專利名稱：穩(wěn)定蛋白和多肽的方法
穩(wěn)定蛋白和多肽的方法修飾且特別是穩(wěn)定蛋白和多肽的方法，通過(guò)該方法將預(yù)先確定的氨基酸引入至所 述蛋白或多肽的選擇位置中以產(chǎn)生一小組突變體。該方法基于以下的前提，即，某些氨基酸 在蛋白或多肽的穩(wěn)定性方面具有關(guān)鍵的作用。然后可以進(jìn)一步分析生成的突變體的穩(wěn)定 性和/或功能，例如，親和性。此外，可以組合適當(dāng)?shù)耐蛔凅w以產(chǎn)生進(jìn)一步優(yōu)化的蛋白或多 肽。另外，提供了被穩(wěn)定的實(shí)例多肽和適當(dāng)?shù)蔫b定和/或分析失穩(wěn)或穩(wěn)定的蛋白或多肽的 方法。該方法可用來(lái)研究特定氨基酸在蛋白結(jié)構(gòu)和功能中的作用和用來(lái)開(kāi)發(fā)新的或改善 的，例如穩(wěn)定的蛋白和多肽諸如抗體和單可變結(jié)構(gòu)域。隨機(jī)化誘變或其他用于蛋白穩(wěn)定的策略受到一些限制。包括在這些限制中的有， 可以產(chǎn)生大量的突變體，在實(shí)踐中不能從這些突變體中選擇將是提供信息的或具有所需特 性的突變體。例如，沒(méi)有可靠的方式來(lái)預(yù)測(cè)蛋白或多肽中特定氨基酸的置換、缺失或插入是 否將對(duì)蛋白/多肽具有局部或整體的效應(yīng)，并且因此是否有可能產(chǎn)生有用的信息或功能。 即使突變限于蛋白的某些區(qū)域，諸如蛋白的活性或結(jié)合位點(diǎn)處的區(qū)域或其周圍，潛在突變 的數(shù)目可以是非常大的，使得難以或不可能以合理的方式鑒定和評(píng)價(jià)產(chǎn)生的這些突變。例 如，單氨基酸位點(diǎn)被所有其他的天然存在的氨基酸置換產(chǎn)生19種不同的蛋白變異體。如果 幾個(gè)位點(diǎn)一次被置換，則變異體的數(shù)目指數(shù)性地增加。對(duì)于在蛋白的10個(gè)氨基酸位點(diǎn)用所 有氨基酸的置換，產(chǎn)生蛋白的19x 19x 19x 19x 19x 19x 19x 19x 19x 19或6.1 χ IO12個(gè) 變異體，有用的突變體必須從其中選擇。由此得出結(jié)論，為了有效地在蛋白的穩(wěn)定中利用誘 變，突變的類型和數(shù)目必須進(jìn)行接受一些限制性標(biāo)準(zhǔn)，這些標(biāo)準(zhǔn)使生成的突變蛋白的數(shù)目 保持在適于分析的數(shù)目。本發(fā)明涉及一種用于生成新的或穩(wěn)定的蛋白(或多肽)的選擇或誘變的方法，以 及由該方法生成的突變蛋白和特定突變蛋白的文庫(kù)。誘變的目標(biāo)蛋白、肽或多肽可以是天 然的、合成的或改造的蛋白、肽或多肽，例如，抗體，單可變結(jié)構(gòu)域諸如納米抗體或dAbs，包 含一個(gè)或多個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域的多肽或變異體(例如，突變體)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法 包括將預(yù)先確定的氨基酸引入至蛋白的氨基酸序列的預(yù)先規(guī)定的氨基酸(或幾個(gè)氨基酸) 的各個(gè)位置和每個(gè)位置中。突變體可以是a)單個(gè)地生成并且因此被單獨(dú)地加工和/或評(píng) 價(jià)，或b)可生成蛋白文庫(kù)，其含有在一個(gè)或多個(gè)預(yù)先規(guī)定的氨基酸位置以及從整體上在每 個(gè)位置中具有預(yù)先確定的氨基酸的突變蛋白。該方法允許系統(tǒng)地評(píng)價(jià)特定氨基酸在蛋白， 例如，抗體或單可變結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定中的作用。本發(fā)明鑒定出在保存期間生成的蛋白例如抗體或單可變結(jié)構(gòu)域的一些主要變體 是如下的結(jié)果i.典型地僅在“可接近的”甲硫氨酸中發(fā)生的(多個(gè))氧化作用事件(如果僅有 一個(gè)氧化事件則為+16Da變異體)，其中在保存期間氧化作用隨著溫育溫度和時(shí)間平行地 增加，ii.如果存在，El的環(huán)化作用，導(dǎo)致焦谷氨酸的形成，以及iii.天冬氨酸或天冬酰胺的異構(gòu)化或脫酰胺作用，例如，在DG，DS, NG或NS基序 中，其中在保存期間異構(gòu)化作用隨著溫育溫度和時(shí)間平行地增加。
本發(fā)明利用此觀察結(jié)果并且提供了一種便利的方法以集中于這些可能的不穩(wěn)定 的“來(lái)源”并且使用此信息來(lái)選擇先導(dǎo)候選物，或生成a)進(jìn)一步被穩(wěn)定的蛋白、抗體或單可 變結(jié)構(gòu)域的單個(gè)突變體，其可通過(guò)定向誘變來(lái)提供，或b)突變蛋白、抗體或單可變結(jié)構(gòu)域 的文庫(kù)，其可通過(guò)合成編碼針對(duì)含有預(yù)先確定的氨基酸的區(qū)域設(shè)計(jì)的氨基酸序列的所有變 異的寡核苷酸的單一混合物來(lái)生成。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，通過(guò)在合成的各個(gè)縮合步驟 中摻入要被誘變的序列(例如，野生型序列)的核苷酸和所述預(yù)先確定的氨基酸的密碼子 所需的核苷酸而合成此寡核苷酸混合物。在被誘變的序列的核苷酸與所述預(yù)先確定的氨基 酸的核苷酸相同時(shí)，不加入額外的核苷酸(還參見(jiàn)，例如W09115581)。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，提供了預(yù)先規(guī)定的氨基酸來(lái)替換所述被鑒定的蛋 白、多肽、抗體或單可變結(jié)構(gòu)域的不穩(wěn)定“來(lái)源”，例如，通過(guò)選擇性誘變，以及隨后對(duì)所述蛋 白、多肽、抗體、或單可變結(jié)構(gòu)域的例如功能、例如結(jié)合特性的分析而進(jìn)行。此誘變方法可用來(lái)生成小的突變蛋白或文庫(kù)組，其具有用于篩選例如結(jié)合親和力 的實(shí)用的大小。該方法可用來(lái)研究特定氨基酸在蛋白穩(wěn)定性和功能中的作用以及開(kāi)發(fā)新的 或穩(wěn)定的蛋白和多肽諸如酶、抗體、其結(jié)合片段或類似物、單鏈抗體、單可變結(jié)構(gòu)域、納米抗 體 、dAbs、單結(jié)構(gòu)域抗體和催化抗體。發(fā)明詳述蛋白的研究已經(jīng)揭示，某些氨基酸在其穩(wěn)定性和功能中具有關(guān)鍵的作用。例如，似 乎僅有不定數(shù)目的氨基酸參與了酶的催化事件或抗體的結(jié)合。盡管明確某些氨基酸特別易于去穩(wěn)定，如果可能，也難以明確地預(yù)測(cè)氨基酸必須 占用哪個(gè)(或哪些)位置以具有此類效應(yīng)。不幸地是，對(duì)蛋白中氨基酸側(cè)鏈的復(fù)雜空間構(gòu) 型和例如抗體的構(gòu)架或CDR區(qū)內(nèi)的不同側(cè)鏈的相互關(guān)系的理解不足以進(jìn)行此類預(yù)測(cè)。如上 面所指出的，鑒于在甚至很小的蛋白、肽或多肽中可能的變異的龐大數(shù)目，隨機(jī)化誘變對(duì)于 研究蛋白穩(wěn)定性和功能的實(shí)用性有限。本發(fā)明的方法提供了一種系統(tǒng)的和實(shí)用的方式用于評(píng)價(jià)特定氨基酸以及它們?cè)?蛋白的規(guī)定區(qū)域內(nèi)的位置對(duì)蛋白的穩(wěn)定性和功能的重要性，以及用于產(chǎn)生有用的，例如穩(wěn) 定的蛋白。該方法首先假設(shè)某些預(yù)先確定的氨基酸對(duì)于蛋白，例如抗體的特殊穩(wěn)定性是重 要的(參見(jiàn),例如 AA Wakankar 等，2007，Biochemistry (生物化學(xué))，46，1534-1544 對(duì)天冬 氨酸在抗體的CDR區(qū)中的異構(gòu)化的研究)。使用預(yù)先確定的氨基酸的選擇，通過(guò)將預(yù)先確定的氨基酸摻入至蛋白的各個(gè)選擇 的氨基酸位點(diǎn)而生成要研究的蛋白的突變體文庫(kù)。如在表B-2中所列舉的，根據(jù)本發(fā)明所 提議的法則來(lái)生成不同的突變體。專業(yè)技術(shù)人員理解，這是本文所述所有實(shí)施方案的普遍方面，即在選擇適當(dāng)?shù)陌?基酸以替換所選擇的殘基時(shí)，可以采用另外的考慮，例如，降低多肽包括納米抗體或Dabs 的免疫原性。例如，在納米抗體的情況下，其可以有利地選擇用于替換M(或如本文所討論 的任何其他的殘基或基序)的氨基酸，其存在人構(gòu)架區(qū)的相應(yīng)位置中。對(duì)于其他的參考文 獻(xiàn)，專業(yè)技術(shù)人員也可考慮WO 2009/004065和/或WO 2009/004066的教導(dǎo)。突變蛋白的文庫(kù)包含在被設(shè)計(jì)用于替換的每個(gè)選擇的氨基酸處具有預(yù)先確定的 氨基酸的單個(gè)蛋白。相對(duì)于例如通過(guò)完全隨機(jī)突變或例如“預(yù)排(walk through)”突變生 成的突變體文庫(kù)，所述蛋白文庫(kù)將具有包含具有提高的穩(wěn)定性并且保留了功能活性的突變體的較高可能性。因此，所需類型的突變濃縮在文庫(kù)中。這是重要的，因?yàn)槠湓试S更快地和 更詳細(xì)地分析在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間范圍內(nèi)生成的突變體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，預(yù)先確定的氨基酸(例如，替換被鑒定的可能具有不穩(wěn)定 性的氨基酸的其他天然存在的19個(gè)氨基酸之一)替換蛋白的DG，DS, NG或NS基序中的 已鑒定的氨基酸，其中所述基序暴露于溶劑，例如，此類已鑒定的氨基酸基序可見(jiàn)于抗體的 CDR中。優(yōu)選預(yù)先確定的氨基酸選自Q，E的組，如果D或N要被替換則優(yōu)選E，或如果S或 G要被替換則優(yōu)選T或A。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，預(yù)先確定的被替換的氨基酸，例如其他 天然存在的19個(gè)氨基酸之一，替換已鑒定的甲硫氨酸，優(yōu)選所述甲硫氨酸對(duì)強(qiáng)制氧化作用 敏感，并且優(yōu)選所述預(yù)先確定的氨基酸氨基選自由A和T組成的氨基酸的組。在進(jìn)一步的 實(shí)施方案中，預(yù)先確定的氨基酸，例如，其他天然存在的19個(gè)氨基酸之一，優(yōu)選D，替換末端 的E(如果存在的話)。基于被誘變分子和/或所需結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)信息或建模的其他考慮可進(jìn) 一步用來(lái)使誘變的候選位置的子集有組織或縮小。此外，通過(guò)某些已鑒定位點(diǎn)的丙氨酸篩 選可快速地鑒定對(duì)要被穩(wěn)定的蛋白的功能特性關(guān)鍵的氨基酸。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，來(lái) 自不同突變體的知識(shí)可組合在一起，并且可生成具有一個(gè)以上的誘變氨基酸(與該方法開(kāi) 始所使用的原始蛋白相比)的突變體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了使蛋白(諸如，例如包含單可變結(jié)構(gòu)域的多 肽)的穩(wěn)定性以下列的方式被改變的方法，即這些蛋白被特異性地穩(wěn)定，去穩(wěn)定或可在去 穩(wěn)定措施后再穩(wěn)定。假定，所需效應(yīng)是使蛋白去穩(wěn)定(例如，短的體內(nèi)半衰期是很重要的， 例如，對(duì)于功能性地參與到凝血中的分子是很重要的)，本發(fā)明的方法基本上被反向進(jìn)行。 簡(jiǎn)言之，在適當(dāng)?shù)膮^(qū)域中引入去穩(wěn)定的氨基酸基序諸如DG，DS, NG或NS，S卩，非功能性的， 例如，對(duì)于抗體來(lái)說(shuō)，不直接地參與到結(jié)合中的區(qū)域，或替換例如，適當(dāng)?shù)?，即暴露于溶劑?DG, DS, NG或NS基序。優(yōu)選地任何此類突變體不喪失關(guān)鍵的生物學(xué)功能性，諸如，例如，抗 體的親和力或酶的催化活性。文庫(kù)的大小將依賴于被誘變的氨基酸的數(shù)目而變化。優(yōu)選的，文庫(kù)將被設(shè)計(jì)含有 小于50個(gè)突變體，和更優(yōu)選小于40個(gè)，更優(yōu)選小于30個(gè)，更優(yōu)選小于20個(gè)，更優(yōu)選小于10 個(gè)突變體。在另一種方式中，目的基因存在于單鏈質(zhì)粒上。例如，基因可被克隆進(jìn)M13噬菌體 載體或具有絲狀噬菌體復(fù)制起點(diǎn)的載體中，這些載體使用輔助噬菌體而允許單鏈分子的擴(kuò) 增。單鏈模板可與一組簡(jiǎn)并探針復(fù)性。探針可被延伸和連接，因此將各個(gè)變體鏈摻入至一 群分子中，這些分子可被引入至適當(dāng)?shù)乃拗髦?Sayers，J. R.等，Nucleic Acids Res.(核 酸研究)16 :791-802(1988))。此方式可繞開(kāi)其中選擇多個(gè)結(jié)構(gòu)域用于誘變的多個(gè)克隆步 馬聚ο聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法學(xué)也可用來(lái)將簡(jiǎn)并寡核苷酸摻入至基因中。例如，簡(jiǎn) 并寡核苷酸本身可用作延伸的引物。在此實(shí)施方案中，A和B是編碼誘變盒或“窗”的簡(jiǎn)并寡核苷酸，并且這些窗彼此 互補(bǔ)(寡聚體的Z型部分代表簡(jiǎn)并部分)。A和B也含有與3'端上用于擴(kuò)增的模板互補(bǔ) 的野生型序列并且因此是能夠生成摻入窗的擴(kuò)增引物。C和D是可擴(kuò)增整條基因或目的 區(qū)域的寡核苷酸，包括摻入了誘變窗的那些寡核苷酸(Steffan，N. H.等，Gene (基因)77 51-59 (1989))。從A和B擴(kuò)增的延伸產(chǎn)物可通過(guò)它們的互補(bǔ)窗雜交，并且提供用于使用C和D作為引物產(chǎn)生全長(zhǎng)分子的模板。C和D可被設(shè)計(jì)為含有用于克隆的方便位點(diǎn)。然后擴(kuò) 增的片段可被克隆。通過(guò)上面技術(shù)或其他適當(dāng)技術(shù)的任意一種生成的突變體文庫(kù)可被篩選以鑒定具 有所需穩(wěn)定性和活性的突變體。篩選可通過(guò)任何適當(dāng)?shù)姆绞絹?lái)完成。例如，可通過(guò)適當(dāng)?shù)?測(cè)定來(lái)確定親和力，所述測(cè)定例如，BiaCore測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)免疫測(cè)定和/或親和層析。本發(fā)明的方法可用來(lái)穩(wěn)定蛋白，所述蛋白根據(jù)本發(fā)明被鑒定為具有可能的不穩(wěn)定 源。前面的記載集中在蛋白，但應(yīng)該理解的是該方法適用于多肽、抗體、包含單可變結(jié)構(gòu)域 的多肽諸如納米抗體和dAbs以及多亞基蛋白。被提議在野生型蛋白中通過(guò)本發(fā)明的方法 誘變的氨基酸可以多于一個(gè)，并且優(yōu)選地不影響野生型蛋白的其他特性。通常，研究的區(qū)域?qū)⑹堑鞍椎墓δ芙Y(jié)構(gòu)域諸如結(jié)合或催化結(jié)構(gòu)域。例如，該區(qū)域可 以是免疫球蛋白的超變區(qū)(互補(bǔ)決定區(qū)或CDR)、酶的催化位點(diǎn)或結(jié)合結(jié)構(gòu)域。如所提及的，如果氨基酸已知或被認(rèn)為參與到穩(wěn)定性而非目的功能中，則選擇 用于誘變的氨基酸通常從那些已知的氨基酸中選擇。僅就其側(cè)鏈而言，20種天然存在的 氨基酸是不同的。各條側(cè)鏈負(fù)責(zé)化學(xué)特性，使各種氨基酸變得獨(dú)特。對(duì)于綜述，參見(jiàn)G. E. Schulz 和 R.M. Schirner 的 Principles of Protein Structure (蛋白結(jié)構(gòu)原理)，1988， Springer-Verlag0從側(cè)鏈的化學(xué)特性來(lái)看，似乎僅有選擇數(shù)目的天然氨基酸優(yōu)先地參與到催化事件 中。這些氨基酸屬于極性和中性氨基酸的組，諸如Ser，Thr, Asn, Gin, TyrJP Cys，帶電荷 氨基酸的組，Asp和Glu，Lys和Arg，并且特別是氨基酸His。典型的極性和中性側(cè)鏈?zhǔn)荂yS，Ser，Thr，ASn，Gln和Tyr的那些側(cè)鏈。Gly也被認(rèn) 為是此組的臨界成員。Ser和Thr在形成氫鍵中具有重要作用。Thr在β碳處具有額外的 不對(duì)稱性，因此僅使用其中一個(gè)立體異構(gòu)體。酰胺酸Gln和Asn也可形成氫鍵，酰氨基作為 氫供體起作用，羰基作為接受體起作用。Gln比Asn多一個(gè)CH. sub. 2基團(tuán)，其使極性基團(tuán)更 為柔性，并且減少其與主鏈的相互作用。Tyr具有非常極性的羥基(酚的0H)，其可在高pH 值下解離。Tyr表現(xiàn)得有點(diǎn)類似帶電荷側(cè)鏈；其氫鍵比較強(qiáng)。在表面處以及蛋白分子內(nèi)可見(jiàn)中性的極性酸。作為內(nèi)部殘基，它們通常彼此或與 多肽主鏈形成氫鍵。Cys可形成二硫鍵。組氨酸(His)具有雜環(huán)芳族側(cè)鏈，其pK值為6.0。在生理性pH范圍內(nèi)，在從溶液 中攝取氫離子后，其咪唑環(huán)可以是不帶電或帶電的。因?yàn)檫@兩種狀態(tài)很容易達(dá)到，His十分 適合用于催化化學(xué)反應(yīng)。其見(jiàn)于大多數(shù)的酶的活性中心中。在生理性pH下Asp和Glu是帶負(fù)電荷的。因?yàn)槠鋫?cè)鏈短，相對(duì)于主鏈Asp的羧基 比較剛性。這可能是為什么在許多催化位點(diǎn)中的羧基由Asp提供而非由Glu的原因。在蛋 白的表面處通常可見(jiàn)帶電荷的酸。另外，Lys和Arg見(jiàn)于表面處。它們具有長(zhǎng)的和柔性的側(cè)鏈。在周圍溶液中擺動(dòng)， 它們?cè)黾拥鞍浊驙铙w的溶解度。在一些情況下，Lys和Arg參與形成內(nèi)部鹽橋或它們協(xié)助 催化。因?yàn)樗鼈儽┞对诘鞍椎谋砻嫣?，Lys是較常被酶攻擊的殘基，酶修飾側(cè)鏈或在Lys殘 基的羰基端處裂解肽鏈。為了向一個(gè)區(qū)域中引入對(duì)催化性重要的氨基酸的目的，本發(fā)明優(yōu)先地涉及一種誘 變，其中預(yù)先確定的氨基酸是下列氨基酸組中的一種Ser，Thr, Asn, Gin, Tyr, Cys, His,Glu, Asp, Lys和Arg。然而，為了改變結(jié)合或產(chǎn)生新的親和力的目的，可選擇20種天然存在 的氨基酸的任意一種。重要的是，蛋白的幾種不同的氨基酸可被同時(shí)或順序地誘變。相同的或不同的氨 基酸可在可能的不穩(wěn)定源的各個(gè)已鑒定的氨基酸位點(diǎn)中“預(yù)排”，并且檢查它們保留或不保 留功能，例如結(jié)合特性。本發(fā)明的方法開(kāi)啟了設(shè)計(jì)不同類型的穩(wěn)定蛋白的新的可能性。新的結(jié)構(gòu)可通過(guò)本 發(fā)明的方法僅突變相關(guān)的氨基酸而構(gòu)建在已有蛋白的天然“支架”上。本發(fā)明的方法特別地用于修飾抗體分子。如本文所使用，抗體分子或抗體是指抗 體或其部分，諸如全長(zhǎng)抗體，F(xiàn)v分子或其他抗體片段，其單個(gè)鏈或片段(例如，F(xiàn)v的單鏈)， 單鏈抗體，單可變結(jié)構(gòu)域諸如納米抗體或dAbs和嵌合抗體。本發(fā)明的方法所提議的改變可 引入至抗體的可變區(qū)和/或構(gòu)架(恒定)區(qū)中?？勺儏^(qū)的修飾可產(chǎn)生具有較好穩(wěn)定性而且 具有較好的抗原結(jié)合性以及催化性的抗體。本發(fā)明的方法特別適于設(shè)計(jì)包含單可變結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定多肽，以及所述包含穩(wěn)定的 單可變結(jié)構(gòu)域諸如納米抗體 、結(jié)構(gòu)域抗體、單結(jié)構(gòu)域抗體、“dAb”或其格式化形式的多肽， 例如包含具有多價(jià)或多聚體結(jié)合特性的納米抗體和/或dAbs的多肽在診斷學(xué)和/或治療 學(xué)中的新用途。包含單可變結(jié)構(gòu)域的多肽在診斷學(xué)和治療學(xué)中的應(yīng)用是一個(gè)正在快速擴(kuò)張的領(lǐng) 域，并且關(guān)于所述包含單可變結(jié)構(gòu)域的多肽的研究正在特別地關(guān)注延長(zhǎng)藥物的體內(nèi)半衰期 以及獲得藥物在較高溫度下(例如室溫以上)規(guī)章可批準(zhǔn)的長(zhǎng)期保存性的可能性。天然單可變結(jié)構(gòu)域諸如例如來(lái)源于美洲駝(Llamas)的納米抗體，或遺傳改造的 駱駝源化dAbs沒(méi)有為長(zhǎng)期保存穩(wěn)定性和/或長(zhǎng)期體內(nèi)功效而優(yōu)化，因此它們中的至少一些 可能仍然是去穩(wěn)定的，盡管它們通常被認(rèn)為比常規(guī)抗體更穩(wěn)定，即，它們不夠穩(wěn)定以適應(yīng)規(guī) 章所要求的特定溫度下的保存時(shí)間或在機(jī)體溫度下在體內(nèi)延長(zhǎng)的半衰期。因此，在本領(lǐng)域中存在著鑒定包含此類單可變結(jié)構(gòu)域的多肽中可能的不穩(wěn)定源并 且找到修飾所述多肽的方法的需求，例如使所述多肽穩(wěn)定或去穩(wěn)定的方法的需求。本發(fā)明 特別地集中在通過(guò)氨基酸序列的特定突變來(lái)修飾所述包含單可變結(jié)構(gòu)域的多肽的方法，例 如使所述多肽穩(wěn)定或去穩(wěn)定的方法。類似于如上所討論的基本原理，本發(fā)明的方法提供了下列主要策略的一種或多種 來(lái)達(dá)到包含至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域的多肽的修飾的，例如改善的或降低的穩(wěn)定性模式a) 避免Asp (D) ^P Asn(N)的異構(gòu)化，即，檢查存在Asp (D) ^P Asn(N)的序列，特別是單可變結(jié) 構(gòu)域的 CDR 中的 Asp-Gly (DG)，Asp-Ser (DS)，Asn-Gly (NG)和 Asn-Ser (NS)，并且用其他氨 基酸替換Asp和/或Asn，使得保留至少一種生物活性，例如，親和力，例如，用另一個(gè)氨基 酸諸如Glu (E)或Gln (Q)替換相關(guān)的Asp和/或Asn ；b)避免Met的氧化，例如，檢查對(duì)氧 化特別是強(qiáng)制氧化敏感的Met，并且如果不能抵抗氧化或強(qiáng)制氧化，則用其他的氨基酸替換 Met,使得保留至少一種生物活性，例如，親和力，例如，用其他氨基酸諸如例如Ala或Thr替 換相關(guān)的Met ；和/或c)避開(kāi)或通過(guò)備選的N-末端，例如Asp替換N-末端Glu。在包含至 少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域的多肽應(yīng)該被去穩(wěn)定，例如，用于急性和/或局部治療并且其中僅需 要短期功效，例如，在手術(shù)期間增加凝血的情況下，上述策略可反向使用，例如，通過(guò)NG，NS, DG或DS基序替換CDR中的NX或DX以促進(jìn)Asp-或Asn-異構(gòu)化，優(yōu)選Asp-異構(gòu)化。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，一種在合適的例如真核或原核生物體中通過(guò)用表達(dá) 載體轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生具有改善的穩(wěn)定性的的多肽、其功能衍生物或片段的方法，所述多肽包含 至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域，例如納米抗體或dAbs，優(yōu)選納米抗體，所述表達(dá)載體包含編碼所述 多肽、衍生物或片段的重組基因，所述方法包括以下的步驟a)在⑶R環(huán)中，優(yōu)選地在⑶R2和/或⑶R3環(huán)，更優(yōu)選地在⑶R3環(huán)中檢查編碼多 肽的至少一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的基因中的編碼N或D，優(yōu)選NG，NS, DG或DS的核苷酸序列；和b)如果存在編碼所述二肽序列的所述核苷酸序列，則突變所述編碼N或D的核苷 酸序列；以及c)用以此方式修飾的基因轉(zhuǎn)化合適的，例如原核或真核生物體，并且表達(dá)具有所 需活性的多肽、片段或衍生物。如果需要，可從生物體中分離單可變結(jié)構(gòu)域，并且任選地根據(jù)本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人 員所熟悉的方法進(jìn)行純化。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種在合適的例如真核或原核生物體中通 過(guò)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生具有改善的穩(wěn)定性的多肽、其功能衍生物或片段的方法，所述多 肽包含至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域，例如納米抗體或dAbs，優(yōu)選納米抗體，所述表達(dá)載體包含編 碼所述多肽、衍生物或片段的重組基因，所述方法包括以下的步驟a)在⑶R環(huán)中，優(yōu)選地在⑶R2和/或⑶R3環(huán)，更優(yōu)選地在⑶R3環(huán)中檢查編碼多 肽的至少一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的基因中的編碼NG，NS, DG或DS的核苷酸序列；和b)如果存在編碼所述二肽序列的至少一個(gè)核苷酸序列，則生成包含多肽衍生物 (或基本上由其組成)的突變體的文庫(kù)，其中在要被穩(wěn)定的多肽中發(fā)現(xiàn)NG或DG的情況下， a)中的一個(gè)或多個(gè)所述已鑒定的核苷酸序列用編碼EG，QG, ES, QS, NA, NT, DA或DT，優(yōu)選編 碼EG或QG的核苷酸序列替換，或在要被穩(wěn)定的多肽中發(fā)現(xiàn)NS或DS的情況下用編碼ES或 QS的核苷酸序列替換；以及c)用以此方式修飾的基因轉(zhuǎn)化合適的例如原核或真核生物體，并且表達(dá)具有所需 活性的多肽、片段或衍生物。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種在合適的例如真核或原核生物體中通 過(guò)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生具有改善的穩(wěn)定性的多肽、其功能衍生物或片段的方法，所述多 肽包含至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域，例如納米抗體或dAbs，優(yōu)選納米抗體，所述表達(dá)載體包含編 碼所述多肽、衍生物或片段的重組基因，所述方法包括以下的步驟a)檢查編碼多肽的至少一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的基因中的編碼NG，NS, DG或DS基序的 核苷酸序列，其中所述氨基酸或基序是表面暴露的，并且其中供給氫鍵的殘基緊密接近不 穩(wěn)定的N或D ；和b)如果a)中的核苷酸序列被鑒定，則生成包含多肽衍生物(或基本上由其組成) 的突變體文庫(kù)，其中在要被穩(wěn)定的多肽中發(fā)現(xiàn)NG或DG的情況下，a)中的一個(gè)或多個(gè)所述 已鑒定的核苷酸序列用編碼EG，QG, ES, QS, NA, NT, DA或DT，優(yōu)選編碼EG或QG的核苷酸序 列替換，或在要被穩(wěn)定的多肽中發(fā)現(xiàn)NS或DS的情況下用編碼ES或QS的核苷酸序列替換； 以及c)用以此方式修飾的基因轉(zhuǎn)化合適的例如原核或真核生物體，并且表達(dá)具有所需 活性的多肽、片段或衍生物。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種在合適的例如真核或原核生物體中通 過(guò)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生具有改善的穩(wěn)定性的多肽、其功能衍生物或片段的方法/過(guò)程， 所述多肽包含至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域，例如納米抗體或dAbs，優(yōu)選納米抗體，所述表達(dá)載體 包含編碼所述多肽、衍生物或片段的重組基因，所述方法/過(guò)程包括以下的步驟a)在⑶R環(huán)中，優(yōu)選地在⑶R2和/或⑶R3環(huán)，更優(yōu)選地在⑶R3環(huán)中檢查編碼多 肽的至少一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的基因中的編碼NG，NS, DG或DS的核苷酸序列；和b)檢查已鑒定的序列是否發(fā)生異構(gòu)化(例如，通過(guò)在較高溫度下延長(zhǎng)保存期并且 隨后觀察RPC譜型中的前峰一一見(jiàn)實(shí)驗(yàn)部分)和已鑒定的序列的異構(gòu)化任選地是否是失 去所述多肽的至少一種活性、優(yōu)選所有活性的原因；和c)不管是否觀察到異構(gòu)化，生成包含多肽衍生物(或基本上由其組成)的突變體 文庫(kù)，其中在要被穩(wěn)定的多肽中發(fā)現(xiàn)NG或DG的情況下，a)中的一個(gè)或多個(gè)所述已鑒定的 核苷酸序列用編碼EG，QG, ES, QS, NA, NT, DA或DT，優(yōu)選編碼EG或QG的核苷酸序列替換， 或在要被穩(wěn)定的多肽中發(fā)現(xiàn)NS或DS的情況下用編碼ES或QS的核苷酸序列替換；以及d)用以此方式修飾的基因轉(zhuǎn)化原核或真核生物體，并且表達(dá)具有所需活性的多 肽、片段或衍生物。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種在合適的例如真核或原核生物體中通 過(guò)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生具有改善的穩(wěn)定性的多肽、其功能衍生物或片段的方法/過(guò)程， 所述多肽包含至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域，例如納米抗體或dAbs，優(yōu)選納米抗體，所述表達(dá)載體 包含編碼所述多肽、衍生物或片段的重組基因，所述方法/過(guò)程包括以下的步驟a)在⑶R環(huán)中，優(yōu)選地在⑶R2和/或⑶R3環(huán)，更優(yōu)選地在⑶R3環(huán)中檢查編碼多 肽的至少一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的基因中的編碼NG或DG的核苷酸序列；和b)檢查已鑒定的序列是否發(fā)生異構(gòu)化(例如，通過(guò)在較高溫度下延長(zhǎng)保存期并且 隨后觀察RPC譜型中的前峰一一見(jiàn)實(shí)驗(yàn)部分)和已鑒定的序列的異構(gòu)化任選地是否是失 去所述多肽的至少一種活性、優(yōu)選所有活性的原因；和c)不管是否觀察到異構(gòu)化，生成包含多肽衍生物(或基本上由其組成)的突變體 文庫(kù)，其中在要被穩(wěn)定的多肽中發(fā)現(xiàn)NG或DG的情況下，a)中的一個(gè)或多個(gè)所述已鑒定的 核苷酸序列用編碼EG，QG, NA, NT, DA或DT，優(yōu)選編碼EG或QG的核苷酸序列替換；以及d)用以此方式修飾的基因轉(zhuǎn)化原核或真核生物體，并且表達(dá)具有所需活性的多 肽、片段或衍生物。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種在合適的例如真核或原核生物體中通 過(guò)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生具有改善的穩(wěn)定性的多肽、其功能衍生物或片段的方法/過(guò)程， 所述多肽包含至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域，例如納米抗體或dAbs，優(yōu)選納米抗體，所述表達(dá)載體 包含編碼所述多肽、衍生物或片段的重組基因，所述方法/過(guò)程包括以下的步驟a)在⑶R環(huán)中，優(yōu)選地在⑶R2和/或⑶R3環(huán)，更優(yōu)選地在⑶R3環(huán)中檢查編碼多 肽的至少一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的基因中的編碼NS或DS的核苷酸序列；和b)檢查已鑒定的序列是否發(fā)生異構(gòu)化(例如，通過(guò)在較高溫度下延長(zhǎng)保存期并且 隨后觀察RPC譜型中的前峰一一見(jiàn)實(shí)驗(yàn)部分)和已鑒定的序列的異構(gòu)化任選地是否是失 去所述多肽的至少一種活性、優(yōu)選所有活性的原因；和c)不管是否觀察到異構(gòu)化，生成包含多肽衍生物(或基本上由其組成)的突變體
9文庫(kù)，其中在要被穩(wěn)定的多肽中發(fā)現(xiàn)NS或DS的情況下，a)中的一個(gè)或多個(gè)所述已鑒定的 核苷酸序列用編碼ES，QS, NA, NT, DA或DT，優(yōu)選編碼ES或QS的核苷酸序列替換；以及d)用以此方式修飾的基因轉(zhuǎn)化原核或真核生物體，并且表達(dá)具有所需活性的多 肽、片段或衍生物。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種在合適的例如真核或原核生物體中通 過(guò)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生具有改善的穩(wěn)定性的多肽、其功能衍生物或片段的方法/過(guò)程， 所述多肽包含至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域，例如納米抗體或dAbs，優(yōu)選納米抗體，所述表達(dá)載體 包含編碼所述多肽、衍生物或片段的重組基因，所述方法/過(guò)程包括以下的步驟a)在⑶R環(huán)中，優(yōu)選地在⑶R2和/或⑶R3環(huán)，更優(yōu)選地在⑶R3環(huán)中檢查編碼多 肽的至少一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的基因中的編碼NG，DG, NS或DS的核苷酸序列；和b)生成包含多肽衍生物(或基本上由其組成)的突變體的文庫(kù)，其中在要被穩(wěn)定 的多肽中發(fā)現(xiàn)NS或DS的情況下，a)中的一個(gè)或多個(gè)所述已鑒定的核苷酸序列用編碼EG， QG, ES, QS, ΝΑ, NT, DA或DT，優(yōu)選編碼ES或QS的核苷酸序列替換，或在要被穩(wěn)定的多肽中 發(fā)現(xiàn)NG或DG的情況下優(yōu)選用編碼EG或QG的核苷酸序列替換；以及c)用以此方式修飾的基因轉(zhuǎn)化合適的，例如原核或真核生物體，并且表達(dá)具有所 需活性的多肽、片段或衍生物。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，對(duì)具有改善的穩(wěn)定性的多肽、其功能衍生物 或片段的進(jìn)行所述方法，所述多肽包含至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域，例如納米抗體或dAbs，優(yōu)選 納米抗體，其中在多肽的單可變結(jié)構(gòu)域的基因中D或N的至少一個(gè)密碼子被替換，特別是如 果此D或N后緊接S或G和/或所述DG，NG, DS或NS在多肽的單可變結(jié)構(gòu)域的⑶R，優(yōu)選 ⑶R2或⑶R3，更優(yōu)選⑶R3內(nèi)，并且轉(zhuǎn)化原核或真核生物體，且表達(dá)具有所需活性的多肽、片 段或衍生物。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，對(duì)具有改善的穩(wěn)定性的多肽、其功能衍生物 或片段的進(jìn)行所述方法，所述多肽包含至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域，例如納米抗體或dAbs，優(yōu)選 納米抗體，其中在多肽的單可變結(jié)構(gòu)域的基因中M的至少一個(gè)密碼子被替換，特別是如果 此M在多肽的單可變結(jié)構(gòu)域的⑶R，優(yōu)選⑶R2或⑶R3，更優(yōu)選⑶R3內(nèi)或M在位點(diǎn)77處(使 用KABAT編號(hào))，并且轉(zhuǎn)化原核或真核生物體，且表達(dá)具有所需活性的多肽、片段或衍生物。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，對(duì)具有改善的穩(wěn)定性的多肽、其功能衍生物 或片段的進(jìn)行所述方法，所述多肽包含至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域，例如納米抗體或dAbs，優(yōu)選 納米抗體，其中El (對(duì)納米抗體的Kabat編號(hào))，如果存在，則被替換，優(yōu)選地被D替換，并且 轉(zhuǎn)化原核或真核生物體，且表達(dá)具有所需活性的多肽、片段或衍生物。根據(jù)本發(fā)明的方法或過(guò)程以下列的方式使用，即包含至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域的多 肽(其意欲被穩(wěn)定的)被測(cè)序，并且其結(jié)構(gòu)域的序列與Kabat等(1991，見(jiàn)下)的序列中所 提到的共有序列比較或其被連續(xù)地編號(hào)。限定在序列的最大同源性或同一性處的氨基酸位 點(diǎn)。隨后一個(gè)或多個(gè)密碼子可根據(jù)本發(fā)明有利地通過(guò)誘變被修飾。其結(jié)果是一個(gè)密碼子的 特定置換可以容易地導(dǎo)致抗體穩(wěn)定性的相當(dāng)大的變化。然而，兩個(gè)、三個(gè)或多個(gè)密碼子優(yōu)選 地被修飾。當(dāng)對(duì)所需應(yīng)用目的很重要的抗體的其他特性(例如，親和性、蛋白酶穩(wěn)定性、選 擇性)被負(fù)面地影響時(shí)，達(dá)到置換數(shù)目的上限。意欲基于實(shí)施例來(lái)闡明所述步驟首先采用Kabat的表(1991，下面)通過(guò)序列比較(最大同源性)測(cè)定氨基酸位點(diǎn)。在SEQ ID NO 2的情況下，發(fā)現(xiàn)氨基酸D105 (連續(xù)編號(hào)，見(jiàn)附圖，例如，圖4)經(jīng)歷 了異構(gòu)化，并且此異構(gòu)化是解釋在較高溫度下長(zhǎng)期保存期間效力喪失的主要分子機(jī)制(見(jiàn) 實(shí)驗(yàn)部分)。然而，E105替換D105，即SEQID NO 2的D105E突變體阻止所提及的在較高的 溫度下親和性隨時(shí)間變化的喪失，并且以二價(jià)形式被格式化時(shí)，具有與具有SEQ ID N0:2的 野生型多肽相當(dāng)?shù)目傮w親和性(也參見(jiàn)實(shí)驗(yàn)部分)。因此，通過(guò)使用根據(jù)本發(fā)明的方法，有 可能在不喪失SEQ ID NO 2的親和力的條件下獲得穩(wěn)定的形式，即SEQ ID NO 2的優(yōu)選突 變體，即，SEQ ID N0:2的D105E突變體。其他實(shí)施例公開(kāi)在實(shí)驗(yàn)部分中。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種在合適的例如真核或原核生物體中通 過(guò)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生功能性多肽、其功能衍生物或片段，例如包含納米抗體或dAbs、優(yōu) 選納米抗體的多肽的方法/過(guò)程，所述表達(dá)載體包含編碼所述多肽、衍生物或片段的文庫(kù) 的重組基因，所述方法/過(guò)程包括如上所公開(kāi)的過(guò)程步驟的任意一個(gè)并且另外包括a)檢查是否存在任意的M，和任選地檢查M是否對(duì)強(qiáng)制氧化敏感，并且如果是，則 通過(guò)用例如，V，L，A，K，G，I，T，優(yōu)選T，L或A，更優(yōu)選A或T，更優(yōu)選A替換M而生成文庫(kù)中 的更多成員；和b)用以此方式修飾的基因轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)纳矬w，并且表達(dá)具有所需活性的本發(fā)明的 多肽、片段或衍生物。專業(yè)技術(shù)人員將理解，在選擇適當(dāng)?shù)陌被嵋蕴鎿QM時(shí)，可采用其他的考慮，例 如，降低多肽包括納米抗體或Dabs的免疫原性。例如，就納米抗體而言，其可有利地選擇 氨基酸以替換M，所述氨基酸存在于人構(gòu)架區(qū)的相應(yīng)位點(diǎn)中(見(jiàn)實(shí)驗(yàn)部分，例如實(shí)施例4的 M78T突變)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種在合適的例如真核或原核生物體中通 過(guò)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生納米抗體或dAbs、優(yōu)選納米抗體肽的方法/過(guò)程，所述表達(dá)載體 包含編碼所述納米抗體的文庫(kù)的重組基因，所述方法/過(guò)程包括如上所公開(kāi)的過(guò)程步驟的 任意一個(gè)并且另外包括a)檢查在位點(diǎn)77處(使用Kabat編號(hào))是否存在M，和任選地檢查M是否對(duì)強(qiáng)制 氧化敏感，并且如果是，則通過(guò)用例如，T，V，L，A，K，G，I，優(yōu)選T，L或A，更優(yōu)選A或T，更優(yōu) 選A替換M生成文庫(kù)中的更多成員；和b)用以此方式修飾的基因轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)纳矬w，并且表達(dá)具有所需活性的本發(fā)明的 多肽、片段或衍生物。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種在合適的例如真核或原核生物體中通 過(guò)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生功能性多肽、其功能衍生物或片段，例如納米抗體或dAbs，優(yōu)選納 米抗體的方法/過(guò)程，所述表達(dá)載體包含編碼所述多肽、衍生物或片段的重組基因，所述方 法/過(guò)程包括如上所公開(kāi)的過(guò)程步驟的任意一個(gè)并且另外包括a)檢查是否存在任意的M，和任選地檢查任意一個(gè)所述M是否對(duì)強(qiáng)制氧化敏感，并 且如果是，則通過(guò)用例如，V，L，A，K，G，I，優(yōu)選L或A，更優(yōu)選A或T，更優(yōu)選A替換至少一個(gè) M ；禾口b)并且用例如D替換N-末端的E (如果存在)；以及c)用以此方式修飾的基因轉(zhuǎn)化真核生物體，并且表達(dá)具有所需活性的多肽、片段
11或衍生物。為了通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的過(guò)程穩(wěn)定蛋白或多肽并且仍然保留其的其他特性諸如尤 其是對(duì)抗原的親和性，優(yōu)選地置換氨基酸，達(dá)到盡可能不損害這些特性的程度。為此，優(yōu)選 通過(guò)保守置換替換已鑒定的氨基酸?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員所熟悉的產(chǎn)生重組蛋白的方法來(lái)產(chǎn)生本發(fā)明所述的 多肽、其衍生物和片段。為了產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明修飾的多肽，例如有可能合成可變結(jié)構(gòu)域的完整DNA(通過(guò) 例如在Sinha等，NAR (核酸研究)12 (1984)，4539-4557中所述的寡核苷酸合成的方式)。如 例如 Innis，編輯，PCR protocols (PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù))，Academic Press (學(xué)術(shù)出版社)(1990)和 Better等，J. Biol. Chem.(生物化學(xué)雜志)267 (1992)，16712-16118所述，寡核苷酸可通過(guò) PCR連接。通過(guò)如例如 Ausubel 等，編輯，Current protocols in Molecular Biology (現(xiàn)代 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù))，John Wiley and Sons，紐約(1989)和 Robinson 等，Hum. Antibod. Hybridomas (人抗體和雜交瘤)2 (1991)84-93中所述的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行克隆和表達(dá)。特 異性抗原結(jié)合活性可例如通過(guò)如Harlow等，編輯，Antibodies (抗體)；A Laboratory Manual (實(shí)驗(yàn)室指南)，第 14 章，Cold Spring Harbor Laboratory ( 7令泉港實(shí)驗(yàn)室)，Cold Spring Harbor (冷泉港)(1988)和 Munson 等，Anal. Biochem.(分析生物化學(xué))407 (1980)， 220-239中所述的競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)來(lái)檢驗(yàn)。適當(dāng)?shù)乃拗魃矬w為例如CHO細(xì)胞，不產(chǎn)生免疫球蛋白的淋巴細(xì)胞系，酵母，昆蟲(chóng) 細(xì)胞和原核生物諸如大腸桿菌(E. coli)。本發(fā)明進(jìn)一步的主題是這樣一種過(guò)程，其中蛋白在原核生物體(例如，大腸桿菌) 中作為變性的內(nèi)含體分離，并且通過(guò)本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員所熟悉的過(guò)程被活化(參見(jiàn)，例 如，EP-A O 364 926)。本發(fā)明進(jìn)一步的主題是一種過(guò)程，其中本發(fā)明的多肽根據(jù)本發(fā)明以這樣的方式被 穩(wěn)定，即，其在胞液中生物學(xué)活性地形成并具有所需的活性，和可以活性形式從其中直接分罔。對(duì)于前面提及的所有應(yīng)用領(lǐng)域，根據(jù)本發(fā)明的方法/過(guò)程改善了多肽和蛋白的穩(wěn) 定性。此外，根據(jù)本發(fā)明可產(chǎn)生新的穩(wěn)定的多肽變體，其在以前不能以足夠穩(wěn)定的形式獲 得，諸如適合于在非生理?xiàng)l件下使用的多肽。本發(fā)明進(jìn)一步的主題是一種產(chǎn)生非破壞性的去穩(wěn)定多肽的過(guò)程，例如，如果需要 快速的藥代動(dòng)力學(xué)則可以有利地使用所述多肽。為了獲得所述多肽，所以必須以與上述相 反的方式進(jìn)行至少一個(gè)氨基酸置換。定義a)術(shù)語(yǔ)“靶分子”或“多個(gè)靶分子”或“靶標(biāo)”是指在包括細(xì)菌和病毒、優(yōu)選動(dòng)物、 更優(yōu)選哺乳動(dòng)物最優(yōu)選人的生物體中具有生物學(xué)功能的蛋白，其中所述生物學(xué)功能可參與 到疾病的引起或進(jìn)展或維持中。優(yōu)選所述蛋白選自由以下組成的組人生長(zhǎng)激素(hGH)， N-甲硫氨酰基人生長(zhǎng)激素，牛生長(zhǎng)激素，甲狀旁腺素，甲狀腺素，胰島素A-鏈，胰島素B-鏈， 胰島素原，松弛素A-鏈，松弛素B-鏈，松弛素原(prorelaxin)，糖蛋白激素諸如促卵泡激 素(FSH)，促甲狀腺激素(TSH)和促黃體素(LH)，糖蛋白激素受體，降鈣素，胰高血糖素，因 子VIII，抗體，納米抗體，被哺乳動(dòng)物尤其是人良好地耐受并且當(dāng)全身和/或局部施用時(shí)具有長(zhǎng)半衰期的分子，例如，具有不同大小的聚乙二醇鏈，例如，PEG-20, PEG-30或PEG40， 肺表面活性劑，尿激酶，鏈激酶，人組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)，鈴蟾肽(bombesin)，因 子IX，凝血酶，造血生長(zhǎng)因子，腫瘤壞死因子(TNF)-Ci和TNF-β，腦啡肽酶，人血清白蛋 白，mullerian 抑制物質(zhì)(mullerian—inhibiting substance),鼠促性腺素關(guān)聯(lián)月太(mouse gonadotropin-associated ρ印tide)，微生物蛋白諸如β內(nèi)酰胺酶，組織因子蛋白，抑制 素，激活素，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，激素或生長(zhǎng)因子的受體；整聯(lián)蛋白，血小板生成素，蛋白A 或D，類風(fēng)濕因子，神經(jīng)生長(zhǎng)因子諸如NGF-β，血小板生長(zhǎng)因子，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)諸如 TGF-α和TGF-β，胰島素樣生長(zhǎng)因子-I和-II，胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白，⑶_4，脫氧 核糖核酸酶，潛在相關(guān)肽，紅細(xì)胞生成素，骨誘導(dǎo)因子，干擾素諸如干擾素-α，- β，和-γ， 集落刺激因子(CSFs)諸如 M-CSF，GF-CSF，和 G-CSF，白介素(ILs)諸如 IL-1，IL-2，IL-3， IL-4，IL-5，IL-6，馮維布蘭德因子(von Willebrand factor)，超氧化物歧化酶；衰變加速 因子，病毒抗原，HIV包膜蛋白諸如GP120，GP140，心房鈉尿肽A，B或C，免疫球蛋白，和上面 列舉的任意一種蛋白的片段或變異體。另外地，所述蛋白可以是上面提及的因子/細(xì)胞因 子的受體和/或受體和因子/細(xì)胞因子的復(fù)合體。更優(yōu)選地，所述靶分子是多聚體蛋白并且 甚至更優(yōu)選地是其亞基選自由下列各項(xiàng)組成的組的多聚體蛋白馮維布蘭德因子(vWF)， IL-6，腫瘤壞死因子-α和-β和許多其他因子。多聚體蛋白是在生物學(xué)生物體諸如人中 與作為亞基的其他蛋白以多聚體結(jié)構(gòu)締合(典型地通過(guò)非共價(jià)相互作用)并且典型地僅多 聚體形式能夠展現(xiàn)其生物學(xué)功能的蛋白。這也稱為蛋白的四級(jí)結(jié)構(gòu)。此締合作用也可通過(guò) 二硫鍵和通過(guò)與反應(yīng)底物或輔因子的非共價(jià)相互作用而被穩(wěn)定。b)存在于本發(fā)明的構(gòu)建體中的單可變結(jié)構(gòu)域可以是形成單抗原結(jié)合單位的任何 可變結(jié)構(gòu)域。通常，此類單可變結(jié)構(gòu)域?qū)⑹腔旧嫌?個(gè)構(gòu)架區(qū)(分別為FR1-FR4)和3個(gè) 互補(bǔ)決定區(qū)(分別為CDR1-CDR3)組成的氨基酸序列；或所述氨基酸序列的任何適當(dāng)?shù)钠?段(然后其通常將包含至少一些形成至少一個(gè)CDR的氨基酸殘基，如本文進(jìn)一步所述)。所 述單可變結(jié)構(gòu)域和片段最優(yōu)選地是這樣的，即它們包含免疫球蛋白折疊或能夠在適當(dāng)?shù)臈l 件下形成免疫球蛋白折疊。因此，例如，單可變結(jié)構(gòu)域可包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列(例如， Vl-序列)或其適當(dāng)?shù)钠?；或重鏈可變結(jié)構(gòu)域(例如，Vh-序列或Vhh序列)或其適當(dāng)?shù)?片段；只要其能夠形成單抗原結(jié)合單位(即，基本上由單可變結(jié)構(gòu)域組成的功能性抗原結(jié) 合單位，使得所述單抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域不需要與另一可變結(jié)構(gòu)域相互作用以形成功能性抗原 結(jié)合單位，如例如下列的情況一樣，即，例如，存在于例如，需要與另一可變結(jié)構(gòu)域相互作用 (例如，通過(guò)VH/VL相互作用)以形成功能性抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的常規(guī)抗體和ScFv片段中的 可變結(jié)構(gòu)域)。例如，單可變結(jié)構(gòu)域可以是結(jié)構(gòu)域抗體(或適合用作結(jié)構(gòu)域抗體的氨基酸序列)， 單結(jié)構(gòu)域抗體(或適合用作單結(jié)構(gòu)域抗體的氨基酸序列)，“dAb"或dAb (或適合用作 dAb的氨基酸序列)或納米抗體TM(NanobodyTM)(如本文所定義，并且包括但不限于Vhh序 列)；其他單可變結(jié)構(gòu)域，或其任意一種的任意合適的片段。對(duì)于(單)結(jié)構(gòu)域抗體的總體 描述，還參考上面引用的現(xiàn)有技術(shù)，以及EP 0 368 684。對(duì)于術(shù)語(yǔ)“dAb’ s”，參考例如，Ward 等(Nature (自然)1989 年 10 月 12 日；341 (6242) :544_6)，Holt 等，Trends Biotechnol. (生物技術(shù)趨勢(shì))，2003，21(11) 484-490 ；以及例如 W004/068820，WO 06/030220，WO 06/003388和Domantis Ltd.的其他已公開(kāi)的專利申請(qǐng)。還應(yīng)該注意的是，盡管在本發(fā)明的情形中由于其不是哺乳動(dòng)物來(lái)源的而不太優(yōu)選，但單結(jié)構(gòu)域抗體或單可變結(jié)構(gòu)域可來(lái)源于 某些鯊魚(yú)物種(例如，所謂的“ IgNAR結(jié)構(gòu)域”，參見(jiàn)例如WO 05/18629)。具體的，本發(fā)明的氨基酸序列可以是納米抗體 或其適當(dāng)?shù)钠?。[注納米抗體 (Nanobody )，納米抗體"(Nanobodies )和納米克隆"(Nanoclone )為埃博靈克斯股份 有限公司(AblyN.V.)的注冊(cè)商標(biāo)]。為了進(jìn)一步說(shuō)明Vhh’ s和納米抗體，參考Muyldermans 在 Reviews in Molecular Biotechnology (分子生物技術(shù)綜述)74 (2001)，277-302 中 的綜述論文；以及下列的專利申請(qǐng)，它們作為一般背景技術(shù)被提及Vrije Universiteit Brussel 的 WO 94/04678，WO 95/04079 和 WO 96/34103 ；Unilever 的 WO 94/25591， WO 99/37681， WO 00/40968, WO 00/43507, W000/65057, WO 01/40310, WO 01/44301, EP 1134231和 WO 02/48193 ；Vlaams Instituut voor Biotechnologie(VIB)的 WO 97/49805， WO 01/21817, WO 03/035694, WO 03/054016 和 WO 03/055527 ；Algonomics N. V.和埃博靈 克斯股份有限公司(Ablynx N. V.)的WO 03/050531 ；加拿大國(guó)家研究委員會(huì)(National Research Council of Canada)白勺 WO 01/90190 -Μ ^Ψ^ (Institute of Antibodies) 的TO 03/025020 ( = EP 1433793)；以及埃博靈克斯股份有限公司(Ablynx N. V.)的TO 04/041867, WO 04/041862, W004/041865, WO 04/041863, WO 04/062551, WO 05/044858, WO 06/40153，WO 06/079372, WO 06/122786，WO 06/122787 和 WO 06/122825，和埃博靈克斯股 份有限公司(Ablynx N. V.)的其它公布的專利申請(qǐng)。還參考這些申請(qǐng)中提及的更多的現(xiàn) 有技術(shù)，并且具體地參考國(guó)際申請(qǐng)WO 06/040153的第41-43頁(yè)上提及的參考文件列表，它 們通過(guò)引用合并于此。如這些參考文獻(xiàn)中所述，納米抗體(特別是Vhh序列和部分人源化 的納米抗體)可特別地以在一個(gè)或多個(gè)構(gòu)架序列中存在一個(gè)或多個(gè)“標(biāo)志殘基(hallmark residues) ”為特征。對(duì)納米抗體，包括納米抗體的人源化和/或駱駝源化，以及其他修飾作用，部 分或片段，衍生物或“納米抗體融合體”，多價(jià)構(gòu)建體(包括接頭序列的一些非限制性實(shí) 例)和增加納米抗體的半衰期的不同修飾作用和它們的制備的進(jìn)一步描述可見(jiàn)于例如， W007/104529 中。c)如本文所使用，“高親和性”是指在生理?xiàng)l件下和通過(guò)本領(lǐng)域中標(biāo)準(zhǔn)步驟測(cè)量， 單價(jià)結(jié)合納米抗體的解離常數(shù)(Kd) < ΙΟΟηΜ，并且優(yōu)選ΙΟηΜ，并且更優(yōu)選InM，并且甚至更 優(yōu)選ΙΟΟρΜ，并且最優(yōu)選10pM。d)如本文所使用，“高抗體親抗原性(high avidity) ”是指在生理?xiàng)l件下和通過(guò)本 領(lǐng)域中標(biāo)準(zhǔn)步驟測(cè)量，二價(jià)或多價(jià)結(jié)合納米抗體的解離常數(shù)(Kd) < ΙΟΟηΜ，并且優(yōu)選ΙΟηΜ， 并且更優(yōu)選InM，并且甚至更優(yōu)選ΙΟΟρΜ，并且最優(yōu)選10pM。e)如本文所使用，“剛性二級(jí)結(jié)構(gòu)”是指顯示規(guī)則的重復(fù)結(jié)構(gòu)的任何多肽節(jié)段，諸 如見(jiàn)于；α-螺旋，310螺旋，π-螺旋，平行和反平行的β-折疊，和回折。缺少可識(shí)別的幾 何秩序的某些“非有序”結(jié)構(gòu)也包括在剛性二級(jí)結(jié)構(gòu)的定義中，條件是它們形成能夠與靶標(biāo) 相互作用的結(jié)構(gòu)域或氨基酸的“補(bǔ)片”并且該結(jié)構(gòu)的總體形狀不被該結(jié)構(gòu)內(nèi)的氨基酸置換 所破壞。相信一些非有序結(jié)構(gòu)是回折的組合。這些剛性二級(jí)結(jié)構(gòu)的幾何形狀通過(guò)圍繞肽“主 鏈”的α-碳的φ和χ (.psi.)扭轉(zhuǎn)角而被明確地定義。二級(jí)結(jié)構(gòu)要暴露于多肽的表面的 要求是提供可暴露于靶分子并與靶分子結(jié)合的結(jié)構(gòu)域或氨基酸殘基的“補(bǔ)片”。正是這些通 過(guò)誘變被替換的氨基酸殘基初步地形成結(jié)構(gòu)上相關(guān)的(突變的)結(jié)合多肽的“文庫(kù)”，它們
14展示在噬菌體的表面上并且從中選擇新的多肽配體。通常避免針對(duì)多肽內(nèi)部的氨基酸殘基 的誘變或置換，使得保留剛性二級(jí)結(jié)構(gòu)的總體結(jié)構(gòu)。在剛性二級(jí)結(jié)構(gòu)的內(nèi)部區(qū)域上的氨基 酸的一些置換，尤其是用疏水性氨基酸殘基的置換，可以被耐受，因?yàn)檫@些保守置換不可能 使多肽的總體結(jié)構(gòu)變形。f)如本文所使用，“前導(dǎo)序列”是指信使RNA(mRNA)和編碼它的DNA的特殊部 分。其在+1位(在此處開(kāi)始轉(zhuǎn)錄)處開(kāi)始并且緊接在編碼區(qū)的起始密碼子(通常為 AUG)之前結(jié)束。其通常包含核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)，在細(xì)菌中也稱為Shine-Delgarno序 列(AGGAGGU)。5' UTR可以是一百或更多個(gè)核苷酸長(zhǎng)，并且3 ‘ UTR甚至可以更長(zhǎng)(直 至幾千個(gè)堿基長(zhǎng)度)(Molecular Cell Biology (分子細(xì)胞生物學(xué))，第5版，Lodish等， 113，4.2章)。除非另外指明或定義，所有使用的術(shù)語(yǔ)具有其在本領(lǐng)域中的一般含義，這 對(duì)于專業(yè)技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是清楚的。例如參考標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)，諸如Sambrook等，“Molecular Cloning =A Laboratory Manual (分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南)“(第二版)，1-3 卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press (冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社)(1989) ；F. Ausubel 等，編 輯，“Current protocols in molecular biology (現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù))〃， Green Publishing and Wiley Interscience，紐約(1987) ；Lewin,"Genes II (基因 II)，，， John Wiley & Sons，紐約，N. Y.，(1985) ；Old 等，"Principles of Gene Manipulation An Introduction to Genetic Engineering (基因操作原理遺傳工程導(dǎo)言)，，，第二版， University of California Press (加利福尼亞大學(xué)出版社)，伯克利，CA (1981) ；Roitt 等， “ Immunology (免疫學(xué))，，(第 6 版)，Mosby/Elsevier，愛(ài)丁堡(2001) ；Roitt 等，Roitt' s Essential Immunology (Roitt 免疫學(xué)基礎(chǔ))，第 10 版，Blackwell Publishing, UK(2001)； 禾口 Janeway 等，“Immunobiology (免疫學(xué))，，(第 6 版)，Garland Science Publishing/ Churchill Livingstone，紐約(2005)，以及其中引用的一般背景技術(shù);g)除非另外指明，術(shù)語(yǔ)“免疫球蛋白序列”一一無(wú)論在本文中使用是指重鏈抗體 還是指常規(guī)的4鏈抗體一一其用作一般術(shù)語(yǔ)以包括全長(zhǎng)抗體，其單條鏈，以及其部分、結(jié)構(gòu) 域或片段(分別地，包括但不限于抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或片段諸如Vffl結(jié)構(gòu)域或結(jié)構(gòu)域)。 另外，如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“序列，，(例如，在類似“免疫球蛋白序列”，“抗體序列”，“可變結(jié) 構(gòu)域序列”，"Vhh序列”或“蛋白序列”的術(shù)語(yǔ)中)，一般應(yīng)該被理解為包括相關(guān)的氨基酸序列 以及編碼其的核酸或核苷酸序列兩者，除非上下文需要更加限制性的解釋。此外，如本文所 使用，術(shù)語(yǔ)“核苷酸序列，，還包括具有所述核苷酸序列的核酸分子，因此術(shù)語(yǔ)“核苷酸序列，， 和“核酸”應(yīng)該被理解為是等價(jià)的，并且在本文中可互換使用；h)除非另外指明，所有沒(méi)有具體詳細(xì)描述的方法、步驟、技術(shù)和操作可以以本身 已知的方式進(jìn)行并且已經(jīng)進(jìn)行，這對(duì)于專業(yè)技術(shù)人員是清楚的。例如，仍舊參考標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)， 參考本文所提及的公知背景技術(shù)，和參考其中所引用的其它參考文獻(xiàn)；以及參考例如下述 綜述Presta，高級(jí)藥物遞送綜述(Adv. Drug Deliv. Rev.) 2006, 58 (5-6) 640-56 ；Levin 和Weiss，分子生物系統(tǒng)學(xué)(Mol. Biosyst). 2006,2(1) :49_57 ；Irving等，免疫學(xué)方法雜 志(J. Immunol. Methods) 2001，248 (1-2)，31-45 ；Schmitz 等，Placenta, 2000, 21 增刊· A， S106-12, Gonzales 等，Tumour Biol.(腫瘤生物學(xué))，2005，26 (1)，31-43，其描述了蛋白質(zhì) 工程技術(shù)，諸如親和力成熟，和用于提高蛋白如免疫球蛋白的特異性和其他需要的性質(zhì)的 其他技術(shù)。
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i)氨基酸殘基按照標(biāo)準(zhǔn)的三字母或一字母的氨基酸代碼顯示，如在表A-2提及 的；表A-2 —字母和三字母氨基酸代碼非極性、 不帶電荷 (在 pH 6.0 一 7.0)(3)丙氨酸AlaA纈氨酸ValV亮氨酸LeuL異亮氨酸IleI苯丙氨酸PheF甲硫氨酸⑴MetM色氨酸TrpW脯氨酸ProP極性、 不帶電荷 (在 pH 6.0-7.0)甘氨酸GlyG絲氨酸SerS蘇氨酸ThrT半胱氨酸CysC天冬酰胺AsnN谷氨酰胺GlnQ酪氨酸TyrY極性、 帶電荷 (在 pH 6.0-7.0)賴氨酸LysK精氨酸ArgR組氨酸(4)HisH天冬氨酸AspD谷氨酸GluE注解 (1)有時(shí)也視作極性不帶電荷的氨基酸。
(2)有時(shí)也視作非極性不帶電荷的氨基酸 (3)專業(yè)技術(shù)人員應(yīng)該清楚，氨基酸殘基在該表中在pH6.0-7.0帶電荷或不帶電荷的事 實(shí)不以任何方式反映所述氨基酸殘基在低于6.0的pH和/或高于7.0的pH下具有的 電荷；在這樣更高或更低的pH，表中提及的氨基酸殘基可以是帶電荷的和/或不帶電 荷的，這對(duì)于專業(yè)技術(shù)人員應(yīng)該是清楚的。
(4)本領(lǐng)域已知，His殘基的電荷極大地取決于即使很小的pH變換，但是在約6.5的 pH, His殘基一般可以認(rèn)為基本上不帶電荷。 j)出于比較兩種或更多種核苷酸序列的目的，第一核苷酸序列和第二核苷酸序 列之間的“序列同一性”百分?jǐn)?shù)可以通過(guò)用[第一核苷酸序列中與第二核苷酸序列中相 應(yīng)位置的核苷酸相同的核苷酸數(shù)目]除以[第一核苷酸序列中的核苷酸總數(shù)]并且乘以[100% ]而計(jì)算，其中在第二核苷酸序列中核苷酸的每一缺失、插入、取代或添加——與第 一核苷酸序列相比——都視作在單一核苷酸(位置)的差異。備選地，兩種或更多種核苷 酸序列之間的序列同一性程度可以使用已知的用于序列比對(duì)的計(jì)算機(jī)算法使用標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置 進(jìn)行計(jì)算，所述計(jì)算機(jī)算法諸如NCBI Blast ν2· 0。例如，在W004/037999，EP 0 967 284， EP 1 085 089, WO 00/55318, WO 00/78972，W098/49185 和 GB 2 357 768-A 中描述了用于 確定序列同一性程度的一些其它的技術(shù)、計(jì)算機(jī)算法和設(shè)置。通常，出于按照上文列出的計(jì) 算方法來(lái)確定兩種核苷酸序列之間的“序列同一性”的百分?jǐn)?shù)的目的，將具有最大核苷酸數(shù) 目的核苷酸序列視作“第一”核苷酸序列，并且將另一種核苷酸序列視作“第二”核苷酸序 列；k)出于比較兩種或更多種氨基酸序列的目的，第一氨基酸序列和第二氨基酸序列 之間的“序列同一性”百分?jǐn)?shù)(在本文也稱為“氨基酸同一性”)可以通過(guò)用[第一氨基酸 序列中與第二氨基酸序列中相應(yīng)位置的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基數(shù)目]除以[第一 氨基酸序列中的氨基酸殘基總數(shù)]并且乘以[100% ]而計(jì)算，其中第二氨基酸序列中氨基 酸殘基的每一缺失、插入、取代或添加一與第一氨基酸序列相比一都視作在單一氨基 酸殘基(位置)上的差異，即，視作本發(fā)明所定義的“氨基酸差異”。備選地，兩種氨基酸序 列之間的序列同一性程度可以使用已知的計(jì)算機(jī)算法進(jìn)行計(jì)算，諸如上文提及的用于確定 核苷酸序列的序列同一性程度的那些，其仍舊使用標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置。通常，出于按照上文列出的 計(jì)算方法來(lái)確定兩種氨基酸序列之間的“序列同一性”的百分?jǐn)?shù)的目的，將具有最大氨基酸 殘基數(shù)目的氨基酸序列視作“第一”氨基酸序列，并且將另一種氨基酸序列視作“第二”氨 基酸序列。此外，在確定兩種氨基酸序列之間的序列同一性程度時(shí)，專業(yè)技術(shù)人員可以考慮 所謂的“保守”氨基酸取代，其通常可以描述為這樣的氨基酸取代，即，其中氨基酸殘基被具 有相似化學(xué)結(jié)構(gòu)的另一種氨基酸殘基取代，并且其對(duì)所述多肽的功能、活性或其它生物學(xué) 性質(zhì)幾乎沒(méi)有或者基本上沒(méi)有影響。這種保守氨基酸取代是本領(lǐng)域內(nèi)公知的，例如，從WO 04/037999,GB-A-2 357 768, WO 98/49185, WO 00/46383 和 WO 01/09300 中可知；并且可以 基于WO 04/037999以及WO 98/49185和其中所引用的其它參考文獻(xiàn)的相關(guān)教導(dǎo)而選擇這 種取代的(優(yōu)選)類型和/或結(jié)合。所述保守取代優(yōu)選地是這樣的取代，S卩，其中下列組(a)-(e)內(nèi)的一個(gè)氨基酸被 同組內(nèi)的另一氨基酸殘基取代(a)小的脂肪族、非極性或弱極性的殘基:Ala，Ser, Thr, Pro和Gly ;(b)極性、帶負(fù)電荷的殘基及其(不帶電荷的)酰胺Asp，Asn，Glu和Gln ； (c) 極性、帶正電荷的殘基=His, Arg ^P Lys ； (d)大的脂肪族、非極性殘基:Met, Leu, lie, Val和 Cys ；以及(e)芳族殘基=Phe, Tyr和Trp0特別優(yōu)選的保守取代如下Ala取代成Gly或取代成Ser ；Arg取代成Lys ；Asn取 代成Gln或取代成His ；Asp取代成Glu ；Cys取代成Ser ；Gln取代成Asn ；Glu取代成Asp ； Gly取代成Ala或取代成Pro ；His取代成Asn或取代成Gln ;Ile取代成Leu或取代成Val ； Leu取代成Ile或取代成Val ；Lys取代成Arg，取代成Gln或取代成Glu ；Met取代成Leu， 取代成Tyr或取代成Ile ；Phe取代成Met，取代成Leu或取代成Tyr ；Ser取代成Thr ；Thr 取代成Ser ；Trp取代成Tyr ；Tyr取代成Trp ；和/或Phe取代成Val，取代成Ile或取代成 Leu0用于本文所述的多肽的任何氨基酸取代還可以基于Schulz等，蛋白結(jié)構(gòu)原理(Principles of Protein Structure), Springer-Verlag, 1978 ^MW^I^^ft Wl^JiJIS 白之間的氨基酸變異頻率的分析，基于Chou和Fasman，生物化學(xué)(Biochemistry) 13 :211， 1974和高級(jí)酶學(xué)(Adv. Enzymo 1.)，47 =45-149,1978研究的結(jié)構(gòu)形成潛力的分析，和基于 Eisenberg 等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)(Proc. Nad. Acad Sci. USA) 81 140-144，1984 ;Kyte 和 Doolittle ；分子生物學(xué)雜志(J Molec. Biol.). 157 :105_132，1981，以及 Goldman 等，物 理化學(xué)綜述年刊(Ann. Rev. Biophys. Chem.). 15 =321-353,1986研究的蛋白中疏水模式的 分析，所有這些通過(guò)引用完全結(jié)合于此。在本文描述和上文引用的公知背景技術(shù)中給出 關(guān)于納米抗體的一級(jí)、二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的信息。此外，出于這一目的，例如，Desmyter等， 自然結(jié)構(gòu)生物學(xué)(Nature Structural Biology)，卷 3，9，803 (1996) ；Spinelli 等，自然 結(jié)構(gòu)生物學(xué)(Natural Structural Biology) (1996) ；3，752-757 ；和 Decanniere 等，結(jié)構(gòu) (Structure)，卷7，4，361 (1999)給出來(lái)自美洲駝(llama)的Vhh結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)。關(guān) 于在常規(guī)Vh結(jié)構(gòu)域中形成界面的一些氨基酸殘基和在這些位置的潛在的駱駝源化 (camelizing)取代的其它信息可以在上文引用的現(xiàn)有技術(shù)中找到。1)如果在它們的全長(zhǎng)有100%的序列同一性(如本文所定義)，那么認(rèn)為氨基酸序 列和核酸序列“完全相同”。m)當(dāng)比較兩種氨基酸序列時(shí)，術(shù)語(yǔ)“氨基酸差異，，是指與第二序列相比，在第一序 列位置上的單個(gè)氨基酸殘基的插入、缺失或取代；應(yīng)該理解兩種氨基酸序列可以包含1個(gè)、 2個(gè)或多個(gè)這樣的氨基酸差異。η)當(dāng)認(rèn)為核苷酸序列或氨基酸序列分別“包括”另一個(gè)核苷酸序列或氨基酸序列， 或“基本由”另一個(gè)核苷酸序列或氨基酸序列“組成”時(shí)，這可以意指后一個(gè)核苷酸序列或 氨基酸序列已經(jīng)分別結(jié)合在最先提及的核苷酸序列或氨基酸序列中，但是更通常地，這一 般意指最先提及的核苷酸序列或氨基酸序列在其序列內(nèi)分別包括核苷酸或氨基酸殘基的 序列，其分別與后一個(gè)序列具有相同的核苷酸序列或氨基酸序列，而不管實(shí)際上已經(jīng)怎樣 產(chǎn)生或獲得最先提及的序列(例如，其可以通過(guò)本發(fā)明所述的任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行)。通過(guò) 非限制性實(shí)例的方式，當(dāng)認(rèn)為本發(fā)明的納米抗體包括CDR序列時(shí)，這可以意指所述CDR序列 已經(jīng)結(jié)合在本發(fā)明的納米抗體內(nèi)，但是更通常地，這一般意指本發(fā)明的納米抗體在其序列 內(nèi)包含具有與所述CDR序列相同的氨基酸序列的氨基酸殘基序列，而不管已經(jīng)怎樣產(chǎn)生或 獲得所述本發(fā)明的納米抗體。還應(yīng)該注意到，當(dāng)后一個(gè)氨基酸序列具有特異性生物學(xué)或結(jié) 構(gòu)功能時(shí)，它優(yōu)選地具有與在最先提及的氨基酸序列中的基本相同、相似或等價(jià)的生物學(xué) 或結(jié)構(gòu)功能(換言之，最先提及的氨基酸序列優(yōu)選是這樣的，以致后一個(gè)序列能夠?qū)嵤┗?本上相同的、相似的或等價(jià)的生物學(xué)或結(jié)構(gòu)功能)。例如，當(dāng)認(rèn)為本發(fā)明的納米抗體分別包 括CDR序列或構(gòu)架序列時(shí)，在所述納米抗體中的所述CDR序列和構(gòu)架優(yōu)選地分別能夠作為 CDR序列或構(gòu)架序列行使功能。此外，當(dāng)認(rèn)為核苷酸序列包括另一個(gè)核苷酸序列時(shí)，最先提 及的核苷酸序列優(yōu)選是這樣的，以致當(dāng)它被表達(dá)成表達(dá)產(chǎn)物(例如，多肽)時(shí)，由后一個(gè)核 苷酸序列編碼的氨基酸序列形成所述表達(dá)產(chǎn)物的一部分(換言之，后一個(gè)核苷酸序列處在 與所述最先提及的、較大的核苷酸序列相同的閱讀框內(nèi))。ο)核酸序列或氨基酸序列視作“(以)基本上分離的(形式)”——例如，與其天 然生物來(lái)源和/或其從中獲得的反應(yīng)介質(zhì)或培養(yǎng)介質(zhì)相比——此時(shí)其已經(jīng)與其通常在所述 來(lái)源或介質(zhì)中與之結(jié)合的至少一種其它成分(諸如另一種核酸，另一種蛋白/多肽，另一種生物成分或高分子或至少一種污染物、雜質(zhì)或微量組分)分離。特別地，當(dāng)它已被純化至 少2倍，特別是至少10倍，更特別地至少100倍，并且達(dá)到1000倍或更多時(shí)，認(rèn)為核酸序列 或氨基酸序列“基本上分離”。當(dāng)使用適當(dāng)技術(shù)(諸如適當(dāng)?shù)膶游黾夹g(shù)，諸如聚丙烯酰胺凝 膠電泳技術(shù))確定時(shí)，“以基本上分離形式”的核酸序列或氨基酸序列優(yōu)選地基本上是均相 的；ρ)當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“結(jié)構(gòu)域”通常是指氨基酸序列的球狀區(qū)域(如抗體鏈，并 且特別是指重鏈抗體的球狀區(qū)域)，或者指基本上由所述球狀區(qū)域組成的多肽。通常，例如， 這樣的結(jié)構(gòu)域包括作為片層或通過(guò)二硫鍵而穩(wěn)定的肽環(huán)(例如3或4個(gè)肽環(huán))；術(shù)語(yǔ)“結(jié)合 結(jié)構(gòu)域”指這樣的結(jié)構(gòu)域，其針對(duì)抗原決定簇(如本文定義)；q)術(shù)語(yǔ)‘抗原決定簇’是指抗原上由抗原_結(jié)合分子(諸如本發(fā)明的納米抗體或 多肽)并且更特別是所述分子的抗原-結(jié)合位點(diǎn)而識(shí)別的表位。術(shù)語(yǔ)“抗原決定簇”和“表 位”在本文中還可以互換地使用；r)對(duì)于特定的抗原決定簇、表位、抗原或蛋白(或?qū)τ谥辽倨涞囊徊糠?、片段或?位)可以(特異性)結(jié)合、具有親和性和/或具有特異性的氨基酸序列(諸如本發(fā)明的納 米抗體、抗體、多肽，或通常為抗原結(jié)合蛋白或多肽或其片段)認(rèn)為是“抗(against)”或者 “針對(duì)(directed against) ”所述抗原決定簇、表位、抗原或蛋白。s)術(shù)語(yǔ)“特異性”是指特定的抗原-結(jié)合分子或抗原-結(jié)合蛋白(諸如本發(fā)明的 納米抗體或多肽)分子可以結(jié)合的不同類型的抗原或抗原決定簇的數(shù)目。一種抗原-結(jié) 合蛋白的特異性可以依據(jù)親和性和/或抗體親抗原性(avidity)而確定。親和性，表示為 抗原與抗原_結(jié)合蛋白的解離平衡常數(shù)(KD)，是抗原決定簇和所述抗原_結(jié)合蛋白上抗 原-結(jié)合位點(diǎn)之間的結(jié)合強(qiáng)度的量度KD值越小，抗原決定簇和抗原-結(jié)合分子之間的結(jié)合 強(qiáng)度越強(qiáng)(備選地，親和性還可以表示為親和常數(shù)(Ka)，其為1/KD)。專業(yè)技術(shù)人員應(yīng)該清 楚(例如，基于本發(fā)明進(jìn)一步的公開(kāi)內(nèi)容)，親和性可以以本身已知的方式確定，其取決于 特定的目的抗原?？贵w親抗原性是抗原-結(jié)合分子(諸如本發(fā)明的納米抗體或多肽)和相 關(guān)抗原之間的結(jié)合強(qiáng)度的量度?？贵w親抗原性與抗原決定簇及其在抗原_結(jié)合分子上的抗 原結(jié)合位點(diǎn)之間的親和性以及在所述抗原_結(jié)合分子上存在的相關(guān)結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目相關(guān)。 典型地，抗原-結(jié)合蛋白(諸如本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體和/或多肽)將以IiT5-IO-12 摩爾/升或更小、并且優(yōu)選地10_7-10_12摩爾/升或更小并且更優(yōu)選地10_8-10_12摩爾/升 的解離常數(shù)(Kd) ( S卩，以IO5-IO12升/摩爾或更大、并且優(yōu)選地IO7-IO12升/摩爾或更大、且 更優(yōu)選地IO8-IO12升/摩爾的締合常數(shù)(Ka))而結(jié)合它們的抗原。任何大于IO4摩爾/升 的Kd值(或任何小于IO4M-1的Ka值)升/摩爾通常認(rèn)為指示非特異性結(jié)合。優(yōu)選地，本發(fā) 明的單價(jià)免疫球蛋白序列將以小于500nM、優(yōu)選地小于200nM、更優(yōu)選地小于IOnM諸如小于 500pM的親和性與需要的抗原結(jié)合。抗原_結(jié)合蛋白與抗原或抗原決定簇的特異性結(jié)合可 以以本身已知的任何適當(dāng)?shù)姆椒ù_定，其包括，例如，斯卡查德分析(Scatchard analysis) 和/或競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合檢測(cè)，諸如放射性免疫測(cè)定(RIA)、酶免疫測(cè)定(EIA)和夾心式(sandwich) 競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定，和本領(lǐng)域本身已知的其不同的變化；以及本發(fā)明提及的其它技術(shù)。專業(yè)技術(shù)人員應(yīng)該清楚，解離常數(shù)可以是實(shí)際的或表觀解離常數(shù)。確定解離常數(shù) 的方法對(duì)于專業(yè)技術(shù)人員應(yīng)該是清楚的，并且例如，包括本發(fā)明提及的技術(shù)。在這一點(diǎn)上， 還應(yīng)該清楚，不可能測(cè)量大于10_4摩爾/升或10_3摩爾/升(例如，IO-2摩爾/升)的解離常數(shù)。任選地，專業(yè)技術(shù)人員應(yīng)該清楚，可以根據(jù)(實(shí)際或表觀)締合常數(shù)(Ka)利用[Kd = 1/KA]的關(guān)系計(jì)算所述(實(shí)際或表觀)解離常數(shù)。親和性表示分子相互作用的強(qiáng)度或穩(wěn)定性。親和性通常作為Kd或解離常數(shù)給出， 其具有的單位為摩爾/升(或M)。親和性還可以表示為締合常數(shù)KA，其等于1/KD，并且具 有的單位為(摩爾/升廣乂或M—1)。在本說(shuō)明書中，兩個(gè)分子(諸如本發(fā)明的氨基酸序列、 納米抗體或多肽及其目的靶點(diǎn))之間的相互作用的穩(wěn)定性將主要以它們相互作用的Kd值 表示；專業(yè)技術(shù)人員應(yīng)該清楚，考慮到Ka = 1/KD的關(guān)系，通過(guò)其Kd值表示分子相互作用的 強(qiáng)度也可以用于計(jì)算相對(duì)應(yīng)的Ka值。由于Kd-值通過(guò)公知的關(guān)系式DG = RT. In(K11)(等價(jià) 于DG = -RT. In (Ka))與結(jié)合的自由能(DG)相關(guān)，Kd-值還在熱力學(xué)意義上表征分子相互作 用的強(qiáng)度，在所述關(guān)系式中，R等于氣體常數(shù)，T等于絕對(duì)溫度，并且In表示自然對(duì)數(shù)。關(guān)于認(rèn)為是有意義的(例如，特異性的)生物學(xué)相互作用的Kd典型地在 IO^10M(0. InM)-IO^5M(IOOOOnM)范圍內(nèi)。相互作用越強(qiáng)，其Kd越低。Kd也可以表示為復(fù)合體 的解離速率常數(shù)(表示為k。ff)與其締合速率(表示為k。n)的比例(因此Kd = k。ff/k。n和Ka =k。n/k。ff)。解離速率k。ff具有單位S—1 (其中S是秒的SI單位符號(hào))。締合速率k。n具有 單位Υ1。締合速率可以在IO2M4iT1-約IOl1iT1之間變化，達(dá)到關(guān)于兩分子相互作用的擴(kuò) 散-極限締合速率常數(shù)。解離速率以關(guān)系式t1/2 = ln(2)/k。ff與給定的分子相互作用的半 衰期相關(guān)。解離速率可以在KTfV1 (接近具有數(shù)天的t1/2的不可逆復(fù)合體)到Is—1 (t1/2 = 0. 69s)之間變化。兩個(gè)分子之間的分子相互作用的親和性可以通過(guò)本身已知的不同技術(shù)測(cè)量，諸 如公知的表面等離子體共振(SPR)生物傳感器技術(shù)(例如，參見(jiàn)Ober等，國(guó)際免疫學(xué) (Intern. Immunology)，13，1551-1559，2001)，其中將一個(gè)分子固定在生物傳感器芯片上， 另一個(gè)分子在流動(dòng)條件下經(jīng)過(guò)所固定的分子，產(chǎn)生k。n，k。ff測(cè)量值以及因此產(chǎn)生Kd(或Ka) 值。例如，這可以使用公知的BIAC0RE儀器進(jìn)行。專業(yè)技術(shù)人員還應(yīng)該理解，如果測(cè)量過(guò)程以某種方式影響暗指的分子的內(nèi)在結(jié)合 親和性，例如通過(guò)與一個(gè)分子的生物傳感器上的涂層相關(guān)的人為產(chǎn)物影響，則測(cè)量的Kd可 以與表觀Kd相對(duì)應(yīng)。此外，如果一個(gè)分子含有針對(duì)另一個(gè)分子的多于一個(gè)的識(shí)別位點(diǎn)，則 可以測(cè)量表觀KD。在這樣的情形中，所測(cè)量的親和性可以受到兩個(gè)分子之間相互作用的抗 體親抗原性的影響。可以用來(lái)評(píng)估親和性的另一個(gè)方法是Friguet等(免疫方法雜志(J. Immunol. Methods), 77, 305-19,1985)的2步ELISA (酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)方法。該方法建立溶液相 結(jié)合平衡測(cè)量，并且避免與在支持物如塑料上的一個(gè)分子的吸附相關(guān)的可能的人為產(chǎn)物。然而，Kd的準(zhǔn)確測(cè)量可能是非常費(fèi)力的，并且作為結(jié)果，通常確定表觀Kd值來(lái)評(píng)估 兩個(gè)分子的結(jié)合強(qiáng)度。應(yīng)該注意到，只要所有的測(cè)量以一致的方式(例如，保持測(cè)定條件不 變)進(jìn)行，表觀Kd測(cè)量可以用作真實(shí)Kd的近似值，并且因此在本文獻(xiàn)中，應(yīng)該以同等的重要 性或相關(guān)性對(duì)待Kd和表觀KD。最后，應(yīng)該注意到，在許多情形中，有經(jīng)驗(yàn)的科學(xué)家可以判斷相對(duì)于一些參照分子 確定結(jié)合親和力是便利的。例如，為了評(píng)估分子A和B之間的結(jié)合強(qiáng)度，例如，人們可以使 用已知與B結(jié)合且用熒光團(tuán)或生色團(tuán)或其它化學(xué)部分適合標(biāo)記的參照分子C，諸如在ELISA 或FACS(熒光活化的細(xì)胞分選)中容易檢測(cè)的生物素、或其它形式(用于熒光檢測(cè)的熒光團(tuán)，用于光吸收檢測(cè)的生色團(tuán)，用于鏈霉抗生物素蛋白_介導(dǎo)的ELISA檢測(cè)的生物素)。典 型地，參照分子C保持在固定的濃度，并且A的濃度關(guān)于B的給定的濃度或量變化。結(jié)果， 對(duì)應(yīng)于A的濃度獲得IC5tl值，在所述A的濃度下將在不存在A的條件下C的測(cè)量信號(hào)減半。 假定已知參照分子的KD，即Kd ref,以及參照分子的總濃度Cref，則可以通過(guò)下式獲得關(guān)于A-B 相互作用的表觀Kd =Kd = IC50/ (1+cref/Kd ref)。注意，如果cMf < < Kd ref,則Kd IC500假定 以一致的方式(例如，保持cMf不變)針對(duì)比較的結(jié)合劑進(jìn)行IC5tl測(cè)量，則分子相互作用的 強(qiáng)度或穩(wěn)定性可以通過(guò)IC5tl進(jìn)行評(píng)估，并且在本發(fā)明的整個(gè)內(nèi)容中，認(rèn)為該測(cè)量值等價(jià)于 Kd或等價(jià)于表觀Kd。t)本發(fā)明的氨基酸序列、化合物或多肽的半衰期通?？梢远x為所述氨基酸序 列、化合物或多肽的血清濃度在體內(nèi)減少50%所花費(fèi)的時(shí)間，例如，由于所述序列或化合 物的降解和/或通過(guò)天然機(jī)制對(duì)所述序列或化合物的清除或螯合(sequestration)。本發(fā) 明的氨基酸序列、化合物或多肽的體內(nèi)半衰期可以以本身已知的任何方式確定，諸如通過(guò) 藥物動(dòng)力學(xué)分析。適當(dāng)?shù)募夹g(shù)對(duì)于本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員應(yīng)該是清楚的，并且例如，通常可 以包括下列步驟將適當(dāng)劑量的本發(fā)明的氨基酸序列、化合物或多肽適當(dāng)施用給溫血?jiǎng)游?(即，施用給人或另一種適當(dāng)?shù)牟溉閯?dòng)物，諸如小鼠、兔、大鼠、豬、狗或靈長(zhǎng)類動(dòng)物，例如來(lái) 自獼猴屬的猴子(諸如，并且特別是食蟹猴(食蟹猴(Macaca fascicularis))和/或恒河 猴(恒河猴(Macaca mulatta)))和狒狒(豚尾狒狒(Papio ursinus)))；從所述動(dòng)物收集 血液樣品或其它樣品；確定在所述血液樣品中的本發(fā)明的氨基酸序列、化合物或多肽的水 平或濃度；并且從這樣獲得的數(shù)據(jù)(數(shù)據(jù)的圖表)計(jì)算與在給藥時(shí)的初始水平相比較直到 本發(fā)明的氨基酸序列、化合物或多肽的水平或濃度已經(jīng)減少50%的時(shí)間。例如，參考下述 實(shí)驗(yàn)部分，以及標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)，諸如Kenneth，A等藥物的化學(xué)穩(wěn)定性藥劑師手冊(cè)(Chemical Stability of Pharmaceuticals :A Handbook for Pharmacists)禾口 Peters 等，藥物動(dòng)力 學(xué)分子實(shí)踐方法(Pharmacokinete analysis :A Practical Approach) (1996)。還參考〃 藥物動(dòng)力學(xué)(Pharmacokinetics) “，M Gibaldi 和 D Perron, Marcel Dekker 出版，第 2 綜 述版(2nd Rev. edition) (1982)。專業(yè)技術(shù)人員還應(yīng)該清楚(例如，參見(jiàn)WO 04/003019的第6和7頁(yè)以及其中引用 的其它參考文獻(xiàn))，半衰期可以用參數(shù)如tl/2-α，tl/2-β和曲線下面積(AUC)表示。在 本說(shuō)明書中，“半衰期增加”是指在這些參數(shù)的任何一種的增加，諸如這些參數(shù)的任何兩種， 或基本上所有這三種參數(shù)的增加。當(dāng)用于本發(fā)明時(shí)，“半衰期增加”或“增加的半衰期”特別 是指tl/2-β的增加，具有或不具有tl/2-α和/或AUC或二者的增加。u)在本發(fā)明的上下文中，“調(diào)節(jié)(modulating)”或“調(diào)節(jié)(to modulate) ”通常意 指減少或抑制靶標(biāo)或抗原的活性，或備選地增加靶標(biāo)或抗原的活性，如使用適當(dāng)?shù)捏w外、細(xì) 胞或體內(nèi)測(cè)定法測(cè)量的。特別地，“調(diào)節(jié)(modulating)”或“調(diào)節(jié)(to modulate) ”可以意 指減少或抑制靶標(biāo)或抗原的活性，或備選地增加靶標(biāo)或抗原的(相關(guān)或目的)生物學(xué)活性， 如使用適當(dāng)?shù)捏w外、細(xì)胞或體內(nèi)測(cè)定法(其通常將取決于涉及的靶標(biāo)或抗原)測(cè)量的，與 在相同條件但不存在本發(fā)明的構(gòu)建體的條件下，在相同測(cè)定中的所述靶標(biāo)或抗原的活性相 比較，至少1%，優(yōu)選至少5%，諸如至少10%或至少25%，例如至少50%，至少60%，至少 70%，至少80%，或90%或更多。專業(yè)技術(shù)人員應(yīng)該清楚，“調(diào)節(jié)”還可以包括與相同條件但不存在本發(fā)明的構(gòu)建體
22相比較，對(duì)靶標(biāo)或抗原對(duì)其配體、結(jié)合配偶體、締合成同源多聚體或異源多聚體形式的配偶 體、或底物中的一種或多種的親和力、抗體親抗原性、特異性和/或選擇性形成改變(其可 以是增加或減少)；和/或?qū)λ霭袠?biāo)或抗原對(duì)于在所述靶標(biāo)或抗原存在于其中的介質(zhì)或 環(huán)境的一種或多種條件(諸如PH、離子強(qiáng)度、輔因子的存在、等等)的敏感性施加改變(其 可以是增加或減少)。專業(yè)技術(shù)人員應(yīng)該清楚，這同樣可以以適當(dāng)?shù)姆绞胶?或使用本身已 知的任何適當(dāng)?shù)臏y(cè)定法來(lái)確定，這取決于所涉及的靶標(biāo)或抗原?！罢{(diào)節(jié)”還可以意指對(duì)所述靶標(biāo)或抗原參與其中(或包括其(多個(gè))底物、(多個(gè)) 配體、或(多個(gè))途徑參與其中，如其信號(hào)傳導(dǎo)途徑或代謝途徑以及它們相關(guān)的生物學(xué)或 生理學(xué)作用)的一種或多種生物學(xué)或生理學(xué)機(jī)制、作用、反應(yīng)、功能、途徑或活性施加改變 (即，分別作為激動(dòng)劑、作為拮抗劑或作為反激動(dòng)劑的活性，這取決于所述靶標(biāo)或抗原和需 要的生物學(xué)或生理學(xué)作用)。同樣，專業(yè)技術(shù)人員應(yīng)該清楚，這樣的作為激動(dòng)劑或拮抗劑的 作用可以以任何適當(dāng)方式和/或使用本身已知的任何適當(dāng)?shù)?體外且通常是細(xì)胞或體內(nèi)測(cè) 定法)測(cè)定法確定，這取決于所涉及的靶標(biāo)或抗原。特別地，作為激動(dòng)劑或拮抗劑的作用可 以是這樣的，以致與在相同條件下但不存在本發(fā)明的構(gòu)建體的相同測(cè)定法中的生物學(xué)或生 理學(xué)活性相比，分別將目的生物學(xué)或生理學(xué)活性增加或減少至少1 %，優(yōu)選至少5 %，諸如 至少10%或至少25%，例如至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，或90%或更多。例如，調(diào)節(jié)還可以包括所述靶標(biāo)或抗原的別構(gòu)調(diào)節(jié)；和/或減少或抑制所述靶標(biāo) 或抗原與其底物或配體之一的結(jié)合和/或與天然配體、底物競(jìng)爭(zhēng)與所述靶標(biāo)或抗原的結(jié) 合。調(diào)節(jié)還可以包括激活所述靶標(biāo)或抗原或所述靶標(biāo)或抗原參與其中的機(jī)制或途徑。例如， 調(diào)節(jié)還可以包括對(duì)所述靶標(biāo)或抗原的折疊或構(gòu)象、或?qū)λ霭袠?biāo)或抗原折疊的能力形成改 變，以改變其構(gòu)象(例如，在與配體結(jié)合時(shí))，以與其他(亞)單位締合，或以解聚。例如，調(diào) 節(jié)還可以包括對(duì)所述靶標(biāo)或抗原轉(zhuǎn)運(yùn)其他化合物或作為其他化合物(諸如離子)的通道的 能力形成改變。調(diào)節(jié)可以是可逆的或不可逆的，但是對(duì)于藥學(xué)和藥理學(xué)目的，通常應(yīng)該是以可逆 的方式。ν)關(guān)于靶標(biāo)或抗原，術(shù)語(yǔ)在所述靶標(biāo)或抗原上的“相互作用位點(diǎn)”意指在所述靶標(biāo) 或抗原上的位點(diǎn)、表位、抗原決定簇、部分、結(jié)構(gòu)域或氨基酸殘基序列，其是所述靶標(biāo)或抗原 的用于結(jié)合配體、受體或其他結(jié)合配偶體的位點(diǎn)、催化位點(diǎn)、分解位點(diǎn)、別構(gòu)相互作用的位 點(diǎn)、參與多聚體化(如同源多聚體化或異源多聚體化)的位點(diǎn)；或是在所述靶標(biāo)或抗原上的 參與所述靶標(biāo)或抗原的生物學(xué)作用或機(jī)制的任何其他位點(diǎn)、表位、抗原決定簇、部分、結(jié)構(gòu) 域或氨基酸殘基序列。更一般地，“相互作用位點(diǎn)”可以是在所述靶標(biāo)或抗原上的本發(fā)明的 氨基酸序列或多肽可以與之結(jié)合的任何位點(diǎn)、表位、抗原決定簇、部分、結(jié)構(gòu)域或氨基酸殘 基序列，以致調(diào)節(jié)(如本文定義)所述靶標(biāo)或抗原(和/或其中包括所述靶標(biāo)或抗原的任 何途徑、相互作用、信號(hào)傳導(dǎo)、生物學(xué)機(jī)制或生物學(xué)作用)。w)認(rèn)為這樣的氨基酸序列或多肽是對(duì)第一靶標(biāo)或抗原“特異性的”，即，與第二靶 標(biāo)或抗原相比較，當(dāng)與第一抗原以是所述氨基酸序列或多肽與第二靶標(biāo)或多肽結(jié)合的親和 力的至少10倍、如至少100倍、且優(yōu)選至少1000倍、且多至10000倍或更多的親和力(如上 述，且適當(dāng)表示為Kd值、Ka值、k。ff-速率和/或k。n-速率)結(jié)合時(shí)。例如，所述第一抗原可 以以比所述氨基酸序列或多肽與所述第二靶標(biāo)或多肽結(jié)合的Kd小至少10倍、如小至少100
23倍、且優(yōu)選小至少1000倍、如小10000倍或者甚至更小的Kd值結(jié)合所述靶標(biāo)或抗原。優(yōu)選 地，當(dāng)氨基酸序列或多肽與第二靶標(biāo)或抗原相比較對(duì)第一靶標(biāo)或抗原是“特異性的”時(shí)，它 針對(duì)(如本文定義)所述第一靶標(biāo)或抗原，但是不針對(duì)所述第二靶標(biāo)或抗原。χ)術(shù)語(yǔ)“交叉阻斷(cross-block)”，“交叉阻斷的(cross-blocked) ”和“交叉阻 斷(cross-blocking)”在本文可以互換使用，用來(lái)意指氨基酸序列或其他結(jié)合試劑(如本 發(fā)明的多肽)干擾本發(fā)明的其他氨基酸序列或結(jié)合試劑與給定靶標(biāo)的結(jié)合的能力。本發(fā)明 的氨基酸序列或其他結(jié)合試劑能夠干擾另一種對(duì)[靶標(biāo)]的結(jié)合的程度，且因此其能否被 認(rèn)為是本發(fā)明所述的交叉阻斷的，可以使用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定法確定。一種特別適當(dāng)?shù)亩繙y(cè) 定法使用Biacore機(jī)器，其可以使用表面等離子體共振技術(shù)測(cè)量相互作用的程度。另一種 適當(dāng)?shù)亩拷徊孀钄鄿y(cè)定法使用基于ELISA的方法來(lái)測(cè)量氨基酸序列或其他結(jié)合試劑之 間對(duì)于它們與所述靶標(biāo)的結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)。以下概括描述用于確定氨基酸序列或其他結(jié)合試劑是否交叉阻斷或按照本發(fā)明 能夠交叉阻斷的適當(dāng)?shù)腂iacore測(cè)定法。應(yīng)該理解，所述測(cè)定法可以與本文所述的任何氨 基酸序列或其他結(jié)合試劑一起使用。按照供應(yīng)商的建議使用Biacore機(jī)器(例如，Biacore 3000)。因此，在一種交叉阻斷測(cè)定法中，使用標(biāo)準(zhǔn)胺偶聯(lián)化學(xué)將靶蛋白偶聯(lián)到CM5Biac0re 芯片上，以產(chǎn)生由所述靶標(biāo)包被的表面。典型地，200-800個(gè)共振單位的靶標(biāo)將被偶聯(lián)到芯 片上(易于給出可測(cè)量水平的結(jié)合但是易于被所用的測(cè)試試劑的濃度飽和的量)。將兩種 待檢測(cè)它們彼此交叉阻斷的能力的測(cè)試氨基酸序列(稱為A*和B*)以結(jié)合位點(diǎn)1 1摩爾 比例混合在適當(dāng)?shù)木彌_液中，以產(chǎn)生測(cè)試混合物。當(dāng)基于結(jié)合位點(diǎn)計(jì)算濃度時(shí)，假設(shè)氨基酸 序列的分子量是氨基酸序列的總分子量除以所述氨基酸序列上的靶標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目。測(cè) 試混合物中每種氨基酸序列的濃度應(yīng)該足夠高，足以易于飽和所述氨基酸序列關(guān)于捕獲在 Biacore芯片上的靶標(biāo)分子的結(jié)合位點(diǎn)。在所述混合物中的氨基酸序列處于相同的摩爾濃 度(基于結(jié)合)，且所述濃度典型地為1. 00-1. 5微摩爾(基于結(jié)合)。還制備僅包含A*和 僅包含B*的分開(kāi)的溶液。在這些溶液中的k*和B*應(yīng)該處在與在所述測(cè)試混合物中相同的 緩沖液中并且處于相同的濃度。將測(cè)試混合物通過(guò)靶標(biāo)_包被的Biacore芯片，且記錄結(jié) 合的總量。然后，以這樣的方式處理芯片，以在不損壞芯片-結(jié)合的靶標(biāo)的條件下去除結(jié)合 的氨基酸序列。典型地，這通過(guò)用30mMHCl處理芯片60秒進(jìn)行。然后，將僅有A*的溶液通 過(guò)靶標(biāo)_包被的表面，并記錄結(jié)合的量。同樣處理芯片，以在不損壞芯片_結(jié)合的靶標(biāo)的條 件下去除所有結(jié)合的氨基酸序列。然后，將僅有B*的溶液通過(guò)靶標(biāo)-包被的表面，并記錄 結(jié)合的量。接著計(jì)算k*和B*混合物的最大理論結(jié)合，且為每種氨基酸序列在單獨(dú)通過(guò)靶標(biāo) 表面時(shí)的結(jié)合的總和。如果實(shí)際記錄的混合物的結(jié)合小于該理論最大值，則該兩種氨基酸 序列彼此是交叉阻斷的。因此，通常，按照本發(fā)明的交叉阻斷的氨基酸序列或其他結(jié)合試劑 是一種在上述Biacore交叉阻斷測(cè)定法中將與靶標(biāo)結(jié)合的，以致在該測(cè)定法中且在存在本 發(fā)明的第二氨基酸序列或其他結(jié)合試劑時(shí)，所記錄的結(jié)合是組合的兩種氨基酸序列或結(jié)合 試劑的最大理論結(jié)合(如上文定義)的80% -0. 1% (例如，80% -4% )，特別地是最大理 論結(jié)合的75% -0. 1% (例如，75% -4% )，且更特別地是最大理論結(jié)合的70% -0. 1% (例 如，70% -4% )。上述Biacore測(cè)定法是用來(lái)確定氨基酸序列或其他結(jié)合試劑彼此是否是 按照本發(fā)明交叉阻斷的主要測(cè)定法。在很少的情形中，特定的氨基酸序列或其他結(jié)合試劑 可能不與通過(guò)胺化學(xué)偶聯(lián)到CM5 Biacore芯片上的靶標(biāo)結(jié)合(這通常在靶標(biāo)上的相關(guān)結(jié)合位點(diǎn)通過(guò)與芯片的偶聯(lián)而被遮蔽或破壞時(shí)發(fā)生)。在這樣的情形中，交叉阻斷可以使用標(biāo)記 形式的靶標(biāo)，例如 N 端 His-標(biāo)記的形式(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA ；2005 cat# 1406-ST-025)。以這種特定的形式，抗-His氨基酸序列將被偶聯(lián)到Biacore芯片上，然后 將His-標(biāo)記的靶標(biāo)通過(guò)芯片表面，并被所述抗-His氨基酸序列捕獲。交叉阻斷分析將基 本上按照上述進(jìn)行，除了在每次芯片再生循環(huán)之后，新的His-標(biāo)記的靶標(biāo)將被重新負(fù)載到 抗-His氨基酸序列包被的表面上。除了使用N端His-標(biāo)記的[靶標(biāo)]給出的實(shí)例之外， 可以備選地使用C端His-標(biāo)記的靶標(biāo)。此外，本領(lǐng)域已知的各種其他標(biāo)記和標(biāo)記結(jié)合蛋白 組合可以用于這樣的交叉阻斷分析(例如，具有抗-HA抗體的HA標(biāo)記；具有抗-FLAG抗體 的FLAG標(biāo)記；具有鏈霉抗生物素蛋白的生物素標(biāo)記)。 下述概括描述用于確定針對(duì)靶標(biāo)的氨基酸序列或其他結(jié)合試劑是否如本文所定 義那樣交叉阻斷或能夠交叉阻斷的ELISA測(cè)定法。應(yīng)該理解，所述測(cè)定法可以與本文所述 的任何氨基酸序列(或其他結(jié)合試劑，如本發(fā)明的多肽)一起使用。本測(cè)定法的一般原理 是使得針對(duì)所述靶標(biāo)的氨基酸序列或結(jié)合試劑包被到ELISA平板的孔上。將過(guò)量的量的第 二、潛在的交叉阻斷、抗-靶標(biāo)氨基酸序列添加到溶液中(即，不與ELISA平板結(jié)合)。然 后將有限量的靶標(biāo)添加到孔中。所述包被的氨基酸序列和溶液中的氨基酸序列競(jìng)爭(zhēng)與有限 量的靶標(biāo)分子的結(jié)合。洗滌平板，以去除未與包被的氨基酸序列結(jié)合的過(guò)量的靶標(biāo)，且還去 除第二、溶液相氨基酸序列以及在所述第二、溶液相氨基酸序列和靶標(biāo)之間形成的任何復(fù) 合物。然后，使用適于檢測(cè)所述靶標(biāo)的試劑測(cè)量結(jié)合的靶標(biāo)的量。相對(duì)于在不存在第二、溶 液相的氨基酸序列的條件下所述包被的氨基酸序列可以結(jié)合的靶標(biāo)分子的數(shù)量，溶液中能 夠交叉阻斷所包被的氨基酸序列的氨基酸序列將能夠引起所述包被的氨基酸序列可以結(jié) 合的靶標(biāo)分子的數(shù)量的減少。在其中選擇第_氨基酸序列如Ab-X作為固定的氨基酸序列 的情形中，它被包被到ELISA平板的孔上，之后使用適當(dāng)?shù)姆忾]溶液來(lái)封閉該平板，以最小 化隨后添加的試劑的非特異性結(jié)合。然后，將過(guò)量的量的第二氨基酸序列如Ab-Y添加到該 ELISA平板中，以致在包被所述ELISA平板的過(guò)程中，每孔Ab-Y [靶標(biāo)]結(jié)合位點(diǎn)的摩爾比 每孔所用的Ab-X[靶標(biāo)]結(jié)合位點(diǎn)的摩爾高至少10倍。然后，加入[靶標(biāo)]，以致每孔加入 的[靶標(biāo)]的摩爾比用于包被每孔的Ab-X[靶標(biāo)]結(jié)合位點(diǎn)的摩爾低至少25倍。在適當(dāng) 的溫育時(shí)間之后，洗滌ELISA平板，且加入用于檢測(cè)所述靶標(biāo)的試劑，以測(cè)量由所述包被的 抗-[靶標(biāo)]氨基酸序列(在該情形中為Ab-X)特異結(jié)合的靶標(biāo)的量。關(guān)于該測(cè)定法的背 景信號(hào)定義為在使用所述包被的氨基酸序列(在該情形中為Ab-X)、第二溶液相氨基酸序 列(在該情形中為Ab-Y)、僅有[靶標(biāo)]緩沖劑(即，無(wú)靶標(biāo))和靶標(biāo)檢測(cè)試劑的孔中獲得 的信號(hào)。關(guān)于該測(cè)定法的陽(yáng)性對(duì)照信號(hào)定義為在使用所述包被的氨基酸序列(在該情形中 為Ab-X)、僅有第二溶液相氨基酸序列緩沖劑(即，無(wú)第二溶液相氨基酸序列)、靶標(biāo)和靶標(biāo) 檢測(cè)試劑的孔中獲得的信號(hào)。該ELISA測(cè)定法可以以這樣的方式運(yùn)行，以使得陽(yáng)性對(duì)照信 號(hào)是背景信號(hào)的至少6倍。為了避免由選擇哪種氨基酸序列用作包被氨基酸序列和哪種用 作第二(競(jìng)爭(zhēng)劑)氨基酸序列導(dǎo)致的任何假象(例如，Ab-X和Ab-Y之間對(duì)于[靶標(biāo)]的 顯著不同的親和力)，該交叉阻斷測(cè)定法可以以兩種形式運(yùn)行1)形式1是其中Ab-X是包 被到ELISA平板上的氨基酸序列，Ab-Y是在溶液中的競(jìng)爭(zhēng)氨基酸序列，和2)形式2是其中 Ab-Y是包被到ELISA平板上的氨基酸序列，Ab-X是在溶液中的競(jìng)爭(zhēng)氨基酸序列。如果在形 式1或在形式2中，與在不存在溶液相抗-靶標(biāo)氨基酸序列的條件下(即，陽(yáng)性對(duì)照孔)獲得的靶標(biāo)檢測(cè)信號(hào)相比較，所述溶液相抗-靶標(biāo)氨基酸序列能夠引起靶標(biāo)檢測(cè)信號(hào)(即，由 所述包被的氨基酸序列結(jié)合的靶標(biāo)的量)減少60% -100%，特別地70% -100%，且更特別 地80% -100%，則Ab-X和Ab-Y被定義為是交叉阻斷的。y)如本發(fā)明進(jìn)一步所述，納米抗體中氨基酸殘基總數(shù)可以在110-130區(qū)間，優(yōu)選 112-115，并且最優(yōu)選113。然而，應(yīng)該注意納米抗體的部分、片段、類似物或衍生物(如本發(fā) 明進(jìn)一步所述)不特別限制它們的長(zhǎng)度和/或大小，只要這樣的部分、片段、類似物或衍生 物滿足本發(fā)明列出的進(jìn)一步要求，并且還優(yōu)選地適于本文所述的目的；ζ)除非另外指明，納米抗體的氨基酸殘基通常按照Kabat等(“免疫學(xué)目的蛋白的 序列(Sequence ofproteins of immunological interest)，，,美國(guó)公眾健康月艮務(wù)中心(US Public Health Services)，NIH貝塞斯達(dá)，MD，公開(kāi)號(hào)91)給出的關(guān)于Vh結(jié)構(gòu)域的通用編號(hào) 方式進(jìn)行編號(hào)，這種編號(hào)方式在Riechmann和Muyldermans，免疫學(xué)方法雜志(J. Immunol. Methods) 2000年6月23日；240(1-2) :185_195的文章中用于來(lái)自駱駝科動(dòng)物的Vhh結(jié)構(gòu)域 (例如，參見(jiàn)該出版物的圖2)；或參照本文。按照這種編號(hào)方式，納米抗體的FRl包括位置 1-30的氨基酸殘基，納米抗體的⑶Rl包括位置31-35的氨基酸殘基，納米抗體的FR2包括 位置36-49的氨基酸，納米抗體的⑶R2包括位置50-65的氨基酸殘基，納米抗體的FR3包 括位置66-94的氨基酸殘基，納米抗體的⑶R3包括位置95-102的氨基酸殘基，以及，納米 抗體的FR4包括位置103-113的氨基酸殘基。[在這一方面，應(yīng)該注意——如在本領(lǐng)域內(nèi)關(guān) 于Vh結(jié)構(gòu)域和關(guān)于Vhh結(jié)構(gòu)域公知的——在每一 CDR中的氨基酸殘基的總數(shù)可以不同，并 且可以不與由Kabat編號(hào)方式指示的氨基酸殘基的總數(shù)相對(duì)應(yīng)(即，按照Kabat編號(hào)方式 的一個(gè)或多個(gè)位置可能不占據(jù)在實(shí)際序列中，或者實(shí)際序列可能包含比由Kabat編號(hào)方式 允許的數(shù)目更多的氨基酸殘基)。這意味著，通常，按照Kabat的編號(hào)方式可能與或可能不 與實(shí)際序列中的氨基酸殘基的實(shí)際編號(hào)方式相對(duì)應(yīng)。然而，通?？梢哉J(rèn)為，按照Kabat的編 號(hào)方式并且不考慮CDR中的氨基酸殘基的數(shù)目，按照Kabat編號(hào)方式的位置1對(duì)應(yīng)FRl的 起點(diǎn)，并且反之亦然，按照Kabat編號(hào)方式的位置36對(duì)應(yīng)FR2的起點(diǎn)，并且反之亦然，按照 Kabat編號(hào)方式的位置66對(duì)應(yīng)FR3的起點(diǎn)，并且反之亦然，以及按照Kabat編號(hào)方式的位置 103對(duì)應(yīng)FR4的起點(diǎn)，并且反之亦然。]。用于編號(hào)乂11結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基的備選方法是由Chothia等(自然(NatUre)342， 877-883 (1989))所述的方法，即所謂的“AbM定義”和所謂的“聯(lián)系定義”，所述方法還可以 以類似的方式用于來(lái)自駱駝科動(dòng)物的Vra結(jié)構(gòu)域以及用于納米抗體。然而，在本說(shuō)明書、各 方面和附圖中，遵循由Riechmarm和Muyldermans用于Vhh結(jié)構(gòu)域的按照Kabat的編號(hào)方 式，除非另外指明；以及aa)如本文所提到的穩(wěn)定性涉及隨時(shí)間變化的化學(xué)穩(wěn)定性，即，本發(fā)明的蛋白、多 肽或單可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)性基本序列的穩(wěn)定性。例如，如果本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員測(cè)試目的 化合物，并且不能找到蛋白或多肽的基本序列(例如，隨時(shí)間變化的基本氨基酸序列)中的 任何變化(或僅有微小的變化，例如通過(guò)諸如RPC或HIC的分離技術(shù)，例如，在指定樣品中 小于1 %，2 %，3%，4%，5%，10%的其他物質(zhì))，則該蛋白或多肽被認(rèn)為隨著測(cè)量的時(shí)間周 期和指定的條件諸如，例如，溫度是穩(wěn)定的。bb)給出附圖、序列表和實(shí)驗(yàn)部分/實(shí)施例只是進(jìn)一步舉例說(shuō)明本發(fā)明，并且不應(yīng) 該被解釋為或者認(rèn)為以任何方式限制本發(fā)明和/或后附的權(quán)利要求的范圍，除非本文中另
26外明確指明。不限于此，納米抗體，(單)結(jié)構(gòu)域抗體或“dAb’ S”可來(lái)源于4鏈抗體的可變區(qū)以 及來(lái)源于重鏈抗體的可變區(qū)。根據(jù)下面參考文獻(xiàn)中使用的方法學(xué)，存在于天然存在的重鏈 抗體中的可變區(qū)也將被稱為“Vhh結(jié)構(gòu)域”，以便將它們與存在于常規(guī)4鏈抗體中的重鏈可變 結(jié)構(gòu)域(本文下面將稱為構(gòu)域”)和存在于常規(guī)4鏈抗體中的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(本文 下面將稱為結(jié)構(gòu)域”)相區(qū)分。因此，不限于此，本發(fā)明的多肽或蛋白具有包括4個(gè)構(gòu)架區(qū)(分別為FR1-FR4)和3 個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(分別為CDR1-CDR3)或基本上由其組成的氨基酸序列。此類氨基酸序列優(yōu) 選地含有80-200個(gè)氨基酸殘基，諸如90-150個(gè)氨基酸殘基，諸如約100-130個(gè)氨基酸殘基 (盡管也可使用此氨基酸序列的合適片段，即，基本上如本文對(duì)本發(fā)明的納米抗體或其等價(jià) 物所述)，并且優(yōu)選是這樣的，即其形成免疫球蛋白折疊，或是這樣的，即，在適當(dāng)?shù)臈l件下， 其能夠形成免疫球蛋白折疊(即，通過(guò)適當(dāng)?shù)恼郫B)。氨基酸序列優(yōu)選地選自納米抗體，結(jié) 構(gòu)域抗體，單結(jié)構(gòu)域抗體或“dAb’ s”，并且最優(yōu)選地是如本文所述的納米抗體。CDR’ s可以 是對(duì)多肽或蛋白提供所需特性的任何合適的CDR’ S。本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)勢(shì)是本發(fā)明的多肽，尤其是納米抗體可根據(jù)本發(fā)明以穩(wěn)定和較 少免疫原性的形式產(chǎn)生。因此根據(jù)本發(fā)明的過(guò)程對(duì)于重組多肽雜合體的治療應(yīng)用是特別重 要的。另外本發(fā)明的多肽可以被定制以通過(guò)免疫系統(tǒng)中選擇而適合大量效應(yīng)器功能。此 天然蛋白工程系統(tǒng)具有無(wú)可比擬的效率。特殊功能性單可變結(jié)構(gòu)域的胞質(zhì)表達(dá)使得此效應(yīng) 器功能被引入至細(xì)胞中。應(yīng)用是有利的，其產(chǎn)生細(xì)胞蛋白的活性的調(diào)節(jié)。例如，這可通過(guò)蛋 白-單可變結(jié)構(gòu)域復(fù)合體形成而穩(wěn)定靶蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)。這可導(dǎo)致降解動(dòng)力學(xué)的變化。也有可 能產(chǎn)生別構(gòu)效應(yīng)劑作用。例如，通過(guò)人工多酶復(fù)合體或誘導(dǎo)型操縱子的代謝物濃度的局部 增加，通過(guò)三元絡(luò)合物的形成和穩(wěn)定，兩個(gè)效應(yīng)器的接近建立了影響代謝途徑的另一種可 能性。然而，胞質(zhì)表達(dá)催化抗體是特別有利的，并且具有選擇催化效率的相關(guān)可能性。對(duì)于 根據(jù)本發(fā)明穩(wěn)定的多肽可以簡(jiǎn)單的方式完成功能性單可變結(jié)構(gòu)域的胞質(zhì)表達(dá)。本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體、多肽和核酸可以以本身已知的方式制備，專業(yè)技 術(shù)人員應(yīng)該從本文的進(jìn)一步描述中而清楚。例如，本發(fā)明的納米抗體和多肽可以以本身已 知用于制備抗體且特別是用于制備抗體片段(包括但不限于(單)結(jié)構(gòu)域抗體和ScFv片 段)的任何方式制備。制備所述氨基酸序列、納米抗體、多肽和核酸的一些優(yōu)選但非限制性 的方法包括本發(fā)明所述的方法和技術(shù)。本發(fā)明的其他實(shí)施方案是通過(guò)本文所述的方法衍生的或可獲得的或可直接獲得 的蛋白，多肽，單可變結(jié)構(gòu)域，文庫(kù)，核苷酸或其選擇物。專業(yè)技術(shù)人員應(yīng)該清楚，用于制備本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體和/或多肽的 一種特別有用的方法通常包括下列步驟i)在適宜的宿主細(xì)胞或宿主生物體(本文還叫作“本發(fā)明的宿主”)中或在另一 種適宜的表達(dá)系統(tǒng)中，表達(dá)編碼所述本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體或多肽的核酸(本文 還叫作“本發(fā)明的核酸”)，任選地接著進(jìn)行ii)分離和/或純化這樣獲得的本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體或多肽。特別地，這樣的方法可以包括下列步驟
i)在某種條件下培養(yǎng)和/或維持本發(fā)明的宿主，所述條件是這樣的，以致所述本 發(fā)明的宿主表達(dá)和/或生產(chǎn)至少一種本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體和/或多肽；任選地接 著進(jìn)行ii)分離和/或純化這樣獲得的本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體或多肽。本發(fā)明的核酸可以是單鏈或雙鏈DNA或RNA的形式，并且優(yōu)選地是雙鏈DNA形式。 例如，本發(fā)明的核苷酸序列可以是基因組DNA、cDNA或合成的DNA(諸如具有特別適用于在 要用的宿主細(xì)胞或宿主生物體中表達(dá)的密碼子應(yīng)用的DNA)。按照本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明的核酸是基本上分離的形式，如本文所定義。本發(fā) 明的核酸還可以是這樣的形式，存在于載體中和/或是載體的一部分，所述載體諸如例如 質(zhì)粒、黏端質(zhì)粒或YAC，其也可以是基本上分離的形式。本發(fā)明的核酸可以以本身已知的方 法制備或獲得，其基于關(guān)于本文給出的本發(fā)明的多肽的氨基酸序列的信息，和/或可以從 適當(dāng)?shù)奶烊粊?lái)源分離。為了提供類似物，例如，編碼天然存在的Vhh結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列可 以進(jìn)行位點(diǎn)定向誘變，以提供編碼所述類似物的本發(fā)明的核酸。并且，專業(yè)技術(shù)人員應(yīng)該清 楚，為了制備本發(fā)明的核酸，一些核苷酸序列，諸如至少一種編碼納米抗體的核苷酸序列， 以及例如編碼一種或多種接頭的核酸，還可以以適當(dāng)?shù)姆椒ㄟB接在一起。用于產(chǎn)生本發(fā)明 的核酸的技術(shù)應(yīng)該是專業(yè)技術(shù)人員所清楚的，并且例如可以包括但不限于，自動(dòng)DNA合成； 位點(diǎn)定向誘變；將兩個(gè)或多個(gè)天然存在的和/或合成的序列(或者其兩個(gè)或更多個(gè)部分) 組合，引入引起截短的表達(dá)產(chǎn)物表達(dá)的突變；引入一個(gè)或多個(gè)限制性位點(diǎn)(例如，以產(chǎn)生可 以使用適宜的限制性酶容易地消化和/或連接的盒和/或區(qū))，和/或通過(guò)使用一個(gè)或多 個(gè)“錯(cuò)配”引物的PCR反應(yīng)的方法引入突變。這些以及其它技術(shù)應(yīng)該是專業(yè)技術(shù)人員所清 楚的，并且參考也參見(jiàn)上文提及的標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)，諸如Sambrook等和Ausubel等，以及下文的實(shí) 施例。本發(fā)明的核酸還可以是這樣的形式，存在于遺傳構(gòu)建體中和/或是遺傳構(gòu)建體的 一部分，這對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該是清楚的。這樣的遺傳構(gòu)建體通常包括至少一種本 發(fā)明的核酸，其任選地與本身已知的一個(gè)或多個(gè)遺傳構(gòu)建體元件連接，諸如例如一個(gè)或多 個(gè)適宜的調(diào)節(jié)元件(諸如適當(dāng)?shù)膯?dòng)子、增強(qiáng)子、終止子、等等)和本文提到的其它遺傳構(gòu) 建體元件。包括至少一種本發(fā)明的核酸的所述遺傳構(gòu)建體在本文也叫作“本發(fā)明的遺傳構(gòu) 建體”。本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體可以是DNA或RNA，并且優(yōu)選地是雙鏈DNA。本發(fā)明的遺傳構(gòu) 建體還可以是適于要用的宿主細(xì)胞或宿主生物體的轉(zhuǎn)化的形式，適于結(jié)合到要用的宿主細(xì) 胞的基因組DNA中的形式，或者適于在要用的宿主生物體中獨(dú)立復(fù)制、維持和/或遺傳的形 式。例如，本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體可以是載體形式，諸如例如質(zhì)粒、黏端質(zhì)粒、YAC、病毒載體或 轉(zhuǎn)座子。特別地，所述載體可以是表達(dá)載體，即，可以提供體外和/或體內(nèi)表達(dá)的載體(例 如，在適宜的宿主細(xì)胞、宿主生物體和/或表達(dá)系統(tǒng)中)。在一個(gè)優(yōu)選的但非限制性的方面中，本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體包括i)至少一種本發(fā)明的核酸；其可操作性地連接ii) 一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)元件，諸如啟動(dòng)子和任選地適宜的終止子；并且任選地還有iii)本身已知的一個(gè)或多個(gè)其它遺傳構(gòu)建體元件；其中術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)元件”、“啟動(dòng)子”、“終止子”和“可操作性地連接”具有它們?cè)诒绢I(lǐng)域中的通用意思(如本文進(jìn)一步所述)；并且其中存在于遺傳構(gòu)建體中的所述“其它元件”， 例如，可以是3’ -或5’ -UTR序列、前導(dǎo)序列、選擇標(biāo)記、表達(dá)標(biāo)記/報(bào)道基因、和/或可以 促進(jìn)或增加轉(zhuǎn)化或整合(效率)的元件。用于所述遺傳構(gòu)建體的這些和其它適宜的元件對(duì) 于專業(yè)技術(shù)人員應(yīng)該是清楚的，并且例如可能取決于所用的構(gòu)建體、要用的宿主細(xì)胞或宿 主生物體的類型；本發(fā)明的目的核苷酸序列在其中表達(dá)的方式(例如，通過(guò)組成型的、瞬時(shí) 的或可誘導(dǎo)的表達(dá))；和/或要用的轉(zhuǎn)化技術(shù)。例如，本身已知用于抗體和抗體片段(包括 但不限于(單)結(jié)構(gòu)域抗體和ScFv片段)表達(dá)和生產(chǎn)的調(diào)節(jié)序列、啟動(dòng)子和終止子可以以 基本上相似的方式使用。優(yōu)選地，在本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體中，所述至少一種本發(fā)明的核酸和所述調(diào)節(jié)元件， 以及任選地所述一個(gè)或多個(gè)其它元件，彼此“可操作性地連接”，這通常意指它們彼此是功 能性關(guān)系。例如，如果所述啟動(dòng)子能夠起始或者另外控制/調(diào)節(jié)編碼序列的轉(zhuǎn)錄和/或表 達(dá)，那么啟動(dòng)子被視為與編碼序列“可操作性地連接”(其中所述編碼序列應(yīng)該理解為“受 控于”所述啟動(dòng)子)。一般地，當(dāng)兩個(gè)核苷酸序列可操作性地連接時(shí)，它們應(yīng)該在相同的方 向，并且通常還在同一閱讀框中。它們通常還應(yīng)該基本上鄰接，盡管這也可以不是必需的。優(yōu)選地，本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體的調(diào)節(jié)以及其它元件是這樣的，即，它們能夠在要用 的宿主細(xì)胞或宿主生物體內(nèi)提供它們需要的生物學(xué)功能。例如，在要用的宿主細(xì)胞或宿主生物體中，啟動(dòng)子、增強(qiáng)子或終止子應(yīng)該是“可操 作的”，這意味著(例如)所述啟動(dòng)子應(yīng)該能夠起始或者另外控制/調(diào)節(jié)與其可操作性地連 接(如本文所定義)的核苷酸序列——例如，編碼序列——的轉(zhuǎn)錄和/或表達(dá)。一些特別優(yōu)選的啟動(dòng)子包括但不限于，本身已知用于在本文提及的宿主細(xì)胞中表 達(dá)的啟動(dòng)子；并且特別是用于在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子，諸如本文提及的那些和/或在 實(shí)施例中所用的那些。選擇標(biāo)記應(yīng)該是這樣的，S卩，其允許一即，在適當(dāng)?shù)倪x擇條件下一已經(jīng)(成功 地)轉(zhuǎn)化了本發(fā)明的核苷酸序列的宿主細(xì)胞和/或宿主生物體與沒(méi)有(成功地)轉(zhuǎn)化的宿 主細(xì)胞/生物體區(qū)分開(kāi)來(lái)。所述標(biāo)記的一些優(yōu)選的但非限制性的實(shí)例是提供針對(duì)抗生素 (諸如卡那霉素或氨芐青霉素)的抗性的基因，提供溫度抗性的基因，或者在培養(yǎng)基中不存 在某些因子、化合物和/或(食物)成分時(shí)允許所述宿主細(xì)胞或宿主生物體維持的基因，所 述因子、化合物和/或(食物)成分是未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或生物體生存所必需的。前導(dǎo)序列應(yīng)該是這樣的，以致——在要用的宿主細(xì)胞或宿主生物體中——其允許 理想的翻譯后修飾和/或以致其將轉(zhuǎn)錄的mRNA導(dǎo)向細(xì)胞的理想部分或細(xì)胞器。前導(dǎo)序列 還可以允許從所述細(xì)胞分泌表達(dá)產(chǎn)物。同樣地，前導(dǎo)序列可以是在所述宿主細(xì)胞或宿主生 物體中可操作的任何原-(pro-)、前-(pre-)或前原_(pr印ro_)序列。對(duì)于在細(xì)菌細(xì)胞中 表達(dá)，前導(dǎo)序列可以不是必需的。例如，本身已知用于抗體和抗體片段(包括但不限于單結(jié) 構(gòu)域抗體和ScFv片段)表達(dá)和生產(chǎn)的前導(dǎo)序列可以以基本上相似的方式使用。表達(dá)標(biāo)記或報(bào)道基因應(yīng)該是這樣的，即，——在宿主細(xì)胞或宿主生物體中——其 允許檢測(cè)所述遺傳構(gòu)建體(其上存在的基因或核苷酸序列)的表達(dá)。表達(dá)標(biāo)記任選地還可 以允許表達(dá)產(chǎn)物的定位，例如，定位在細(xì)胞的特定部分或細(xì)胞器中和/或在多細(xì)胞生物體 的特定細(xì)胞、組織、器官或部分中。所述報(bào)道基因還可以表達(dá)為與本發(fā)明的氨基酸序列融合 的蛋白融合體。一些優(yōu)選的但非限制性的實(shí)例包括熒光蛋白如GFP。
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適宜的啟動(dòng)子、終止子和其它元件的一些優(yōu)選的但非限制性的實(shí)例包括可以用 于在本文提及的宿主細(xì)胞中表達(dá)的那些；并且特別是適用于在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)的那些，諸 如本文提及的那些和/或在下述實(shí)施例中所用的那些。關(guān)于可以存在于/用于本發(fā)明的 遺傳構(gòu)建體的啟動(dòng)子、選擇標(biāo)記、前導(dǎo)序列、表達(dá)標(biāo)記和其它元件的一些(其它)非限制 性的實(shí)例——諸如終止子、轉(zhuǎn)錄和/或翻譯增強(qiáng)子和/或整合因子——參考上文提及的通 用手冊(cè)，諸如 Sambrook 等和 Ausubel 等，以及 WO 95/07463，WO 96/23810，W095/07463, WO 95/21191, WO 97/11094, WO 97/42320, WO 98/06737, W098/21355, US-A-7, 207,410, US-A-5，693，492和EP 1 085 089中給出的實(shí)例。其它實(shí)例對(duì)于專業(yè)技術(shù)人員應(yīng)該是清楚 的。參考也參見(jiàn)上文引用的公知背景技術(shù)和本文引用的其它參考文獻(xiàn)。本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體通?？梢酝ㄟ^(guò)將本發(fā)明的核苷酸序列與上文所述的一個(gè) 或多個(gè)其它元件適當(dāng)?shù)剡B接而提供，例如應(yīng)用上文提及的通用手冊(cè)諸如Sambrook等和 Ausubel等中所述的技術(shù)。通常，本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體通過(guò)將本發(fā)明的核苷酸序列插入到本 身已知的適當(dāng)?shù)?表達(dá))載體中而獲得。適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體的一些優(yōu)選的但非限制性的實(shí)例 是下述實(shí)施例中所用的那些，以及本文提及的那些。本發(fā)明的核酸和/或本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體可以用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞或宿主生物體， 即，用于表達(dá)和/或生產(chǎn)本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體或多肽。適當(dāng)?shù)乃拗骰蛩拗骷?xì)胞是 專業(yè)技術(shù)人員所清楚的，并且例如可以是任何適當(dāng)?shù)恼婢摹⒃说幕蛘婧说募?xì)胞或細(xì)胞 系，或者任何適當(dāng)?shù)恼婢摹⒃说幕蛘婧说纳矬w，例如-細(xì)菌菌株，其包括但不限于革蘭氏-陰性菌株，諸如大腸桿菌(Escherichia coli)菌株；變形菌屬(Proteus)菌株，例如奇異變形菌(Proteus mirabilis)菌株；假 單胞菌屬(Pseudomonas)菌株,例如熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)菌株；以 及革蘭氏-陽(yáng)性菌株，諸如芽孢桿菌屬(Bacillus)菌株，例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)菌株或短芽孢桿菌(Bacillus brevis)菌株；鏈霉菌屬(Streptomyces)菌株， 例如淺青紫鏈霉菌(Sti^ptomyces lividans)菌株；葡萄球菌屬(Staphylococcus)菌株， 例如肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)菌株；以及乳球菌屬(Lactococcus)菌株,例 如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)菌株；_真菌細(xì)胞，其包括但不限于來(lái)自下列各項(xiàng)物種的細(xì)胞木霉屬(Trichoderma)， 例如Trichoderma reesei的物種；脈抱菌屬(Neurospora)，例如粗糖脈抱菌(Neurospora crassa)；獎(jiǎng)殼屬(Sordaria)，例如大抱獎(jiǎng)殼(Sordaria macrospora)；曲霉菌 (Aspergillus)，例如黑曲霉(Aspergillusniger)或醬油曲霉(Aspergillus sojae)；或其 它絲狀真菌；_酵母細(xì)胞，其包括但不限于來(lái)自下列各項(xiàng)物種的細(xì)胞酵母屬 (Saccharomyces),例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；裂殖酵母屬 (Schizosaccharomyces),例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；畢赤酵 母屬(Pichia)，例如巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)或 Pichia methanolica ；漢 遜酵母屬(Hansenula)，例如多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)；克魯維酵母屬 (Kluyveromyces),例如乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis) ；Arxula,例如 Arxula adeninivorans ；Yarrowia,例如 Yarrowia Iipolytica ；-兩棲類細(xì)胞或細(xì)胞系，諸如爪蟾卵母細(xì)胞(Xenopusoocytes)；
-來(lái)源于昆蟲(chóng)的細(xì)胞或細(xì)胞系，諸如來(lái)源于鱗翅目(1印idoptera)的細(xì)胞/細(xì)胞 系，包括但不限于貪夜蛾(Spodoptera) SF9和Sf21細(xì)胞，或者來(lái)源于果蠅屬(Drosophila) 的細(xì)胞/細(xì)胞系，諸如Schneider和Kc細(xì)胞；-植物或植物細(xì)胞，例如在煙草(tobacco)植物中；和/或-哺乳動(dòng)物細(xì)胞或細(xì)胞系，例如來(lái)源于人的細(xì)胞或細(xì)胞系、來(lái)源于哺乳動(dòng)物的細(xì)胞 或細(xì)胞系，包括但不限于CHO-細(xì)胞、BHK-細(xì)胞(例如BHK-21細(xì)胞)，以及人細(xì)胞或細(xì)胞系， 諸如 HeLa, COS (例如 C0S-7)和 PER. C6 細(xì)胞；以及本身已知的用于表達(dá)和生產(chǎn)抗體及抗體片段(包括但不限于(單)結(jié)構(gòu)域 抗體和ScFv片段)的所有其它宿主或宿主細(xì)胞，這對(duì)于專業(yè)技術(shù)人員應(yīng)該是清楚的。參 考還參見(jiàn)上文引用的公知背景技術(shù)，以及例如W094/29457 ;W0 96/34103 ；WO 99/42077 ； Frenken 等，(1998)，同前所述；Riechmann 禾口 Muyldermans，(1999)，同前所述；van der Linden, (2000)，同前所述；Thomassen 等，(2002)，同前所述 Joosten 等，(2003)，同前所 述Joosten等，(2005)，同前所述；以及本文所引用的其它參考文獻(xiàn)。本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體和多肽還可以被引入多細(xì)胞生物體的一個(gè)或多 個(gè)細(xì)胞、組織或器官中并且在其中表達(dá)，例如用于預(yù)防和/或治療目的(例如，作為基因 治療)。為了這一目的，可以將本發(fā)明的核苷酸序列以任何適當(dāng)?shù)姆绞揭氲郊?xì)胞或組 織中，例如照此(例如使用脂質(zhì)體)或者在它們插入到適當(dāng)?shù)幕蛑委熭d體(例如，衍生 于反轉(zhuǎn)錄病毒諸如腺病毒，或者細(xì)小病毒諸如腺伴隨病毒)中之后。同樣對(duì)于專業(yè)技術(shù) 人員應(yīng)該是清楚的，這樣的基因治療可以在體內(nèi)進(jìn)行和/或在患者體內(nèi)原位進(jìn)行，其通過(guò) 給患者或患者的特定細(xì)胞或特定組織或器官施用本發(fā)明的核酸或者編碼其的適當(dāng)?shù)幕?治療載體而進(jìn)行；或者適宜的細(xì)胞(通常取自要治療的患者的身體，諸如移植的淋巴細(xì) 胞、骨髓吸出物或活組織切片)可以用本發(fā)明的核苷酸序列在體外進(jìn)行治療，然后適當(dāng)?shù)?(重新)引入回到所述患者的身體內(nèi)。所有這些可以使用專業(yè)技術(shù)人員公知的基因治療 載體、技術(shù)和遞送系統(tǒng)進(jìn)行，例如，在下列各項(xiàng)中所述Culver，K. W.，“基因治療(Gene Therapy) “ , 1994, p. xii,Mary Ann LiebertYork, ) ；Giordano,
F 醫(yī)學(xué)(Nature F Medicine) 2 (1996)，534-539 ；Schaper，循環(huán)研究(Circ. Res). 79 (1996), 911-919 ；Anderson,科學(xué)(Science) 256(1992),808-813 ；Verma,自然(Nature) 389 (1994) ,239 ；Isner,柳葉刀(Lancet) 348 (1996)，370-374 ；Muhlhauser,循環(huán)研究(Circ. Res) · 77 (1995)，1077-1086 ；Onodera,血液學(xué)(Blood) 91 ； (1998)，30-36 ；Verma,基因治 療(Gene Ther) · 5 (1998)，692-699 ；Nabel,紐約科學(xué)院年刊(Ann. N. Y. Acad. Sci.) 811 (1997), 289-292 ；Verzeletti,人類基因治療(Hum. Gene Ther.) 9 (1998), 2243-51 ； Wang,自然醫(yī)學(xué)(Nature Medicine)2(1996),714-716 ；W094/29469 ；WO 97/00957， US 5，580，859 ；US 5，5895466 ；或 Schaper,現(xiàn)代生物技術(shù)觀點(diǎn)(Current Opinion in Biotechnology) 7 (1996)，635-640。例如，在本領(lǐng)域中已描述 ScFv 片段(Afanasieva 等，基因治療(Gene Ther.)，10，1850-1859 (2003))和雙抗體(Blanco等，免疫學(xué)雜志 (J. Immunol), 171,1070-1077 (2003))的原位表達(dá)。對(duì)于納米抗體在細(xì)胞中的表達(dá)，它們還可以作為所謂的“細(xì)胞內(nèi)抗體”表達(dá)，例如 在 WO 94/02610, WO 95/22618 和 US-A-7004940 ；WO 03/014960 中所述；在 Cattaneo，A.和 Biocca, S. (1997)細(xì)胞內(nèi)抗體開(kāi)發(fā)禾口應(yīng)用(Intracellular Antibodies =Development
31and Applications). Landes 禾口 Springer-Verlag ；以及在 Kontermann,方法(Methods) 34, (2004)，163-170 中所述。例如，本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體和多肽還可以在轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的乳中產(chǎn) 生，例如在兔、母牛、山羊或綿羊的乳中(對(duì)于將轉(zhuǎn)基因引入哺乳動(dòng)物的通用技術(shù)參見(jiàn)例如 US-A-6, 741，957，US-A-6，304, 489 和 US-A-6，849，992)，在植物中或植物的部分中產(chǎn)生，所 述植物部分包括但不限于它們的葉、花、果實(shí)、種子、根或turbers (例如在煙草、玉米、大豆 或苜蓿中)中，或者例如在蠶家蠶(Bombix mori)的蛹中。此外，本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體和多肽還可以在不含細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)中表 達(dá)和/或生產(chǎn)，并且這樣的系統(tǒng)的適當(dāng)?shù)膶?shí)例應(yīng)該是專業(yè)技術(shù)人員所清楚的。一些優(yōu)選的 但非限制性的實(shí)例包括在麥芽胚系統(tǒng)中的表達(dá)；在兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物中表達(dá)；或者在大 腸桿菌(E. coli) Zubay系統(tǒng)中表達(dá)。如上文提及，應(yīng)用納米抗體的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于，基于此的多肽可以通過(guò)在適宜的細(xì) 菌系統(tǒng)中表達(dá)而制備，并且適宜的細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)、載體、宿主細(xì)胞、調(diào)節(jié)元件等對(duì)專業(yè)技術(shù) 人員是清楚的，例如參考上文引用的參考文獻(xiàn)。然而，應(yīng)該注意，本發(fā)明在其最廣泛意義上 并不限于在細(xì)菌系統(tǒng)中表達(dá)。優(yōu)選地，在本發(fā)明中，應(yīng)用(體內(nèi)或體外)表達(dá)系統(tǒng)，諸如細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)，其以適于 藥用的形式提供本發(fā)明的多肽，并且所述表達(dá)系統(tǒng)也是專業(yè)技術(shù)人員所清楚的。專業(yè)技術(shù) 人員還應(yīng)該清楚，適于藥用的本發(fā)明的多肽可以使用肽合成技術(shù)制備。對(duì)于工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)，用于納米抗體或包含納米抗體的蛋白治療物的(工業(yè))生 產(chǎn)的優(yōu)選的異源宿主包括大腸桿菌、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、釀酒酵母(S. cerevisiae)的菌株，其適用于大規(guī)模表達(dá)/生產(chǎn)/發(fā)酵，并且特別適用于大規(guī)模藥物(即， GMP級(jí)別)表達(dá)/生產(chǎn)/發(fā)酵。所述菌株的適當(dāng)?shù)膶?shí)例是專業(yè)技術(shù)人員所清楚的。所述菌 株以及生產(chǎn)/表達(dá)系統(tǒng)也可從公司諸如Biovitrum(Uppsala，瑞典)獲得。備選地，哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，特別是中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，可以用于大規(guī)模表達(dá) /生產(chǎn)/發(fā)酵，并且特別用于大規(guī)模藥物表達(dá)/生產(chǎn)/發(fā)酵。并且，所述表達(dá)/生產(chǎn)系統(tǒng)也 可從上文提及的一些公司獲得。具體的表達(dá)系統(tǒng)的選擇部分取決于特定的翻譯后修飾的需要，更具體地是糖基化 的需要。生產(chǎn)包含納米抗體的重組蛋白，對(duì)于所述重組蛋白糖基化是理想的或者必需的，將 使得應(yīng)用具有將所表達(dá)的蛋白糖基化的能力的哺乳動(dòng)物表達(dá)宿主成為必要。在這一方面， 專業(yè)技術(shù)人員應(yīng)該清楚，獲得的糖基化模式(即，附著的殘基的種類、數(shù)量和位置)將取決 于表達(dá)所用的細(xì)胞或細(xì)胞系。優(yōu)選地，使用人細(xì)胞或細(xì)胞系(即，形成基本上具有人糖基化 模式的蛋白)，或者使用另一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，其可以提供基本上和/或功能上與人糖基 化作用相同的糖基化模式或者至少模擬人糖基化作用。一般地，原核宿主諸如大腸桿菌不 具有將蛋白糖基化的能力，并且應(yīng)用更低等真核細(xì)胞諸如酵母通常導(dǎo)致與人糖基化作用不 同的糖基化模式。不過(guò)，應(yīng)該理解，所有前述宿主細(xì)胞和表達(dá)系統(tǒng)可以用于本發(fā)明，這取決 于要獲得的理想的氨基酸序列、納米抗體或多肽。因此，按照本發(fā)明的一個(gè)非限制性方面，本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體或多肽被 糖基化。按照本發(fā)明的另一個(gè)非限制性方面，本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體或多肽未被糖基化。
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按照本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的但非限制性的方面，本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體或 多肽在細(xì)菌細(xì)胞中生產(chǎn)，特別是在適于大規(guī)模藥物生產(chǎn)的細(xì)菌細(xì)胞，諸如上文提及的菌株 的細(xì)胞中生產(chǎn)。按照本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的但非限制性的方面，本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體或 多肽在酵母細(xì)胞中生產(chǎn)，特別是在適于大規(guī)模藥物生產(chǎn)的酵母細(xì)胞，諸如上文提及的物種 的細(xì)胞中生產(chǎn)。按照本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的但非限制性的方面，本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體或 多肽在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中生產(chǎn)，特別是在人細(xì)胞或人細(xì)胞系的細(xì)胞中，并且更特別是在適于 大規(guī)模藥物生產(chǎn)的人細(xì)胞或人細(xì)胞系的細(xì)胞中，諸如上文提及的細(xì)胞系中生產(chǎn)。當(dāng)應(yīng)用在宿主細(xì)胞中的表達(dá)來(lái)生產(chǎn)本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體和多肽時(shí)，本 發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體和多肽可以在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生(例如，在細(xì)胞溶質(zhì)中，在周質(zhì)或在 內(nèi)含體中)，然后從宿主細(xì)胞分離，并且任選地進(jìn)一步純化；或者可以在細(xì)胞外產(chǎn)生(例如， 在培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中)，然后從培養(yǎng)基分離，并且任選地進(jìn)一步純化。當(dāng)使用真 核宿主細(xì)胞時(shí)，由于極大地促進(jìn)進(jìn)一步的分離以及獲得的納米抗體和蛋白的下游處理，所 以通常優(yōu)選細(xì)胞外生產(chǎn)。除了少數(shù)種類的蛋白諸如毒素和溶血素之外，細(xì)菌細(xì)胞諸如上文 提及的大腸桿菌的菌株一般不向細(xì)胞外分泌蛋白，并且在大腸桿菌內(nèi)的分泌生產(chǎn)是指蛋白 穿過(guò)內(nèi)膜易位到周質(zhì)空間。周質(zhì)生產(chǎn)相對(duì)于細(xì)胞溶質(zhì)生產(chǎn)提供一些優(yōu)點(diǎn)。例如，在通過(guò)特 異的信號(hào)肽酶將分泌信號(hào)序列裂解之后，所分泌的產(chǎn)物的N-端氨基酸序列可以與天然基 因產(chǎn)物相同。此外，在周質(zhì)中比在細(xì)胞質(zhì)中似乎存在少得多的蛋白酶活性。另外，由于在周 質(zhì)中更少的污染蛋白，所以蛋白純化更簡(jiǎn)單。另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，由于周質(zhì)提供比細(xì)胞質(zhì)更加氧 化性的環(huán)境，所以可以形成正確的二硫鍵。在大腸桿菌中過(guò)量表達(dá)的蛋白通常在不溶的聚 集體，即所謂的內(nèi)含體中發(fā)現(xiàn)。這些內(nèi)含體可以位于細(xì)胞溶質(zhì)中或在周質(zhì)中；從這些內(nèi)含體 回收生物活性蛋白需要變性/重折疊步驟。許多重組蛋白，包括治療性蛋白，是從內(nèi)含體回 收的。備選地，專業(yè)技術(shù)人員應(yīng)該清楚，可以使用細(xì)菌已被遺傳修飾的重組菌株，來(lái)分泌理 想的蛋白，并且特別是本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體或多肽。因此，按照本發(fā)明的一個(gè)非限制性方面，本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體或多肽是 在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生并且從宿主細(xì)胞分離，并且特別是從細(xì)菌細(xì)胞或者從細(xì)菌細(xì)胞中的內(nèi)含體中 分離的氨基酸序列、納米抗體或多肽。按照本發(fā)明的另一個(gè)非限制性的方面，本發(fā)明的氨基 酸序列、納米抗體或多肽是在細(xì)胞外產(chǎn)生并且從培養(yǎng)宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中分離的氨基酸序 列、納米抗體或多肽。與這些宿主細(xì)胞一起使用的一些優(yōu)選的但非限制性的啟動(dòng)子包括，-用于在大腸 桿菌中表達(dá)lac啟動(dòng)子(及其衍生物，諸如lacUV5啟動(dòng)子)；阿拉伯糖啟動(dòng)子；噬菌體λ 的左向-(PL)和右向(PR)啟動(dòng)子；trp操縱子的啟動(dòng)子；雜合lac/trp啟動(dòng)子(tac和trc)； T7-啟動(dòng)子(更具體地是T7-噬菌體基因10的啟動(dòng)子)以及其它T-噬菌體啟動(dòng)子；TnlO 四環(huán)素抗性基因的啟動(dòng)子；上述啟動(dòng)子的工程變體，其包括一個(gè)或多個(gè)拷貝的外來(lái)調(diào)節(jié)操 縱基因序列；-用于在釀酒酵母中表達(dá)組成型ADH1(醇脫氫酶1)，ENO (烯醇化酶)， CYCl (異-1細(xì)胞色素C)，GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)；PGKl (磷酸甘油酸激酶)， PYKl (丙酮酸激酶)；調(diào)節(jié)型=GALl, 10，7 (半乳糖代謝酶)，ADH2 (醇脫氫酶2)，PH05 (酸性
33磷酸酶)，CUPl (銅金屬硫蛋白)；異源型=CaMV(花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子)；-用于在畢赤酵母(Pichiapastoris)中表達(dá)A0X1啟動(dòng)子(醇氧化酶I)；-用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)人巨細(xì)胞病毒(hCMV)即時(shí)早期增強(qiáng)子/啟動(dòng)子； 人巨細(xì)胞病毒(hCMV)即時(shí)早期啟動(dòng)子變體，其包含兩個(gè)四環(huán)素操縱基因序列，以致所述啟 動(dòng)子可以受Tet抑制基因調(diào)節(jié)；單純皰疹病毒胸苷激酶(TK)啟動(dòng)子；勞斯肉瘤病毒長(zhǎng)末端 重復(fù)(RSV LTR)增強(qiáng)子/啟動(dòng)子；來(lái)自于人、黑猩猩、小鼠或大鼠的延伸因子la (hEF-1 a ) 啟動(dòng)子；SV40早期啟動(dòng)子；HIV-I長(zhǎng)末端重復(fù)啟動(dòng)子；β -肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子；與這些宿主細(xì)胞一起使用的一些優(yōu)選的但非限制性的載體包括_用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的載體pMAMneo (Clontech)，pcDNA3 (Invitrogen)， pMClneo(Stratagene), pSG5 (Stratagene), EB0-pSV2_neo(ATCC 37593)，pBPV-1 (8-2) (ATCC 37110)，pdBPV-MMTneo (342-12) (ATCC 37224)，pRSVgpt (ATCC37199)， pRSVneo(ATCC37198)，pSV2-dhfr(ATCC 37146)，pUCTag(ATCC 37460)禾口 1ZD35 (ATCC37565)，以及基于病毒的表達(dá)系統(tǒng)，諸如基于腺病毒的那些；-用于在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)的載體pET載體(Novagen)和pQE載體(Qiagen)；-用于在酵母或其它真菌細(xì)胞中表達(dá)的載體pYES2(Invitrogen)和畢赤表達(dá)載 體(Invitrogen)；-用于在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)的載體pBlueBacII(Invitrogen)和其它桿狀病毒載 體；-用于在植物或植物細(xì)胞中表達(dá)的載體例如基于花椰菜花葉病毒或煙草花葉病 毒的載體，適宜的農(nóng)桿菌(Agrobacterium)菌株，或基于Ti-質(zhì)粒的載體。與這些宿主細(xì)胞一起使用的一些優(yōu)選的但非限制性的分泌序列包括-用于細(xì)菌細(xì)胞諸如大腸桿菌PelB，Bla,OmpA, OmpC, OmpF, OmpT, StII, PhoA, PhoE, MalE, Lpp, LamB等；TAT信號(hào)肽，溶血素C-端分泌信號(hào)；_ 用于酵母α _ 交配因子前原一序歹Ij ( α -mating factor prepro-sequence), Μ 酸酶(phol)，轉(zhuǎn)化酶(Sue)，等;-用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞在靶蛋白是真核起源的情形中固有的信號(hào)(indigenous signal)；鼠 Ig κ -鏈 V-J2-C 信號(hào)肽；等。用于轉(zhuǎn)化本發(fā)明的宿主或宿主細(xì)胞的適宜的技術(shù)對(duì)專業(yè)技術(shù)人員是清楚的，并且 可以取決于要用的宿主細(xì)胞/宿主生物體和要用的遺傳構(gòu)建體。參考也參見(jiàn)上文提及的手 冊(cè)和專利申請(qǐng)。轉(zhuǎn)化后，可以進(jìn)行檢測(cè)并且選擇已經(jīng)成功轉(zhuǎn)化了本發(fā)明的核苷酸序列/遺傳構(gòu)建 體的那些宿主細(xì)胞或宿主生物體的步驟。例如，這可以是基于存在于本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體 中的選擇標(biāo)記的選擇步驟，或者是包括檢測(cè)本發(fā)明的氨基酸序列的步驟，例如，使用特異的 抗體進(jìn)行。轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞(其可以是穩(wěn)定的細(xì)胞系的形式)或宿主生物體(其可以是穩(wěn)定 的突變系或株系的形式)形成本發(fā)明的另一方面。優(yōu)選地，這些宿主細(xì)胞或宿主生物體是這樣的，以致它們表達(dá)或者(至少)能夠表 達(dá)(例如，在適宜的條件下)本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體或多肽(并且在宿主生物體的 情形中在它的至少一種細(xì)胞、部分、組織或器官中)。本發(fā)明還包括本發(fā)明的宿主細(xì)胞或宿主生物體的其它世代、后代和/或子代，例如，其可以通過(guò)細(xì)胞分裂或者通過(guò)有性或無(wú)性
生殖獲得。為了生產(chǎn)/獲得本發(fā)明的氨基酸序列的表達(dá)，所述轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或轉(zhuǎn)化的宿主 生物體通?？梢栽诒景l(fā)明(理想的)氨基酸序列、納米抗體或多肽得到表達(dá)/生產(chǎn)的條件 下保存、維持和/或培養(yǎng)。適宜的條件對(duì)專業(yè)技術(shù)人員是清楚的，并且通常取決于所用的宿 主細(xì)胞/宿主生物體，以及取決于控制本發(fā)明的(相關(guān))核苷酸序列表達(dá)的調(diào)節(jié)元件。此 外，參考參見(jiàn)在上文關(guān)于本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體段落中提及的手冊(cè)和專利申請(qǐng)。一般地，適宜的條件可以包括使用適宜的培養(yǎng)基，存在適宜的食物來(lái)源和/或適 宜的營(yíng)養(yǎng)素，使用適當(dāng)?shù)臏囟龋⑶胰芜x地存在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)因子或化合物(例如，在本發(fā)明 的核苷酸序列在可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的控制下的情形中)；所有這些可以由專業(yè)技術(shù)人員選擇。 此外，在這樣的條件下，本發(fā)明的氨基酸序列可以以組成型方式、以瞬時(shí)方式、或者只在適 當(dāng)?shù)卣T導(dǎo)時(shí)表達(dá)。專業(yè)技術(shù)人員還應(yīng)該清楚，本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體或多肽可以(首先)以 不成熟的形式(如上文提及)產(chǎn)生，其然后可以進(jìn)行翻譯后修飾，這取決于所用的宿主細(xì)胞 /宿主生物體。并且，本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體或多肽可以被糖基化，這也取決于所用 的宿主細(xì)胞/宿主生物體。然后，本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體或多肽可以從宿主細(xì)胞/宿主生物體和/或 從培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞或宿主生物體的培養(yǎng)基中分離，這使用本身已知的蛋白分離和/或純 化技術(shù)，諸如(制備級(jí))層析和/或電泳技術(shù)、差別沉淀技術(shù)、親和技術(shù)(例如，使用與本發(fā) 明的氨基酸序列、納米抗體或多肽融合的特異性的、可裂解的氨基酸序列)和/或制備級(jí)免 疫學(xué)技術(shù)(即，使用針對(duì)要被分離的氨基酸序列的抗體)進(jìn)行。通常，對(duì)于藥物應(yīng)用，本發(fā)明的多肽可以配制成藥物制劑或組合物，其包括至少一 種本發(fā)明的多肽和至少一種藥用載體、稀釋劑或賦形劑和/或輔藥，并且任選地一種或多 種其它藥物活性多肽和/或化合物。通過(guò)非限制性實(shí)例的方式，這樣的制劑可以是適于下 列各項(xiàng)的形式口服給藥，腸胃外給藥(諸如通過(guò)靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下注射或靜脈內(nèi)輸注)， 局部給藥，通過(guò)吸入、皮膚貼片、植入物、栓劑給藥，等等。所述適宜的給藥形式——取決于 給藥的方式，其可以是固體、半固體或液體——以及制備其所用的方法和載體，對(duì)專業(yè)技術(shù) 人員是清楚的，并且在本文中進(jìn)一步描述。因此，在另一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及一種藥物組合物，其包含至少一種本發(fā)明的氨 基酸，至少一種本發(fā)明的納米抗體或至少一種本發(fā)明的多肽，以及至少一種適當(dāng)?shù)妮d體、稀 釋劑或賦形劑(即，適于藥用)，以及任選地一種或多種其它活性物質(zhì)。通常，本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體和多肽可以以本身已知的任何適當(dāng)?shù)姆?法配制和施用，例如，關(guān)于其的參考文獻(xiàn)參見(jiàn)上文引用的公知背景技術(shù)(并且特別參見(jiàn) WO 04/041862, WO 04/041863，WO 04/041865 和 WO 04/041867)，以及參見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)，諸 如雷明頓藥物科學(xué)(Remington，sPharmaceutical Sciences)，第 18 版，Mack 出版公司， 美國(guó)(1990)或雷明頓，制藥科學(xué)和實(shí)踐(Remington，the Science and Practice of Pharmacy),第 21 版，Lippincott Williams 禾口 Wilkins(2005)。例如，本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體和多肽可以本身已知的用于常規(guī)抗體及抗 體片段(包括ScFv’ s和雙抗體)和其它藥物活性蛋白的任何方法配制和施用。所述制劑以及制備其的方法對(duì)于專業(yè)技術(shù)人員是清楚的，并且例如，包括適于腸胃外給藥(例如靜 脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、腔內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)或鞘內(nèi)給藥)或適于局部(即，經(jīng)皮的或皮內(nèi))給藥 的制劑。例如，用于腸胃外給藥的制劑可以是適于輸注或注射的無(wú)菌溶液、混懸液、分散液 或乳劑。例如，用于所述制劑的適宜的載體或稀釋劑包括但不限于，無(wú)菌水以及水性緩沖 液和溶液，諸如生理磷酸鹽緩沖液、林格溶液、葡萄糖溶液、和Hank' s溶液；水油(water oils)；甘油；乙醇；二醇諸如丙二醇，或者以及礦物油，動(dòng)物油和植物油例如花生油、豆油， 及它們的適宜的混合物。通常優(yōu)選水性溶液或混懸液。本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體和多肽還可以使用遞送的基因治療方法進(jìn)行施 用。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利號(hào)5，399，346，其完全結(jié)合作為參考。使用遞送的基因治療方法， 轉(zhuǎn)染了編碼本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體或多肽的基因的原代細(xì)胞另外可以用組織特異 性啟動(dòng)子轉(zhuǎn)染，以靶向特異的器官、組織、移植物、腫瘤或細(xì)胞，并且另外可以使用用于亞細(xì) 胞定位表達(dá)的信號(hào)和穩(wěn)定序列進(jìn)行轉(zhuǎn)染。因此，本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體和多肽可以與藥用賦形劑諸如惰性稀釋劑 或載體組合全身施用，例如，口服地施用。它們可以包封在硬殼或軟殼的明膠膠囊中，可以 壓縮成片劑，或者可以直接與患者日常飲食的食物組合。對(duì)于口服治療性施用，本發(fā)明的 氨基酸序列、納米抗體和多肽可以與一種或多種賦形劑組合，并且以可吸收的片劑、頰含片 劑、藥片、膠囊、酏劑、混懸劑、糖漿、糯米紙囊劑等形式使用。所述組合物和制劑應(yīng)該包含至 少0. 的本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體或多肽。當(dāng)然，所述組合物和制劑的百分?jǐn)?shù)可以 變化，并且可以便利地在所給單位劑型的約2-約60重量％之間。本發(fā)明的氨基酸序列、納 米抗體或多肽在這樣的治療有效組合物中的量是這樣的，以致獲得有效的劑量水平。所述片劑、藥片、丸劑、膠囊等還可以包含下列各項(xiàng)粘合劑，諸如黃蓍膠、阿拉伯 樹(shù)膠、玉米淀粉或明膠；賦形劑，諸如磷酸二鈣；崩解劑，諸如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、褐藻 酸等；潤(rùn)滑劑，諸如硬脂酸鎂；并且可以加入甜味劑，諸如蔗糖、果糖、乳糖或阿司帕坦，或 者調(diào)味劑，諸如薄荷、冬青油、或櫻桃調(diào)味劑。當(dāng)單位劑型是膠囊時(shí)，除上述類型的物質(zhì)之 外，它還可以包含液體載體，諸如植物油或聚乙二醇。各種其它物質(zhì)可以作為涂層存在，或 者另外改變所述固體單位劑型的物理形式。例如，片劑、丸劑、或膠囊可以用膠、蠟、紫膠或 糖等包被。糖漿或酏劑可以包含本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體和多肽，作為甜味劑的蔗糖 或果糖，作為防腐劑的對(duì)羥基苯甲酸甲酯和對(duì)羥基苯甲酸丙酯類，染料和調(diào)味劑諸如櫻桃 或橙味調(diào)味劑。當(dāng)然，在制備任何單位劑型中所用的任何物質(zhì)都應(yīng)該是藥學(xué)可接受的，并且 在所用的量上基本上無(wú)毒。另外，本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體和多肽可以結(jié)合在緩釋制 劑和裝置中。用于口服給藥的制備物和制劑還可以被提供以腸衣，所述腸衣允許本發(fā)明的構(gòu)建 體抵抗胃環(huán)境，并且進(jìn)入腸內(nèi)。更一般地，用于口服給藥的制備物和制劑可以適當(dāng)?shù)嘏渲贸?用于遞送到胃腸道的任何理想的部分。另外，適宜的栓劑可以用于遞送到胃腸道內(nèi)。本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體和多肽還可以通過(guò)輸注或注射進(jìn)行靜脈內(nèi)或腹膜 內(nèi)施用。本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體和多肽或者它們的鹽的溶液可以在水中制備，任選 地與無(wú)毒表面活性劑混合。分散體還可以在甘油、液體聚乙二醇、三醋精及其混合物中以及 在油中制備。在普通的保存和使用條件下，這些制劑包含防腐劑以防止微生物的生長(zhǎng)。
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適于注射或輸注的藥物劑型可以包括包含活性成分的無(wú)菌的水溶液或分散液或 者無(wú)菌粉劑，其適合即時(shí)制備無(wú)菌注射或輸注溶液或分散體，任選地包封在脂質(zhì)體中。在所 有情形中，在制備和保存條件下，最終劑型必須是無(wú)菌的、流動(dòng)的和穩(wěn)定的。液體載體或賦 形劑可以是溶劑或液體分散介質(zhì)，例如，其包括水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液體 聚乙二醇等)、植物油、無(wú)毒甘油酯及其適當(dāng)?shù)幕旌衔?。可以保持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性，例如，通過(guò) 形成脂質(zhì)體，在分散劑的情形中通過(guò)保持需要的顆粒大小或者通過(guò)使用表面活性劑。防止 微生物作用可以通過(guò)各種抗細(xì)菌和抗真菌試劑獲得，例如，對(duì)羥基苯甲酸酯類、氯代丁醇、 苯酚、山梨酸、硫柳汞(thimerosal)等。在許多情形中，優(yōu)選地包括等滲劑，例如，糖、緩沖 劑或氯化鈉?？勺⑸浣M合物的延長(zhǎng)吸收可以通過(guò)在所述組合物中使用延遲吸收劑例如單硬 脂酸鋁和明膠而獲得。無(wú)菌注射溶液通過(guò)將需要量的本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體和多肽結(jié)合在適當(dāng) 的溶劑中，當(dāng)需要時(shí)，與上文列舉的各種其它成分一起結(jié)合，然后進(jìn)行過(guò)濾除菌而制備。在 用于制備無(wú)菌注射溶液的無(wú)菌粉劑情形中，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥技術(shù)， 其產(chǎn)生活性成分加上在先前的無(wú)菌過(guò)濾溶液中存在的任何其它理想的成分的粉劑。對(duì)于局部給藥，本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體和多肽可以以純的形式應(yīng)用，即， 在它們是液體的情形中。然而，通常理想地將它們作為與皮膚病學(xué)可接受的載體結(jié)合的組 合物或制劑施用到皮膚上，所述載體可以是固體或液體。有用的固體載體包括細(xì)碎分裂的固體，諸如滑石、粘土、微晶纖維素、硅石、礬土 等。有用的液體載體包括水、羥烷類或二醇類或水_醇/ 二醇摻合劑，其中本發(fā)明的氨基酸 序列、納米抗體和多肽可以以有效水平溶解或分散，任選地在無(wú)毒表面活性劑的幫助下溶 解或分散?？梢蕴砑虞o藥諸如香味劑和其它抗微生物劑，以將給定用途的特性最優(yōu)化。得 到的液體組合物可以通過(guò)吸收襯墊應(yīng)用，用于浸漬的繃帶及其它敷料，或者使用泵型或氣 溶膠噴霧器噴到感染區(qū)域。增稠劑諸如合成的聚合物、脂肪酸、脂肪酸鹽及酯、脂肪醇、改性纖維素或改性的 礦物質(zhì)還可以與液體載體一起使用，以形成易涂開(kāi)的糊劑、凝膠、藥膏、皂劑等，用于直接涂 覆到使用者的皮膚?？梢杂糜趯⒈景l(fā)明的氨基酸序列、納米抗體和多肽遞送到皮膚的有用的皮膚病用 組合物的實(shí)例是本領(lǐng)域已知的；例如，參見(jiàn)Jacquet等(美國(guó)專利號(hào)4，608，392)，Geria (美 國(guó)專利號(hào)4，992，478)，Smith等(美國(guó)專利號(hào)4，559，157)和Wortzman (美國(guó)專利號(hào) 4，820，508)。本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體和多肽的有用劑量可以通過(guò)比較它們的體外活性 和在動(dòng)物模型中的體內(nèi)活性而確定。將在小鼠和其它動(dòng)物中的有效劑量外推至人的方法是 本領(lǐng)域已知的；例如，參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)4，938，949。通常，本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體和多肽在液體組合物諸如洗液中的濃度約 0. 1-25重量-%，優(yōu)選地約0.5-10重量-%。在半固體或固體組合物諸如凝膠或粉劑中的 濃度約0. 1-5重量，優(yōu)選地約0. 5-2. 5重量。需要用于治療的本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體和多肽的量不但隨著所選的特定 的氨基酸序列、納米抗體或多肽而變化，而且隨著施用途徑、要治療的病癥的性質(zhì)以及患者 的年齡和病癥而變化，并且最終取決于隨從醫(yī)生或臨床醫(yī)生的判斷力。此外，本發(fā)明的氨基酸序列、納米抗體和多肽的劑量變化取決于靶細(xì)胞、腫瘤、組織、移植物或器官。理想的劑量可以便利地以單一劑量或作為在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間間隔施用的分劑量而存 在，例如，作為每天2、3、4次或更多的亞劑量。所述亞劑量本身可以進(jìn)一步分割，例如，分割 成許多次不連續(xù)的寬松間隔的施用；諸如從吸入器多次吸入，或者通過(guò)施用多滴到眼睛中。根據(jù)本發(fā)明的穩(wěn)定多肽可有利地用于所有應(yīng)用領(lǐng)域中例如在癌癥和感染的治療 中，作為免疫毒素用于藥物靶向和用于基因治療中。在影像和診斷中的應(yīng)用同樣是有利的， 例如以便分析抗原結(jié)合物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的過(guò)程對(duì)于穩(wěn)定已經(jīng)因?yàn)槠渌虮恍揎椀膯慰勺兘Y(jié)構(gòu)域，諸如例如 人源化或嵌合的單可變結(jié)構(gòu)域是特別有利的。這種氨基酸的修飾可導(dǎo)致去穩(wěn)定，并且根據(jù) 本發(fā)明的過(guò)程可通過(guò)這些在⑶R區(qū)外的單可變結(jié)構(gòu)域的額外修飾而恢復(fù)或甚至改善單可 變結(jié)構(gòu)域的初始穩(wěn)定性。本發(fā)明設(shè)想，天然存在的免疫球蛋白序列是序列的規(guī)范集合體，其總和應(yīng)當(dāng)與單 可變結(jié)構(gòu)域功能的所有方面相適合的。本發(fā)明通過(guò)下面的實(shí)驗(yàn)部分、附圖、表格和序列表更詳細(xì)地進(jìn)行描述。附圖描述

圖1 :SEQ ID NO 1的RP-HPLC層析譜的放大圖以圖示顯示為前峰和后峰的產(chǎn)物相 關(guān)的物質(zhì)(即，主峰之前和之后的洗脫物)。指示了在標(biāo)記SEQID NO :1主基準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品BATCH 1(批次1)中存在的峰時(shí)使用的術(shù)語(yǔ)。圖2 在-70°C，+5°C和+25°C下保存0，1 和 2個(gè)月后 SEQ ID NO 1 批次2 的RP-HPLC 層析譜的相關(guān)部分。圖3 在37°C下溫育0，4和8周后SEQ ID NO 1 BATCH 1的RP-HPLC層析譜的相 關(guān)部分。圖4 =SEQ ID NO 2 ( 二價(jià)納米抗體 SEQ ID NO 1的單價(jià)構(gòu)件)的氨基酸序列和 序數(shù)編號(hào)。SEQ ID NO :1是由兩個(gè)相同拷貝的SEQ ID NO :2免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域組成的單一 多肽鏈，所述兩個(gè)拷貝頭對(duì)尾地融合，其間為三個(gè)丙氨酸殘基接頭(總計(jì)259個(gè)殘基)。CDR 區(qū)被下劃線。在本報(bào)告中討論的殘基被突出顯示；這些殘基根據(jù)其在單價(jià)SEQ ID N0:2上 的位置進(jìn)行編號(hào)，即:E1, M34，M78，M83，D62/S63，D105/G106，和N84/S85。讀者將認(rèn)識(shí)到， 在SEQ ID NO :1的情況下，這些名稱指兩個(gè)等價(jià)位置，即兩個(gè)相同結(jié)構(gòu)域中的每一個(gè)中各有 一個(gè)，并且例如，M34還指存在于SEQ IDNO 1中165位點(diǎn)處的甲硫氨酸殘基。還要指出此 編號(hào)與本申請(qǐng)中其他地方也提到的KABAT編號(hào)系統(tǒng)不對(duì)應(yīng)。圖5 在計(jì)時(shí)起點(diǎn)時(shí)(藍(lán)色層析譜)和在37°C下溫育8周后(紅色層析譜)SEQ ID NO :1批次1的胰蛋白酶消化產(chǎn)物在214nm記錄的RP-HPLC層析譜。標(biāo)記至今已經(jīng)表征的 各個(gè)峰；它們的特性顯示在表B-3中。未標(biāo)記的峰的特性仍然要確定。比T12晚洗脫的峰 可能是部分消化的產(chǎn)物；完整的SEQ ID NO 1也在90分鐘左右洗脫。圖6 被有意氧化(虛線)的和參考的(實(shí)線；批次1) SEQ ID NO 1的RPC層析譜 的相關(guān)部分的比較。插入部分顯示持續(xù)強(qiáng)制氧化后的譜型；清晰地，在用H2O2處理期間，不 僅形成單氧化(+16Da)而且形成雙氧化(+32Da)的SEQ ID NO :1。圖7 用過(guò)氧化氫(H2O2，下圖)和叔丁基過(guò)氧化物(TBHP，上圖)有意氧化未折疊的 和天然的SEQ ID NO :2。在4M鹽酸胍(Gua. HCl)的存在下，當(dāng)用TBHP處理時(shí)SEQ ID NO 1容易氧化，并且甚至用過(guò)氧化氫處理時(shí)仍然如此。除了非氧化物質(zhì)(即，最右側(cè)的峰)以外， 在RPC層析譜中可辨別7個(gè)峰MS分析(數(shù)據(jù)未顯示)表明這些代表三種可能的單氧化形 式(+16Da)，三種不同的雙氧化變異體(+32Da)，和最后，在最左側(cè)，三聯(lián)氧化種類(+48Da)。 當(dāng)在D-PBS中對(duì)SEQ ID NO :2進(jìn)行氧化時(shí)獲得的譜型清晰地表明本質(zhì)上在天然SEQ ID NO: 2分子中僅一個(gè)單甲硫氨酸殘基是易受影響的。最小的峰可認(rèn)為是第二個(gè)甲硫氨酸殘基對(duì) H2O2處理有點(diǎn)敏感的證據(jù)。圖8中H2O2處理的M78A突變體的RPC譜型確認(rèn)了此觀點(diǎn)。各 種混合物在RPC分析之前進(jìn)行SEC(NAP5脫鹽柱，GE Healthcare)。圖8 =SEQ ID NO 2野生型(wt)和3種不同的M- > A突變體的有意氧化。在各種 情況下，未處理的變體(藍(lán)色)的RPC譜型與用叔丁基過(guò)氧化物(TBHP ；綠色)或過(guò)氧化氫 (H2O2 ；紅色)氧化后獲得的層析譜進(jìn)行比較。注意，在本實(shí)驗(yàn)中使用的wt SEQ ID N0:2的 批次似乎含有污染物(與圖7比較)。各種混合物在RPC分析之前進(jìn)行SEC(NAP5脫鹽柱， GE Healthcare) 0圖9:具有使用正亮氨酸殘基全部置換所有甲硫氨酸的SEQ ID N0:1變體的 RPC(左圖)和MS (右圖)分析。左圖顯示wt SEQ ID NO :1 (2. 5 μ g批次1)和正亮氨酸變 體(25 μ g)的RPC譜型的重疊。很顯然，正亮氨酸變體的制劑包括所有可能的部分取代的 變體以及一些wt SEQ ID NO :1(詳情見(jiàn)文中；根據(jù)它們摻入正亮氨酸的數(shù)目來(lái)標(biāo)記各個(gè)種 類)。下面的分子質(zhì)量是經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)定的27876(wt，預(yù)測(cè)質(zhì)量為27876) ；27823. 5 (3，具有3 個(gè)正亮氨酸的變體的預(yù)測(cè)質(zhì)量為27822) ；27805 (4，預(yù)測(cè)質(zhì)量27804) ；27786. 5 (5，預(yù)測(cè)質(zhì)量 27786) ；27768 (6，預(yù)測(cè)質(zhì)量 27768)。圖10 后峰2的面積和RPC柱上滯留時(shí)間之間的相關(guān)性。第一時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)于滯留 /保留時(shí)間。對(duì)于其他實(shí)驗(yàn)，梯度的開(kāi)始被延緩15分鐘，30分鐘，60分鐘或120分鐘。圖11 在37°C下保存4周后批次1，SEQ ID NO 1的ElQ_a變體和ElQ_b變體的 RPC譜型。圖12 在37°C下保存的SEQ ID NO=I的部分肽圖。在胰蛋白酶消化和RPC分析 之前，批次1在37°C下保存2，4，6或8周；藍(lán)色譜型代表計(jì)時(shí)起點(diǎn)的對(duì)照。在70°C下使用 Zorbax 300SB-C3 柱和 5% -36. 7% ACN 的梯度以每分鐘 0. 33%進(jìn)行 RP-HPLC。圖13:批次1和SEQ ID NO 1 ElQ_a和ElQ_b變體的肽譜。蛋白用胰蛋白酶 (l/50w/w比值)在37°C下在24小時(shí)內(nèi)消化；將25 μ g各種消化的蛋白施加在柱上。RPC條 件與圖12中的實(shí)驗(yàn)相同。圖14:通過(guò)cIEF鑒定焦谷氨酸修飾。顯示了電泳圖的相關(guān)部分放大圖以使PI 差異更明顯。左圖批次1和ElQ-a變體(進(jìn)樣樣品含有0. 23mg/mL的批次1和0. 09mg/ mL的ElQ-a)的混合物的cIEF分析。右圖批次1和ElQ_b變體(進(jìn)樣樣品含有0. 23mg/ mL的批次1和0. 15mg/mL的ElQ_b)的混合物的cIEF分析。樣品在ICE280等電聚焦器 (isoelectric focuser)上分析之前用Zeba脫鹽吸附柱(Pierce)脫鹽。圖15 通過(guò)cIEF鑒定穩(wěn)定性樣品中的焦谷氨酸修飾。上圖含有在37°C下保存6 周的批次1的樣品的電泳圖。下圖相同的批次1穩(wěn)定性研究樣品和ElQ-a變體的混合物 (0. 42mg/mL的批次1和0. 09mg/mL的ElQ-a)的電泳圖。樣品在ICE280等電聚焦器上分析 之前用Zeba脫鹽吸附柱(Pierce)脫鹽。圖16:SEQ ID NO 1批次1 (上圖)和SEQ ID NO :2 (下圖)相對(duì)于在37°C下保存時(shí)間的RP-HPLC譜型。對(duì)材料原樣(對(duì)照，具有最高的主峰的曲線)，以及在37°C下保存2 周(具有第二高的主峰的曲線)、4周(具有第三高的主峰的曲線)、6周(具有第四高的主 峰的曲線)和8周(具有最低的主峰的曲線)后的樣品進(jìn)行分析。在保持于70°C下的C3 柱上對(duì)樣品進(jìn)行層析，吸光度在280nm下測(cè)量。SEQ ID NO :2的RPC譜型顯示了兩個(gè)新的 較早洗脫的分子種類，稱為Il和12。圖17 在計(jì)時(shí)起點(diǎn)時(shí)(藍(lán)線/上跡線)和在37°C下保存8周后(紅線/下跡線) wt SEQ ID NO :2 與其突變體形式 D105A，D105E，D105Q，D105N，和G106A的RPC譜型的比較。圖18 在計(jì)時(shí)起點(diǎn)時(shí)(紅線/上跡線)和在37°C下保存4周后(藍(lán)線/下跡線) 野生型SEQ ID NO 2 (WT)與其突變體形式D62A，D62E，和S63G的RPC譜型的比較。圖19 在37°C下保存的SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2中異天冬氨酸的形成。對(duì) 在各種溫育期后完整的SEQ ID NO :1(空心圓)、胰蛋白酶消化的SEQ ID N0:1(實(shí)心圓) 或胰蛋白酶消化的SEQ ID NO :2(三角形)測(cè)量異天冬氨酸。在完整蛋白中測(cè)量到的異天 冬氨酸的水平顯著較低，表明需要消化來(lái)盡量減小蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)對(duì)檢測(cè)異天冬氨酸殘基的影 響。蛋白中的異天冬氨酸豐度表示為百分比(％M M ；摩爾異天冬氨酸摩爾納米抗體 )。對(duì)于某些樣品，進(jìn)行兩次或三次獨(dú)立的異天冬氨酸含量的測(cè)定。圖20 在37°C下保存期間SEQ ID NO :1 (圓)及其單價(jià)副體SEQ IDNO :2(正方 形)的活性喪失。數(shù)據(jù)擬合為準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)態(tài)模型(見(jiàn)文中的eq.2)以推導(dǎo)出異構(gòu)化過(guò)程的表 觀速率常數(shù)，該過(guò)程似乎是失活的分子機(jī)制。對(duì)于SEQ ID N0:1和SEQ ID NO :2，半衰期分 別為 58天和 100天。圖21 在制備時(shí)存在或在保存期間出現(xiàn)的SEQ ID NO=I的主要產(chǎn)物相關(guān)變體。顯 示了 SEQ ID NO 2的氨基酸序列，SEQ ID NO 2為二價(jià)納米抗體 SEQ ID NO 1的單價(jià)構(gòu) 件。CDR區(qū)被下劃線。在本報(bào)告中討論的殘基顯示為紅色，即E1，M34，M78，M83，D62/S63， D105/G106(使用根據(jù)圖4的編號(hào))。除了 El以外，這些名稱指兩個(gè)等價(jià)位點(diǎn)，即SEQ ID NO 1的兩個(gè)相同結(jié)構(gòu)域的每一個(gè)中各有一個(gè)。圖 22 如在 AlphaScreen 測(cè)定(例如獲自 Perkin Elmer, UK 的 AlphaScreen 技 術(shù))中測(cè)定，RANKL-I和RANKL-1D62E顯示類似的效力。圖23 :RANKL-1+RANKL-1_D62E (線或多或少相同)的RPC分析。包括具有isoD62， isoD105，和oxM78峰(也參見(jiàn)實(shí)施例1)的SEQ ID NO :1譜型作為陽(yáng)性對(duì)照。*表示在起 始物質(zhì)和參考物質(zhì)中也存在的峰。IsoD62和isoD105分別對(duì)應(yīng)于Asp-105和Asp-62的異 構(gòu)化。oxM78對(duì)應(yīng)于Met-78的氧化。pyroEl對(duì)應(yīng)于N-末端環(huán)狀焦谷氨酸的形成。圖24 在ZORBAX C3上進(jìn)行IL6R203分析的214nm RP-HPLC層析譜，流速為ImL/ 分鐘，梯度斜率為0. 33 % B/分鐘，并使用TFA作為離子配對(duì)劑，但處于不同的柱溫度下 (500C -600C -700C -750C )。隨著柱溫度的下降峰洗脫時(shí)間增加且面積減小。圖25 在75和70°C下分析的樣品的峰底區(qū)上的放大圖。75°C顯示第一后峰中有 相當(dāng)大地增加。應(yīng)當(dāng)注意這可能是溫度效應(yīng)。圖26 不同的柱溫度對(duì)IL6R202的RP-HPLC譜型的作用非常大——這也見(jiàn)于 IL6R203。獲得可用的層析譜的最小溫度為70°C。圖27-33 通過(guò)RPC分析IL6R201野生型和突變體使用的柱為安捷倫(Agilent) 系統(tǒng)上的ZORBAX 300SB C3 (5 μ m)柱。在實(shí)驗(yàn)期間柱的溫度為70°C。實(shí)驗(yàn)期間使用的緩沖液A為0. 三氟乙酸，緩沖液B為0. 三氟乙酸/99. 9%乙腈。圖34 =SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 26均在37°C下保存。4周后，樣品通過(guò)RPC分 析；層析譜的重疊顯示在圖34中。圖35 :ALX-0081和VffFOOOl的Folts'研究。血流顯示為時(shí)間的函數(shù)，表示CFR0 股動(dòng)脈(對(duì)照)損傷和狹窄后測(cè)量CFR 30分鐘。注射鹽水，并測(cè)量對(duì)CFR的作用30分鐘。 注射ALX-0081或VWF0001，每30分鐘增加劑量。給藥時(shí)間用紅色箭頭指示，劑量以紅色指 示(yg/kg)。當(dāng)觀察到CFR的完全抑制時(shí)，施加新的損傷。在測(cè)試項(xiàng)目的最高劑量后，注射 腎上腺素。圖36 對(duì)于用ALX-0081和VWF0001治療的狒狒，利托菌素誘導(dǎo)的聚集(％ )和CFR 的長(zhǎng)度(秒)是所有劑量的函數(shù)。圖37 =VHH片段IL6R201的強(qiáng)制氧化實(shí)驗(yàn)的280nm處的重疊RP-HPLC層析譜。下 跡線是未處理的參考物質(zhì)IL6R201的層析譜。上跡線是用IOmM H2O2處理2小時(shí)的IL6R201 的層析譜。圖38 :119A3的強(qiáng)制氧化實(shí)驗(yàn)的280nm處的重疊RP-HPLC層析譜。上跡線未處理 的119A3參考樣品沖間跡線在6M胍的存在下用H2O2處理的119A3樣品；下跡線用H2O2 處理的119A3樣品。圖39 在37°C下溫育8周的ISEQ ID NO :26(上跡線)和在_80°C下保存的參考 物質(zhì)(下跡線)的在280nm處記錄的RP/HPLC/RPC層析譜。圖40 在37°C下溫育8周的SEQ ID NO 25 (上跡線)和在_80°C下保存的參考物 質(zhì)(下跡線)的在280nm處記錄的RP/HPLC層析譜。圖41 =RANKL-I中pH依賴性的N-末端環(huán)狀焦谷氨酸形成。RANKL-1配制在不同 的緩沖液中并且在37°C下保存至8周。在以63mg/ml處于IOmM NaH2PO4,pH 7中(實(shí)心正 方形)，以30mg/ml處于IOmM NaH2PO4, pH7中(空心正方形)，以63mg/ml處于乙酸鈉，pH 5. 5(實(shí)心三角形)或以30mg/ml處于IOmM乙酸鈉，pH 5. 5中(空心三角形)中的RANKL-I 保存樣品的RPC分析顯示隨著溫育時(shí)間和緩沖液pH的增加焦谷氨酸變體的形成增加。表 示為總積分表面積的百分比的焦谷氨酸的峰表面積在PH7下比在pH5. 5下高。圖42 納米抗體321中pH依賴性的N-末端環(huán)狀焦谷氨酸形成。納米抗體321的 穩(wěn)定性在2種緩沖液中評(píng)估pH6下的組氨酸20mM與pH 6.5下的組氨酸20mM相比，兩者 均以5mg/mL的蛋白濃度。樣品在37°C下脅迫直至6周。納米抗體321保存樣品的RPC分 析顯示焦谷氨酸變體的形成隨著溫育時(shí)間和緩沖液PH的增加而增加。上圖(圖42A)，在 37°C下6周后RPC層析譜的實(shí)例(下跡線-80°C參考；中間跡線pH6 ；上跡線pH6. 5)。下 圖(圖42B)，顯示表示為總積分表面積的百分比的焦谷氨酸的峰表面積的圖，該峰表面積 在ρΗ6· 5下(空心正方形)比在ρΗ6下(實(shí)心正方形)高。實(shí)驗(yàn)部分實(shí)施例1 :vWF結(jié)合納米抗體和納米抗體構(gòu)建體(SEQ ID NO 1 ;SEQ IDNO 2)的穩(wěn) 定1)SEQ ID NO 1 的化學(xué)表征SEQ ID NO 1是二價(jià)納米抗體 ;單條多肽鏈由兩個(gè)相同拷貝的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域 組成，所述兩個(gè)拷貝頭對(duì)尾地融合，其間為三個(gè)丙氨酸殘基接頭(參見(jiàn)W02006122825的SEQID NO 98以及用于生成SEQ ID NO 1的說(shuō)明書)。在每個(gè)結(jié)構(gòu)域中存在一個(gè)二硫鍵。分析 包將評(píng)估大多數(shù)典型地觀察到的蛋白降解/修飾機(jī)制，更具體地為水解作用、氧化作用、脫 酰胺作用、二硫鍵修飾作用以及凝集/沉淀。注意某些修飾作用，諸如脫磷酸作用和去糖基 化作用不適用，因?yàn)闆](méi)有發(fā)生這些翻譯后修飾。表B-I 使用特殊的方法對(duì)SEQ ID NO=I的各批次獲得的測(cè)試結(jié)果。
測(cè)試測(cè)試結(jié)果批次1批次2批次3批次4批次5Biacore 1 批次1的％ 效力10095959496cIEF (毛細(xì)管 主峰 等電聚 焦)97.897.798.198.197.6SEC (尺寸排 主峰 阻層析)99.699.999.599.699.5主峰 前峰1+2+3 RPC 后峰1 其他后峰93.6 1.9 3.7 0.893.8 1.8 3.5 0.993.4 2.1 3.6 0.992.8 2.6 4.693.1 2.3 3.6 0.9 (#)表中顯示的所有值均為百分?jǐn)?shù)。(#)對(duì)于批次5,后峰2的％面積單獨(dú)地報(bào)告；對(duì)于此樣 品的其他峰的％面積為0%。 通常，類似cIEF，SEC, RPC和表面等離子共振的分析方法揭示了 SEQID NO 1的 各批次之間的高度一致性。這在表B-I中闡明，該表中顯示了最相關(guān)的產(chǎn)物特異性分析方 法的結(jié)果。對(duì)我們而言反相層析(RPC)是最有益的方法，因?yàn)槠鋵EQ ID NO :1藥物物質(zhì) (DS)解析成許多不同的種類(參見(jiàn)圖1)。備選地，HIC(疏水相互作用層析)也可以是分 析DS中多樣性的合適的方法。除了主峰以外，可辨別前峰(在主物質(zhì)前洗脫的物質(zhì))和許 多后峰。在到目前為止產(chǎn)生的批次中，前峰和后峰1分別始終表現(xiàn)為約2%和3. 6%，而其 他后峰占DS的< 1%。
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以前對(duì)RPC前峰和后峰1進(jìn)行了表征。通過(guò)ESI質(zhì)譜法顯示前峰比目的物質(zhì)重 16Da ；結(jié)合由用H2O2處理組成的強(qiáng)制氧化實(shí)驗(yàn)，這表明前峰來(lái)自氧化作用。假設(shè)此氧化作用 發(fā)生在一個(gè)或多個(gè)甲硫氨酸殘基處(注意SEQ ID NO :1在兩個(gè)相同的結(jié)構(gòu)域的每一個(gè)中含 有三個(gè)甲硫氨酸殘基)。此外證明強(qiáng)制氧化的程度(在一定限度內(nèi))對(duì)生物活性無(wú)影響。 質(zhì)譜和氨基酸分析已經(jīng)證明后峰1比主物質(zhì)輕18Da，并且這是正亮氨酸殘基錯(cuò)誤摻入甲硫 氨酸位點(diǎn)的結(jié)果。RPC后后峰1物質(zhì)的回收表明此產(chǎn)物相關(guān)物質(zhì)也是功能性的。實(shí)驗(yàn)工作 揭示在收獲時(shí)氧化和正亮氨酸產(chǎn)物相關(guān)物質(zhì)都可存在于培養(yǎng)基中，且在下游加工期間它們 的水平在一定程度上降低。對(duì)SEQ ID NO 1的各批次的穩(wěn)定性研究指出某些產(chǎn)物相關(guān)物質(zhì)的相對(duì)豐度隨時(shí)間 和溫度增加。圖2清晰地顯示了對(duì)于前峰以及后峰1均是如此。相反，并且十分令人驚奇 地，后峰1的相對(duì)峰面積顯然不受溫育時(shí)間或溫度的影響。另外，對(duì)SEQ ID NO :1觀察到的 RPC主峰在延長(zhǎng)溫育時(shí)似乎分裂成幾種不同的種類。尤其在較高的溫度下(》250C ；見(jiàn)圖 3)。數(shù)據(jù)指出在保存期間生成了一些較早洗脫的新分子種類。使用下面的氨基酸的單字母代碼A，丙氨酸；D，天冬氨酸；E，谷氨酸；G，甘氨酸； K，賴氨酸；M,甲硫氨酸；N，天冬酰胺；Q，谷氨酰胺；R，精氨酸；S，絲氨酸；T，蘇氨酸。SEQ ID NO 1的幾種不同的制劑/樣品用于本報(bào)告中討論的各種實(shí)驗(yàn)中，包括，例 如，SEQ ID N0:1批次1，且其他的見(jiàn)表B-1。二價(jià)SEQ IDNO :1納米抗體⑧由兩個(gè)相同拷貝 的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域組成，所述兩個(gè)拷貝頭對(duì)尾地融合，其間為三丙氨酸接頭。對(duì)稱為SEQ ID NO :2(參見(jiàn)W02006122825的SEQ ID NO :90和用于生成SEQ ID NO :2的說(shuō)明書)的單 價(jià)構(gòu)件的分析，結(jié)果是非常有價(jià)值的；這歸因于與SEQ ID NO :1相比較低的復(fù)雜性以及以 下的事實(shí)，即，與二價(jià)SEQ ID N0:1相比，對(duì)于SEQ IDNO :2，目的分子及其產(chǎn)物相關(guān)變體被 RP-HPLC更好地解析。另外，進(jìn)行突變分析，并且構(gòu)建、純化并分析SEQ ID NO :1和SEQ ID NO 2兩者的各種突變體形式(見(jiàn)表B-2)。單價(jià)構(gòu)件SEQ ID NO 2的氨基酸序列顯示在圖 4中，并且突出顯示在本報(bào)告中討論的殘基。至少一個(gè)批次不含有RPC后峰1 (見(jiàn)圖1)，發(fā) 現(xiàn)其是生物合成期間正亮氨酸錯(cuò)誤摻入的結(jié)果(見(jiàn)下)。表B-2:在本表征研究中使用的 SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2的修飾/突變體形式的目錄。所有重組蛋白均在大腸桿菌中 產(chǎn)生，并且經(jīng)離子交換層析，緊接著尺寸排阻層析純化。
SED ID NO 2的其他突變體
突變體SEQ ID NO:VWF0001；25DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSYNPMGWFRQAPGKG RELVAAISRTGGSTYYPESVEGRFTISRDNAKRTVYLQMNSLRAE DTAVYYCAAAGVRAEQGRVRTLPSEYTFWGQGTQVTVSSAAAE VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSYNPMGWFRQAPGKGR 2)方法SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 2 的突變體(表 B-2)的生成使用QuikChange定向誘變?cè)噭┖?Stratagene，CA, USA)引入突變。使用 PfuTurbo DNA聚合酶和循環(huán)變溫儀進(jìn)行QuikChange定向誘變法。PfuTurbo DNA聚合 酶高保真地復(fù)制兩條質(zhì)粒鏈，而不置換突變體寡核苷酸引物?；静襟E利用含有目的插入 體的超螺旋的雙鏈DNA(dsDNA)載體和含有所需突變的兩個(gè)合成的寡核苷酸引物。每個(gè)都 與載體的相反鏈互補(bǔ)的寡核苷酸引物通過(guò)PfuTurbo DNA聚合酶在循環(huán)變溫期間延伸。寡核 苷酸引物的摻入生成了含有交錯(cuò)切口的突變質(zhì)粒。在循環(huán)變溫后，產(chǎn)物用Dpn I處理。Dpn I核酸內(nèi)切酶(靶序列5' -Gm6ATC-3')對(duì)甲基化和半甲基化DNA特異，并且用來(lái)消化親 代DNA模板并選擇含有突變的合成DNA。從幾乎所有大腸桿菌菌株中分離的DNA均是dam 甲基化的(dam-methylated)，因此對(duì)Dpn I消化敏感。2. DSEQ ID NO !, SEQ ID NO 2及其突變體的結(jié)合效力使用并行線路測(cè)定SEQ ID NO 1的結(jié)合效力。該方法以這樣方式設(shè)計(jì)，以觀察到 雙功能性；因此SEQ ID NO 1的單價(jià)構(gòu)件SEQ ID NO 2沒(méi)有效力。SEQ ID NO :2的野生型和突變體形式對(duì)vWF的Al結(jié)構(gòu)域的親和性通過(guò)SI3R技術(shù) (BIAcore)進(jìn)行測(cè)定。各種濃度的SEQ ID NO 2(0. 5_20nM范圍)在Al傳感器芯片上流過(guò)。 從獲得的傳感圖譜推導(dǎo)動(dòng)力學(xué)常數(shù)k。n和k。ff，并且用來(lái)計(jì)算平衡解離常數(shù)KD。在某些實(shí)驗(yàn) 中，野生型和突變體SEQID NO 2的樣品通過(guò)測(cè)量與Al傳感器芯片的初始結(jié)合速率來(lái)進(jìn)行 比較。對(duì)于這些實(shí)驗(yàn)，樣品稀釋至2nM濃度。通過(guò)將在進(jìn)樣開(kāi)始后5秒和25秒之間獲得的數(shù)據(jù)點(diǎn)進(jìn)行線性擬合從傳感圖譜的解離相中測(cè)定初始結(jié)合速率，并且報(bào)告的值為5次獨(dú)立 測(cè)量值的平均值。2. 2) SEQ ID NO !, SEQ ID NO 2 及其突變體的 RP-HPLC 分析大多數(shù)對(duì)完整蛋白的RPC分析本質(zhì)上如其他地方(A. A. Wakankar等， Biochemistry (生物化學(xué))2007，46，1534-1544)所述而進(jìn)行。在本報(bào)告中提及相關(guān)的差異。 胰蛋白酶消化產(chǎn)物的RPC分析在下面更詳細(xì)地描述。2. 3)通過(guò) RPC 測(cè)定 SEQ ID NO 1 的濃度反相-HPLC(RP-HPLC 或 RPC)使用的柱為安捷倫(Agilent)系統(tǒng)上的ZORBAX 300SB C3 (5 μ m)。在實(shí)驗(yàn)期間該 柱的溫度為70°C。使用的緩沖液A為0. 三氟乙酸，緩沖液B為0. 三氟乙酸/99.9% 乙腈。使用的程序描述如下程序 作為通用規(guī)則，利用分光光度計(jì)測(cè)量SEQ ID NO :1,SEQ ID NO 2及其突變體的濃 度。回收某些RP-HPLC級(jí)分中包含的物質(zhì)用于直接測(cè)量生物活性。回收收率一般十分低， 并且在重建的樣品中SEQ ID NO :1(產(chǎn)物相關(guān)的變體)的濃度不允許進(jìn)行濃度的分光光度 計(jì)測(cè)量。在這些情況下，通過(guò)RPC再分析收集的物質(zhì)和針對(duì)校正曲線的峰面積比較來(lái)確定 濃度，所述校正曲線用SEQ ID NO 1批次1建立并且使SEQ ID NO=I的量與RPC總峰面積 相關(guān)聯(lián)。2. 4)質(zhì)譜法使用來(lái)自安捷倫(Agilent)的MSD ESI-TOF儀器進(jìn)行質(zhì)譜分析。如果該儀器連接 到安捷倫(Agilent) 1100HPLC，則其用作MS檢測(cè)器以測(cè)定RPC法中各個(gè)峰的質(zhì)量。對(duì)于獨(dú) 立樣品的質(zhì)量測(cè)定，在MS分析之前使用Poros-I柱用于緩沖液更換。在根特大學(xué)蛋白質(zhì)生物化學(xué)和蛋白質(zhì)工程實(shí)驗(yàn)室(Ghent University, Laboratory of Protein Biochemistry and Protein Engineering)進(jìn)對(duì)于白勺MS禾口MS/MS實(shí) 驗(yàn)在以陽(yáng)離子模式工作的4700蛋白組學(xué)分析儀(Proteomics Analyzer) (MALDI-T0F/T0F, Applied B iosystems)或四極飛行時(shí)間儀(quadrupole time-of-flight instrument) (Q-T0F I，Micromass/Waters)上運(yùn)行。在埃博靈克斯股份有限公司和布魯塞爾自由大學(xué)(Free University of Brussels)，使用 Q-TOF Ultima (Micromass/ffaters)獲得 ESI 質(zhì)譜。對(duì)于MALDI分析，0. 5 μ L胰蛋白酶消化產(chǎn)物與10 μ L α -氰基_4_羥基肉桂酸 (10mg，在ImL 50% ACN, 10%乙醇和0. 1 % TFA中)混合，并且點(diǎn)樣在MALDI靶標(biāo)板上。在 400-4500Th的m/z范圍內(nèi)記錄光譜。對(duì)于ESI-MS分析，在400_1200Th的m/z范圍內(nèi)記 錄光譜。最終的光譜解卷積(deconvoluted)，并且使用MaxEnt軟件(Micromass/Waters) 測(cè)定蛋白的分子質(zhì)量。經(jīng)碰撞誘導(dǎo)解離(CID)6進(jìn)行ESI-MS/MS分析。使用MaXEnt3算法 (Micromass/ffaters)從MS/MS光譜中推導(dǎo)出序列信息。2. 5) SEQ ID NO=I的胰蛋白酶肽圖SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2 (ca. lmg/mL終濃度)的樣品用被還原性甲基化修飾 的胰蛋白酶(Promega ；約20 μ g/mL終濃度)消化。如果需要使用D-PBS進(jìn)行稀釋，并且在 37°C下水解24小時(shí)，然后將該混合物在_20°C下冷凍。在于70°C工作的C3柱上進(jìn)行肽分級(jí) 分離。典型地，將25yL消化產(chǎn)物(ca. 20 μ g蛋白)加樣至柱上，并且使用從5% ACN-0. 1% TFA增加至36. 7% ACN-0. 1% TFA的乙腈梯度在97分鐘內(nèi)洗脫肽。在214nm處檢測(cè)各峰。 圖5給出了胰蛋白酶消化后獲得的層析譜，該層析譜與在37°C下溫育8周后獲得的曲線重 疊。通過(guò)質(zhì)譜法確定大多數(shù)峰的身份(見(jiàn)表B-3)。表B-3 在SEQ ID NO 1的胰蛋白酶圖譜中觀察到的峰的身份。T2-T2，代表預(yù)期 的二硫鍵連接的肽。T2-T2和T2’ -T2’是意料之外的；在SEQ ID NO 2中也觀察到這些的
事實(shí)表明它們反映了一些人工的二硫化物重排，并且不是錯(cuò)誤的二硫鍵鍵合的結(jié)果。
2. 6)異天冬氨酸的酶法定量ISOQUANT 異天冬氨酸檢測(cè)試劑盒(Promega Corporation, Madison, WI, USA)用于定量檢測(cè)SEQ ID NO=I和SEQ ID NO 2中的異天冬氨酸殘基。ISOQUANT 法使用酶蛋白異天冬氨酰甲基轉(zhuǎn)移酶(PIMT)，該酶介導(dǎo)不規(guī)則的β-天冬氨酸肽鍵轉(zhuǎn)變成 為正常的肽鍵。PIMT催化S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)的活性甲基轉(zhuǎn)移至異天冬氨酸的 α-羧基位置處，以形成0-甲基酯并且在該過(guò)程中生成S-腺苷高半胱氨酸(SAH)。此甲基 酯的自發(fā)分解導(dǎo)致甲醇的釋放和琥珀酰亞胺中間產(chǎn)物(即，在天冬酰胺殘基的脫酰胺作用 和天冬氨酸殘基的重排期間形成的相同的環(huán)狀酰亞胺中間產(chǎn)物)的形成。然后環(huán)狀酰亞胺 緩慢地水解以形成天冬氨酸和異天冬氨酸的混合物。在每次甲基化循環(huán)下，15-30%的不規(guī) 則肽鍵轉(zhuǎn)變?yōu)檎５碾逆I。異肽鍵向正常肽鍵的甲基化依賴性轉(zhuǎn)變支持了 PIMT在衰老損 傷蛋白的修復(fù)中的生物學(xué)作用。酶促甲基化提供了一種高度敏感的定量測(cè)定法以測(cè)定肽或蛋白中的異天冬氨酸。 在一種格式中，ISOQUANT 試劑盒檢測(cè)甲基化反應(yīng)的副產(chǎn)物，即SAH。由于這是相對(duì) 小的分子，其通?？蓮碾闹蟹蛛x，并且可通過(guò)反相高壓液相色譜(使用Everest C18柱的 RP-HPLC)來(lái)定量。在測(cè)試樣品中異天冬氨酸針對(duì)靶蛋白的量通過(guò)與使用參考標(biāo)準(zhǔn)肽(序 列WAGG-IsoD-ASGE)并且借助于SAH HPLC標(biāo)準(zhǔn)品(兩種試劑均由該試劑盒提供)進(jìn)行的 反應(yīng)進(jìn)行比較而確定。典型地，在使用陽(yáng)性對(duì)照肽的實(shí)驗(yàn)中， 82%預(yù)期的異天冬氨酸被回 收。根據(jù)ISOQUANT 試劑盒的供應(yīng)商的使用說(shuō)明書進(jìn)行該測(cè)定。我們發(fā)現(xiàn)必須將SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2的樣品粉碎以盡量減小蛋白結(jié)構(gòu)對(duì)異天冬氨酸殘基的檢測(cè)的影 響。事實(shí)上觀察到在完整蛋白中測(cè)量到的異天冬氨酸的皮摩爾數(shù)顯著地低于消化蛋白中的 皮摩爾數(shù)。用胰蛋白酶(1 50 ;w w)在37°C下對(duì)樣品進(jìn)行蛋白酶消化24小時(shí)，并且用 蛋白酶抑制劑PMSF(ImM終濃度；甲苯磺酰氟(phenylmethanesulphonylfluoride))終止反 應(yīng)。在ISOQUANT 分析中包含適當(dāng)?shù)目瞻?對(duì)照反應(yīng)以確認(rèn)不存在殘余的胰蛋白酶活 性，并且解釋胰蛋白酶中存在的任何異天冬氨酸殘基。3)結(jié)果3. 1) RPC前峰1 (和前峰3)的分析RPC前峰(在主物質(zhì)前洗脫的物質(zhì))包括占優(yōu)勢(shì)的前峰1。此前峰1的相對(duì)峰面 積隨保存時(shí)間和溫度增加(見(jiàn)圖2)。以前通過(guò)ESI質(zhì)譜和強(qiáng)制氧化實(shí)驗(yàn)(參照?qǐng)D6)顯示 此前峰1代表單氧化形式，其比預(yù)期的SEQ ID N0:1重16Da?；谶@是一個(gè)常見(jiàn)類型的蛋 白化學(xué)修飾這一事實(shí)，假設(shè)此氧化作用發(fā)生在一個(gè)或多個(gè)甲硫氨酸殘基處。SEQ ID N0:1含 有6個(gè)甲硫氨酸殘基，即兩個(gè)相同結(jié)構(gòu)域的每一個(gè)中有3個(gè)(圖4)。有意氧化可產(chǎn)生另外 的(多個(gè))氧化種類，最顯著地是在圖6中指出的+32Da種類。如觀察結(jié)果所證明，所有的 氧化變體似乎都是有活性的，所述觀察結(jié)果是由14%主峰和多至86%前峰組成的物質(zhì)是 完全功能性的。通過(guò)直接分析在RP-HPLC分離期間收集的前峰1物質(zhì)進(jìn)一步證實(shí)了前峰是完全 有活性的論點(diǎn)。為此，代表前峰1的洗脫級(jí)分使用離心濃縮器(speedvac) (miVAc濃縮器， Genevac)干燥，重新溶解在含有0. 02%吐溫80的PBS中，并且測(cè)定濃度后，在效力測(cè)定中 進(jìn)行分析。通過(guò)RPC再分析確認(rèn)分離物質(zhì)的身份。這也允許通過(guò)將峰面積與使用SEQ ID NO 1建立的校準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較而定量前峰1物質(zhì)(見(jiàn)章節(jié)6. 3 ；注意相對(duì)低量的前峰1物質(zhì)不允許分光光度測(cè)定濃度)。通過(guò)對(duì)照的方式使用相同的方法分離RPC主峰物質(zhì)，重建和 定量。發(fā)現(xiàn)RPC主峰和前峰1的效力實(shí)際上相同；主峰和前峰的相對(duì)效力分別為66. 7%和 65.5%?；厥盏闹鞣搴颓胺?物質(zhì)的等同性強(qiáng)烈地支持氧化的SEQ ID NO :1與真實(shí)蛋白一 樣有活性的論點(diǎn)。使用SEQ ID NO :2，即SEQ ID NO 1的單價(jià)構(gòu)件，進(jìn)一步研究SEQ IDNO 1納米抗 體⑧的氧化。我們預(yù)期這將是有利的，因?yàn)镾EQ ID NO 1的SEQ ID NO 2亞結(jié)構(gòu)域僅含有 三個(gè)甲硫氨酸殘基，因此降低了復(fù)雜性，即，減少了氧化變體的理論可能數(shù)目。我們還發(fā)現(xiàn) 與SEQ ID NO :1相比，對(duì)于SEQ ID NO :2，非氧化分子和各種氧化變體較好地被解析。圖7 顯示天然SEQ ID NO :2納米抗體的氧化多半發(fā)生在一個(gè)單甲硫氨酸殘基上；相反，當(dāng)該分 子通過(guò)鹽酸胍處理被展開(kāi)后所有三個(gè)甲硫氨酸殘基都易于被氧化。通過(guò)分析三個(gè)不同的甲 硫氨酸至丙氨酸突變體，即，M34A，M78A，和M83A，獲得了易發(fā)生氧化的殘基的鑒定，以及，同 時(shí)，明確地證明氧化作用實(shí)際上發(fā)生在甲硫氨酸處。顯示在圖8中的這些分析清楚地指出 氧化作用發(fā)生在78位的甲硫氨酸殘基上；M34A和M83A突變體仍然對(duì)氧化作用敏感，而丙 氨酸對(duì)M78的置換似乎導(dǎo)致SEQ ID NO :2變體基本上耐受強(qiáng)制氧化(至少在測(cè)試條件下)。 不象M34A和M83A突變體，M78A變體在制備時(shí)不含有前峰，表明前峰僅由M78氧化導(dǎo)致(數(shù) 據(jù)未顯示)。另外，也發(fā)現(xiàn)對(duì)于M34A和M83A所見(jiàn)到的小的前峰在37°C下延長(zhǎng)保存時(shí)增加 (例如，6周；數(shù)據(jù)未顯示)。后一觀察結(jié)果證實(shí)空氣氧化和強(qiáng)制過(guò)氧化物介導(dǎo)的氧化作用 靶向相同的M78殘基。單價(jià)SEQ ID NO :2中基本上僅單個(gè)甲硫氨酸對(duì)氧化作用敏感的結(jié)論 與在二價(jià)SEQ ID NO :1納米抗體 的持續(xù)氧化期間單氧化和雙氧化種類兩者的積累相一致 (見(jiàn)圖6)。似乎這一雙氧化形式與RPC譜型中的前峰3相對(duì)應(yīng)。還要注意所有三種甲硫氨酸至丙氨酸突變體對(duì)固定的vWF Al結(jié)構(gòu)域的親和性與 wt SEQ ID NO :2納米抗體的結(jié)合常數(shù)(1. 2nM)處于相同的范圍。發(fā)現(xiàn)M34A，M78A，和M83A 的平衡解離常數(shù)分別為1. 96nM, 1. 46nM，和1. 29nM。該結(jié)果與甲硫氨酸氧化不影響SEQ ID NO 1的效力的發(fā)現(xiàn)相一致。因此似乎甲硫氨酸殘基不參與與vWF Al結(jié)構(gòu)域的結(jié)合。還使用胰蛋白酶肽圖來(lái)檢驗(yàn)SEQ ID NO 1的氧化。峰TlO興(見(jiàn)圖5和表B_3) 顯示含有1269. 6Da的肽，其恰好對(duì)應(yīng)于TlO的單氧化變體(1253. 5+16Da)。這不允許定位 在氧化敏感的甲硫氨酸殘基，因?yàn)門lO肽包含M78和M83兩者。而且，發(fā)現(xiàn)TlO興峰主要由 897. 4Da的非特異性裂解產(chǎn)物組成(MVYLQMN ；見(jiàn)表B-3和肽圖顯影報(bào)告)，其還包括78位 和83位處的甲硫氨酸。后一片段解釋了下面的觀察結(jié)果，即，TlO興相對(duì)于TlO的峰面積在 計(jì)時(shí)起點(diǎn)已經(jīng)很高，并且在37°C下溫育期間不顯著地增加。實(shí)際上，氧化作用對(duì)TlO興中存 在的兩個(gè)片段將具有相反的作用，一方面T10+16Da變體增加，另一方面非特異性裂解產(chǎn)物 減少。肽作圖數(shù)據(jù)的分析也顯示TlO峰的面積在37°C下保存期間逐漸減小。盡管這與78 位處甲硫氨酸殘基的氧化相一致，假如有可能與非特異性裂解相沖突，結(jié)果必須要小心處 理。在37°C下溫育8周后的SEQ ID NO=I中觀察到的1269. 6Da片段，對(duì)其進(jìn)行ESI-Q-TOF MS/MS分析。在該實(shí)驗(yàn)中獲得的部分序列數(shù)據(jù)不允許直接確認(rèn)78位處的甲硫氨?；鶃嗧?(methionyl sulfoxide) 0然而這可從83位處未修飾的甲硫氨酸的存在而推斷出來(lái)。3. 2) RPC后峰1的分析后峰1由生物合成期間在一個(gè)甲硫氨酸位點(diǎn)處錯(cuò)誤摻入正亮氨酸殘基而產(chǎn)生。這 通過(guò)質(zhì)譜和氨基酸分析的組合而最終確定。電噴霧電離飛行時(shí)間(ESI-TOF)測(cè)量已經(jīng)顯示后峰1以質(zhì)量為27858 Da的蛋白占優(yōu)勢(shì)，其分子質(zhì)量比真實(shí)的二硫鍵連接的SEQ ID NO=I 納米抗體 小_18Da。對(duì)于-ISDa差異一種可能的解釋是正亮氨酸替換了甲硫氨酸殘基。 此假設(shè)通過(guò)純化的主峰和后峰的氨基酸分析得到確認(rèn)，該分析指出僅后峰1物質(zhì)含有正亮 氨酸和按比例地較少量的甲硫氨酸。應(yīng)當(dāng)注意，在氨基酸分析中典型地用作內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的正 亮氨酸在這些實(shí)驗(yàn)中被省略。為了測(cè)定-ISDa產(chǎn)物相關(guān)變體的效力(即，觀察親和性測(cè)量值)，在RP-HPLC分離 期間收集后峰1并直接在PLA效力測(cè)定中測(cè)量。類似于對(duì)前峰1進(jìn)行的處理，代表后峰1 的洗脫級(jí)分首先使用離心濃縮器(speedvac) (miVac Duo Concentrator，Genevac)干燥，然 后在PBS中再溶解。以相同的方式純化RPC主峰作為對(duì)照。進(jìn)行三個(gè)獨(dú)立但稍有不同的實(shí) 驗(yàn)。在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，用分光光度計(jì)測(cè)定重建后的濃度，并且不向PBS中加入吐溫。在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，在干燥物質(zhì)重建時(shí)，在PBS中存在0.02%吐溫(以防止蛋白從 相對(duì)稀的樣品中損失)并且通過(guò)RP-HPLC再分析從峰面積推算濃度。RPC再分析還確認(rèn)分 離物質(zhì)的身份。在第三個(gè)實(shí)驗(yàn)中，我們另外將純化的主峰物質(zhì)稀釋至與后峰變體大致相同 的濃度以盡可能地消除主峰和后峰樣品之間的任何不一致性。在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，在RPC分 析后收集主峰和后峰1級(jí)分，在離心過(guò)濾裝置(Microcon YM_3，3kDa NMW,Millipore)上濃 縮，并且通過(guò)在S印hadex G-25離心柱上凝膠過(guò)濾將緩沖液更換為D-PBS。在實(shí)驗(yàn)期間，觀 察到部分物質(zhì)的沉淀，并且關(guān)于效力測(cè)定中使用的濃度存在一些不精確性。發(fā)現(xiàn)主峰和后 峰1的效力分別為參考SEQ IDNO 1的91. 9%和51. 6%。在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，蛋白通過(guò)干燥 和在水中再溶解而由RPC級(jí)分重建。與第一次測(cè)量相比，發(fā)現(xiàn)主峰和后峰1分別具有50% 和81%的效力。整體上，上述結(jié)果提供了強(qiáng)力的證據(jù)，即后峰1具有與真實(shí)的SEQ ID NO 1相同的效力。觀察到的變化歸因于WH2O-TFA-ACN溶劑中回收完整物質(zhì)的難度；發(fā)現(xiàn)回收 率本身是十分低的，特別是在低豐度產(chǎn)物相關(guān)的變體的情況下。為了進(jìn)一步證實(shí)正亮氨酸對(duì)效力沒(méi)有不良作用的假設(shè)，與在SEQ IDNO=I中的摻 入位點(diǎn)無(wú)關(guān)，我們制備了甲硫氨酸被正亮氨酸殘基全部替換的SEQ ID N0:1變體。在生長(zhǎng) 在補(bǔ)充了 L-正亮氨酸的基本培養(yǎng)基中的甲硫氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷株中產(chǎn)生此SEQ ID N0:1變異 體。更具體地，細(xì)胞首先在非誘導(dǎo)條件下生長(zhǎng)在豐富培養(yǎng)基中，然后通過(guò)離心收集并重新懸 浮在含有L-正亮氨酸的基本培養(yǎng)基中，并且最后，在短暫的溫育時(shí)間后，通過(guò)加入IPTG誘 導(dǎo)。此方法以前已經(jīng)進(jìn)行了描述(Cirino等，2003，Biotechnol. Bioeng.(生物技術(shù)與生物 工程)83，729-734)。SEQ ID NO :1制劑通過(guò)RPC、肽作圖和MS表征；本質(zhì)上，這些方法確認(rèn) 所有6個(gè)甲硫氨酸被正亮氨酸殘基交換。然而從圖9中很清楚，該制劑除了預(yù)期的正亮氨 酸變體以外(圖9中標(biāo)記的6)，還含有小量的所有可能的部分置換的變體(圖9中標(biāo)記的 1-5)以及一些wt SEQ ID NO :1。wt SEQ ID NO=I的存在非?？赡苁怯捎诩?xì)胞在豐富培養(yǎng) 基預(yù)培養(yǎng)期間啟動(dòng)子的不完全關(guān)閉而引起的遺漏表達(dá)的結(jié)果。部分置換形式清楚地指示在 轉(zhuǎn)換至基本培養(yǎng)基+正亮氨酸后剩余的甲硫氨酸的存在。多置換的變體的相對(duì)效力為80% (三次測(cè)量值的均值67.9%，85. 5%和86. 7% )。因此，在所有6個(gè)甲硫氨酸殘基被正亮 氨酸完全置換的情況下，似乎SEQ ID NO :1的生物活性甚至不受影響，此結(jié)果必然暗示，單 個(gè)正亮氨酸交換，不論其位置如何，也不影響效力。單個(gè)甲硫氨酸被正亮氨酸殘基置換或甲硫氨酸-78的氧化不(可測(cè)量到的)影響 SEQ ID NO :1的效力的結(jié)論與下列的觀察結(jié)果相一致，即所有三個(gè)甲硫氨酸至丙氨酸突變體(參見(jiàn)章節(jié)7. 1)對(duì)固定的vWF Al結(jié)構(gòu)域的親和性與wt SEQ ID NO :2納米抗體的結(jié)合常 數(shù)處于相同的范圍內(nèi)。野生型，M34A，M78A，和M83A的平衡解離常數(shù)分別為1. 2nM, 1. 96nM, 1.46nM，和1.29nM。這種相對(duì)小的差異，假設(shè)它們真是這樣，在二價(jià)SEQ ID NO :1與固定的 vWF Al結(jié)構(gòu)域結(jié)合的強(qiáng)烈條件下不可能被顯示出來(lái)。總之，數(shù)據(jù)表明甲硫氨酸殘基對(duì)SEQ ID NO 1的生物活性不是關(guān)鍵性的。3. 3) RPC后峰2的分析誦i寸RPC俯_一斜滿卜遞魏2后峰2在制備時(shí)占總峰面積的約0. 9%。觀察到當(dāng)改變RPC運(yùn)轉(zhuǎn)使得材料被洗脫 之前在70°C下在柱上停留較長(zhǎng)時(shí)間時(shí)該后峰增加。其中洗脫被延遲15分鐘，30分鐘，60分 鐘或120分鐘的實(shí)驗(yàn)表明，后峰2面積線性地與柱上的滯留時(shí)間線性相關(guān)(參見(jiàn)圖10)。外 推至計(jì)時(shí)起點(diǎn)表明在不可能實(shí)施的柱上滯留時(shí)間為0的情況下，后峰2幾乎不出現(xiàn)。這些 發(fā)現(xiàn)使我們得出這樣的結(jié)論，在制備時(shí)各批次SEQ ID NO :1均同樣地缺少由后峰2代表的 SEQ ID NO :1變體，并且該變體僅在RPC柱上相對(duì)短時(shí)間地暴露于70°C溫度期間或保存期 間形成(參見(jiàn)圖2和SEQ ID NO :1)。后峰2代表H有N-末端#1谷氡避的SEQ ID NO!在5°C，25°C和40°C下延長(zhǎng)溫育期間形成后峰2。這也圖示在圖2中。然而％峰面 積是擴(kuò)大的，因?yàn)樵谥系腞PC分析期間形成部分變體。我們已經(jīng)顯示后峰2應(yīng)該歸因于 N-末端谷氨酸殘基轉(zhuǎn)變?yōu)榄h(huán)狀焦谷氨酸。得出此結(jié)論的各個(gè)實(shí)驗(yàn)在下面討論。后峰2變體比真實(shí)SEQ ID NO :1輕18Da為了鑒定作為后峰2洗脫的蛋白，在RP-HPLC分離后收集后峰，并且通過(guò)ESI-TOF 質(zhì)譜法測(cè)定其質(zhì)量。由于在批次1標(biāo)準(zhǔn)品中可獲得的濃度太低，因此用于ESI-QTOF分析的 物質(zhì)為在37°C下保存4周的批次1制劑。來(lái)自RPC級(jí)分的主峰具有27858Da的質(zhì)量，SP比 天然SEQ ID N0:l(27876Da)輕18Da。盡管對(duì)此質(zhì)量減少有幾種不同的解釋，但一致認(rèn)為 是N-末端谷氨酸殘基的環(huán)化產(chǎn)生焦谷氨酸導(dǎo)致的水分子丟失所引起的。(類似于后峰1， 后峰2代表在生物合成期間甲硫氨酸殘基被正亮氨酸替換的SEQ ID NO :1變體的這種形式 上的可能性被排除，因?yàn)樵谠撉闆r下相對(duì)峰面積不受溫育時(shí)間或溫度的影響。)改造的焦谷氨酸變體具有與RPC后峰2相同的滯留時(shí)間通常，與谷氨酸相比，在N-末端谷氨酰胺殘基的情況下，焦谷氨酸更容易出現(xiàn) (Gadgil ^,2006, J. of the American Society of Mass Spectrometry ( ^HMif ^^^ 志)17,867-872)。因此我們決定構(gòu)建一種SEQ ID NO 1變體，其中谷氨酰胺替代N-末端 谷氨酸(ElQ突變體)。此SEQ ID NO 1突變體可在monoS柱上在pH 4下被分級(jí)分離；稱 為ElQ-a和ElQ-b的兩個(gè)豐度大約相同的種類被洗脫。兩種級(jí)分被脫鹽并進(jìn)行ESI-TOF質(zhì) 譜測(cè)定；發(fā)現(xiàn)ElQ-b具有27874Da的質(zhì)量(ElQ變異體的預(yù)期質(zhì)量為27875Da)而ElQ_a具 有27857 Da的質(zhì)量(N-末端谷氨酰胺的環(huán)化導(dǎo)致?lián)p失一個(gè)NH3分子或17Da ；預(yù)期質(zhì)量為 27858 Da)。從這些數(shù)據(jù)得出結(jié)論，ElQ-b對(duì)應(yīng)于具有N-末端谷氨酰胺殘基的SEQ ID N0 1，而ElQ-a代表環(huán)化的焦谷氨酸形式。RPC分析顯示ElQ-a具有與后峰2相同的滯留時(shí)間， 而ElQ-b譜型含有兩個(gè)峰，與批次1主峰和后峰2相符合(參見(jiàn)圖11)。最可能地，后一結(jié) 果必須歸因于下列的事實(shí)，即，在RPC分析期間顯著部分的N-末端谷氨酰胺轉(zhuǎn)變?yōu)榻构劝?酸，如對(duì)野生型SEQ ID N0:1分子所觀察的那樣?？傊瑪?shù)據(jù)支持了 RPC后峰2歸因于環(huán)狀焦谷氨酸形式的形成的觀點(diǎn)。肽作圖確認(rèn)保存期間形成焦谷氨酸通過(guò)肽作圖確認(rèn)在N-末端處形成焦谷氨酸殘基(參見(jiàn)章節(jié)2. 5)。胰蛋白酶肽的 RPC分析揭示了一個(gè)峰的存在(即，表B-3所述的峰Tl Φ )，其質(zhì)量與N-末端片段減ISDa 相對(duì)應(yīng)。通過(guò)MS/MS分析的部分序列測(cè)定已經(jīng)確認(rèn)此肽實(shí)際上與N-末端Tl胰蛋白酶片段 相對(duì)應(yīng)。根據(jù)對(duì)RPC后峰2的觀察，發(fā)現(xiàn)在肽圖中峰Tl興的相對(duì)峰面積隨保存時(shí)間增加； 在批次1中(幾乎)不存在焦谷氨酸N-末端肽，而在37°C下保存8周后其較多地存在(參 見(jiàn)圖13)。與Tl興峰面積增加的同時(shí)，未修飾的N-末端Tl肽的面積隨保存時(shí)間減小(數(shù) 據(jù)未顯示)。另外通過(guò)對(duì)上述ElQ-a和ElQ-b變體進(jìn)行肽作圖證明了 Tl興峰的身份。與 ElQ-a代表在N-末端處具有環(huán)狀焦谷氨酸的SEQ ID NO 1的觀點(diǎn)相符合，發(fā)現(xiàn)此變體缺少 Tl肽，而是產(chǎn)生與Tl興峰相一致的片段。發(fā)現(xiàn)ElQ-b變體產(chǎn)生相同的Tl興峰以及另一個(gè) 峰，該另一個(gè)峰被假定對(duì)應(yīng)于在1位處含有谷氨酰胺而非谷氨酸殘基的Tl肽(參見(jiàn)圖13)。SEQ ID NO :1與IIH谷氡JT奪體具有等同的效力如上測(cè)定ElQ-a，即SEQ ID NO 1的焦谷氨酸變異體(參見(jiàn)上面)的效力，即，親 和力。相對(duì)于批次1的效力平均值為105% ；在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中的95% CL為105% -113%和 96%-106%。得出結(jié)論SEQ ID NO :1和其焦谷氨酸形式的效力沒(méi)有顯著的差異。cIEF ^HI SEQ ID NO=I 焦谷氨酸變體發(fā)現(xiàn)焦谷氨酸修飾誘發(fā)SEQ ID NO=I等電點(diǎn)(pi)的遷移；這通過(guò)批次1以及批次 1和上面提到的ElQ-a焦谷氨酸變體的混合物的cIEF分析來(lái)證明(參見(jiàn)圖14)。焦谷氨酸 形成清楚地產(chǎn)生了具有較高Pl的獨(dú)特峰。圖14還顯示谷氨酰胺替換谷氨酸(即ElQ-b變 體)也對(duì)pi有作用，雖然不如環(huán)狀焦谷氨酸明顯。一方面焦谷氨酸對(duì)Pl的明顯作用，另一 方面ElQ-b變體不容易被合理地解釋。在37°C下溫育6周的SEQ ID NO 1的電泳圖清楚地顯示，除了主峰以外，保存導(dǎo) 致許多新峰的出現(xiàn)(圖15)。最突出的新峰，特征為較高的pl，其現(xiàn)在可明確地被歸屬為 N-末端焦谷氨酸環(huán)的形成。圖15顯示該高pi變體與ElQ-a種類相符。N-末端焦谷氨酸 產(chǎn)物因此可通過(guò)RP-HPLC被檢測(cè)為后峰2，并且在cIEF中被檢測(cè)為交高pi變體。與后峰2 相反，在還沒(méi)有進(jìn)行保存的SEQ ID NO 1各批次中觀察不到該高pi變異體；此觀察結(jié)果支 持了 RPC條件本身誘發(fā)一些焦谷氨酸形成的觀點(diǎn)。當(dāng)考慮此作用時(shí)，如使用該兩種不同技 術(shù)從相對(duì)峰面積推算的焦谷氨酸形成的量良好地相符合(數(shù)據(jù)未顯示)。對(duì)于其他納米抗體構(gòu)建體也已經(jīng)觀察到了焦谷氨酸形成(見(jiàn)圖41和42)。請(qǐng)注 意，納米抗體321的氨基酸序列列舉在SEQ ID NO 38中。納米抗體321的氨基酸序列-SEQ ID NO 38 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRIFSLPASGNIFNLLTIAWYRQAPGKGRELVATINSGSRTYYADSVKGRFTISRDNSKKTLYLQMNSLRPEDTAVYYCQTSGSGSPNFWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEffVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTLSSYAMGWFRQAPGKGREFVSRISQGGTAIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAKDPSPYYRGSAYLLSGSYDSWGQGTLVTVSS
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存在著一種跡象，即使用較高的pH環(huán)境焦谷氨酸形成增加(pH6. 5似乎顯示焦谷 氨酸形成多于PH6-參見(jiàn)圖42)。3. 4)保存期間RPC主峰的裂峰的分析在延長(zhǎng)保存后RPC主峰分裂在較高的溫度下延長(zhǎng)保存時(shí)使用SEQ ID NO 1觀察到的RPC主峰似乎分成了幾個(gè) 不同的種類。數(shù)據(jù)表明在延長(zhǎng)保存期間生成了一些較早洗脫的新種類(參見(jiàn)圖3和16)。分析發(fā)現(xiàn)使用單價(jià)構(gòu)件SEQ ID NO :2更為簡(jiǎn)單直接，因?yàn)榫哂刑岣叩慕馕龆取PC 譜型揭示了盡管復(fù)雜性降低了，但同時(shí)主峰更容易分裂。圖16顯示可辨別出兩個(gè)較早的新 洗脫峰。如圖16所指示，我們將這些峰稱為Il和12。主峰的分裂由D105和D62的異構(gòu)化產(chǎn)牛為了鑒定較早洗脫的Il和12種類，在RP-HPLC分離后收集這兩個(gè)峰，以及主峰， 并且通過(guò)ESI-TOF質(zhì)譜法測(cè)定它們的質(zhì)量。用于ESI-TOF分析的物質(zhì)是在37°C下保存6周 的SEQ ID NO :2的制劑。發(fā)現(xiàn)所有三個(gè)峰具有相同的質(zhì)量，即，對(duì)SEQ ID NO :2計(jì)算的質(zhì) 量。結(jié)果證明生成Il和12的修飾作用不影響質(zhì)量。數(shù)據(jù)使我們假設(shè)Il和12可能由天冬 氨酸的大量中性異構(gòu)化引起，或可能由天冬酰胺殘基的脫酰胺作用(導(dǎo)致重量?jī)H增加IDa) 引起。此工作假設(shè)還基于文獻(xiàn)的數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)表明在RP層析中異構(gòu)化變體典型地洗脫早 于非修飾形式。SEQ ID NO :1的氨基酸序列的檢查顯示三個(gè)看上去似乎最可能的降解位點(diǎn) 為N84/S85，D105/G106，和D62/S63。在每種情況下，N-或D-殘基后緊接甘氨酸或絲氨酸 殘基，這些殘基根據(jù)本發(fā)明通常被認(rèn)為是最不穩(wěn)定的。此外，D105位于CDR3區(qū)內(nèi)，該區(qū)可被 假定為較為柔性，這是已知有助于β-Asp形成的另一條件(Clarke，1987 ；Robinson, 2002 ； Xie, 2003).在這一情形中，要注意已經(jīng)報(bào)道了位于常規(guī)單克隆抗體的⑶R區(qū)內(nèi)的天冬氨酸 殘基的異構(gòu)化(Cacia 等，1996 ；Wakankar 等，2007)。84位處的天冬酰胺殘基在所有美洲駝/單峰駝的結(jié)構(gòu)中是嚴(yán)格保守的。其側(cè)鏈完 全地暴露于溶劑。對(duì)于N84的脫酰胺作用還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)證據(jù)。首先，肽作圖數(shù)據(jù)顯示在 37°C下延長(zhǎng)溫育不能導(dǎo)致出現(xiàn)比TlO峰早洗脫的分子種類。其次，發(fā)現(xiàn)將在N84的脫酰胺 作用時(shí)形成的分子種類之一，即SEQ ID NO :2的N84D突變體，與wt種類一起洗脫出來(lái)，并 且不形成RPC前峰或后峰中的任一種。在62位和105位處的天冬氨酸殘基發(fā)生異構(gòu)化的最令人信服的證據(jù)來(lái)源于二肽 D105/G106和D62/S63的突變分析。圖17顯示D105被A，E或Q替換消除了 Il峰的出現(xiàn)， 該峰清楚地見(jiàn)于在37°C下溫育8周的wt分子的相應(yīng)RPC譜型中。另一方面，在37°C下溫 育8周后，D105N突變體似乎完全地轉(zhuǎn)變?yōu)楫愄於滨：驼ｋ牡幕旌衔?。i3-D105與D105 的平衡比為70 30或約2. 3，該數(shù)值類似于其他作者所發(fā)現(xiàn)的數(shù)值(Geiger和Clarke， 1987，J. of Biological Chemistry (生物化學(xué)雜志)262，785-794)。D105N 突變體的層析 譜顯示其他的產(chǎn)物相關(guān)變體(即，氧化形式和焦谷氨酸形式)也以相同的相對(duì)量分為D105 和i3-D105形式。另外，發(fā)現(xiàn)丙氨酸殘基替換G106導(dǎo)致很小的Il峰。Il種類與D105的存 在的關(guān)聯(lián)性和另外的發(fā)現(xiàn)(即，Il峰可受天冬氨酸下游緊接的氨基酸的性質(zhì)的調(diào)節(jié))提供 了強(qiáng)力的證據(jù)，即，實(shí)際上105位處的異構(gòu)化是形成較早洗脫的種類Il的原因。類似地，顯 示A或E替換D62防止在37°C下溫育期間形成12峰(圖18)。此外，甘氨酸替換S63殘基 清楚地促進(jìn)了 12峰的形成。在后一種情況下，62位處的異構(gòu)化變得比105位處的異構(gòu)化更為重要，并且37°C下保存4周后的層析譜清楚地顯示了 i3-D105/i3-D62雙異構(gòu)化變體存在 的跡象。對(duì)于上面提到的其中高豐度地形成i3_D105的D105N突變體也適用。從這些數(shù)據(jù) 似乎天冬氨酸異構(gòu)化發(fā)生在105位和62位兩處；兩個(gè)修飾作用清楚地解釋了在37°C下保 存SEQ ID NO 2時(shí)新形成的峰。Il和12的相對(duì)峰面積表明D62異構(gòu)化的速率大大地低于 105位。對(duì)于SEQ ID NO :1，在37°C溫育時(shí)似乎形成多個(gè)不能分辨的峰(見(jiàn)圖16)。我們相 信考慮到二價(jià)分子(即，可生成額外的變異體，諸如在兩個(gè)結(jié)構(gòu)域中均具有0_D1O5的SEQ IDNO 1)增加的復(fù)雜性，這兩個(gè)上面提到的異構(gòu)化事件足以解釋這些。在62位形成β-天冬氨酸的第一個(gè)證據(jù)來(lái)源于在SEQ ID Ν0:1的肽圖中檢測(cè) 到一個(gè)峰(即圖5中的峰Τ7興)，其隨著在37°C下保存的時(shí)間而線性地增加并且在Τ7 之前洗脫，即，該肽包含D62殘基。在37°C下8周溫育期后，T7興峰代表約6. 4%的總量 (T7+T7 Φ )。發(fā)現(xiàn)此峰的質(zhì)量對(duì)應(yīng)于Τ7片段的理論質(zhì)量(1487. 5相對(duì)于1487. 7Da)，并且 MS/MS分析證實(shí)了該相同性。D62殘基的大量中性異構(gòu)化提供了對(duì)這些發(fā)現(xiàn)的最佳解釋。在 低能條件下生成的b-和y-型系列離子允許T7興峰的全序列測(cè)定，但不能區(qū)分α和β天 冬氨酸。D105的異構(gòu)化不能使用肽圖進(jìn)行研究，因?yàn)樵摎埢切〉?聚體肽的一部分，該5 聚體肽在肽圖中不能引起注意。Isoquant 異天冬氨酸檢測(cè)試劑盒用于在37°C保存的SEQ ID NO :1和SEQ ID NO: 2中異天冬氨酸殘基的定量檢測(cè)。對(duì)于批次1和SEQ ID N0:2每月在37°C下β-D形成的 比率分別為約7. 6%和3. 9% (摩爾異天冬氨酸摩爾蛋白)。該2倍差異與這些納米抗體 ⑧的價(jià)位相一致。使用Isoquant試劑盒在SEQ ID NO 2中檢測(cè)的異天冬氨酸水平與從肽圖 中推算的0-D62的量處于相同的范圍內(nèi)(即在37°C下保存8周后2x3. 9%相對(duì)于6.4%)。 此結(jié)果表明在完整納米抗體⑧或在胰蛋白酶片段中，105位處的異天冬氨酸可能不是PIMT 酶的底物(或至少是非常差的一個(gè))，盡管此酶在體外具有很寬的異天冬氨酸底物特異性。 此推論得到下列觀察結(jié)果的支持，即，分離的RPC峰Il僅包含約十分之一的預(yù)期量的異天 冬氨酸(事后認(rèn)識(shí)到，似乎檢測(cè)到的水平歸因于12對(duì)Il峰的污染)RPC主峰被并行地 分離并在Isoquant測(cè)定中記分為負(fù)。分離的RPC峰通過(guò)RPC再分析驗(yàn)證并通過(guò)分光光度 計(jì)定量測(cè)量。最終通過(guò)對(duì)合成肽A-E-IsoD-G-R及其非修飾副體A-E-D-G-R運(yùn)行Isoquant 測(cè)定獲得確定性證據(jù)，即β_ 105不是PIMT酶的底物。此肽對(duì)應(yīng)于包含D105殘基的胰蛋 白酶片段(參照?qǐng)D4)，其實(shí)際上在測(cè)定條件下不是PIMT酶的底物。在37°C下保存期間Il峰面積的增加已經(jīng)用來(lái)推算在此溫度下D105異構(gòu)化的反應(yīng) 速率。線性最小二乘回歸分析用來(lái)擬合數(shù)據(jù)集并且獲得準(zhǔn)一級(jí)速率常數(shù)(k。bs)。下列的方 程式用于擬合In(Il00-IlZIl00) = _k。bst [eq. 1]其中Il代表在時(shí)刻t時(shí)在SEQ ID NO 2 RPC層析譜中峰Il的相對(duì)面積，Il00是在 無(wú)窮遠(yuǎn)處(t->c )的相對(duì)峰面積。Il00設(shè)置在70%，因?yàn)轭A(yù)期異構(gòu)化生成70 30比值 (如對(duì)D105N突變體的脫酰胺作用所觀察到的；見(jiàn)上)。發(fā)現(xiàn)速率常數(shù)為0. 006天— (θδ^置 信區(qū)間0. 0065-0. 0049 ；等價(jià)于t"2 ^ 115天)，該數(shù)字與在其他蛋白/肽中發(fā)現(xiàn)的異構(gòu)化 速率一致(Stephenson 和 Clarke，1989，J. ofBiological Chemistry (生物化學(xué)雜志)264， 6164-6170)。關(guān)于62和105位處異構(gòu)化的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)良好地符合。在SEQ ID NO=I中，D62高度地暴露于溶劑；相對(duì)可及表面積為0. 906。對(duì)于D105計(jì)算的較低的相對(duì)可及 表面積值0. 191可由晶體結(jié)構(gòu)中R102和R107的側(cè)鏈的接近性來(lái)解釋。然而，在溶液中，精 氨酸側(cè)鏈非常柔性。在存在于不對(duì)稱單位中的三個(gè)SEQ ID N0:1分子的每一個(gè)中，D105的 側(cè)鏈與G106的主鏈酰胺相互作用，可為在此位置處觀察到的顯著異構(gòu)化作用提供解釋。相 反，D90似乎是溶劑不可及的，根據(jù)肽作圖數(shù)據(jù)其是其中不發(fā)生異構(gòu)化的殘基(未顯示的數(shù) 據(jù))。此外，此殘基接受來(lái)自R67的氫鍵，而非與T91主鏈酰胺相互作用，這預(yù)期能對(duì)抗異構(gòu) 化。D105的異構(gòu)化是解釋效力喪失的豐要分子和,制在保存期間SEQ ID NO :1喪失其親和力(本文也稱為效力)。進(jìn)行了幾個(gè)保存 研究。發(fā)現(xiàn)在25°C (12個(gè)月期間喪失 50% )，40°C (7周和5個(gè)月后分別為 40%和 20%殘余活性)但非在5°C下該喪失是可檢測(cè)的。在類似的研究中，還發(fā)現(xiàn)單價(jià)構(gòu)件SEQ ID NO 2在保存期間喪失對(duì)vWF Al結(jié)構(gòu)域的親和性(如通過(guò)BIAcore分析確定)?？紤]到由 于SEQ ID NO :1分子的二價(jià)性質(zhì)，該分子劣化的速度約快2倍，使用SEQ ID NO :2觀察到的 親和性喪失(在37°C下溫育的首個(gè)8周期間為約20% )大致與SEQ ID NO=I的效力喪失 一致。第一個(gè)線索是在105位處的異構(gòu)化可能是生物活性喪失的原因，其由下列的觀察 結(jié)果推斷而來(lái)，即SEQ ID NO 2的親和性喪失幅度似乎與RPC峰Il的相對(duì)峰面積相關(guān)(參 見(jiàn)圖16)。此觀點(diǎn)還得到下列事實(shí)的支持，即，D105位于⑶R3中，⑶R3通常被認(rèn)為構(gòu)成主 要的抗原結(jié)合區(qū)，即，大部分結(jié)合自由能。下列的觀察結(jié)果使我們得出結(jié)論，D105異構(gòu)化代 表主要的失活機(jī)制(參見(jiàn)表B-5)i.分離的RPC峰Il具有主峰的5%活性；這是用于Isoquant測(cè)定(見(jiàn)上)中的 相同物質(zhì)，并且應(yīng)該不排除殘余活性是污染的結(jié)果。ii. D105A突變導(dǎo)致親和性的10倍下降，表明D105側(cè)鏈對(duì)與vWF Al結(jié)構(gòu)域的結(jié)合
提供很重要的貢獻(xiàn)。iii.在D105N突變體中，異構(gòu)化作用交換為相當(dāng)快的脫酰胺過(guò)程。在37°C下，天 冬氨酰殘基快速地修飾成 2. 5 1的比值的β-D和D的混合物；RPC分析已經(jīng)指出此修 飾反應(yīng)在約2周后是完全的(數(shù)據(jù)未顯示)。β-D對(duì)D的比值與觀察到的約30%的殘余活 性非常吻合。iv.大體上，除D105N外，對(duì)D105突變蛋白的穩(wěn)定性研究表明它們?cè)?7°C溫育期 間保持其活性，或無(wú)論如何，以與野生型SEQ ID NO :2分子相比相當(dāng)慢的速率失活。表B-5 在D62/S63或D105/G106異構(gòu)化位點(diǎn)處含有置換的SEQ ID NO 2突變蛋 白的生物活性。列舉了在37°C溫育4，8和16周后的平衡解離常數(shù)以及活性。保存期間的 活性后緊接著測(cè)定對(duì)固定在傳感器芯片上的vWFAl結(jié)構(gòu)域的初始結(jié)合速率(5次測(cè)量)；活 性與計(jì)時(shí)起點(diǎn)比較，并且表示為百分比(士95%置信區(qū)間；η = 10)。
56 可獲得的數(shù)據(jù)還證明62位處的異構(gòu)化不負(fù)面地影響結(jié)合親和力。此結(jié)論從下面 的觀察結(jié)果得出(i)D105突變蛋白似乎在37°C保存期間保持其活性(見(jiàn)上)，和(ii)S63G 突變，使得62位處的異構(gòu)化比105位處的異構(gòu)化更重要，其在37°C保存期間失活的速度不 比野生型SEQ ID N0:2快。D62A突變體與野生型分子具有相同的親和性的發(fā)現(xiàn)證明此殘 基不促進(jìn)結(jié)合，并且與此位點(diǎn)處的異構(gòu)化不影響親和性的觀點(diǎn)相一致。D105/G106和D62/S63異構(gòu)化位點(diǎn)的突變分析已顯示丙氨酸替換106位處的甘氨 酸殘基去除所有活性(表B-5)。此觀察結(jié)果至今未被闡明。想法是此甘氨酸殘基的特征是 其他氨基酸通常觀察不到的phi/psi 二面角，該想法沒(méi)有得到晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的支持；G106 的phi/psi角(平均-86° /-5° )所處的范圍對(duì)于環(huán)區(qū)并非是異常的。然而，不可排除 G106殘基和CDR3區(qū)在與vWF al結(jié)構(gòu)域結(jié)合時(shí)采取不同的局部構(gòu)象?；?05位處的異構(gòu)化是基本的主要分子失活機(jī)制這一觀點(diǎn)，我們使用在37°C下 保存期間的活性喪失來(lái)推算D105異構(gòu)化的反應(yīng)速率。通過(guò)準(zhǔn)一級(jí)擬合獲自以SEQ ID NO 2和SEQ ID NO :1進(jìn)行的穩(wěn)定性研究的親和性/效力數(shù)據(jù)來(lái)獲得k。bs值。使用下列的方程 用于擬合In (A-A ^ /A0-A ^) = _k。bst [eq. 2]其中A代表時(shí)刻t時(shí)的相對(duì)活性，A0是初始相對(duì)活性，以及A00是無(wú)窮遠(yuǎn)處(t- > ⑴)的相對(duì)活性。對(duì)于SEQ ID而2^00設(shè)置為30%，因?yàn)橛?105異構(gòu)化造成的活性喪失 預(yù)期在 30%時(shí)達(dá)到穩(wěn)定水平。對(duì)于SEQ ID NO :1，因?yàn)閷?duì)于完全效力需要雙官能性的事實(shí)，效力喪失預(yù)期在A00值為 9% ( = 30% χ 30% )時(shí)達(dá)到平衡。當(dāng)對(duì)SEQ ID NO :2測(cè) 量時(shí)表觀異構(gòu)化速率常數(shù)為0.007天4(95%置信區(qū)間0. 0074-0. 0062)并且當(dāng)由SEQ ID NO :1測(cè)量時(shí)為0.012天-乂95%置信區(qū)間0. 0177-0. 0065)。由SEQ ID NO :2穩(wěn)定性數(shù)據(jù) 推算的值與由Il峰面積增加推算的值(見(jiàn)上)良好地吻合。此確證了至少在37°C下保存 第一個(gè)月內(nèi)活性喪失與D105異構(gòu)化相關(guān)的觀點(diǎn)。SEQ ID NO :1的效力喪失比其單價(jià)副體 SEQ ID NO :2的失活快約2倍。這與兩個(gè)等價(jià)位點(diǎn)(即，每個(gè)結(jié)構(gòu)域中的D105)的存在相 符，在各個(gè)位點(diǎn)處的異構(gòu)化將使納米抗體失活。因此從該效力喪失數(shù)據(jù)推算的表觀異構(gòu)化 速率也比對(duì)SEQ IDNO 2所觀察到的速率高兩倍。結(jié)論提出的結(jié)論性證據(jù)是，SEQ ID NO 1的主要產(chǎn)物相關(guān)物質(zhì)是下列的結(jié)果iv. RPC前峰1 單氧化事件(+16Da)，發(fā)生在兩個(gè)相同的結(jié)構(gòu)域中的任一個(gè)中存在 的三個(gè)甲硫氨酸中的一個(gè)特異性甲硫氨酸(M78)處，v.RPC后峰1 生物合成期間在甲硫氨酸位點(diǎn)處正亮氨酸殘基的單錯(cuò)誤摻入 (-18Da)，vi. RPC后峰2 =El殘基的環(huán)化，導(dǎo)致焦谷氨酸形成，以及另外，發(fā)現(xiàn)所有三種上面提到的變體的效力與真實(shí)產(chǎn)物的效力沒(méi)有顯著的差異。 這些結(jié)果，結(jié)合這些產(chǎn)物相關(guān)變體的相對(duì)豐度(表B-1)，得出這樣的結(jié)論，基于活性，SEQ ID NO 1 DS/DP的純度好于99%。在較高溫度(即彡25°C )下SEQ ID NO 1的延長(zhǎng)溫育導(dǎo)致RPC譜型的相當(dāng)大的變 化。上面提到的氧化和焦谷氨酸變體在保存期間與溫育溫度和時(shí)間平行地增加。另外，主 峰分裂成幾個(gè)不同的種類，表明正在生成一個(gè)或多個(gè)新的分子種類。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)RPC主 峰的分裂歸因于105位以及較小程度地D62處天冬氨酸的異構(gòu)化。我們還顯示105位處天 冬氨酸殘基(其位于⑶R3區(qū)內(nèi))的異構(gòu)化是解釋在較高溫度下SEQ ID NO 1的效力喪失 的主要分子機(jī)制。這些發(fā)現(xiàn)總結(jié)在圖21中。實(shí)施例2 :RANKL結(jié)合納米抗體 構(gòu)津體(SEQ ID NO: 19)的穩(wěn)定1. RANKL結(jié)合納米抗體的生成氨基酸序列RANKL-I (SEQ ID NO: 19)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYPMGWFRQAPGKGREFVSSITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAAYIRPDTYLSRDYRKYDYffGQGTLVTVSSRANKL-1_D62E(SEQ ID NO 20)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYPMGWFRQAPGKGREFVSSITGSGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAAYIRPDTYLSRDYRKYDYffGQGTLVTVSS基于上面公開(kāi)的氨基酸序列，本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員能夠基于例如，多肽序列的回 譯，生成重疊的寡引物，PCR擴(kuò)增，克隆進(jìn)合適的表達(dá)載體，在合適的宿主中表達(dá)，以及所需 多肽例如上面的 RANKL-I (例如由諸如 GeneArt，DNA-2-go , sloning BioTechnology 的公 司提供)的分離/純化，來(lái)生成該多肽。
RANKL-I的基本序列的分析鑒定D62為異構(gòu)化的潛在位點(diǎn)，并因此為該分子的化 學(xué)不穩(wěn)定性的潛在來(lái)源。為了測(cè)試此可能性，使用RANKL-I分子和突變體RANKL-1_D62E進(jìn) 行穩(wěn)定性測(cè)定，在所述突變體中潛在的異構(gòu)化位點(diǎn)被谷氨酸殘基(E)替換。RANKL-I中的 D62E突變通過(guò)重疊PCR使用下述包括突變的引物而引入RevRANKL-l_D62E :CCTCCCTTTGACGGATTCCGCGTAATACGT(SEQ ID NO 21)FwRANKL-l_D62E :ACGTATTACGCGGATTCCGTCAAAGGGAGG (SEQ ID NO 22)編碼RANKL-I或RANKL_1_D62E的兩個(gè)cDNA作為Sf il/BstEII片段被克隆進(jìn) PAX054載體中，該載體是pUC119的衍生物。其包含LacZ啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子能使用IPTG進(jìn) 行控制的表達(dá)誘導(dǎo)。該載體具有卡那霉素抗性基因。多克隆位點(diǎn)帶有幾個(gè)限制性位點(diǎn)，其 中Sf Π和BstEII常常用于克隆納米抗體 。納米抗體 編碼序列在框內(nèi)，該載體編碼C-末 端c-myc標(biāo)簽和(His)6標(biāo)簽。信號(hào)肽為gen3前導(dǎo)序列，其將表達(dá)的納米抗體⑧轉(zhuǎn)位至周 質(zhì)中。為制備，RANKL-I和RANKL_1_D62E構(gòu)建體接種在50ml TB/0. 1 %葡萄糖/卡那霉 素中，并且懸浮液在37°C下溫育過(guò)夜。以獲得的ο/η預(yù)培養(yǎng)物的1/100接種在5 χ 400ml 培養(yǎng)基中。培養(yǎng)物進(jìn)一步在37°C，250rpm下溫育直至0D600 > 5。培養(yǎng)物用ImM IPTG誘 導(dǎo)，并且進(jìn)一步在37°C 250rpm下保持溫育4小時(shí)。培養(yǎng)物以4500rpm離心20分鐘，之后棄 去上清液。沉淀物在_20°C下保存。為純化，將沉淀物解凍，并重新懸浮在20mLdPBS中并在 4°C下溫育1小時(shí)。然后，懸浮液以8500rpm離心20分鐘以從周質(zhì)提取物中清除細(xì)胞碎片。經(jīng)陽(yáng)離子交換(Source 30S柱，洗滌緩沖液IOmM檸檬酸pH 4.0;洗脫緩沖液 IOmM檸檬酸/IM NaCl pH 4. 0)，緊接著通過(guò)尺寸排阻層析(Superdex 75 Hiload 16/60柱； d-PBS中))純化納米抗體。測(cè)量OD 280nm，并計(jì)算濃度。樣品保存在-20C。α 篩選納米抗體RANKL-I和RANKL_1_D62E的純化樣品在α篩選中分析其抑制人RANKL 和人RANK-Fc之間相互作用的能力。在此測(cè)定中，IuM-IOpM范圍內(nèi)的各種濃度的抗RANKL 抗體與3ηΜ生物素化的人RANK在384孔板中溫育15分鐘。隨后，加入RANKL (InM)和以抗 RANKL MAb BN-12 (Diaclone)包被的接納體珠(20ug/ml)的混合物并且溫育30分鐘。最 后，加入抗生蛋白鏈菌素包被的供體珠(20ug/ml)。溫育1小時(shí)后，在Envison Alphascreen 讀數(shù)儀(PerkinElmer)上讀板。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行2次。抑制曲線和IC5tl值顯示在圖22 中。RANKL-1_D62E突變體中的D62E突變不干擾結(jié)合效力。穩(wěn)定性研究各批次蛋白在D-PBS中稀釋為lmg/mL。之后樣品通過(guò)0. 22微米濾器過(guò)濾。一部 分樣品在-80°C保存作為參考樣品，其他部分在37°C下保存4周(在溫育箱中)用于隨后 的反相-HPLC分析。反相-HPLC分析使用的柱為安捷倫(Agilent)系統(tǒng)上的Z0RBAX300SB C3 (5 μ m)。 在實(shí)驗(yàn)期間該柱的溫度為70°C。實(shí)驗(yàn)期間使用的緩沖液A為0. 1 %三氟乙酸，緩沖液B為 0. 三氟乙酸/99. 9%乙腈。使用的程序描述如下程序
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圖23顯示RANKL-I和RANKL_1D_62E兩者均不顯示暗示任何異構(gòu)化(例如，D62 和/或D105上的異構(gòu)化)的峰，而對(duì)照納米抗體vWF-12A2hlSEQ ID NO :2則有。對(duì)于兩種 RANKL納米抗體均存在反映N-末端環(huán)狀焦谷氨酸形成的峰，表明2種多肽在1位處是不穩(wěn) 定的(在指定條件下)。實(shí)施例3 為RP-HPLC優(yōu)化柱溫度材料-IL6R203(SEQID NO 23)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYDIGWFRQAPGKGREGVSGISSSDGNTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAAEPPDSSWYLDGSPEFFKYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEffVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYDIGWFRQAPGKGREGVSGISSSDGNTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAAEPPDSSWYLDGSPEFFKYWGQGTLVTVSS例如，如上面所公開(kāi)(通過(guò)服務(wù)提供商GeneArt)生成IL6R203 (SEQ IDNO :23)，并 在上述層析條件下在ZORBAX C 3柱上分析，但在4個(gè)不同的柱溫度(75，70，60和50°C )下 分析，以便評(píng)估柱溫度對(duì)RP-HPLC譜型的作用。HPLC 條件流動(dòng)相A 99. 9% H20q/0. 1 % TFA流動(dòng)相B :0· 1 % TFA/99. 9% 乙腈柱Z0RBAX300SB-C3 (Agilent,部件編號(hào) 883995-909，系列號(hào) USKD001612)流速ImL/分鐘梯度0.33% B/min(5 % B (Omin) -5 % B(3min) -30. 5 % B (3. 5min) -40. 5 % B (33. 5min) -95% B(34min) -95% B(37min) -5% B (37. lmin) -5% B (40min))檢測(cè)UV214nm(也采集 28Onm)進(jìn)樣量5yg使用的柱溫度50V -60 V -70 V -75 °C表:B-6
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使用不同的柱溫度(75，70和601)分析IL6R203的數(shù)據(jù)的綜合概述。沒(méi)有綜合 較低柱溫度的層析譜。如所見(jiàn)到的，降低柱溫度對(duì)峰回收率具有負(fù)面效應(yīng)。對(duì)主峰和稱為 前梯度峰的峰顯示綜合數(shù)據(jù)。很明顯，在較低的柱溫度下主峰減小。在60-70°C之間似乎達(dá) 到臨界點(diǎn)。盡管主峰面積減小，但在前梯度峰中洗脫的物質(zhì)的量顯著地增加。這可能表明 在較低柱溫度下分子的較高程度的粘性。評(píng)價(jià)·柱溫度對(duì)洗脫峰特性具有極大地作用。獲得的數(shù)據(jù)顯示最佳溫度在70_75°C之 間。被測(cè)試的較低溫度導(dǎo)致峰面積回收率損失(見(jiàn)表B-6)、解析度的損失并且誘發(fā)拖尾。 在60°C下所有齊備后，峰形與在70-75°C時(shí)的峰形完全不同?！ぎ?dāng)與70°C層析譜比較時(shí)，75°C層析譜顯示幾個(gè)側(cè)峰的面積/高度增加。這些可 能是溫度誘導(dǎo)的峰并且不是IL6R203批次中的實(shí)際亞群。IL6R202例如，如上面所公開(kāi)(通過(guò)服務(wù)提供商GeneArt)生成IL6R202 (SEQ IDNO :24)，并 且也對(duì)IL6R202測(cè)試相同范圍的柱溫度。IL6R202 :SEQ ID NO 24EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYDIGWFRQAPGKGREGVSGISSSDGNTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAAEPPDSSWYLDGSPEFFKYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEffVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSHPLC 條件流動(dòng)相A 0.1% TFA流動(dòng)相B :0· 1 % TFA/99. 9% 乙腈柱Z0RBAX300SB-C3 (Agilent，部件編號(hào) 883995-909，系列號(hào) USKD001612)流速ImL/分鐘梯度0.33 % B/min(5 % B (Omin) -5 % B(3min) -30. 5 % B (3. 5min) -40. 5 % B (33. 5min) -95% B(34min) -95% B(37min) -5% B (37. lmin) -5% B (40min))檢測(cè)UV214nm進(jìn)樣量5yg
使用的柱溫度50 "C -60 "C -70 "C -75 °C表:B~7 使用不同的柱溫度(75，70和601)分析IL6R202的綜合數(shù)據(jù)的概述。沒(méi)有顯示 較低柱溫度的層析譜。如使用IL6R203可見(jiàn)到的，在60-70°C之間達(dá)到臨界點(diǎn)。在此界限的 較低溫度端，似乎發(fā)生峰回收率的大量損失。同時(shí)前梯度峰的面積大幅度升高。評(píng)價(jià)·柱溫度對(duì)IL6R202的洗脫峰譜型具有極大地作用(如對(duì)IL6R203那樣)。最佳 溫度在70-75°C之間?！?shí)踐中使用70°C的柱溫度將是較好地，這樣能盡量減少在該高柱溫度下由 IL6R202降解所導(dǎo)致的假峰的出現(xiàn)。實(shí)施例4 考慮來(lái)自上述突變體研究的發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定12A2hl和ALX-0081基于我們?cè)赟EQ ID NO 1及其單價(jià)構(gòu)件SEQ ID NO 2的化學(xué)穩(wěn)定性方面的見(jiàn)解， 我們改造了一個(gè)SEQ ID NO :2變體，其摻入了 4個(gè)單氨基酸置換，S卩，ElD, D62E，M78T和 D105Q(SEQ ID NO 26)。因此，穩(wěn)定的單價(jià)構(gòu)件被稱為穩(wěn)定的12A2hl或SEQ ID NO 26,并且實(shí)施例1的穩(wěn) 定的vWF化合物在本文中被稱為VWF0001或SEQ ID NO :25。SEQ ID NO :25-ALX-Q081 SV1，本文中也稱為VWF0001的氨基酸序列DVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGRTFS YNPMGffFRQA PGKGRELVAA ISRTGGSTYYPESVEGRFTI SRDNAKRTVY LQMNSLRAED TAVYYCAAAG VRAEQGRVRT LPSEYTFffGQGTQVTVSSAA AEVQLVESGG GLVQPGGSLR LSCAASGRTF SYNPMGffFRQ APGKGRELVAAISRTGGSTY YPESVEGRFT ISRDNAKRTV YLQMNSLRAE DTAVYYCAAA GVRAEQGRVRTLPSEYTFffG QGTQVTVSSSEQ ID NO :26_12A2H1 SVl 的氨基酸序列DVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGRTFS YNPMGffFRQA PGKGRELVAA ISRTGGSTYYPESVEGRFTI SRDNAKRTVY LQMNSLRAED TAVYYCAAAG VRAEQGRVRT LPSEYTFffGQGTQVTVSS通過(guò)基因拼裝完成12A2hlSVl和ALX-0081SV1基因的構(gòu)建。一組覆蓋目的基因的 重疊寡核苷酸通過(guò)PCR有序地組裝基因。從凝膠中純化挽救PCR產(chǎn)物并用KpnI和NdeI限制性酶消化。然后片段連接在先前用KpnI/Ndel酶切割的pet28a/TAC/pelB載體中。然后將連接混合物轉(zhuǎn)化至TOP 10電感受態(tài)細(xì)胞中。加入SOC培養(yǎng)基并在37°C下 溫育1小時(shí)后，將一等分試樣接種至LB/卡那霉素板上并在37°C下溫育過(guò)夜。第二天使 用pet28a啟動(dòng)子和T7終止子引物通過(guò)菌落PCR分析單個(gè)克隆。隨后將關(guān)于12A2SV1和 ALX-0081SV1的PCR陽(yáng)性克隆在LB/卡那霉素中生長(zhǎng)過(guò)夜。從過(guò)夜培養(yǎng)物中，通過(guò)小量制備 (Mini-Prep) (Sigma Aldrich試劑盒)制備質(zhì)粒DNA用于DNA測(cè)序。12A2hlSVl 和 ALX0081SV1 的表汰和純化制備過(guò)夜起子培養(yǎng)物，并用來(lái)在含有卡那霉素和0. 1 % g/v葡萄糖的Terrific肉 湯培養(yǎng)基中開(kāi)始大規(guī)模表達(dá)。將含有300mL上述培養(yǎng)基的燒瓶接種以IOmL起子培養(yǎng)物，之 后在37°C下同時(shí)以250rpm振搖下生長(zhǎng)。大約4小時(shí)后，溫度降低至28°C。另外3小時(shí)后， 通過(guò)加入IPTG至ImM終濃度而開(kāi)始誘導(dǎo)，培養(yǎng)物進(jìn)一步在28°C下溫育過(guò)夜。第二天培養(yǎng)物 以4500rpm離心30分鐘。沉淀物即刻冷凍，并且在解凍后加入PBS/lmMEDTA。重新懸浮細(xì) 胞后，在室溫下振搖懸液2小時(shí)。將懸液以8500rpm離心20分鐘以從提取物中清除細(xì)胞碎 片。之后將上清液酸化至PH 3. 5并在4°C下保存過(guò)夜。第二天早上，將懸液以SOOOrpm離 心，并過(guò)濾上清液。過(guò)濾后，將溶液用水稀釋至電導(dǎo)率低于5mS/cm。之后將溶液加樣在用緩 沖液A(10mM檸檬酸pH 3. 5)預(yù)平衡的Source S離子交換柱上。在用緩沖液A洗滌后，結(jié) 合物質(zhì)用10柱體積的梯度緩沖液B (IOMm檸檬酸/1 M NaCl pH 3.5)的0-100%梯度洗脫。 含有目的蛋白的級(jí)分通過(guò)SDS-PAGE鑒定并匯集在一起。之后匯集的級(jí)分在SuperdeX75柱 上通過(guò)凝膠過(guò)濾層析加工。之后通過(guò)分光光度法在280nm處測(cè)定含有純化的構(gòu)建體的級(jí)分 的蛋白濃度，由此使用計(jì)算的消光系數(shù)和分子量。蛋白的純度通過(guò)HPLC-RPC確認(rèn)。穩(wěn)定變體12A2hlSVl和ALX-0081SV1的結(jié)合功能性。使用平行線法在Biacore 300儀器上測(cè)定ALX-0081SV1的結(jié)合效力，并且因此使 用ALX-0081作為參考物質(zhì)。以觀察雙功能性的方式設(shè)計(jì)該方法。在此測(cè)定中，我們?nèi)珙A(yù)期 的觀察到對(duì)ALX-0081SV1的親和結(jié)合，以及對(duì)12A2hlSVl沒(méi)有效力。與ALX0081(SEQ ID NO 1)比較的相對(duì)效力為約80%。也使用Biacore儀器測(cè)定12A2hlSVl對(duì)VWF的Al結(jié)構(gòu)域的親和性。測(cè)定了動(dòng)力 學(xué)速率常數(shù)(k。n和k。ff)以及平衡解離常數(shù)(Kd)(見(jiàn)下表)。 穩(wěn)定的奪體的化學(xué)穩(wěn)定件12A2hl SVl和ALX-0081 SVl兩者以在D-PBS中的lmg/mL濃度在37°C下溫育。在 不同的時(shí)間點(diǎn)，通過(guò)RP/HPLC分析樣品。如圖39和40中所示，似乎在8周后僅形成小量的 變體。與圖16中對(duì)SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2給出的譜型相比，RP/HPLC譜型不太復(fù)雜，并且缺少主要的前峰和后峰，已經(jīng)顯示這些前峰和后峰由氧化、焦谷氨酸形成和天冬氨酸 異構(gòu)化產(chǎn)生。因此，通過(guò)用適當(dāng)專門選擇的氨基酸殘基替換關(guān)鍵的殘基，我們能夠產(chǎn)生具有 基本上相同的生物活性和大幅度改善的化學(xué)穩(wěn)定性的變體(還參見(jiàn)實(shí)施例6的通過(guò)Folts 模型和RIPA測(cè)量的體內(nèi)活性)。我們還通過(guò)Biacore測(cè)定了在37°C下保存的樣品的功能性。在這些實(shí)驗(yàn)中，參考 和穩(wěn)定性樣品均稀釋10，000倍，并且隨后流過(guò)以3500RU vffFAl結(jié)構(gòu)域包被的傳感器芯片。 由于觀察到在參考和穩(wěn)定的樣品之間結(jié)合傳感圖譜中僅有微小的差異，我們得出這樣的結(jié) 論，化學(xué)穩(wěn)定性改善，同時(shí)結(jié)合功能性幾乎不變。對(duì)于根據(jù)SEQ ID NO 39 ( 二價(jià))和SEQ ID NO 40 (單價(jià)構(gòu)件)的突變體結(jié)合劑也 分別預(yù)期具有如上所述的相似結(jié)果。實(shí)施例5 另一納米抗體構(gòu)津體，S卩，IL6R結(jié)合納米抗體 構(gòu)津體(SEQ IDNO 27) 的穩(wěn)定DNA 序列IL6R201 (SEQ ID NO 27 ；野生型要檢查其穩(wěn)定性和并且有可能被穩(wěn)定)GAGGTACAGCTGGTGGAGTCTGGCGGAGGTCTGGTTCAACCGGGCGGGAGCTTGCGTCTGAGTTGCGCTGCGAGCGGTTTCACATTTAGCGACTACGACATCGGATGGTTTCGTCAGGCTCCGGGCAAAGGTCGCGAAGGTGTGTCTGGCATTTCAAGTTCTGACGGCAACACTTATTACGCAGACAGCGTTAAAGGTCGTTTCACCATTTCGCGTGATAACGCAAAGAATACCCTGTACCTTCAAATGAATAGCTTACGCCCAGAAGATACCGCCGTTTACTATTGTGCCGCGGAACCGCCAGATAGCTCGTGGTATCTGGATGGCTCTCCTGAATTCTTTAAATATTGGGGTCAGGGTACGCTGGTCACCGTCTCCTCATAATGAIL6R201 的突變體IL6R201_D55E(SEQ ID NO 28)GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGTCTGGTTCAACCGGGCGGGAGCTTGCGTCTGAGTTGCGCTGCGAGCGGTTTCACATTTAGCGACTACGACATCGGATGGTTTCGTCAGGCTCCGGGCAAAGGTCGCGAAGGTGTGTCTGGCATTTCAAGTTCTGAAGGCAACACTTATTACGCAGACAGCGTTAAAGGTCGTTTCACCATTTCGCGTGATAACGCAAAGAATACCCTGTACCTTCAAATGAATAGCTTACGCCCAGAAGATACCGCCGTTTACTATTGTGCCGCGGAACCGCCAGATAGCTCGTGGTATCTGGATGGCTCTCCTGAATTCTTTAAATATTGGGGTCAGGGTACGCTGGTCACCGTCTCCTCATAATGAIL6R201_D55Q(SEQ ID NO 29) GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGTCTGGTTCAACCGGGCGGGAGCTTGCGTCTGAGTTGCGCTGCGAGCGGTTTCACATTTAGCGACTACGACATCGGATGGTTTCGTCAGGCTCCGGGCAAAGGTCGCGAAGGTGTGTCTGGCATTTCAAGTTCTCAAGGCAACACTTATTACGCAGACAGCGTTAAAGGTCGTTTCACCATTTCGCGTGATAACGCAAAGAATACCCTGTACCTTCAAATGAATAGCTTACGCCCAGAAGATACCGCCGTTTACTATTGTGCCGCGGAACCGCCAGATAGCTCGTGGTATCTGGATGGCTCT
CCTGAATTCTTTAAATATTGGGGTCAGGGTACGCTGGTCACCGTCTCCTCATAATGAIL6R201_D62E(SEQ ID NO 30)GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGTCTGGTTCAACCGGGCGGGAGCTTG
CGTCTGAGTTGCGCTGCGAGCGGTTTCACATTTAGCGACTACGACATCGGATGGTTTCGTCAGGCTCCGGGCAAAGGTCGCGAAGGTGTGTCTGGCATTTCAAGTTCTGACGGCAACACTTATTACGCAGAAAGCGTTAAAGGTCGTTTCACCATTTCGCGTGATAACGCAAAGAATACCCTGTACCTTCAAATGAATAGCTTACGCCCAGAAGATACCGCCGTTTACTATTGTGCCGCGGAACCGCCAGATAGCTCGTGGTATCTGGATGGCTCTCCTGAATTCTTTAAATATTGGGGTCAGGGTACGCTGGTCACCGTCTCCTCATAATGAIL6R201_D102E(SEQ ID NO 31)GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGTCTGGTTCAACCGGGCGGGAGCTTGCGTCTGAGTTGCGCTGCGAGCGGTTTCACATTTAGCGACTACGACATCGGATGGT
TTCGTCAGGCTCCGGGCAAAGGTCGCGAAGGTGTGTCTGGCATTTCAAGTTCTGACGGCAACACTTATTACGCAGACAGCGTTAAAGGTCGTTTCACCATTTCGCGTGATAACGCAAAGAATACCCTGTACCTTCAAATGAATAGCTTACGCCCAGAAGATACCGCCGTTTACTATTGTGCCGCGGAACCGCCAGAAAGCTCGTGGTATCTGGATGGCTCTCCTGAATTCTTTAAATATTGGGGTCAGGGTACGCTGGTCACCGTCTCCTCATAATGAIL6R201_D102Q(SEQ ID NO 32)GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGTCTGGTTCAACCGGGCGGGAGCTTGCGTCTGAGTTGCGCTGCGAGCGGTTTCACATTTAGCGACTACGACATCGGATGGTTTCGTCAGGCTCCGGGCAAAGGTCGCGAAGGTGTGTCTGGCATTTCAAGTTCTGACGGCAACACTTATTACGCAGACAGCGTTAAAGGTCGTTTCACCATTTCGCGTGATAACGCAAAGAATACCCTGTACCTTCAAATGAATAGCTTACGCCCAGAAGATACCGCCGTTTACTATTGTGCCGCGGAACCGCCACAAAGCTCGTGGTATCTGGATGGCTCTCCTGAATTCTTTAAATATTGGGGTCAGGGTACGCTGGTCACCGTCTCCTCATAATGAIL6R201_D108E(SEQ ID NO 33)GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGTCTGGTTCAACCGGGCGGGAGCTTGCGTCTGAGTTGCGCTGCGAGCGGTTTCACATTTAGCGACTACGACATCGGATGGTTTCGTCAGGCTCCGGGCAAAGGTCGCGAAGGTGTGTCTGGCATTTCAAGTTCTGACGGCAACACTTATTACGCAGACAGCGTTAAAGGTCGTTTCACCATTTCGCGTGATAACGCAAAGAATACCCTGTACCTTCAAATGAATAGCTTACGCCCAGAAGATACCGCCGTTTACTATTGTGCCGCGGAACCGCCAGATAGCTCGTGGTATCTGGAAGGCTCTCCTGAATTCTTTAAATATTGGGGTCAGGGTACGCTGGTCACCGTCTCCTCATAATGAIL6R201_D108Q(SEQ ID NO 34)
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GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGTCTGGTTCAACCGGGCGGGAGCTTGCGTCTGAGTTGCGCTGCGAGCGGTTTCACATTTAGCGACTACGACATCGGATGGTTTCGTCAGGCTCCGGGCAAAGGTCGCGAAGGTGTGTCTGGCATTTCAAGTTCTGACGGCAACACTTATTACGCAGACAGCGTTAAAGGTCGTTTCACCATTTCGCGTGATAACGCAA AGAATACCCTGTACCTTCAAATGAATAGCTTACGCCCAGAAGATACCG
CCGTTTACTATTGTGCCGCGGAACCGCCAGATAGCTCGTGGTATCTGCAAGGCTCTCCTGAATTCTTTAAATATTGGGGTCAGGGTACGCTGGTCACCGTCTCCTCATAATGA納米抗體被克隆在pet28a載體中，該載體使用Tac啟動(dòng)子和PelB前導(dǎo)序列。表達(dá)和純化在50ml LB/卡那霉素中開(kāi)始IL6R201構(gòu)建體D55E (克隆2)，D55Q(克隆4)， D102E (克隆 3)，D102Q (克隆 1) D108E (克隆 2)和 D108Q (克隆 2) (pet28a/TAC/pelB 載體) 的預(yù)培養(yǎng)并在37°C下溫育過(guò)夜。在3x士330mLTB 1+11/卡那霉素中開(kāi)始表達(dá)。每個(gè)燒瓶中 接種以IOmL起子培養(yǎng)物，之后在37°C同時(shí)以250rpm振搖下生長(zhǎng)約4小時(shí)，之后溫度降低至 28°C。之后用ImM IPTG(330uL IM母液)誘導(dǎo)培養(yǎng)物6小時(shí)，并進(jìn)一步在28°C下以250rpm 保持溫育過(guò)夜。培養(yǎng)物以4500rpm離心30分鐘，之后棄去上清液。沉淀物在-20°C下保存 2-3小時(shí)，之后沉淀物重新懸浮在30mLPBS/lmM EDTA中，并在室溫下振搖2小時(shí)。將懸液以 8500rpm離心20分鐘以從提取物中清除細(xì)胞碎片。用于純化的柱為MabCaptureA(Poros)。在此試驗(yàn)中的緩沖液A為D-PBS/0，5M NaCl，緩沖液B為IOOMm甘氨酸pH 2，5。士30mL周質(zhì)提取物以IOmL/分鐘的流速泵至柱上。 之后該柱用緩沖液A以多個(gè)柱體積洗滌。為了洗脫結(jié)合的蛋白，我們轉(zhuǎn)換為緩沖液B。下一步，使用尺寸排阻層析。使用Superdex 75HR 26/60來(lái)進(jìn)行尺寸排阻。在 D-PBS中完成凝膠過(guò)濾。測(cè)量OD 280nm，并且計(jì)算濃度。樣品保存在-20C。穩(wěn)定性研究初始的蛋白批料在D-PBS中稀釋至500或lmg/mL(總體積為5mL)。之后，樣品通 過(guò)0. 22微米濾器過(guò)濾，并且500微升在-80°C下保存作為參考樣品，約4500微升在37°C下 (在溫育箱中)保存。Biacore3000 中的分析通過(guò)使用初始結(jié)合速率(IBR)和斜率研究在37°C下保存4周的IL-6R201， IL-6R201 D55E, IL-6R201 D55Q, IL-6R201 D102E, IL-6R201D102Q, IL-6R201 D108E 和 IL-6R201 D108Q的結(jié)合特性。顯示在高密度hIL-6R芯片上，對(duì)于IL-6R201和它的突變體在0_50ng/mL的范圍 內(nèi)校準(zhǔn)曲線是完全線性的。因此0-50ng/ml的濃度范圍將包括在本實(shí)驗(yàn)中(以控制線性)， 并且通過(guò)將各個(gè)樣品以40ng/ml的濃度加樣5次來(lái)確定功能性。首先，通過(guò)將IL-6R201加樣5次對(duì)高密度hIL_6R芯片進(jìn)行預(yù)處理。下一步，將 0-50ng/mL濃度范圍的IL-6R201加樣，緊接著將所有樣品加樣5次。使用BIA評(píng)價(jià)軟件完成評(píng)價(jià)。在BIA評(píng)價(jià)軟件中使用“通用擬合”法和線性擬合 模型來(lái)確定斜率。用來(lái)測(cè)定初始結(jié)合速率(IBR)的數(shù)據(jù)是在5和25s之間選擇的斜率。
反相-HPLC(RP-HPLC 或 RPC)使用的柱為安捷倫(Agilent)系統(tǒng)上的ZORBAX 300SB C3 (5 μ m)。在實(shí)驗(yàn)期間該 柱的溫度為70°C。使用的緩沖液A為0. 三氟乙酸，緩沖液B為0. 三氟乙酸/99.9% 乙腈。使用的程序描述如下程序 評(píng)價(jià)已經(jīng)進(jìn)行誘變以去除潛在的異構(gòu)化位點(diǎn)(⑶R2中的2個(gè)位點(diǎn)和⑶R3中的2 個(gè)位點(diǎn))。對(duì)不同的突變體進(jìn)行穩(wěn)定性研究(在37°C下保存4周)。RPC中的分析將D108E 和D108Q鑒定為保留活性并減少異構(gòu)化的關(guān)鍵突變(比較圖27-圖33 僅將D108替換為 D108E或D108Q導(dǎo)致防止異構(gòu)化)。實(shí)施例6 :ALX-0081(SEQ ID NO 1)和 VWF0001(SEQ ID NO 25)的體內(nèi)功效Folts’ 模型狒狒中的改良Folts’模型用來(lái)測(cè)定在預(yù)防急性血栓形成中的功效。Folts’模型 詳細(xì)地描述在W02004/062551中的實(shí)施例18中。在野外捕捉9只健康雄性狒狒(豚尾狒 狒(Papio ursinus))，動(dòng)物重9.6-17kg，并用于本研究中。狒狒只用干的標(biāo)準(zhǔn)食物喂養(yǎng)。所有操作根據(jù)‘在南非用于藥物和相關(guān)物質(zhì)的研究、教育、診斷和測(cè)試動(dòng)物的國(guó)家 法規(guī)(National Code for Animal Use in Research，Education，Diagnosis and Testing of Drug and Related Substanced in South Africa)，經(jīng)‘自由州大學(xué)和自由州省政 _ 白勺云力(Ethics committee for Animal Experimentation of the University of the Free State and Free State Provincial Administration)'批準(zhǔn)。簡(jiǎn)言之，在全麻下將分流器(shunt)安放在股動(dòng)脈和股靜脈之間。分流器用于藥 物施用和血液采樣以及用于使用血管周圍超聲波流量探測(cè)器(Transonic systems TS410, rpobe :ME3PXL 1008)監(jiān)測(cè)血流，該流量探測(cè)器置于分流器周圍。然后通過(guò)使用鑷子損傷股 動(dòng)脈并將夾鉗置于損傷部位上，用于產(chǎn)生股動(dòng)脈的外部狹窄。結(jié)果獲得高剪切率，并且血流 減少至初始流速的20%。形成富含血小板的血栓，隨后機(jī)械性地將其去除，導(dǎo)致周期性流量 減少(cyclic flow reductions, CFRs)。一次CFR是動(dòng)脈的狹窄和完全閉塞(0流動(dòng))之 間的時(shí)間。在可重復(fù)的CFRs的30-分鐘控制期之后，沖洗分流器并施用賦形劑(鹽水)作 為內(nèi)部對(duì)照。追蹤C(jī)FRs 30多分鐘。隨后，增加劑量的納米抗體 經(jīng)靜脈內(nèi)注射入分流器中
67并且研究對(duì)CFRs的作用。當(dāng)抑制CFRs后施加新的損傷，以證實(shí)所述抑制是處理的作用而 不是自然愈合現(xiàn)象。在施用最高劑量的納米抗體 后完全抑制CFRs后，注射腎上腺素以進(jìn) 一步測(cè)試納米抗體⑧的效力。腎上腺素再次激活血小板，并且可區(qū)分區(qū)分CFRs的弱抑制和 強(qiáng)抑制。實(shí)際上，以前已經(jīng)證明，當(dāng)在同一模型中使用阿司匹林 時(shí)，存在腎上腺素時(shí)CFRs 重新出現(xiàn)。每次用藥后10分鐘，取血樣(6. 5ml)用于實(shí)驗(yàn)室分析。如其他地方所述，例如， W02004/062551的實(shí)施例18，分析RIPA，F(xiàn)VIIIiC以及納米抗體 的血漿濃度和VWF:Ag。進(jìn)行兩種不同的出血分析皮膚出血時(shí)間(使用Surgicut裝置；在納米抗體⑧的 每次劑量后測(cè)量10分鐘)和第二個(gè)手術(shù)出血實(shí)驗(yàn)，在該試驗(yàn)中，將紗布塞到腹股溝的切口 中，通過(guò)對(duì)紗布稱重來(lái)測(cè)量總失血。恰好在納米抗體 的各次新劑量前每30分鐘更換紗布。 每次劑量的失血量通過(guò)稱重紗布而確定。失血相對(duì)于在對(duì)照紗布(鹽水注射期間)中的失 血量來(lái)表示。RIPARIPA是ALX-0081的生物標(biāo)志，并且測(cè)量通過(guò)抗生素利托菌素非生理性激活A(yù)l結(jié) 構(gòu)域后在富含血小板的血漿(PRP)的樣品中分散的血小板形成聚集體的速率和程度(還參 見(jiàn)，例如W02004/062551的實(shí)施例18)。RIPA以兩個(gè)步驟發(fā)生。在第一步驟中，在利托菌素 的存在下血小板與VWF凝集，在第二步驟中，由于從血小板中內(nèi)源性ADP的釋放引起血小板 聚集。血小板的凝集導(dǎo)致PRP變得不太混濁。在血小板凝集計(jì)中測(cè)量濁度的改變。在南非布隆方舟的自由州大學(xué)(University of the Free State,Bloemfontein, South Africa)分析 RIPA。在 Chronolog 全血和光學(xué)凝集計(jì)(Model 560CA, Chronolog, USA)上進(jìn)行血小板聚集。通過(guò)將全血在1200rpm離心5分鐘而制備PRP (收集在0. 32mol/ L檸檬酸鹽上)。小心去除含有PRP的上層級(jí)分。將下層級(jí)分在3000rpm進(jìn)一步離心10分 鐘，以制備貧血小板血漿(platelet poor plasma, PPP)。計(jì)數(shù)PRP中的血小板，并且在自 體PPP中稀釋至200. 000個(gè)血小板/ μ 1的最終濃度。加入3mg/ml利托菌素(DAKO)誘導(dǎo) 聚集，并且用凝集計(jì)測(cè)量。ALX-0081 和 VWF0001 的功效首先2只狒狒分別注射增加劑量的ALX-0081和VffFOOOl (ALX_0081_Sv或 ALX-0081的穩(wěn)定變體)。在這些Folts’實(shí)驗(yàn)期間的血流測(cè)量值顯示在圖35中。在測(cè)試化合物的每次劑量后的CFRs的平均長(zhǎng)度總結(jié)在表B-8中。該表還指示總 劑量，該總劑量是在該時(shí)間點(diǎn)的所有給藥的累積劑量。獲得CFRs的完全抑制時(shí)的劑量標(biāo)記 以(> 1800)。表B-8 用ALX-0081和VWF0001處理的動(dòng)物的CFRs長(zhǎng)度(秒)。> 1800 =完全 抑制達(dá)30分鐘，沒(méi)有血流的減少
68 對(duì)于ALX-0081 在 30 μ g/kg (43 μ g/kg 的累積劑量)，且對(duì)于 VffFOOOl 在 10 μ g/ kg(13 μ g/kg的累積劑量)的劑量下獲得CFRs的完全抑制。在新?lián)p傷時(shí)仍保持抑制，但在輸注腎上腺素后意外地喪失了。后者可以下面的事 實(shí)來(lái)解釋，g卩，由于實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)間太長(zhǎng)，在注射腎上腺素時(shí)ALX-0081的血漿水平可能太低 (過(guò)去我們經(jīng)推注+持續(xù)輸注施用ALX-0081，而現(xiàn)在僅推注施用)。在鹽水注射后和在ALX-0081或VWF0001的每次劑量后10分鐘取的血樣中測(cè)量 RIPA。對(duì)于2只狒狒，來(lái)自RIPA檢測(cè)的結(jié)果與CFRs長(zhǎng)度進(jìn)行比較(圖36)。在RIPA和CFRs長(zhǎng)度之間觀察到反比關(guān)系。對(duì)于2只狒狒，RIPA結(jié)果非常好地 與Folts’模型中的功效結(jié)果相比較。因此，RIPA可以被認(rèn)為是對(duì)vWF結(jié)合劑諸如例如 ALX-0081/VffFOOOl的功效生物標(biāo)志。實(shí)施例7 強(qiáng)制氧化試驗(yàn)實(shí)施例7. 1使用IL6R201的強(qiáng)制氧化試驗(yàn)我們以前證明SEQ ID NO 2 (vffF-12A2hl)中78位處存在的甲硫氨酸對(duì)氧化作用 敏感。在此實(shí)施例中，我們描述了我們已經(jīng)在VHH片段IL6R201 (SEQ ID NO 35)中引入了 突變。在此突變體中，78位處的蘇氨酸(蘇氨酸，是在VH或VHH片段中的FR3中的此位點(diǎn) 處經(jīng)常存在的殘基)改變?yōu)榧琢虬彼?，并且命名為IL6R201 T78M(SEQ ID NO :36)。在純化 突變體蛋白后，使用IL6R201和IL6R201 T78M兩者進(jìn)行采用H2O2的強(qiáng)制氧化試驗(yàn)。通過(guò)隨 后在RP/HPLC上的分析，我們可以證明突變的VHH變得對(duì)氧化作用敏感(圖37-上跡線)， 而未突變的則對(duì)用H2O2的處理有抵抗力(圖37-下跡線)。IL6R201 的氨基酸序列(SEQ ID NO 35)EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS DYDIGffFRQA PGKGREGVSGISSSDGNTYY ADSVKGRFTI SRDNAKNTLY LQMNSLRPED TAVYYCAAEPPDSSffYLDGS PEFFKYffGQG TLVTVSSIL6R201-T78M 的氨基酸序列(SEQ ID NO 36)EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS DYDIGffFRQA PGKGREGVSGISSSDGNTYY ADSVKGRFTI SRDNAKWLY LQMNSLRPED TAVYYCAAEPPDSSffYLDGS PEFFKYffGQG TLVTVSS實(shí)施例7. 2采用H。0。的119A3的強(qiáng)制氧化試驗(yàn)
119A3 的氨基酸序列(SEQ ID NO 37)EVQLVESGGG LVQAGGSLRL SCAASGRIFS LPASGNIFNL LTIAffHRQAPGMQRELVATI NSGSRTNYAD SVKGRFTISR DNAQKTVYLQ MNNLKPEDTAVYYCQTSGSG SPNFffGQGTQ VTVSS119A3(SEQ ID NO 37)包含兩個(gè)甲硫氨酸殘基，分別是構(gòu)架2中的52位處的一個(gè) 甲硫氨酸和FR3中91位處的第二個(gè)甲硫氨酸?；谝郧安捎胿WF-12A2hl(SEQ ID NO 2) 的發(fā)現(xiàn)，我們假設(shè)在納米抗體119A3中，僅M52是溶劑可及的，因此易于被H2O2氧化?；?我們使用vWF-12A2hl的發(fā)現(xiàn)，我們假設(shè)在天然條件下，僅M52對(duì)強(qiáng)制氧化敏感，而在未折疊 條件下，兩個(gè)殘基應(yīng)該均易于氧化。純化后，在D-PBS中l(wèi)mg/mL的119A3溶液與IOmM H2O2 溫育2小時(shí)。在脫鹽柱上去除過(guò)量的H2O2后，通過(guò)RP-HPLC分析混合物。如圖38中所示， 似乎被處理的物質(zhì)(圖38中的下跡線)發(fā)生變化，因?yàn)榇嬖谝粋€(gè)峰(峰移)，與未處理物質(zhì) (上跡線)相比該峰較早地從柱中被洗脫下來(lái)。我們還觀察到在未處理的樣品中總是存在 一個(gè)與氧化物質(zhì)對(duì)應(yīng)的小峰。還在6M胍的存在下用H2O2處理該物質(zhì)。該物質(zhì)在RP-HPLC上的分析也揭示了比 未處理樣品早洗脫的峰(圖38中的中跡線)。使用天然和未折疊樣品形成的氧化變體的保 留時(shí)間的差異提供了下列的證據(jù)，在天然條件下僅M52被氧化，而以未折疊狀態(tài)兩個(gè)殘基 都對(duì)氧化敏感。優(yōu)選的方面1.多肽，其是在1位處具有D的單可變結(jié)構(gòu)域，或是在1位處具有D的人源化單可 變結(jié)構(gòu)域。2.根據(jù)方面1的多肽，其中所述單可變結(jié)構(gòu)域是納米抗體或dAb，或是在1位處具 有D的人源化抗體或dAb。3.根據(jù)方面1或方面2的多肽，其中所述氨基酸序列在1位處具有D且在⑶Rs內(nèi) 沒(méi)有M或在使用kabat編號(hào)的77位處沒(méi)有M。4.根據(jù)方面1-3的多肽，其中所述氨基酸序列在任意一個(gè)⑶R中沒(méi)有N。5.根據(jù)方面1-4的多肽，其中所述氨基酸序列在⑶R3中沒(méi)有N。6.根據(jù)方面1-3的多肽，其中所述氨基酸序列在任意一個(gè)⑶R中沒(méi)有D。7.根據(jù)方面1-4的多肽，其中所述氨基酸序列在⑶R3中沒(méi)有D。8.根據(jù)方面1-3的多肽，其中所述氨基酸序列在任意一個(gè)CDR中沒(méi)有NG或NS基 序。9.根據(jù)方面1-4的多肽，其中所述氨基酸序列在⑶R3中沒(méi)有NG或NS基序。10.根據(jù)方面1-3的多肽，其中所述氨基酸序列在任意一個(gè)⑶R中沒(méi)有DG或DS基序。11.根據(jù)方面1-4的多肽，其中所述氨基酸序列在⑶R3中沒(méi)有DG或DS基序。12.多肽，其是在任意一個(gè)⑶R中沒(méi)有DG或DS基序的單可變結(jié)構(gòu)域。13.多肽，其是在⑶R3中沒(méi)有DG或DS基序的單可變結(jié)構(gòu)域。14. 一種在合適的生物體中通過(guò)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生具有改善的穩(wěn)定性的多 肽、其功能衍生物或片段的方法，所述多肽包含至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域，例如納米抗體或 dAbs，優(yōu)選納米抗體，所述表達(dá)載體包含編碼所述多肽、衍生物或片段的重組基因，所述方法包括替換易于異構(gòu)化的至少一個(gè)N或D的步驟。15. 一種在合適的生物體中通過(guò)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生具有改善的穩(wěn)定性的多 肽、其功能衍生物或片段的方法，所述多肽包含至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域，例如納米抗體或 dAbs，優(yōu)選納米抗體，所述表達(dá)載體包含編碼所述多肽、衍生物或片段的重組基因，所述方 法包括替換易于氧化的至少一個(gè)M的步驟。16. 一種在合適的生物體中通過(guò)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生具有改善的穩(wěn)定性的多 肽、其功能衍生物或片段的方法，所述多肽包含至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域，例如納米抗體或 dAbs，優(yōu)選納米抗體，所述表達(dá)載體包含編碼所述多肽、衍生物或片段的重組基因，所述方 法包括替換El或Ql的步驟。17. 一種在合適的生物體中通過(guò)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生具有改善的穩(wěn)定性的多 肽、其功能衍生物或片段的方法，所述多肽包含至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域，例如納米抗體或 dAbs，優(yōu)選納米抗體，所述表達(dá)載體包含編碼所述多肽、衍生物或片段的重組基因，所述方 法包括以下的步驟a)如果存在El或Q1，則用另一個(gè)天然存在的氨基酸替換El或Ql ；或b)如果存在至少一個(gè)易于氧化的M，則用另一個(gè)天然存在的氨基酸替換所述至少 一個(gè)易于氧化的M ；或c)如果存在至少一個(gè)易于異構(gòu)化的N或D，則用另一個(gè)天然存在的氨基酸替換所 述至少一個(gè)易于異構(gòu)化的N或D ；或d)組合步驟a)和b)；或e)組合步驟b)和C)；或f)組合步驟a)和C)。18.通過(guò)方面17的方法產(chǎn)生的突變體的文庫(kù)。19.在根據(jù)方面14-18的方法產(chǎn)生突變體中使用的核苷酸。20.包含方面19的核苷酸的宿主細(xì)胞。21.包含方面20的宿主細(xì)胞的篩選方法。22.來(lái)自方面18的文庫(kù)的選擇的突變體組，其中所述突變體具有小于ΙΟΟΟηΜ，優(yōu) 選地小于ΙΟΟηΜ，更優(yōu)選地小于ΙΟηΜ，更優(yōu)選地小于InM的解離常數(shù)Kd。23.來(lái)自方面18的文庫(kù)的選擇的突變體組，其中所述突變體具有不高于要被穩(wěn)定 的原始多肽的約100 %，優(yōu)選90 %，更優(yōu)選80 %，更優(yōu)選50 %，更優(yōu)選30 %，更優(yōu)選20 %，更 優(yōu)選10 %，更優(yōu)選5 %的解離常數(shù)Kd。24. 一種在合適的生物體中通過(guò)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生具有改善的穩(wěn)定性的多 肽、其功能衍生物或片段的方法，所述多肽包含至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域，例如納米抗體或 dAbs，優(yōu)選納米抗體，所述表達(dá)載體包含編碼所述多肽、衍生物或片段的重組基因，所述方 法包括以下的步驟a)在⑶R環(huán)中，優(yōu)選地在⑶R2和/或⑶R3環(huán)，更優(yōu)選地在⑶R3環(huán)中檢查編碼多 肽的至少一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的基因中的編碼N的核苷酸序列；和b)如果存在編碼所述二肽序列的所述核苷酸序列，則突變所述編碼N的核苷酸序 列；以及c)用以此方式修飾的基因轉(zhuǎn)化合適的生物體，并且表達(dá)具有所需活性的多肽、片段或衍生物。25. 一種在合適的生物體中通過(guò)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生具有改善的穩(wěn)定性的多 肽、其功能衍生物或片段的方法，所述多肽包含至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域，例如納米抗體或 dAbs，優(yōu)選納米抗體，所述表達(dá)載體包含編碼所述多肽、衍生物或片段的重組基因，所述方 法包括以下的步驟a)在⑶R環(huán)中，優(yōu)選地在⑶R2和/或⑶R3環(huán)，更優(yōu)選地在⑶R3環(huán)中檢查編碼多 肽的至少一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的基因中的編碼D的核苷酸序列；和b)如果存在編碼所述二肽序列的所述核苷酸序列，則突變所述編碼D的核苷酸序 列；以及c)用以此方式修飾的基因轉(zhuǎn)化合適的生物體，并且表達(dá)具有所需活性的多肽、片 段或衍生物。26. 一種在合適的生物體中通過(guò)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生具有改善的穩(wěn)定性的多 肽、其功能衍生物或片段的方法，所述多肽包含至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域，例如納米抗體或 dAbs，優(yōu)選納米抗體，所述表達(dá)載體包含編碼所述多肽、衍生物或片段的重組基因，所述方 法包括以下的步驟a)在⑶R環(huán)中，優(yōu)選地在⑶R2和/或⑶R3環(huán)，更優(yōu)選地在⑶R3環(huán)中檢查編碼多 肽的至少一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的基因中的編碼NG或NS的核苷酸序列；和b)如果存在編碼所述二肽序列的所述核苷酸序列，則突變所述編碼N的核苷酸序 列；以及c)用以此方式修飾的基因轉(zhuǎn)化合適的生物體，并且表達(dá)具有所需活性的多肽、片 段或衍生物。27. 一種在合適的生物體中通過(guò)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生具有改善的穩(wěn)定性的多 肽、其功能衍生物或片段的方法，所述多肽包含至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域，例如納米抗體或 dAbs，優(yōu)選納米抗體，所述表達(dá)載體包含編碼所述多肽、衍生物或片段的重組基因，所述方 法包括以下的步驟a)在⑶R環(huán)中，優(yōu)選地在⑶R2和/或⑶R3環(huán)，更優(yōu)選地在⑶R3環(huán)中檢查編碼多 肽的至少一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的基因中的編碼DG或DS的核苷酸序列；和b)如果存在編碼所述二肽序列的所述核苷酸序列，則突變所述編碼D的核苷酸序 列；以及c)用以此方式修飾的基因轉(zhuǎn)化合適的生物體，并且表達(dá)具有所需活性的多肽、片 段或衍生物。28. 一種在合適的生物體中通過(guò)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生具有改善的穩(wěn)定性的多 肽、其功能衍生物或片段的方法，所述多肽包含至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域，例如納米抗體或 dAbs，優(yōu)選納米抗體，所述表達(dá)載體包含編碼所述多肽、衍生物或片段的重組基因，所述方 法包括以下的步驟a)在⑶R環(huán)中，優(yōu)選地在⑶R2和/或⑶R3環(huán)，更優(yōu)選地在⑶R3環(huán)中檢查編碼多 肽的至少一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的基因中的編碼NG，NS, DG或DS的核苷酸序列；和b)如果存在編碼所述二肽序列的所述核苷酸序列，則突變所述編碼N或D的核苷 酸序列；以及
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c)用以此方式修飾的基因轉(zhuǎn)化合適的生物體，并且表達(dá)具有所需活性的多肽、片 段或衍生物。29. 一種在合適的例如真核或原核生物體中通過(guò)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生具有改善 的穩(wěn)定性的多肽、其功能衍生物或片段的方法，所述多肽包含至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域，例如 納米抗體或dAbs，優(yōu)選納米抗體，所述表達(dá)載體包含編碼所述多肽、衍生物或片段的重組基 因，所述方法包括以下的步驟a)在⑶R環(huán)中，優(yōu)選地在⑶R2和/或⑶R3環(huán)，更優(yōu)選地在⑶R3環(huán)中檢查編碼多 肽的至少一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的基因中的編碼NG，NS, DG或DS的核苷酸序列；和b)如果存在編碼所述二肽序列的至少一個(gè)核苷酸序列，則生成包含多肽衍生物 (或基本上由其組成)的突變體文庫(kù)，其中在要被穩(wěn)定的多肽中發(fā)現(xiàn)NG或DG的情況下，a) 中的一個(gè)或多個(gè)所述已鑒定的核苷酸序列用編碼EG，QG, ES, QS, NA, NT, DA或DT，優(yōu)選編碼 EG或QG的核苷酸序列替換，或在要被穩(wěn)定的多肽中發(fā)現(xiàn)NS或DS的情況下用編碼ES或QS 的核苷酸序列替換；以及c)用以此方式修飾的基因轉(zhuǎn)化所述原核或真核生物體，并且表達(dá)具有所需活性的 多肽、片段或衍生物。30. 一種在合適的例如真核或原核生物體中通過(guò)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生具有改善 的穩(wěn)定性的多肽、其功能衍生物或片段的方法，所述多肽包含至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域，例如 納米抗體或dAbs，優(yōu)選納米抗體，所述表達(dá)載體包含編碼所述多肽、衍生物或片段的重組基 因，所述方法包括以下的步驟a)檢查編碼多肽的至少一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的基因中的編碼NG，NS, DG或DS基序的 核苷酸序列，其中所述氨基酸或基序是表面暴露的，并且其中氫鍵供給殘基緊密接近不穩(wěn) 定的N或D ；和b)如果a)中的核苷酸序列被鑒定，則生成包含多肽衍生物(或基本上由其組成) 的突變體文庫(kù)，其中在要被穩(wěn)定的多肽中發(fā)現(xiàn)NG或DG的情況下，a)中的一個(gè)或多個(gè)所述 已鑒定的核苷酸序列用編碼EG，QG, ES, QS, NA, NT, DA或DT，優(yōu)選編碼EG或QG的核苷酸序 列替換，或在要被穩(wěn)定的多肽中發(fā)現(xiàn)NS或DS的情況下用編碼ES或QS的核苷酸序列替換； 以及c)用以此方式修飾的基因轉(zhuǎn)化所述原核或真核生物體，并且表達(dá)具有所需活性的 多肽、片段或衍生物。31. 一種在合適的例如真核或原核生物體中通過(guò)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生具有改善 的穩(wěn)定性的多肽、其功能衍生物或片段的方法，所述多肽包含至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域，例如 納米抗體或dAbs，優(yōu)選納米抗體，所述表達(dá)載體包含編碼所述多肽、衍生物或片段的重組基 因，所述方法包括以下的步驟a)檢查編碼多肽的至少一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的基因中的編碼NG，NS, DG或DS基序的 核苷酸序列，其中所述氨基酸或基序是表面暴露的，并且其中氫鍵供給殘基緊密接近不穩(wěn) 定的N或D ；和b)如果a)中的核苷酸序列被鑒定，則生成包含多肽衍生物(或基本上由其組成) 的突變體文庫(kù)，其中在要被穩(wěn)定的多肽中發(fā)現(xiàn)NG或DG的情況下，a)中的一個(gè)或多個(gè)所述 已鑒定的核苷酸序列用編碼EG，QG, ES, QS, NA, NT, DA或DT，優(yōu)選編碼EG或QG的核苷酸序列替換，或在要被穩(wěn)定的多肽中發(fā)現(xiàn)NS或DS的情況下用編碼ES或QS的核苷酸序列替換； 以及c)用以此方式修飾的基因轉(zhuǎn)化所述原核或真核生物體，并且表達(dá)具有所需活性的 多肽、片段或衍生物。32. 一種在合適的例如真核或原核生物體中通過(guò)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生具有改善 的穩(wěn)定性的多肽、其功能衍生物或片段的方法，所述多肽包含至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域，例如 納米抗體或dAbs，優(yōu)選納米抗體，所述表達(dá)載體包含編碼所述多肽、衍生物或片段的重組基 因，所述方法包括以下的步驟a)在⑶R環(huán)中，優(yōu)選地在⑶R2和/或⑶R3環(huán)，更優(yōu)選地在⑶R3環(huán)中檢查編碼多 肽的至少一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的基因中的編碼NG，NS, DG或DS的核苷酸序列；和b)檢查已鑒定的序列是否發(fā)生異構(gòu)化，和已鑒定的序列的異構(gòu)化任選地是否是失 去所述多肽的至少一種活性、優(yōu)選所有活性的原因；和c)不管是否觀察到異構(gòu)化，則生成包含多肽衍生物(或基本上由其組成)的突變 體文庫(kù)，其中在要被穩(wěn)定的多肽中發(fā)現(xiàn)NG或DG的情況下，a)中的一個(gè)或多個(gè)所述已鑒定的 核苷酸序列用編碼EG，QG, ES, QS, NA, NT, DA或DT，優(yōu)選編碼EG或QG的核苷酸序列替換， 或在要被穩(wěn)定的多肽中發(fā)現(xiàn)NS或DS的情況下用編碼ES或QS的核苷酸序列替換；以及d)用以此方式修飾的基因轉(zhuǎn)化所述原核或真核生物體，并且表達(dá)具有所需活性的 多肽、片段或衍生物。33. 一種在合適的例如真核或原核生物體中通過(guò)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生具有改善 的穩(wěn)定性的多肽、其功能衍生物或片段的方法，所述多肽包含至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域，例如 納米抗體或dAbs，優(yōu)選納米抗體，所述表達(dá)載體包含編碼所述多肽/衍生物或片段的重組 基因，所述方法包括以下的步驟a)在⑶R環(huán)中，優(yōu)選地在⑶R2和/或⑶R3環(huán)，更優(yōu)選地在⑶R3環(huán)中檢查編碼多 肽的至少一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的基因中的編碼NG或DG的核苷酸序列；和b)檢查已鑒定的序列是否發(fā)生異構(gòu)化(例如，通過(guò)在較高溫度下延長(zhǎng)保存期并且 隨后觀察RPC譜型中的前峰一一見(jiàn)實(shí)驗(yàn)部分)和已鑒定的序列的異構(gòu)化任選地是否是失 去所述多肽的至少一種活性、優(yōu)選所有活性的原因；和C)不管是否觀察到異構(gòu)化，則生成包含多肽衍生物(或基本上由其組成)的突變 體文庫(kù)，其中在要被穩(wěn)定的多肽中發(fā)現(xiàn)NG或DG的情況下，a)中的一個(gè)或多個(gè)所述已鑒定 的核苷酸序列用編碼EG，QG, NA, NT, DA或DT，優(yōu)選編碼EG或QG的核苷酸序列替換；以及d)用以此方式修飾的基因轉(zhuǎn)化所述原核或真核生物體，并且表達(dá)具有所需活性的 多肽、片段或衍生物。34. 一種在合適的例如真核或原核生物體中通過(guò)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生具有改善 的穩(wěn)定性的多肽、其功能衍生物或片段的方法，所述多肽包含至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域，例如 納米抗體或dAbs，優(yōu)選納米抗體，所述表達(dá)載體包含編碼所述多肽、衍生物或片段的重組基 因，所述方法包括以下的步驟a)在⑶R環(huán)中，優(yōu)選地在⑶R2和/或⑶R3環(huán)，更優(yōu)選地在⑶R3環(huán)中檢查編碼多 肽的至少一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的基因中的編碼NS或DS的核苷酸序列；和b)檢查已鑒定的序列是否發(fā)生異構(gòu)化(例如，通過(guò)在較高溫度下延長(zhǎng)保存期并且隨后觀察RPC譜型中的前峰一一見(jiàn)實(shí)驗(yàn)部分)和已鑒定的序列的異構(gòu)化任選地是否是失 去所述多肽的至少一種活性、優(yōu)選所有活性的原因；和c)不管是否觀察到異構(gòu)化，則生成包含多肽衍生物(或基本上由其組成)的突變 體文庫(kù)，其中在要被穩(wěn)定的多肽中發(fā)現(xiàn)NS或DS的情況下，a)中的一個(gè)或多個(gè)所述已鑒定 的核苷酸序列用編碼ES，QS, NA, NT, DA或DT，優(yōu)選編碼ES或QS的核苷酸序列替換；以及d)用以此方式修飾的基因轉(zhuǎn)化所述原核或真核生物體，并且表達(dá)具有所需活性的 多肽、片段或衍生物。35. 一種在合適的例如真核或原核生物體中通過(guò)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生具有改善 的穩(wěn)定性的多肽、其功能衍生物或片段的方法，所述多肽包含至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域，例如 納米抗體或dAbs，優(yōu)選納米抗體，所述表達(dá)載體包含編碼所述多肽、衍生物或片段的重組基 因，所述方法包括以下的步驟a)在⑶R環(huán)中，優(yōu)選地在⑶R2和/或⑶R3環(huán)，更優(yōu)選地在⑶R3環(huán)中檢查編碼多 肽的至少一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的基因中的編碼NG，DG, NS或DS的核苷酸序列；和b)生成包含多肽衍生物(或基本上由其組成)的突變體文庫(kù)，其中在要被穩(wěn)定的 多肽中發(fā)現(xiàn)NS或DS的情況下，a)中的一個(gè)或多個(gè)所述已鑒定的核苷酸序列用編碼EG，QG, ES, QS, NA, NT, DA或DT，優(yōu)選編碼ES或QS的核苷酸序列替換，或在要被穩(wěn)定的多肽中發(fā)現(xiàn) NG或DG的情況下優(yōu)選用編碼EG或QG的核苷酸序列替換；以及c)用以此方式修飾的基因轉(zhuǎn)化所述原核或真核生物體，并且表達(dá)具有所需活性的 多肽、片段或衍生物。36. 一種在合適的例如真核或原核生物體中通過(guò)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生功能性 多肽、其功能性衍生物或片段，例如包含納米抗體或dAbs、優(yōu)選納米抗體的多肽的方法，所 述表達(dá)載體包含編碼多肽、衍生物或片段的所述文庫(kù)的重組基因，所述方法包括以下的步 驟a)在⑶R環(huán)中，優(yōu)選地在⑶R2和/或⑶R3環(huán)，更優(yōu)選地在⑶R3環(huán)中檢查編碼多 肽的至少一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的基因中的編碼NG，DG, NS或DS的核苷酸序列；和b)生成包含多肽衍生物(或基本上由其組成)的突變體文庫(kù)，其中在要被穩(wěn)定的 多肽中發(fā)現(xiàn)NS或DS的情況下，a)中的一個(gè)或多個(gè)所述已鑒定的核苷酸序列用編碼EG，QG, ES, QS, NA, NT, DA或DT，優(yōu)選編碼ES或QS的核苷酸序列替換，或在要被穩(wěn)定的多肽中發(fā)現(xiàn) NG或DG的情況下用編碼EG或QG的核苷酸序列替換；以及c)檢查任意一個(gè)M是否對(duì)強(qiáng)制氧化敏感，并且如果是，則通過(guò)用例如，V, L，A，K， G，I，T，優(yōu)選L或A，更優(yōu)選A替換M而生成文庫(kù)中的更多成員；和d)用以此方式修飾的基因轉(zhuǎn)化真核生物體，并且表達(dá)具有所需活性的本發(fā)明的多 肽、片段或衍生物。37. 一種在合適的例如真核或原核生物體中通過(guò)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生功能性 多肽、其功能性衍生物或片段，例如包含納米抗體或dAbs、優(yōu)選納米抗體的多肽的方法，所 述表達(dá)載體包含編碼多肽、衍生物或片段的所述文庫(kù)的重組基因，所述方法包括以下的步 驟a)在⑶R環(huán)中，優(yōu)選地在⑶R2和/或⑶R3環(huán)，更優(yōu)選地在⑶R3環(huán)中檢查編碼多 肽的至少一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的基因中的編碼NG，DG, NS或DS的核苷酸序列；和
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b)生成包含多肽衍生物(或基本上由其組成)的突變體文庫(kù)，其中在要被穩(wěn)定的 多肽中發(fā)現(xiàn)NS或DS的情況下，a)中的一個(gè)或多個(gè)所述已鑒定的核苷酸序列用編碼EG，QG, ES, QS, NA, NT, DA或DT，優(yōu)選編碼ES或QS的核苷酸序列替換，或在要被穩(wěn)定的多肽中發(fā)現(xiàn) NG或DG的情況下優(yōu)選用編碼EG或QG的核苷酸序列替換；以及c)檢查在78位(以納米抗體內(nèi)的連續(xù)編號(hào)系統(tǒng)-見(jiàn)圖4例如SEG IDNO 2中的 編號(hào))處是否存在M，并且如果M78存在，則通過(guò)用例如，V，L，A，K，G，I，優(yōu)選L或A，更優(yōu)選 A替換M而生成文庫(kù)中的更多成員；和d)用以此方式修飾的基因轉(zhuǎn)化真核生物體，并且表達(dá)具有所需活性的本發(fā)明的多 肽、片段或衍生物。38. 一種在合適的例如真核或原核生物體中通過(guò)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生功能性 多肽、其功能性衍生物或片段，例如包含納米抗體或dAbs、優(yōu)選納米抗體的多肽的方法，所 述表達(dá)載體包含編碼多肽、衍生物或片段的所述文庫(kù)的重組基因，所述方法包括以下的步 驟a)在⑶R環(huán)中，優(yōu)選地在⑶R2和/或⑶R3環(huán)，更優(yōu)選地在⑶R3環(huán)中檢查編碼多 肽的至少一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的基因中的編碼NG，DG, NS或DS的核苷酸序列；和b)生成包含多肽衍生物(或基本上由其組成)的突變體文庫(kù)，其中在要被穩(wěn)定的 多肽中發(fā)現(xiàn)NS或DS的情況下，a)中的一個(gè)或多個(gè)所述已鑒定的核苷酸序列用編碼EG，QG, ES, QS, NA, NT, DA或DT，優(yōu)選編碼ES或QS的核苷酸序列替換，或在要被穩(wěn)定的多肽中發(fā)現(xiàn) NG或DG的情況下優(yōu)選用編碼EG或QG的核苷酸序列替換；以及c)檢查任意一個(gè)M是否對(duì)強(qiáng)制氧化敏感，并且如果是，則通過(guò)用例如，V，L，A，K， G，I，優(yōu)選L或A，更優(yōu)選A替換；和d)如果存在N-末端E，用例如D替換N-末端E ；以及e)用以此方式修飾的基因轉(zhuǎn)化真核生物體，并且表達(dá)具有所需活性的多肽、片段 或衍生物。39.將包含納米抗體或dAbs、優(yōu)選納米抗體，優(yōu)選地在⑶R環(huán)中，優(yōu)選地在⑶R2和 /或⑶R3環(huán)，更優(yōu)選地在⑶R3環(huán)中包含至少一個(gè)DS，DG，NG或NS氨基酸基序的多肽修飾為 其他的多肽的方法，其中所述DS，DG, NG或NS氨基酸基序的至少一個(gè)被選自由DQ，DE, DT, DA, NT和NA組成的組中的氨基酸基序替換。40.將包含納米抗體或dAbs、優(yōu)選納米抗體的多肽修飾為另一蛋白的方法，其中 a)所述多肽優(yōu)選地在CDR環(huán)中，優(yōu)選地在CDR2和/或CDR3環(huán)，更優(yōu)選地在CDR3環(huán)中包含 至少一個(gè)DS，DG, NG或NS氨基酸基序和b)所述DS，DG, NG或NS氨基酸基序已知在蛋白的 活性位點(diǎn)內(nèi)，其中所述DS，DG, NG或NS氨基酸基序的至少一個(gè)被選自由DQ，DE, DT, DA, NT 和NA組成的組中的氨基酸基序替換。41.由方面24-40的方法產(chǎn)生的包含納米抗體或dAbs、優(yōu)選納米抗體的突變多肽 的文庫(kù)。42.根據(jù)方面41的包含納米抗體或dAbs、優(yōu)選納米抗體的突變多肽的文庫(kù)，其中 完成了在已鑒定的DS，DG, NG或NS氨基酸基序中的所有可能替換。43.根據(jù)方面41的包含納米抗體或dAbs、優(yōu)選納米抗體的突變多肽的文庫(kù)，其中 完成了在已鑒定的DS，DG，NG或NS氨基酸基序中的僅某些替換，例如，僅DQ或DE，優(yōu)選DE。
44.穩(wěn)定包含納米抗體或dAbs、優(yōu)選納米抗體的多肽的方法，所述方法包括以下 步驟a)檢查所述多肽的一級(jí)序列，和b)如果優(yōu)選地在⑶R環(huán)中，優(yōu)選地在⑶R2和/或 ⑶R3環(huán)，更優(yōu)選地在⑶R3環(huán)中鑒定到DS，DG, NG或NS氨基酸基序，則生成突變體的文庫(kù)， 其中每個(gè)突變體中至少一個(gè)已鑒定的氨基酸基序被選自由DQ，DE, DT, DA, NT和NA組成的 組中的氨基酸基序替換，以及c)篩選單個(gè)突變體的改善的穩(wěn)定性。45.穩(wěn)定包含納米抗體或dAbs、優(yōu)選納米抗體的多肽的方法，所述方法包括以下 步驟a)檢查所述多肽的一級(jí)序列，和b)如果優(yōu)選地在⑶R環(huán)中，優(yōu)選地在⑶R2和/或 ⑶R3環(huán)，更優(yōu)選地在⑶R3環(huán)中鑒定到DS，DG, NG或NS氨基酸基序，則生成突變體的文庫(kù)， 其中每個(gè)突變體中至少一個(gè)已鑒定的氨基酸基序被選自由DQ，DE, DT, DA, NT和NA組成的 組中的氨基酸基序替換，以及c)篩選單個(gè)突變體的改善的穩(wěn)定性，其中當(dāng)在指定條件下的 時(shí)間段與野生型蛋白相比延長(zhǎng)時(shí)，所有這些突變體被認(rèn)為具有改善的穩(wěn)定性，在所述條件 下在有效的分離測(cè)定中可觀察到除蛋白主峰以外的另外的大峰(有效=能夠分開(kāi)野生型 蛋白和其中至少一個(gè)D或N被異構(gòu)化的蛋白)。46.穩(wěn)定包含納米抗體或dAbs、優(yōu)選納米抗體的多肽的方法，所述方法包括以下 步驟a)檢查所述多肽的一級(jí)序列，和b)如果優(yōu)選地在⑶R環(huán)中，優(yōu)選地在⑶R2和/或 ⑶R3環(huán)，更優(yōu)選地在⑶R3環(huán)中鑒定到DS，DG, NG或NS氨基酸基序，則生成突變體的文庫(kù)， 其中每個(gè)突變體中至少一個(gè)已鑒定的氨基酸基序被選自由DQ，DE, DT, DA, NT和NA組成的 組中的氨基酸基序替換，以及c)篩選單個(gè)突變體的改善的穩(wěn)定性，其中當(dāng)在例如，25°C以 上或37°C的較高溫度下保存的所述突變體的時(shí)間段與野生型蛋白相比延長(zhǎng)時(shí)，所有這些突 變體被認(rèn)為具有改善的穩(wěn)定性，所述突變體在有效的分離測(cè)定中觀察到除蛋白主峰以外的 另外的大峰(=代表例如大于蛋白主峰的10或5%的峰)。47.根據(jù)方面44-46任一方面的穩(wěn)定包含納米抗體或dAbs、優(yōu)選納米抗體的多肽 的方法，其中所述已鑒定的氨基酸基序被選自由DQ或DE組成的組中的氨基酸基序，優(yōu)選DE 替換。48.穩(wěn)定包含納米抗體或dAbs、優(yōu)選納米抗體的多肽的方法，所述方法包括以下 步驟a)檢查所述多肽的一級(jí)序列，和b)如果優(yōu)選地在⑶R環(huán)中，優(yōu)選地在⑶R2和/或 ⑶R3環(huán)，更優(yōu)選地在⑶R3環(huán)中鑒定到DS，DG, NG或NS氨基酸基序，則生成突變體的文庫(kù)， 其中每個(gè)突變體中至少一個(gè)已鑒定的氨基酸基序被選自由DQ，DE, DT, DA, NT和NA組成的 組中的氨基酸基序替換，以及c)檢查任意一個(gè)M是否對(duì)氧化作用，例如強(qiáng)制氧化敏感，并且 如果是，則通過(guò)用例如，T，V，L，A，K，G，I，優(yōu)選T，L或A，更優(yōu)選A替換；和任選地d)如果存在N-末端E，用例如D替換N-末端E ；以及e)篩選單個(gè)突變體的改善的穩(wěn)定性。49.將包含至少一個(gè)DS，DG, NG或NS氨基酸基序的蛋白修飾為另一蛋白的方法， 其中所述DS，DG，NG或NS氨基酸基序的至少一個(gè)被選自由DQ或DE組成的組中的氨基酸基
序替換。50.將蛋白，其中a)所述蛋白包含至少一個(gè)DS，DG, NG或NS氨基酸基序和b)所 述DS，DG，NG或NS氨基酸基序已知在所述蛋白的活性位點(diǎn)內(nèi)，修飾為另一蛋白的方法，其中 所述DS，DG, NG或NS氨基酸基序的至少一個(gè)被選自由DQ，DE, DT, DA, NT和NA組成的組中
的氨基酸基序替換。
51.由方面49或方面50的方法產(chǎn)生的突變蛋白的文庫(kù)。52.根據(jù)方面51的突變蛋白的文庫(kù)，其中完成了在已鑒定的DS，DG，NG或NS氨基 酸基序中的所有可能的替換。53.根據(jù)方面51的突變蛋白的文庫(kù)，其中完成了在已鑒定的DS，DG，NG或NS氨基 酸基序中的僅某些替換，例如，僅DQ或DE，優(yōu)選DE。54.穩(wěn)定蛋白的方法，其包括以下步驟a)檢查所述蛋白的一級(jí)序列，和b)如果鑒 定到DS，DG，NG或NS氨基酸基序，則生成突變體的文庫(kù)，其中每個(gè)突變體中至少一個(gè)已鑒定 的氨基酸基序被選自由DQ，DE, DT, DA, NT和NA組成的組中的氨基酸基序替換，以及c)篩 選單個(gè)突變體的改善的穩(wěn)定性。55.穩(wěn)定蛋白的方法，其包括以下步驟a)檢查所述蛋白的一級(jí)序列，和b)如果鑒 定到DS，DG，NG或NS氨基酸基序，則生成突變體的文庫(kù)，其中每個(gè)突變體中至少一個(gè)已鑒定 的氨基酸基序被選自由DQ，DE, DT, DA, NT和NA組成的組中的氨基酸基序替換，以及c)篩 選單個(gè)突變體的改善的穩(wěn)定性，其中當(dāng)在指定條件下的時(shí)間段與野生型蛋白相比延長(zhǎng)時(shí)， 所有這些突變體被認(rèn)為具有改善的穩(wěn)定性，在所述條件下在有效的分離測(cè)定中可觀察到除 蛋白主峰以外的另外的大峰(有效=能夠分開(kāi)野生型蛋白和其中至少一個(gè)D或N被異構(gòu)化 的蛋白)。56.穩(wěn)定蛋白的方法，其包括以下步驟a)在穩(wěn)定性試驗(yàn)中檢查與參考化合物，例 如具有相對(duì)穩(wěn)定的RPC的SEQ ID NO 21多肽相比，序列是否具有改變的RPC譜型，和b)如 果觀察到改變，開(kāi)始生成突變體的文庫(kù)，其中已鑒定的可能不穩(wěn)定的氨基酸來(lái)源被其他氨
基酸替換。57.穩(wěn)定蛋白的方法，其包括以下步驟a)檢查所述蛋白的一級(jí)序列，和b)如果鑒 定到DS，DG，NG或NS氨基酸基序，則生成突變體的文庫(kù)，其中每個(gè)突變體中至少一個(gè)已鑒定 的氨基酸基序被選自由XS或XG組成的組中的氨基酸基序替換，其中X是除D或N以外的 任何其他氨基酸，優(yōu)選X是Q或E，以及c)篩選單個(gè)突變體的改善的穩(wěn)定性，其中如果與要 被穩(wěn)定的原始蛋白相比，檢測(cè)到所述突變體的第一降解產(chǎn)物的時(shí)間段延長(zhǎng)，則所有這些突 變體被認(rèn)為具有改善的穩(wěn)定性。58.穩(wěn)定蛋白的方法，其包括以下步驟a)檢查所述蛋白的一級(jí)序列，和b)如果鑒 定到DS，DG，NG或NS氨基酸基序，則生成突變體的文庫(kù)，其中每個(gè)突變體中至少一個(gè)已鑒定 的氨基酸基序被選自由NX或DX組成的組中的氨基酸基序替換，其中X是除G或S以外的 任何其他氨基酸，優(yōu)選X是A或T，以及c)篩選單個(gè)突變體的改善的穩(wěn)定性，其中如果與要 被穩(wěn)定的原始蛋白相比，檢測(cè)到所述突變體的第一降解產(chǎn)物的時(shí)間段延長(zhǎng)，則所有這些突 變體被認(rèn)為具有改善的穩(wěn)定性。59.將在任一⑶R區(qū)內(nèi)包含至少一個(gè)DS，DG，NG或NS氨基酸基序的單可變結(jié)構(gòu)域 修飾為另一單可變結(jié)構(gòu)域的方法，其中所述DS，DG, NG或NS氨基酸基序的至少一個(gè)被選自 由XS或XG組成的組中的氨基酸基序替換，其中X是除D或N以外的任何其他氨基酸，優(yōu)選 X是Q或E。60.修飾包含至少一個(gè)DS，DG, NG或NS氨基酸基序的單可變結(jié)構(gòu)域的方法，所述 氨基酸基序在較高的溫度下在延長(zhǎng)的時(shí)間段內(nèi)異構(gòu)化，例如，在高于25°C，例如37°C的較 高溫度下，在例如多于1，2，3或4周的時(shí)段內(nèi)異構(gòu)化，并且其中所述單可變結(jié)構(gòu)域要被修飾為另一單可變結(jié)構(gòu)域，其中至少一個(gè)異構(gòu)化的DS，DG, NG或NS氨基酸基序被選自由XS或 XG組成的組中的氨基酸基序替換，其中X是除D或N以外的任何其他氨基酸，優(yōu)選X是Q或
E061.如上所述的修飾包含至少一個(gè)DS，DG, NG或NS氨基酸基序的蛋白，多肽或單 可變結(jié)構(gòu)域的方法，其包括以下步驟當(dāng)所述單可變結(jié)構(gòu)域在較高的溫度下在延長(zhǎng)的時(shí)間 段內(nèi)保存時(shí)，例如，在37°C下在4周的時(shí)段內(nèi)保存時(shí)，檢查所述突變的單可變結(jié)構(gòu)域的RPC 譜型是否改變。62.根據(jù)方面54-61的方法，其中所述修飾的蛋白、多肽或單可變結(jié)構(gòu)域與特定靶 分子的解離常數(shù)等于或低于ΙΟΟηΜ，優(yōu)選ΙΟηΜ，更優(yōu)選InM，更優(yōu)選0. InM。63.根據(jù)方面54-61的方法，其中所述修飾的蛋白、多肽或單可變結(jié)構(gòu)域與特定靶 分子的解離常數(shù)仍然與未修飾的親代或野生型單可變結(jié)構(gòu)域基本上相同。64.根據(jù)方面54-61的方法，其中所述修飾的蛋白、多肽或單可變結(jié)構(gòu)域與特定靶 分子的解離常數(shù)不超過(guò)ΙΟηΜ。65.根據(jù)方面54-61的方法，其中所述修飾的蛋白、多肽或單可變結(jié)構(gòu)域與特定靶 分子的解離常數(shù)不超過(guò)InM。66.根據(jù)方面54-61的方法，其中所述修飾的蛋白、多肽或單可變結(jié)構(gòu)域與特定靶 分子的解離常數(shù)不超過(guò)0. InM。67.根據(jù)方面54-61的方法，其中所述蛋白、多肽或單可變結(jié)構(gòu)域包括單納米抗 體、結(jié)構(gòu)域抗體、單結(jié)構(gòu)域抗體或“dAb”，優(yōu)選納米抗體，或基本上由其組成。68.根據(jù)方面54-61的方法，其中所述蛋白、多肽或單可變結(jié)構(gòu)域包括至少兩個(gè)納 米抗體、結(jié)構(gòu)域抗體、單結(jié)構(gòu)域抗體或“ dAb ”，優(yōu)選納米抗體，或基本上由其組成。69.根據(jù)方面54-61的方法，其中所述蛋白、多肽或單可變結(jié)構(gòu)域包括至少一個(gè)針 對(duì)一種表位、抗原、靶標(biāo)、蛋白或多肽的納米抗體、結(jié)構(gòu)域抗體、單結(jié)構(gòu)域抗體或“dAb”以及 至少一個(gè)針對(duì)另一種表位、抗原、靶標(biāo)、蛋白或多肽的其他的納米抗體、結(jié)構(gòu)域抗體、單結(jié)構(gòu) 域抗體或“ dAb ”，或基本上由其組成。70.制備蛋白、多肽或單可變結(jié)構(gòu)域(例如，納米抗體)的文庫(kù)的方法，所述文庫(kù)缺 少包含對(duì)異構(gòu)化敏感的DS，DG, NG或NS基序的蛋白、多肽或單可變結(jié)構(gòu)域。71.改變蛋白、多肽或單可變結(jié)構(gòu)域(例如，納米抗體)的文庫(kù)的方法，使得所述文 庫(kù)缺少包含對(duì)異構(gòu)化敏感的DS，DG, NG或NS基序的蛋白、多肽或單可變結(jié)構(gòu)域。72.修飾包含對(duì)異構(gòu)化敏感的DS，DG, NG或NS基序的蛋白、多肽或單可變結(jié)構(gòu)域 (例如，納米抗體)的方法，其中所述基序改變?yōu)椴缓蠨或N，但含有例如Q或E的基序。73.制備核苷酸序列的方法，其包括以下步驟a.提供編碼包含至少一個(gè)納米抗體或dAb，優(yōu)選至少納米抗體的任意一種上述多 肽的核苷酸序列，所述多肽在⑶R區(qū)中，優(yōu)選地在⑶R2和/或⑶R3區(qū)，更優(yōu)選地在⑶R3區(qū) 中具有至少一個(gè)DS，DG，NG或NS基序，或在具有接近不穩(wěn)定的N或D的H-供體基團(tuán)的表面 暴露區(qū)中具有至少一個(gè)DS，DG, NG或NS基序；和b.生成突變的核苷酸序列的文庫(kù)，其中編碼所述DS，DG，NG或NS基序的D或N的 序列被改變?yōu)榫幋aD或N以外的氨基酸的核苷酸序列。74.制備核苷酸序列的方法，其包括以下步驟
79
a.提供編碼包含至少一個(gè)納米抗體或dAb、優(yōu)選至少納米抗體的任意一終上述多 肽的核苷酸序列，所述多肽在⑶R區(qū)中，優(yōu)選地在⑶R2和/或⑶R3區(qū)，更優(yōu)選地在⑶R3區(qū) 中具有至少一個(gè)DS，DG，NG或NS基序，或在具有接近不穩(wěn)定的N或D的H-供體基團(tuán)的表面 暴露區(qū)中具有至少一個(gè)DS，DG, NG或NS基序；和b.生成突變的核苷酸序列的文庫(kù)，其中編碼所述DS，DG，NG或NS基序的D或N的 序列被改變?yōu)榫幋aD或N以外的氨基酸的核苷酸序列；和c.其中所述突變的序列的至少一個(gè)編碼包含至少一個(gè)納米抗體或dAb、優(yōu)選至少 納米抗體的突變的多肽，所述突變的多肽具有與野生型多肽基本上相同的對(duì)靶分子的親和 性。75.制備核苷酸序列的方法，其包括以下步驟a.提供編碼包含至少一個(gè)納米抗體或dAb、優(yōu)選至少納米抗體的任意一種上述多 肽的核苷酸序列，所述多肽在⑶R區(qū)中，優(yōu)選地在⑶R2和/或⑶R3區(qū)，更優(yōu)選地在⑶R3區(qū) 中具有至少一個(gè)DS，DG，NG或NS基序，或在具有接近不穩(wěn)定的N或D的H-供體基團(tuán)的表面 暴露區(qū)中具有至少一個(gè)DS，DG, NG或NS基序；和b.生成突變的核苷酸序列的文庫(kù)，其中編碼所述DS，DG，NG或NS基序的D或N的 序列被改變?yōu)榫幋aD或N以外的氨基酸的核苷酸序列；和c.其中所述突變的序列的至少一個(gè)編碼包含至少一個(gè)納米抗體或dAb、優(yōu)選至少 納米抗體的突變的多肽，所述突變的多肽與其靶分子的解離常數(shù)等于或低于ΙΟΟηΜ，優(yōu)選 IOnM,更優(yōu)選InM，更優(yōu)選ΙΟΟρΜ，更優(yōu)選ΙΟρΜ，更優(yōu)選ΙρΜ。76.制備核苷酸序列的方法，其包括以下步驟a.提供編碼包含至少一個(gè)納米抗體或dAb、優(yōu)選至少納米抗體的任意一種上述多 肽的核苷酸序列，所述多肽在⑶R區(qū)中，優(yōu)選地在⑶R2和/或⑶R3區(qū)，更優(yōu)選地在⑶R3區(qū) 中具有至少一個(gè)DS，DG，NG或NS基序，或在具有接近不穩(wěn)定的N或D的H-供體基團(tuán)的表面 暴露區(qū)中具有至少一個(gè)DS，DG, NG或NS基序；和b.生成突變的核苷酸序列的文庫(kù)，其中編碼所述DS，DG，NG或NS基序的D或N的 序列被改變?yōu)榫幋a選自由Q和E組成的組的氨基酸的核苷酸序列。77.制備核苷酸序列的方法，包括以下步驟a.提供編碼包含至少一個(gè)納米抗體或dAb、優(yōu)選至少納米抗體的任意一種上述多 肽的核苷酸序列，所述多肽在⑶R區(qū)中，優(yōu)選地在⑶R2和/或⑶R3區(qū)，更優(yōu)選地在⑶R3區(qū) 中具有DS，DG，NG或NS基序，或在具有接近不穩(wěn)定的N或D的H-供體基團(tuán)的表面暴露區(qū)中 具有DS, DG, NG或NS基序；和b.生成突變的核苷酸序列的文庫(kù)，其中編碼所述DS，DG，NG或NS基序的D或N的 序列被改變?yōu)榫幋a選自由Q和E組成的組的氨基酸的核苷酸序列；和c.其中所述突變的序列的至少一個(gè)編碼包含至少一個(gè)納米抗體或dAb、優(yōu)選至少 納米抗體的突變的多肽，所述突變的多肽具有與野生型多肽基本上相同的對(duì)靶分子的親和 性。78.制備核苷酸序列的方法，包括以下步驟a.提供編碼包含至少一個(gè)納米抗體或dAb、優(yōu)選至少納米抗體的任意一種上述多 肽的核苷酸序列，所述多肽在⑶R區(qū)中，優(yōu)選地在⑶R2和/或⑶R3區(qū)，更優(yōu)選地在⑶R3區(qū)中具有DS，DG，NG或NS基序，或在具有接近不穩(wěn)定的N或D的H-供體基團(tuán)的表面暴露區(qū)中 具有DS, DG, NG或NS基序；和b.生成突變的核苷酸序列的文庫(kù)，其中編碼所述DS，DG，NG或NS基序的D或N的 序列被改變?yōu)榫幋a選自由Q和E組成的組的氨基酸的核苷酸序列；和c.其中所述突變的序列的至少一個(gè)編碼包含至少一個(gè)納米抗體或dAb、優(yōu)選至少 納米抗體的突變的多肽，所述突變的多肽與其靶分子的解離常數(shù)等于或低于ΙΟΟηΜ，優(yōu)選 IOnM,更優(yōu)選InM，更優(yōu)選ΙΟΟρΜ，更優(yōu)選ΙΟρΜ，更優(yōu)選ΙρΜ。79.根據(jù)方面73-78的制備核苷酸序列的方法，其中所述⑶R區(qū)是⑶R1，⑶R2或 CDR3 區(qū)。80.根據(jù)方面73-78的制備核苷酸序列的方法，其中所述⑶R區(qū)是⑶R2或⑶R3區(qū)。81.根據(jù)方面73-78的制備核苷酸序列的方法，其中所述⑶R區(qū)是⑶R3區(qū)。82.制備核苷酸序列的方法，其包括以下步驟提供編碼包含至少一個(gè)納米抗體 或dAb、優(yōu)選至少納米抗體的多肽的核苷酸序列，所述多肽在CDR區(qū)中，優(yōu)選地在CDR2和/ 或⑶R3區(qū)，更優(yōu)選地在⑶R3區(qū)中沒(méi)有DS，DG，NG或NS基序，或在具有接近不穩(wěn)定的N或D 的H-供體基團(tuán)的表面暴露區(qū)中沒(méi)有DS，DG, NG或NS基序。83.鑒定多肽、其功能衍生物或片段中的修飾作用的方法，所述多肽包含至少一個(gè) 單可變結(jié)構(gòu)域，例如納米抗體或dAbs，優(yōu)選納米抗體，所述方法包括使用反相-HPLC分析的步驟。84.包含選自由 SEQ ID NO :3 至 SEQ ID NO 18 ；SEQ ID N0:25 禾口 SEQ IDNO 26 組 成的組的多肽的氨基酸序列。85.包含選自由 SEQ ID NO 15 ；SEQ ID NO 25 和 SEQ ID NO 26 組成的組的多肽
的氨基酸序列。86.包含具有SEQ ID NO 15的多肽的氨基酸序列。87.選自由 SEQ ID NO 3 至 SEQ ID NO 18 ；SEQ ID NO 25 和 SEQ ID NO 26 組成 的組的多肽。88.由 SEQ ID N0:15 組成的多肽。89.選自由 SEQ ID NO 15 ；SEQ ID NO 25 和 SEQ ID NO 26 組成的組的多肽。90.編碼實(shí)施方案81-86的多肽的核苷酸。91.編碼實(shí)施方案82或?qū)嵤┓桨?6的多肽的核苷酸。92.編碼實(shí)施方案83或?qū)嵤┓桨?5的多肽的核苷酸。93.包含方面90-92的核苷酸的宿主細(xì)胞。94. 一種修飾包含對(duì)異構(gòu)化敏感的DS，DG, NG或NS氨基酸基序的蛋白、多肽或單 可變結(jié)構(gòu)域(例如，納米抗體)的方法，其中所述基序被改變?yōu)椴缓蠨或N，但含有例如Q 或E的基序。95. 一種修飾包含對(duì)氧化作用敏感的M氨基酸基序的蛋白、多肽或單可變結(jié)構(gòu)域 (例如，納米抗體)的方法，其中所述基序被改變?yōu)椴缓蠱,但含有例如T或A的基序。96. 一種修飾在1位處包含對(duì)焦谷氨酸形成或脫酰胺作用敏感的Q或E氨基酸基 序的蛋白、多肽或單可變結(jié)構(gòu)域(例如，納米抗體)的方法，其中所述基序被改變?yōu)椴缓?br> 81Q或E，但含有例如D的基序。
權(quán)利要求
一種在適當(dāng)?shù)纳矬w中通過(guò)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化而制備具有改善的穩(wěn)定性的多肽序列、其功能衍生物或片段的方法，所述多肽包括至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域，所述表達(dá)載體包含能夠產(chǎn)生所述多肽的重組基因，所述方法包括以下的步驟a)如果存在N 末端E(E1)或N 末端Q(Q1)，則用另一個(gè)天然存在的氨基酸替換所述N 末端E(E1)或N 末端Q(Q1)；和/或b)如果存在至少一個(gè)易于氧化的M，用另一個(gè)天然存在的氨基酸替換所述至少一個(gè)易于氧化的M；和/或c)如果存在至少一個(gè)易于異構(gòu)化的N或D，用另一個(gè)天然存在的氨基酸替換所述至少一個(gè)易于異構(gòu)化的N或D。
2.一種制備具有改善的化學(xué)穩(wěn)定性的多肽序列的方法，其中所述方法包括以下步驟a.從親代多肽生成突變的多肽序列、其功能衍生物或片段的文庫(kù)，其中所述的親代多 肽包括至少一個(gè)單可變結(jié)構(gòu)域，并且其中所述親代多肽在⑶R區(qū)中具有DS，DG，NG或NS基 序，或在具有接近不穩(wěn)定的N或D的H-供體基團(tuán)的表面暴露區(qū)中具有DS，DG，NG或NS基 序，并且其中一些所述突變多肽序列的氨基酸序列以下列的方式被改變i.如果存在N-末端E(E1)或N-末端Q (Q1)，用D替換所述N-末端E (E1)或N-末端 Q(Q1)；和 / 或ii.如果存在至少一個(gè)易于氧化的M，用A或T替換所述至少一個(gè)易于氧化的M；和/或iii.如果存在所述DS，DG，NG或NS基序的D或N，用Q或E替換所述DS，DG，NG或NS 基序的D或N;b.和篩選所述已生成的文庫(kù)的具有高親和性或抗體親抗原性的多肽序列；c.和任選地選擇一個(gè)或幾個(gè)具有所述高親和性或抗體親抗原性的突變多肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述DS，DG，NG或NS基序在CDR區(qū)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述DS，DG，NG或NS基序在CDR2或CDR3區(qū)中。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述DS，DG，NG或NS基序在CDR3區(qū)中。
6.根據(jù)權(quán)利要求2，3，4或5所述的方法，其中所述高親和性或抗體親抗原性表示為與 其靶分子的解離常數(shù)，并且所述解離常數(shù)等于或小于lOOnM。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述解離常數(shù)等于或小于lOnM。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述解離常數(shù)等于或小于InM。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述多肽基本上由納米抗體或其構(gòu) 建體組成。
10.突變體文庫(kù)，其由根據(jù)權(quán)利要求1-9所述的任意一種方法生成。
11.核苷酸，其用于根據(jù)權(quán)利要求1-9所述的任意一種方法以生成突變體。
12.包含權(quán)利要求11所述的核苷酸的宿主細(xì)胞。
13.包括權(quán)利要求10所述的突變體文庫(kù)的篩選方法。
14.一種選自由SEQ ID N0:25和SEQ ID NO :26組成的組的多肽。
15.一種選自由SEQ ID N0:33和SEQ ID NO :34組成的組的核苷酸序列。
16.一種由權(quán)利要求8所述的核苷酸序列編碼的多肽。
全文摘要
修飾且特別是穩(wěn)定蛋白和多肽的方法，通過(guò)該方法將預(yù)先確定的氨基酸引入至所述蛋白或多肽的選擇位置中以產(chǎn)生一小組突變體。該方法基于以下的前提，即，某些氨基酸在蛋白或多肽的穩(wěn)定性方面具有關(guān)鍵的作用。然后可以進(jìn)一步分析生成的突變體的穩(wěn)定性和/或功能，例如，親和性。此外，可以組合適當(dāng)?shù)耐蛔凅w，以產(chǎn)生進(jìn)一步優(yōu)化的蛋白或多肽。另外，提供了被穩(wěn)定的實(shí)例多肽和適當(dāng)?shù)蔫b定和/或分析去穩(wěn)定或穩(wěn)定的蛋白或多肽的方法。該方法可用來(lái)研究特定氨基酸在蛋白結(jié)構(gòu)和功能中的作用，和用來(lái)開(kāi)發(fā)新的或改善的，例如穩(wěn)定的蛋白和多肽諸如抗體和單可變結(jié)構(gòu)域。
文檔編號(hào)C07K14/00GK101932593SQ200980103486
公開(kāi)日2010年12月29日 申請(qǐng)日期2009年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月29日
發(fā)明者帕特里克·斯坦森斯, 讓-呂克·若尼奧, 馬克·約瑟夫·勞韋里斯 申請(qǐng)人:埃博靈克斯股份有限公司