37°C將板靜置1.5小時。靜置后將板離心，從各孔中回收一定量的上清液，用Y計數(shù) 器Wallac 1480測定放射活性，與3_6同樣地求出特異性鉻釋放率(% )。結(jié)果，如圖10所示，試驗中使用的本發(fā)明的抗人CLDN6單克隆抗體中，特別是 AE1-16、AE3-20、AE49-11誘導產(chǎn)生強的⑶C活性。另一方面，作為對照使用的小鼠IgGl抗 體不顯示⑶C活性。3-8.使用Mab-ZAP的抗人CLDN6抗體的抗腫瘤效果評價使用Mab-ZAP (Advanced Targeting Systems 公司)評價以人 CLDN6 為靶的免疫 毒素是否可以顯示抗腫瘤活性。Mab-ZAP為山羊抗小鼠IgG的皂草毒蛋白(saporin)的標 記抗體。皂草毒蛋白為核糖體中以蛋白質(zhì)合成抑制為作用機制的蛋白質(zhì)性毒素。不是所有 抗體都適于制作免疫毒素，另外，已知作為免疫毒素如果包括藥效強的抗體，則也包括藥效 弱的抗體(非專利文獻 9 ;Kohls and Lappi, BioTechniques 2000,28(1) :162)。因此，使 用Mab-ZAP，評價此次獲得的18種抗人CLDN6抗體作為免疫毒素的潛力。使用肺腺癌細胞株ABC-1、及胃癌細胞株AGS作為靶癌細胞株。對于ABC-1，于第 0日在96孔板上以5X IO3細胞/100 μ L/孔進行接種，于第1日添加各種抗人CLDN6單克 隆抗體，使其最終濃度為100ng/200 μ L培養(yǎng)基/孔、或者Ong/200 μ L培養(yǎng)基/孔，接著添 加Mab-ZAP，使其最終濃度為100ng/200 μ L培養(yǎng)基/孔，于37°C在二氧化碳培養(yǎng)箱中進行 培養(yǎng)。于第9日以20 μ L/孔添加活細胞測定試劑SF (Nacalai Tesque)，于37°C在二氧化 碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30分鐘后，測定450nm 650nm的吸光度。對于AGS，于第0日在96孔板 上以IX IO3細胞/100 μ L/孔進行接種，于第1日添加各種抗人CLDN6單克隆抗體，使其最 終濃度為100ng/200 μ L培養(yǎng)基/孔、或0ng/200 μ L培養(yǎng)基/孔。接著，添加Mab-ZAP，使其 最終濃度為100ng/200 μ L培養(yǎng)基/孔，于37°C在二氧化碳培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。于第7日以 20 μ L/孔添加活細胞測定試劑SF (Nacalai Tesque公司)，于37°C在二氧化碳培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)30分鐘后，測定450nm 650nm的吸光度。關于ABC-I及AGS的結(jié)果分別示于圖11及圖12。單獨使用Mab-ZAP或者單獨使 用抗體均沒有觀察到抗腫瘤效果，相對于此，在AE1-16抗體或者AE49-11抗體與Mab-ZAP 共存的條件下，對ABC-I及AGS觀察到非常強的抗腫瘤效果。以上結(jié)果表明，以人CLDN6為靶的免疫毒素作為抗腫瘤劑非常有用。
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「t施例41 ^A CLDN6杭體可奪區(qū)某因序歹！丨的確定基于以上結(jié)果，在此次獲得的抗人CLDN6抗體中，選擇3種ADCC、⑶C，及在 Mab-ZAP共存條件下作為免疫毒素的抗腫瘤活性強的抗體(AB3-1、AE1-16、AE49-11、 AE3-20)，確定抗體可變區(qū)的核酸序列及氨基酸序列。培養(yǎng)產(chǎn)生各種抗體的雜交瘤，使用 RNeasy (QIAGEN公司)從IX IO6個細胞中純化總RNA。使用純化后的總RNA 1 μ g，使用 SMART RACE cDNA Amplification Kit (Clontech 公司)，和與小鼠 IgGl 恒定區(qū)序列互補 的合成寡核苷酸MHC-IgGl(序列號7)或者與小鼠IgG2b恒定區(qū)序列互補的合成寡核苷酸 MHC-IgG2b(序列號8)或者與小鼠κ鏈恒定區(qū)堿基序列互補的合成寡核苷酸mCKappaR(序 列號9)，從3種抗體H鏈、L鏈cDNA的恒定區(qū)的與上述寡核苷酸序列相當?shù)奈恢玫?’_cDNA 末端的序列進行PCR擴增。將擴增片段克隆到pTA2載體(Τ0Υ0Β0)上，確定cDNA序列。 AB3-1的H鏈可變區(qū)的堿基序列如序列號10所示，氨基酸序列如序列號11所示；L鏈可變 區(qū)的堿基序列如序列號12所示，氨基酸序列如序列號13所示。AE1-16的H鏈可變區(qū)的堿 基序列如序列號14所示，氨基酸序列如序列號15所示；L鏈可變區(qū)的堿基序列如序列號16 所示，氨基酸序列如序列號17所示。AE49-11的H鏈可變區(qū)的堿基序列如序列號18所示， 氨基酸序列如序列號19所示；L鏈可變區(qū)的堿基序列如序列號20所示，氨基酸序列如序列 號21所示。AE3-20的H鏈可變區(qū)的堿基序列如序列號36所示，氨基酸序列如序列號37所 示；L鏈可變區(qū)的堿基序列如序列號38所示，氨基酸序列如序列號39所示。另外，上述可變區(qū)的⑶R的氨基酸序列示于下表。[表1]
「實施例51抗人CLDN6單克降抗體對人CUMl、CLDN3、CLDN4、CLDN9分子的結(jié)合活性評價針對[實施例4]中確定了可變區(qū)氨基酸序列的4種抗人CLDN6單克隆抗體 (ΑΒ3-1、ΑΕ1-16、ΑΕ49-11、ΑΕ3-20)對人 CLDW、CLDN3、CLDN4、CLDN9 分子的結(jié)合活性，通過 制作各分子的強制表達Ba/F3細胞株，調(diào)節(jié)抗體濃度，根據(jù)流式細胞術，進行評價。將懸浮于FACS buffer (0.5% BSA、1XPBS(-)、0· NaN3)中的 IX IO5 個細胞 分別注入96孔U底板(FALCON 353910)中，添加各抗體，使最終濃度為10、2、0· 4、0· 08、 0 μ g/mL,混合后于4°C培養(yǎng)1小時。進行離心操作，通過抽吸除去反應液，以200uL/孔添加 FACSbuffer清洗細胞，之后作為 2次抗體將FITC標記Goat F(ab' )2 FragmentAnti-mouse IgG(Fcy) (BECKMAN COULTER)用 FACS buffer 稀釋 100 倍添加到細胞中。于 4°C培養(yǎng) 30 分鐘后，用與上述相同的FACSbuffer進行清洗，將其懸浮于以10 μ g/mL的濃度含有碘化丙錠(SIGMA)的FACS buffer IOOuL中，用于流式細胞術。流式細胞術中，在X軸前向散射光(forwad scatter)、Y軸側(cè)向散射光(side scatter)的散點圖，及X軸前向散射光(forwad scatter)、Y軸碘化丙錠的熒光(FL-3) 的散點圖中，用門圈出活細胞群體。如表2所示，本發(fā)明的抗體即ΑΕ3-20為與人CLDN6基本特異性結(jié)合的抗體， ΑΕ1-16及ΑΕ49-11為與人CLDN9中等程度交叉反應的抗體、與人CLDN4弱交叉反應的抗體， ΑΒ3-1為與人CLDN9交叉反應的抗體。[表 2] 「61誦i寸免染盧,檢測丨肺腺中的CLDN6利用免疫組織染色，對肺腺癌組織中的CLDN6蛋白質(zhì)表達以及在癌細胞膜上的局 部存在進行確認。在免疫組織染色中，使用從肺腺癌臨床組織中提取的總RNA，首先根據(jù)實 時PCR對CLDN6轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行定量，采用CLDN6轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物高度表達的病例。用4% PFA固 定冷凍切片，采用通常的 LSAB 法，使用 Ventana HX Discovery System(Ventana Medical Systems公司)進行免疫組織染色。免疫組織染色中的1次抗體以12. 5 μ g/mL使用山羊抗 CLDN6多克隆抗體(Santa Cruz公司Code No. sc-17669 Lot. H2605)。結(jié)果在肺腺癌組織 中，確認細胞膜及細胞質(zhì)內(nèi)為陽性反應。另一方面，在非腫瘤組織中，確認巨噬細胞、II型 肺泡上皮及細支氣管上皮處為陽性反應，但染色強度均輕微，沒有確認到在腫瘤組織中確 認的對細胞膜的陽性反應。肺腫瘤組織中的細胞膜的染色強度高于正常肺組織。本發(fā)明首 次公開了以人腫瘤組織的細胞膜中的蛋白質(zhì)水平的表達檢測[實施例7]抗CLDN6抗體的抗腫瘤活性評價AE49-11抗體的抗腫瘤活性的評價AE49-11抗體的亞類為IgG2b，在目前研究中，有報道稱IgG2a的ADCC活性較強 (非專利文獻[10]、[11])，所以為了增強藥效，構筑表達AE49-11抗體(稱作“AE49-11/ mIgG2a”)，H鏈氨基酸序列(序列號[52] )、L鏈氨基酸序列(序列號[53])的載體，用 CH0-DG44細胞進行表達、純化，所述AE49-11抗體將抗體的Fc區(qū)轉(zhuǎn)化為IgG2a。用流式細 胞術可以確認此AE49-ll/mIgG2a抗體的結(jié)合活性與原來的IgG2b抗體基本等同，使用此抗 體，如下所述地進行體內(nèi)抗腫瘤實驗。(I)PA-I皮下移植模型將PA-I 細胞用 Hanks' Balanced Salt Solution(HBSS)調(diào)制為 5X IO7 細胞 /ml,將200 μ 1該PA-I細胞移植到于前一日腹腔內(nèi)給與了 100 μ 1抗脫唾液酸GMl抗體(和光 純藥公司、將1小瓶用Iml注射用蒸餾水溶解后，添加4ml生理鹽水)的SCID小鼠(雌、9 周齡，日本Charles River公司)的腹部皮下。從移植后第23日每周1次通過尾靜脈給與 AE49-ll/mIgG2a抗體，共4周。將抗體用生理鹽水調(diào)制成5mg/ml以50mg/kg進行給與。作 為陰性對照，同樣地給與生理鹽水(載體)。以1組5只進行試驗。用腫瘤體積來評價抗腫 瘤活性。腫瘤體積(mm3)、腫瘤體積變化量及腫瘤增殖抑制效果(％)如下所述地算出。腫瘤體積(mm3)=腫瘤長徑X腫瘤短徑X腫瘤短徑X 1/2腫瘤體積變化量(mm3)=測定時的腫瘤體積-給與開始時的腫瘤體積腫瘤增殖抑制率(％ ) = {1_(給與藥物組的腫瘤體積變化量的平均值/給與載體 組的腫瘤體積變化量的平均值)} X100試驗結(jié)果，AE49-ll/mIgG2a抗體在50mg/kg給與組中相對于載體給與組顯示出抑 制腫瘤增殖的傾向。給與開始1、2、3、4周后的腫瘤增殖抑制率為49.5%、31. 1%,29.9%, 17.9%,給與開始早期觀察到腫瘤增殖抑制效果強的傾向。(2)NUGC_3皮下移植模型接著，研究NUGC-3皮下移植模型的藥效。進行此模型中的藥效試驗時，使用下述 抗體(低巖藻糖型AE49-ll/mIgG2a抗體)進行藥效試驗，所述抗體是在敲除了巖藻糖轉(zhuǎn)運 體的CH0-DXB11S細胞中表達、純化AE49-ll/mIgG2a抗體得到的。將NUGC-3 細胞用 Hanks'Balanced Salt Solution(HBSS)調(diào)制成 5 X IO7 細胞/ml， 將200 μ 1該NUGC-3細胞移植到SCID小鼠(雌、12周齡，日本Charles River公司)的腹 部皮下。于移植后第11日按腫瘤體積和體重分為2組，于移植后第11日、第17日、第24日 通過尾靜脈給與各組低巖藻糖型AE49-ll/mIgG2a抗體和載體。將抗體用載體調(diào)制成5mg/ ml，以50mg/kg進行給與。載體使用下述溶液，所述溶液以elution buffer為D-PBS (-)，用 PD-10柱將IOOmM甘氨酸(pH 2. 7)和其1/10量的IM Tris-HCl(pH 9. 0)的混合溶液進行 buffer置換，將所得溶液進行0. 22 μ m過濾器滅菌。以1組8只進行試驗。用延長壽命效果來評價抗腫瘤活性。試驗結(jié)果表明，低巖藻糖型AE49-ll/mIgG2a抗體相對于載體給與組具有延長壽 命效果。以上結(jié)果暗示了抗CLDN6抗體在人臨床上可能顯示抗腫瘤活性。產(chǎn)生上的可利用性本發(fā)明的抗CLDN6抗體作為抗體藥物、特別是作為細胞生長抑制劑及抗癌劑有用。將本說明書中引用的全部出版物、專利及專利申請直接作為參考引入本說明書 中。
3權利要求
一種抗體，與在細胞膜上表達的Claudin6(CLDN6)結(jié)合。
2.一種抗CLDN6抗體，具有細胞毒性。
3.如權利要求1或2所述的抗CLDN6抗體，具有ADCC活性。
4.如權利要求1或2所述的抗CLDN6抗體，具有⑶C活性。
5.如權利要求1 4中任一項所述的抗CLDN6抗體，其特征在于，結(jié)合有細胞毒性物質(zhì)。
6.以下(a) (j)中任一項所述的抗體(a)抗體，包含重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)具有包含序列號24表示的氨基酸序列的 CDRl、包含序列號25表示的氨基酸序列的CDR2、包含序列號26表示的氨基酸序列的CDR3 ；(b)抗體，包含輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)具有包含序列號27表示的氨基酸序列的 CDRl、包含序列號28表示的氨基酸序列的CDR2、包含序列號29表示的氨基酸序列的CDR3 ；(c)抗體，包含(a)所述的重鏈可變區(qū)及(b)所述的輕鏈可變區(qū)；(d)抗體，包含重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)具有包含序列號30表示的氨基酸序列的 CDRl、包含序列號31表示的氨基酸序列的CDR2、包含序列號32表示的氨基酸序列的CDR3 ；(e)抗體，包含輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)具有包含序列號33表示的氨基酸序列的 CDRl、包含序列號34表示的氨基酸序列的CDR2、包含序列號35表示的氨基酸序列的CDR3 ；(f)抗體，包含(d)所述的重鏈可變區(qū)及(e)所述的輕鏈可變區(qū)；(g)抗體，包含重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)具有包含序列號40表示的氨基酸序列的 CDR1、包含序列號41表示的氨基酸序列的CDR2、包含序列號42表示的氨基酸序列的CDR3 ；(h)抗體，包含輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)具有包含序列號43表示的氨基酸序列的 CDRl、包含序列號44表示的氨基酸序列的CDR2、包含序列號45表示的氨基酸序列的CDR3 ；(i)抗體，包含(g)中所述的重鏈可變區(qū)及(h)中所述的輕鏈可變區(qū)；(j)抗體，識別與(a) ⑴中任一項所述的抗體所識別的抗原決定部位相同的抗原決 定部位。
7.一種藥物組合物，含有抗CLDN6抗體。
8.如權利要求7所述的藥物組合物，為細胞生長抑制劑。
9.如權利要求8所述的藥物組合物，為抗癌劑。
10.如權利要求7 9中任一項所述的藥物組合物，其特征在于，含有權利要求1 6 中任一項所述的抗體。
11.一種方法，是診斷癌癥的方法，包括下述步驟(a)步驟，提供從受試者采取的試樣；(b)步驟，檢測(a)的試樣中所含的CLDN6蛋白質(zhì)。
12.如權利要求11所述的方法，其特征在于，用抗CLDN6抗體檢測CLDN6蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種與細胞膜上表達的Claudin6(CLDN6)結(jié)合的抗體。本發(fā)明的抗體識別在細胞膜上以天然形存在的人CLDN6，對高度表達人CLDN6的癌細胞株顯示出由ADCC及/或CDC活性產(chǎn)生的細胞毒性。另外，本發(fā)明的抗體通過與毒素結(jié)合對人CLDN6高度表達癌細胞株顯示出細胞生長抑制作用。由于人CLDN6在正常組織中沒有確認到其表達，而在腫瘤組織(肺腺癌、胃癌、卵巢癌)中表達亢進，所以推測抗CLDN6抗體高度聚集在人CLDN6高度表達的腫瘤中，可以成為非常有效的抗腫瘤劑。
文檔編號C07K16/28GK101918450SQ20098010196
公開日2010年12月15日 申請日期2009年1月9日 優(yōu)先權日2008年1月11日
發(fā)明者作本裕史, 堤修一, 川合重人, 油谷浩幸, 西村邦裕 申請人:國立大學法人東京大學;株式會社未來創(chuàng)藥研究所