專利名稱：抗軟骨退變的抗原結(jié)合多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗軟骨退變的藥劑。
背景技術(shù)：
關(guān)節(jié)軟骨由包埋在細(xì)胞外基質(zhì)中的軟骨細(xì)胞組成。所述基質(zhì)主要由水組成并且還 包含I I型膠原和聚集蛋白聚糖(一種軟骨特異性蛋白聚糖)。膠原部分賦予軟骨以抗張 強(qiáng)度(tensile strength)，而蛋白聚糖部分吸收水分，從而提供抗擠壓和分配負(fù)荷的能力。在許多病狀(其中有骨性關(guān)節(jié)炎(OA))中觀察到軟骨退變。退變由許多細(xì)胞因 子、生長因子和蛋白酶驅(qū)動。最初，可在關(guān)節(jié)表面上觀察到以導(dǎo)致裂縫出現(xiàn)的原纖維變性 (fibrillation)的形式表現(xiàn)的退變。然后，觀察到軟骨厚度的漸進(jìn)損失，這是由蛋白聚 糖-透明質(zhì)酸復(fù)合物的過度分解代謝引起的。退變由金屬蛋白酶例如糖苷酶和己糖胺酶催 化(參見例如US2007197471)。最后，膠原網(wǎng)絡(luò)被攻擊?？捎^察到正反饋回路，其中基質(zhì)分子 的降解產(chǎn)物刺激降解。針對提及的反饋回路的細(xì)胞響應(yīng)牽涉已知誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶的表 達(dá)的細(xì)胞因子例如IL-1和TNFa的產(chǎn)生(參見Goldring 2000, Arthritis & Rheumatism 第 43 卷 ppl916-1926 ；Kobayashi, M.等人(2005) :Role of Interleukin-landTumor Necrosis Factor a in matrix degradation of humanosteoarthritic cartilage. Arthritis & Rheumatism，第 52 卷(l)，pp. 128-135 ；和 Gerwin，N.等人(2006), Adv. Drug Delivery Rev. 58，pp.226—242)。Kobayashi，M.等人(2005)在體外顯示IL-1和/或TNF a的抑制阻止了 OA軟骨 中II型膠原和蛋白聚糖的降解(參見Kobayashi，M.等人(2005) :Role of Interleukin-1 and Tumor Necrosis Factor a inmatrix degradation of human osteoarthritic cartilage. Arthritis& Rheumatism，第 52 卷(1)，pp. 128-135)。因此認(rèn)為，退變的調(diào)控和 細(xì)胞外基質(zhì)的降解可導(dǎo)致關(guān)節(jié)疾病的治療(參見EP1547617)。0A，也稱為退行性關(guān)節(jié)炎，是歐洲、美國和日本最常見類型的關(guān)節(jié)炎和殘疾的首 要原因，據(jù)估計(jì)存在36-48 %的群體流行率。由于老年人的比例日益增加以及0A的其他 危險因素(例如，肥胖癥和懶散的生活方式)的日益增加的發(fā)生率，預(yù)期所述數(shù)量將增加 (Gerwin, N.等人(2006)，Adv. Drug Delivery Rev. 58，pp. 226-242)。盡管對有效的 OA 治 療存在日益增加的需要，但目前的療法只可治療體征和癥狀，即疼痛的減輕，但不能治療關(guān) 節(jié)軟骨的根本結(jié)構(gòu)變化。目前的療法包括簡單的鎮(zhèn)痛藥、非留體類消炎藥或關(guān)節(jié)內(nèi)注射的 糖皮質(zhì)激素和透明質(zhì)酸制劑的施用。因此，存在對治療0A的巨大的未滿足的醫(yī)療需要。使軟骨退變的治療更復(fù)雜的一個因素是，關(guān)節(jié)軟骨是無血管和無淋巴的；因 此，分子，例如營養(yǎng)物或藥物，必須能夠通過致密的軟骨基質(zhì)從滑液擴(kuò)散至到達(dá)軟骨細(xì)胞 (Gerwin, N.等人(2006), Adv. Drug Delivery Rev. 58，pp. 226-242)。已研究了溶質(zhì)，特別 是大分子(其中有IgG抗體)通過軟骨的滲透性(Maroudas A.，(1976)，J. Anat. 122(2)， pp. 335-347)。發(fā)現(xiàn)隨著溶質(zhì)的大小增加，分配系數(shù)急劇下降；因而，較大分子的穿過受 到基質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的孔徑大小限制，從而，強(qiáng)烈依賴于糖胺聚糖的局部濃度。關(guān)于不同大小和不
3同pi的蛋白質(zhì)在關(guān)節(jié)軟骨中的滲透和駐留的另外的工作已由van Lent和同事進(jìn)行。他 們發(fā)現(xiàn)，與陰離子蛋白相比較，陽離子蛋白在關(guān)節(jié)軟骨中的滲透和駐留要顯著得多(van Lent, P. L. E. M.等人(1987)，J. Rheumatol. 14 (4)，pp. 798-805)。由 vant Lent 等人進(jìn) 行的小鼠體內(nèi)研究很大程度上確認(rèn)了他的早期發(fā)現(xiàn)(van Lent, P. L. E. M.等人(1989)， J. Rheumatol. 16(10)，pp. 1295-1303)。他發(fā)現(xiàn)，特定蛋白質(zhì)越小并且陽離子性程度越高 (高Pl)，軟骨滲透就越好。在另一方面，對于大的陽離子性蛋白質(zhì)，軟骨駐留最明顯，這 表明此類蛋白質(zhì)有效地結(jié)合帶負(fù)電荷的軟骨成分糖胺聚糖(GAG)，然而通過小的陽離子 性蛋白進(jìn)行的軟骨結(jié)合效率要低得多。發(fā)現(xiàn)體外高度陽離子性蛋白的軟骨滲透的上限為 240kDa至440kDa。下列實(shí)例指示了軟骨滲透的pi的重要性。測試具有不同pi值的IgG 抗體(150kDa)的3個不同形式。pi為9. 0的經(jīng)工程改造的IgG變體深深地滲透入軟骨， 而對Pi值為7. 0-8. 0的天然IgG未檢測到滲透；對pi為4. 5的第三變體不再檢測。對 于BSA(67kDa)，pi 8. 5-9. 0的變體導(dǎo)致軟骨的深度滲透，pI7. 0-8. 0的變體駐留在軟骨 表面，天然的pi為4. 5的變體不顯示任何可檢測信號(van Lent, P. L. E. M.等人(1987)， J. Rheumatol. 14(4)，pp. 798—805)。本發(fā)明的公開內(nèi)容因此，本發(fā)明的一個目的是提供抗軟骨降解，特別地用于治療骨關(guān)節(jié)炎的藥劑。本發(fā)明提供了用于軟骨退變和與其相關(guān)的任何病癥的治療、預(yù)防和/或進(jìn)展的延 遲的抗原結(jié)合多肽，其中所述多肽能夠滲入軟骨。已令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，特異性抗原結(jié)合多肽，特別是單鏈抗體，能夠以有效地方式滲 入軟骨，在軟骨中它們可結(jié)合軟骨基質(zhì)中的靶蛋白，例如細(xì)胞因子、細(xì)胞因子受體或金屬蛋 白酶。在結(jié)合靶分子后，可在它們的產(chǎn)生部位阻斷它們的生物學(xué)功能，從而可減少和/或抑 制軟骨退變。因此，本發(fā)明的多肽能夠以直接的方式作用于特定靶分子。通過向多肽中加 入正電荷，可增加在軟骨內(nèi)的駐留時間，從而允許與靶蛋白進(jìn)行更長時間的接觸。此外，由于更大的分子不能滲透軟骨基質(zhì)，因此與更大的蛋白質(zhì)分子相比較，本發(fā) 明的藥劑在施用后可獲得更大體積的分配。本發(fā)明還提供了所述抗原結(jié)合多肽用于軟骨退變，特別是骨關(guān)節(jié)炎的治療、預(yù)防 和/或進(jìn)展的延遲的用途。本文中公開的抗原結(jié)合多肽還可用于軟骨退變的體外診斷劑和/或體內(nèi)診斷劑。此外，本發(fā)明包括含有本文中公開的抗原結(jié)合多肽的組合物和所述組合物用于軟 骨退變和與其相關(guān)的任何病癥(特別是骨關(guān)節(jié)炎)的治療、預(yù)防和/或進(jìn)展的延遲的用途。在另一個實(shí)施方案中，提供了用于治療軟骨退變的方法，其中局部施用，特別地通 過關(guān)節(jié)內(nèi)施用來施用抗原結(jié)合多肽。附圖概述當(dāng)考慮下列其詳細(xì)描述時，將更好地理解本發(fā)明并且除了上文所示的目的外的目 的將變得顯然。此類描述參考附圖，其中

圖1 體外軟骨滲透實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)裝置的示意圖。描述下列組件泵(1)，試管系統(tǒng)， 箭頭指示流動方向(2)，緩沖液池(3)，具有裝有FITC標(biāo)記探針的貯液池(4)和通流室 (flow through chamber) (5)的擴(kuò)散室，被夾至滲透室(6)的軟骨(關(guān)節(jié)表面向上(朝向探 針貯液池))。大箭頭指示FITC標(biāo)記分子滲透入和穿過軟骨。
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圖2:稀釋(1 2,1 4,1 8,1 16)用于軟骨滲透的FITC標(biāo)記蛋白，并將所 述蛋白點(diǎn)在載玻片上以在紫外光下測定信號強(qiáng)度。圖3 通過在紫外光下拍攝的軟骨切片的圖像顯示在指定的時期后esba105-fitc 和英夫利昔單抗(Remi cade ) -fitc至軟骨內(nèi)的滲透.圖4 在用FITC-標(biāo)記的TNF- a抑制劑溫育后在離牛軟骨的頂部表面確定的距離 處的熒光強(qiáng)度。圖5 在以大約lOOOmcg/動物的劑量水平單次靜脈內(nèi)(A)或單次關(guān)節(jié)內(nèi)⑶施用 [125I]-ESBA105后，雄兔子的腿中放射性濃度的比較。注意，對于關(guān)節(jié)內(nèi)給藥后的關(guān)節(jié)軟骨， 在6小時的時間點(diǎn)未獲得定量的范圍內(nèi)的值。因此，對于該組織在圖中未劃出連續(xù)線。圖6 在靜脈內(nèi)和關(guān)節(jié)內(nèi)注射[125I]-ESBA105后，至膝關(guān)節(jié)組織的生物分布。在關(guān) 節(jié)內(nèi)(虛線)和靜脈內(nèi)(實(shí)線)注射后血漿中[125I]-ESBA105水平的時間進(jìn)程。圖7 從TNF-a誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡拯救L929小鼠成纖維細(xì)胞。將通過放線菌 素D的存在致敏的L929小鼠成纖維細(xì)胞暴露于不同濃度的ESBA105或英夫利昔單抗與 rhTNF-a (終濃度100pg/ml)的預(yù)溫育混合物。與英夫利昔單抗相似，ESBA105以劑量依賴 性的方式阻斷TNF-a的促凋亡效應(yīng)。ESBA105的效力與英夫利昔單抗幾乎完全相同，如分 別由12. 5ng/ml (對于ESBA105)和14. Ong/ml (對于英夫利昔單抗)的EC50值所確定的。圖8 大鼠單關(guān)節(jié)炎模型中關(guān)節(jié)內(nèi)ESBA105的抑制關(guān)節(jié)內(nèi)注射的ESBA105和英夫 利昔單抗分別對通過關(guān)節(jié)內(nèi)注射10 yg rhTNF-a誘導(dǎo)的急性單關(guān)節(jié)炎的抑制性潛能的比 較。評價了對關(guān)節(jié)腫脹(通過使用測徑器定量)、滑膜炎(HE染色；也參見B)和葡聚糖蛋 白損失(甲苯胺藍(lán)染色；也參見B)的作用。圖9 大鼠單關(guān)節(jié)炎模型中關(guān)節(jié)內(nèi)ESBA105的劑量響應(yīng)分別為ESBA105和英夫利 昔單抗的體內(nèi)劑量響應(yīng)。未顯示關(guān)于滑膜炎和蛋白聚糖損失的數(shù)據(jù)。圖10 在第5天，使用FW2. 3或20ug/ml或100ug/ml ESBA105處理的軟骨培養(yǎng)物 的上清液中MMP的活性。與同種型對照相比較，使用ESBA105治療人骨關(guān)節(jié)炎軟骨外植體 顯著降低了 MMP的活性。通過將對照條件(FW2. 3)設(shè)置為100%來分別標(biāo)準(zhǔn)化各患者的絕 對值。*P < 0. 05。在圖下面的表格行中給出了對于各培養(yǎng)條件MMP活性的絕對平均值。圖11 所有時間點(diǎn)的匯集培養(yǎng)基中的PGE2。ESBA105的兩個濃度都顯著降低軟骨 培養(yǎng)物的上清液中PGE2的水平。通過將對照條件(FW2. 3)設(shè)置為100%來分別標(biāo)準(zhǔn)化各患 者的絕對值。*p<0.05。在圖下面的表格行中給出了各培養(yǎng)條件中測量的PGE2水平的絕 對平均值。用于講行本發(fā)明的樽式下面將更詳細(xì)地描述本發(fā)明。要理解可隨意組合不同的實(shí)施方案、優(yōu)選方式和范 圍。此外，取決于特定的實(shí)施方案，選擇的定義、實(shí)施方案或范圍可能不適用。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，使用下列定義術(shù)語“抗原結(jié)合多肽”是指天然氨基酸或非天然氨基酸的聚合物特異性結(jié)合抗原 的能力。此類多肽包括對選擇的抗原具有足夠的結(jié)合能力的全長抗體的任何抗原結(jié)合片段 或單鏈。由本發(fā)明包括的抗原結(jié)合片段的實(shí)例包括Fab片段、F(ab' )2片段、Fd片段、Fv片 段；單結(jié)構(gòu)域或dab片段、分離互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)；兩個或更多個可任選地通過合成的連接 體連接的分離cdr和單鏈可變片段(scfv)的組合?！叭L抗體”包括嵌合抗體，其中將一個
5來源的抗原結(jié)合可變結(jié)構(gòu)域偶聯(lián)至不同來源的恒定結(jié)構(gòu)域，例如將鼠抗體的可變結(jié)構(gòu)域Fv 偶聯(lián)至人抗體的恒定結(jié)構(gòu)域Fc。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)獲得上文例舉的抗體 和抗體片段，以與對于完整抗體的方式相同的方式就有用性篩選片段。術(shù)語抗原結(jié)合多肽 還包括基于在本領(lǐng)域內(nèi)熟知的備選支架的抗原結(jié)合多肽，包括但不限于CTLA-4、淀粉酶抑 肽(tendamistat)、纖連蛋白(FN3)、新制癌菌素、CBM4-2、脂運(yùn)載蛋白、T細(xì)胞受體、蛋白A 結(jié)構(gòu)域(蛋白Z)、Im9、設(shè)計(jì)的錨蛋白重復(fù)序列蛋白(DARPin)、設(shè)計(jì)的IPR蛋白、鋅指pVIII、 禽類胰腺多肽、GCN4、ffff結(jié)構(gòu)域、Src同源結(jié)構(gòu)域3 (SH3)、Src同源結(jié)構(gòu)域2 (SH2)、PDZ結(jié)構(gòu) 域、TEM-I0-內(nèi)酰胺酶、GFP、硫氧還蛋白、葡萄球菌核酶、PHD-指、CI-2、BPT1 APPI、HPSTI、 大腸桿菌素(ecotin)、LACI-Dl、LDTI、MTI-II、蝎毒素、昆蟲防衛(wèi)素 A 肽、EETI-II、Min-23、 080、？8 、細(xì)胞色素13562、1^1受體結(jié)構(gòu)域A、晶狀體蛋白、泛素、轉(zhuǎn)移和C-型凝集素-樣 結(jié)構(gòu)域(參見Binz等人(2005 Oct) Nat Biotech23 (10) 1257-68)。在本文中公開的方法 和組合物的優(yōu)選實(shí)施方案中，抗原結(jié)合多肽是單鏈抗體?？墒褂弥亟M遺傳學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明的抗原結(jié)合多肽。已知多肽的序 列，可通過基因合成產(chǎn)生編碼它們的cDNA?？梢杂美绶派湫詷?biāo)記或用熒光劑標(biāo)記，或通過例如PEG化化學(xué)修飾本文中公開 的抗原結(jié)合多肽?？赏ㄟ^許多方法測量“軟骨退變”。在使用軟骨外植體培養(yǎng)物進(jìn)行的臨床前實(shí)驗(yàn) 中，可在應(yīng)用治療之前通過稱取外植體的重量，和通過測定釋放入培養(yǎng)基的糖胺聚糖(GAG) 的量和駐留在軟骨中的GAG含量來直接測量膠原和/或蛋白聚糖的損失。此外，特定細(xì)胞因 子例如IL-1和TNF a的表達(dá)特征譜可提供炎癥/分解代謝過程的指示。膠原分解可通過測 量釋放入培養(yǎng)基的膠原降解產(chǎn)物CTX-II來測定。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)表達(dá)或活性或前 列腺素E2(PGE2)濃度的測量是軟骨退變的間接指示劑。CTX-II還可用作人類軟骨退變的 生物標(biāo)志物。可利用商業(yè)試劑盒(例如CTX-II-Ur in (Cart iLapS )，Human from 0STE0 medical GmbH,Bunde,Germany)在尿中對其進(jìn)行測量。目前用于評價人類軟骨退變的標(biāo)準(zhǔn) 方法是X射線，然而可預(yù)見該方法將被磁共振成像(MRI)取代。MRI允許定量關(guān)節(jié)軟骨體積 和形態(tài)(Peterfy，CG等人(2006)0s teoarthritis andCartilage，第 14卷，pp A95-A1I1)。 抗原結(jié)合多肽的治療有效量是指治療、改善或預(yù)防疾病或病癥或展示可檢測的治療或預(yù)防 效果所需的量。術(shù)語“藥物制劑”是指可給受試者施用并且使抗原結(jié)合多肽的生物學(xué)活性保持明 確有效，以及不包含另外的有毒成分的制劑。藥學(xué)上可接受的賦形劑(媒介物、添加劑)是 可適度地給受試哺乳動物施用以提供有效劑量的使用的活性成分的賦形劑。在第一方面，本發(fā)明提供了用于軟骨退變的治療、預(yù)防和/或進(jìn)展的延遲的抗原 結(jié)合多肽，其中所述多肽能夠滲入軟骨。在優(yōu)選實(shí)施方案中，多肽是單鏈抗體?？梢岳缤ㄟ^利用實(shí)施例1中描述和圖3中顯示的實(shí)驗(yàn)裝置對軟骨外植體使用標(biāo) 記的抗原結(jié)合多肽來體外測量軟骨滲透。備選地，可利用放射性標(biāo)記的蛋白質(zhì)評價軟骨滲 透(參見，例如，van Lent, P. L. E. M.等人(1987)，J. Rheumatol. 14(4)，pp. 798-805)。放 射性標(biāo)記也適合用于體內(nèi)測定軟骨滲透，如實(shí)施例2或van Lent, P. L. E. M.等人(1989)， J. Rheumatol. 16 (10)，pp. 1295-1303 中描述的。
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在另外的優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)Atha和Ingham(1981)的方法測量的本發(fā)明的多 肽的溶解度是至少5mg/ml，更優(yōu)選至少10mg/ml，和最優(yōu)選至少20mg/ml。特別地，穩(wěn)定且可溶的抗體，優(yōu)選具有W0 03/097697中描述的穩(wěn)定和可溶性的構(gòu) 架的單鏈抗體是有利的，因?yàn)榭色@得高度濃縮的制劑；這樣，可使用較小的應(yīng)用體積。提及 的穩(wěn)定且可溶的抗體具有一個或多個下列特征-其在還原條件下是穩(wěn)定的，如在W001/48017中公開的酵母相互作用分析(所謂 的質(zhì)量對照系統(tǒng))中測量的，-在20°C至40°C，優(yōu)選在37°C在PBS中至少在1個月內(nèi)是穩(wěn)定的，優(yōu)選至少2個 月，最優(yōu)選至少6個月，-其在生理?xiàng)l件下保持單體狀態(tài)，-其在大于大約lmg/ml，優(yōu)選大于大約4mg/ml，更優(yōu)選大于大約10mg/ml，甚至更 優(yōu)選大于大約25mg/ml和最優(yōu)選大于大約50mg/ml的濃度在環(huán)境溫度在PBS中是可溶的，-其在鹽酸胍滴定中顯示了轉(zhuǎn)換中點(diǎn)(midpointof transition)為至少1. 5M，優(yōu) 選至少1. 75M，更優(yōu)選至少1. 9M，最優(yōu)選至少2M，即對變性具有抗性。在優(yōu)選實(shí)施方案中，多肽具有至少lOkDa并且低于50kDa的分子量。優(yōu)選，多肽具 有大約26-27kDa的分子量。此外，多肽優(yōu)選特異性結(jié)合細(xì)胞因子或細(xì)胞因子受體。更優(yōu)選所述細(xì)胞因子或 細(xì)胞因子受體是促炎性的。所述促炎細(xì)胞因子優(yōu)選是TNF a或白細(xì)胞介素，例如，IL-1或 IL-6，或特異于任何所列細(xì)胞因子的結(jié)合的任何細(xì)胞因子受體。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中， 多肽特異性結(jié)合軟骨蛋白聚糖降解酶。此類酶包括蛋白聚糖酶和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)。 通過靶分子的特異性結(jié)合，可調(diào)控和/或阻斷它們在軟骨退變中的生物活性。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，抗原結(jié)合多肽包含與SEQ. ID. No. 1具有至少90%的同 一性，更優(yōu)選至少95%的同一性和最優(yōu)選至少99%同一性的可變輕鏈VL ；和/或與SEQ. ID. No. 2具有至少90%的同一性，更優(yōu)選至少95%的同一性和最優(yōu)選至少99%的同一性的 可變重鏈VH。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，多肽具有與序列SEQ. ID. No. 3至少90%的同一性，更 優(yōu)選95%和最優(yōu)選100%的同一性。本發(fā)明的序列是SEQ ID No :1ESBA105 的 VLDIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDVVWYQQRPGKAPKLLIYSAFNRYTGVPSRFSGRGYGT DFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGTKLEVKRSEQ ID No :2ESBA105 的 VHQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYT FTHYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTYTGEPTYADKFKDRF TFSLETSASTVYMELTSLTSDDTAVYYCARERGDAMDYWGQGTLVTVSSSEQ ID No :3ESBA105DIVMTQSPSSLSASVGDRVTLTCTASQSVSNDVVWYQQRPGKAPKLLIYSAFNRYTGVPSRFSGRGYGT DFTLTISSLQPEDVAVYYCQQDYNSPRTFGQGTKLEVKRGGGGSGGGGSGGGGSSGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASV KVSCTASGYTFTHYGMNWVRQAPGKGLEWMGWINTYTGEPTYADKFKDRFTFSLETSASTVYMELTSLTSDDTAVYY CARERGDAMDYWGQGTLVTVSS
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兩個序列之間的百分比同一性是在考慮為了進(jìn)行兩個序列的最佳比對而需引入 的缺口的數(shù)目和各缺口的長度的情況下，由序列共有的相同位點(diǎn)的數(shù)目的函數(shù)。序列的 比較和兩個序列之間百分比同一性的測定可使用對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的數(shù)學(xué) 算法來完成。本文中提及的同一性可使用可在國際互聯(lián)網(wǎng)上獲得的BLAST程序(基本局 部比對搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool)；參見 Altschul，S. F.，Gish， W. , Miller, W. , Myers, Ε· W. & Lipman, D. J. (1990) " Basic local alignment search tool. “ J. MoI. Biol. 215 403-410)來測定。可使用 XBLAST 程序，評分=50，字長=3 進(jìn) 行BLAST蛋白質(zhì)搜索以將氨基酸序列與本發(fā)明的蛋白質(zhì)分子相比較。為了獲得帶缺口的 比對來進(jìn)行比較目的，可以利用Gapped BLAST,如Altschul等人，(1997)NucleicAcids Res. 25(17) :3389_3402中所述。當(dāng)使用BLAST和Gapped BLAST程序時，可使用各程序(例 如，XBLASI^PNBLAST)的缺省參數(shù)。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，滲透效率取決于抗原結(jié)合多肽的大小和所述多肽的pi 與軟骨或給藥部位中發(fā)現(xiàn)的PH的對比。例如，健康膝關(guān)節(jié)中的PH是大約7. 4。在發(fā)炎的關(guān) 節(jié)中，PH可下降至大約7。優(yōu)選，抗原結(jié)合多肽的pi高于7. 0，更優(yōu)選高于7. 4和最優(yōu)選其 為7. 8或更高。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，將抗原結(jié)合多肽用于制劑，所述制劑為抗原結(jié)合多肽 提供總體正電荷以促進(jìn)軟骨滲透并最優(yōu)化軟骨駐留。在第二方面，本發(fā)明提供了公開的抗原結(jié)合多肽用于軟骨退變，特別是骨關(guān)節(jié)炎 的治療、預(yù)防和/或進(jìn)展的延遲的用途。本文中公開的抗原結(jié)合多肽還可用于軟骨退變，特別是骨關(guān)節(jié)炎的體外診斷和/ 或體內(nèi)診斷。在另一個方面，抗原結(jié)合多肽可用于產(chǎn)生用于軟骨退變特別是骨關(guān)節(jié)炎的治療、 預(yù)防和/或進(jìn)展的延遲的藥物或作為用于軟骨退變特別是骨關(guān)節(jié)炎的的檢測的體外診斷 試齊LU此外，本發(fā)明包括含有本文中公開的抗原結(jié)合多肽的組合物。組合物優(yōu)選是藥物 組合物，并且還可包含藥學(xué)上可接受的載體或一種或多種另外的有效試劑。在優(yōu)選實(shí)施方案中，組合物的抗原結(jié)合多肽是scFv并且特異性結(jié)合TNF α?？稍?抗原結(jié)合多肽摻入組合物之前將其經(jīng)歷冷凍干燥。優(yōu)選，組合物是水性制劑。可通過將多 肽溶解在PH被緩沖的溶液中來制備所述水性制劑，其中緩沖劑具有高于6. 0的ρΗ，優(yōu)選ρΗ 在6. 0以上至7. 8的范圍內(nèi)?？蓪ⅵ薛Э刂圃谠摲秶鷥?nèi)的緩沖劑的實(shí)例包括有機(jī)酸緩沖劑 例如醋酸鹽(例如，醋酸鈉)、琥珀酸鹽(例如琥珀酸鈉)、葡糖酸鹽、組氨酸和檸檬酸鹽。可對許多不同的受試者，優(yōu)選溫血動物，更優(yōu)選哺乳動物，包括人和非人動物例如 大鼠、小鼠、兔子、狗、馬、牛施用本發(fā)明的抗體和組合物。在本文中公開的方法、抗原結(jié)合多 肽和/或組合物的優(yōu)選實(shí)施方案中，受試者是人。本文中公開的方法、抗原結(jié)合多肽和/或組合物的施用方式優(yōu)選是非腸道，最優(yōu) 選關(guān)節(jié)內(nèi)施用。由本發(fā)明公開的在哺乳動物中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)(參見實(shí)施例1)顯示在關(guān)節(jié)內(nèi)施用本 發(fā)明的抗原結(jié)合多肽后，多肽以比靜脈內(nèi)途徑應(yīng)用后有效得多的方式滲透入軟骨(參見圖 5Α和B)。在血漿中，本發(fā)明的抗原結(jié)合多肽的測量的最大濃度(Cmax)在關(guān)節(jié)內(nèi)施用后比
8在靜脈內(nèi)施用后的更低。在特定的實(shí)驗(yàn)設(shè)置中，差異為10倍。此外，在關(guān)節(jié)內(nèi)施用后數(shù)小 時血漿中Cmax達(dá)到峰值，這表明從關(guān)節(jié)內(nèi)注射部位進(jìn)入循環(huán)的相對較慢的吸收，這與持續(xù) 釋放作用相當(dāng)。這些發(fā)現(xiàn)驗(yàn)證了抗原結(jié)合多肽的局部施用優(yōu)于全身性施用的假說，因?yàn)樵?注射部位，觀察到多肽的更高的局部濃度以及觀察到延遲的至血漿內(nèi)清除。此外，在關(guān)節(jié)內(nèi) 施用后，與靜脈內(nèi)施用相比較，多肽的全身性暴露更低，這減少了潛在的全身性不利反應(yīng)。優(yōu)選，選擇本文中公開的多肽和/或組合物以便在關(guān)節(jié)內(nèi)施用后，血漿中多肽的 峰濃度Cmax降低至靜脈內(nèi)注射后的大約1/10，優(yōu)選低于靜脈內(nèi)注射后的1/10。此外，選擇 多肽和/或組合物以便在關(guān)節(jié)軟骨中，在關(guān)節(jié)內(nèi)施用后所述多肽的峰濃度Cmax優(yōu)選比靜脈 內(nèi)注射后的至少高40倍，優(yōu)選比靜脈內(nèi)注射后的至少高45倍。優(yōu)選，對于關(guān)節(jié)內(nèi)施用，與 本文中公開的多肽或組合物的靜脈內(nèi)施用相比較，基于AUC0-6的關(guān)節(jié)軟骨中多肽的暴露 高出大約135倍和/或AUC0-240高出150至500倍。如上所提及的，優(yōu)選選擇抗原結(jié)合多 肽以便其具有高于7. 0的pl，和/或選擇組合物以使其具有為抗原結(jié)合多肽提供總體正電 荷的配方?？砂凑毡绢I(lǐng)域內(nèi)已知的用于制造藥物組合物的任何方法制備意欲用于非腸道和/ 或關(guān)節(jié)內(nèi)使用的組合物，除了本發(fā)明的有效物質(zhì)外，所述組合物還可包含一種或多種試劑 例如防腐劑和/或佐劑。組合物可在混合物中包含活性成分和合適的生理上可接受的賦形 劑。此類賦形劑包括，例如，惰性稀釋劑(例如，碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉)、成 粒劑和崩解劑(例如，玉米淀粉或海藻酸)、粘合劑(例如，淀粉、明膠或阿拉伯膠)和潤滑 劑(例如，硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石)。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，組合物包含具有止痛和/或消炎特性的多肽。當(dāng)多肽特 異性結(jié)合TNFa時，情況尤其如此。在一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物還包含除了本文 中描述的多肽外的止痛藥和/或非甾體類消炎藥。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，組合物包含透明質(zhì)酸和/或關(guān)節(jié)內(nèi)注射的糖皮質(zhì)激
ο優(yōu)選以穩(wěn)定的方式配制本文中公開的組合物。穩(wěn)定制劑是這樣的制劑其中的抗 原結(jié)合多肽在貯存后基本上保持其生物活性，優(yōu)選其物理穩(wěn)定性和/或化學(xué)穩(wěn)定性。用于 測量蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的各種分析技術(shù)在本領(lǐng)域內(nèi)是可獲得的，其綜述參見例如P印tide and Protein Drug Delivery,247-301, Vincent Lee Ed. , Marcel Dekker, Inc., New York, N. Y. ,Pubs. (1991)和 Jones，A. Adv. Drug Delivery Rev. 10 :29_90(1993)中?？稍谶x擇的 溫度在選擇的時間段內(nèi)測量穩(wěn)定性。優(yōu)選，制劑在室溫(大約25°C )或40°C穩(wěn)定至少1個 月和或在大約2-8°C穩(wěn)定至少1年，優(yōu)選至少2年。此外，在制劑冷凍(至，例如，-70°C)和 解凍后，制劑優(yōu)選是穩(wěn)定的。因?yàn)殛P(guān)節(jié)內(nèi)注射要求侵入過程，因此不推薦太頻繁地施用它們。因此優(yōu)選地，藥物 活性化合物在注射部位和/或關(guān)節(jié)組織內(nèi)顯示高駐留時間。因?yàn)楸疚闹忻枋龅亩嚯哪軌驖B 入軟骨，因此在關(guān)節(jié)內(nèi)施用后，所述多肽從關(guān)節(jié)的釋放在延長的時期內(nèi)發(fā)生。在一個優(yōu)選實(shí) 施方案中，還可通過將本文中公開的藥物組合物配制為持續(xù)釋放的組合物，即，允許在施用 后延長釋放，優(yōu)選在零級速率上延長釋放有效化合物的制劑來獲得延長的駐留時間。通?？墒褂檬熘募夹g(shù)將此類制劑制備為流體水性膠體懸浮液。制劑優(yōu)選具有充 分的流動性以易于注射。此外，制劑優(yōu)選在液體形式上是穩(wěn)定的、生物相容的和可生物降解
9的、無毒的、非免疫原性的和具有優(yōu)良的局部耐受性。持續(xù)釋放制劑優(yōu)選提供相對恒定水平 的調(diào)節(jié)劑釋放。幾種方法在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。在一個方法中，制劑包括至少一種聚合物 和一種活性劑，所述聚合物和活性劑是液態(tài)的和可注射的，并且由于PH和/或溫度的變化， 在對受試者施用后變得更粘稠。另一選擇是膠化沉積物的形成。在施用后，因?yàn)槭茉囌叩?溫度高于膠凝劑的膠凝點(diǎn)，所以流體變成膠凝。另一個方法在于將活性劑整合入隨后給受 試者施用的微球體或植入劑。第四種方法是給納米顆粒裝載抗原結(jié)合多肽。然后以低粘度 液體懸浮物的形式施用顆粒。可將本文中公開的多肽和/或組合物用于例如進(jìn)行軟骨退變和與其相關(guān)的任何 病癥的治療、預(yù)防和/或進(jìn)展的延遲。優(yōu)選，所述病癥是骨關(guān)節(jié)炎。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，與 軟骨退變相關(guān)的所述病癥包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎和幼年特發(fā) 性關(guān)節(jié)炎等等。優(yōu)選，給有此需要的受試者施用治療有效量的本文中公開的多肽和/或組合物。 合適的劑量取決于許多因素例如待治療病狀、病狀的嚴(yán)重度和過程、施用抗體是為了預(yù)防 還是治療目的、之前的治療、患者的臨床史和對抗原結(jié)合多肽的反應(yīng)、使用的抗原結(jié)合多肽 的類型和主治醫(yī)生的判定。本發(fā)明還包括裝有一個或多個裝組合物的容器的制品。合適的容器包括例如瓶 子、小瓶和注射器，其可由多種材料例如玻璃或塑料形成。從商業(yè)和用戶角度來看，制品還 可包括其他期望的材料，包括緩沖劑、稀釋劑、過濾器、針、注射器和具有使用說明書的裝箱 單。此外，本發(fā)明包括編碼本文中公開的抗原結(jié)合多肽的DNA序列。在另一個方面，本發(fā)明還包括含有所述DNA序列的克隆性載體或表達(dá)載體。本發(fā)明還公開了用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的合適的宿主細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞可 以是原核宿主細(xì)胞，優(yōu)選大腸桿菌(E. coli)，或真核宿主細(xì)胞例如酵母，優(yōu)選釀酒酵母 (S. cerevisiae)，昆蟲細(xì)胞，哺乳動物細(xì)胞或植物細(xì)胞。優(yōu)選，如果使用的scFv構(gòu)建體包含 指導(dǎo)多肽至周質(zhì)的信號序列，則所述方法可提供從大腸桿菌包涵體或從大腸桿菌周質(zhì)純化 的scFv抗體。在另一個方面，本發(fā)明包括用于軟骨退變的治療、預(yù)防和/或進(jìn)展的延遲的方法， 其包括下列步驟(a)提供具有至少IOkDa并且低于50kDa的分子量并且還具有高于7. 0的pi的抗 原結(jié)合多肽；和(b)給有此需要的受試者局部施用所述多肽。所述多肽優(yōu)選是本文中公開的多肽。特別地，所述多肽優(yōu)選結(jié)合細(xì)胞因子或細(xì)胞 因子受體，優(yōu)選TNFa或白細(xì)胞介素。更優(yōu)選，所述多肽是穩(wěn)定的和可溶性的。更優(yōu)選，所 述多肽具有與序列SEQ. ID. No. 3至少90%的同一性，更優(yōu)選95%和最優(yōu)選100%的同一性。任選地，對多肽進(jìn)行工程化改造以增加所述多肽的正電荷和/或?qū)⑺龆嚯挠糜?具有為抗原結(jié)合多肽提供總體正電荷的配方的組合物?？梢岳缤ㄟ^遺傳工程，例如通過 一個或多個氨基酸的置換和/或通過多肽的化學(xué)修飾增加多肽的正電荷。由此可促進(jìn)軟骨 滲透和/或可增加軟骨駐留。施用的方式優(yōu)選是非腸道施用，更優(yōu)選關(guān)節(jié)內(nèi)施用。通常，給有此需要的受試者施用治療有效量的多肽。所述受試者優(yōu)選是哺乳動物，
10更優(yōu)選是人類。實(shí)施例1FITC-標(biāo)記的TNF α拮抗劑至牛軟骨內(nèi)的大小依賴性滲透實(shí)驗(yàn)的目的是比較抗TNFa單鏈抗體(scFv) ESBA105 (在附圖中有時也稱為Ε105) 與全長抗TNF α抗體英夫利昔單抗的離體軟骨滲透。材料和方法如W008/006235中所述產(chǎn)生ESBA105。在官方Swiss pharmacy購買英夫利昔單抗 /Remicade 。從牛股骨(從屠宰場新獲得的)切割出軟骨制備物，將其置于如圖1中示意性描 述的角膜滲透室(corneal perfusion chamber)中。將天然暴露于滑液的軟骨層暴露于 300mcl的FITC-標(biāo)記的抗體溶液。FITC標(biāo)記的抗體在PBS緩沖液pH7. 4中的測試濃度分 別為lmg/ml (對于E105-FITC)和lmg/ml及2. 2mg/ml (對于英夫利昔單抗-FITC)。循環(huán)通 過室、試管和貯液池的總液體體積為5ml。在指定的溫育時間(2、4、6或8小時)之后，用 20ml PBS pH 7. 4清洗軟骨組織3次，隨后包埋在OCT化合物(TissueTek)中，然后將其在 液氮中冷凍。將樣品包裹在石蠟?zāi)?Parafilm)中，于-20°C貯存直至切片。使用MI CROM低溫保持器(0T :_18°C，刀-20°C )以14mcm的切片厚度進(jìn)行切 片。分析封好的切片，以40-100X的放大倍數(shù)在UV-顯微鏡(Leica)下照相。使用IMAGE QUANT(5. 0)軟件分析照片上的信號強(qiáng)度。如下進(jìn)行FI TC標(biāo)記向Iml的2mg/ml抗體溶液中加入75mcl新制備的Img/ ml NHS-FITC/DMS0溶液，同時進(jìn)行渦旋并在室溫溫育45分鐘。在4°C使用5ml透析盒 (dialysis-cassette)于5升PBS pH6. 5中通過透析將未結(jié)合的FITC與標(biāo)記的蛋白質(zhì)分 離。在48小時的時間內(nèi)進(jìn)行透析，在此期間完全置換透析緩沖液4次。由于使用解剖刀從骨切取，所以軟骨制備物具有不同的厚度。將暴露于制劑的軟 骨表面朝向各照片的底部定向排列。圖“體外軟骨滲透”的照片3至5(從左至右)由連續(xù) 拍攝并且疊加(以產(chǎn)生完整檢查的軟骨組織的概圖)的兩張(photograph 4 of three)照 片組成。結(jié)果ESBA105-FITC和英夫利昔單抗-FITC至牛軟骨內(nèi)的滲透研究的結(jié)果顯示于圖3。 時間進(jìn)程研究顯示ESBA105-FITC以時間依賴性方式有效地滲入牛軟骨，然而英夫利昔單 抗-FITC卻不這樣。對于英夫利昔單抗-FITC，未觀察到時間依賴性滲透，甚至在8小時后 和在2.2mg/ml的濃度，照片不能與PBS處理的軟骨相區(qū)別。為了允許比較不同標(biāo)記的蛋 白質(zhì)制備物，在使用它們進(jìn)行軟骨滲透實(shí)驗(yàn)之前，將其等分進(jìn)行稀釋(1 2，1 4，1 8， 1 16)并且點(diǎn)在載玻片上以在紫外光下確定信號強(qiáng)度。該稀釋系列的結(jié)果描述于圖2中， 該圖顯示FITC-標(biāo)記對于兩種蛋白質(zhì)作用同樣有效，從而滲透實(shí)驗(yàn)的結(jié)果在定性基礎(chǔ)上是 可直接比較的。圖4A描述了在時間進(jìn)程研究過程中在離頂點(diǎn)0. 5距離[任意單位](關(guān)于標(biāo)尺， 參見圖4B)處測量的信號強(qiáng)度的定量。對于PBS和對于英夫利昔單抗-FITC，測量的值幾乎 相等，表明無英夫利昔單抗-FITC滲入軟骨。對于ESBA105，定量分析顯示信號強(qiáng)度隨時間 有幾乎線性增加。
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實(shí)施例2體內(nèi)和生物分布研究材料和方法TNF-α抑制劑。如所描述的，將ESBA105在大腸桿菌中表達(dá)并且從其中進(jìn)行純化， 并且在25mM磷酸鈉ρΗ6. 5中使用。在當(dāng)?shù)厮幏抠徺I英夫利昔單抗(Remicade )和依那西 普(Enbre 1 ) 0細(xì)胞培養(yǎng)中TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。將？!￡6和？!￡15代之間的小鼠L929成纖維細(xì)胞于100μ 1測定培養(yǎng)基(含有L-谷氨 酰胺 +5% FCS 的無酚紅 RPMI)中接種在 96 孔板(167008，Nunc, Langenselbold, Germany) 中，達(dá)到20000個細(xì)胞/孔的細(xì)胞密度。將細(xì)胞在37°C和5% CO2中溫育過夜。在第二天， 制備含有重組人rhTNF-α (300-01Α，PeproTech, London, UK)和不同量的ESBA105或英夫 利昔單抗的激動劑抑制劑混合物，將其在環(huán)境溫度溫育30分鐘。向各孔中加入50 μ 1的放 線菌素D (終濃度為1 μ g/ml)，然后向細(xì)胞中加入50 μ 1的激動劑抑制劑混合物(rhTNF- α 終濃度為100pg/ml)。將細(xì)胞溫育20小時。然后，向細(xì)胞培養(yǎng)物中加入50 μ 1含有l(wèi)mg/ml XTT (于無酚紅的 RPMI 中)禾Π 25 μ M PMS (Ρ9625, Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland)的 溶液，將細(xì)胞在37°C再溫育另外90分鐘。增殖細(xì)胞表達(dá)線粒體琥珀酸-四唑「還原酶系統(tǒng)， 該系統(tǒng)將四唑「鹽XTT催化成紅色產(chǎn)物。通過在平板讀數(shù)器(TECAN，Genios，Switzerland) 中測量450nm處的吸光度來評價紅色的強(qiáng)度。單關(guān)節(jié)炎模型。按照Bolon等人2004，使用28-規(guī)針，通過雌性10周齡Lewis大 鼠(Jackson)的膝蓋的髕下韌帶關(guān)節(jié)內(nèi)注射ESBA105、英夫利昔單抗或由與ESBA105相同 的可變結(jié)構(gòu)域構(gòu)架組成但具有無關(guān)特異性的scFv(此處稱為“天然” scFv ；ESBATech)(各 自處于40 μ 1 PBS中注射)，5分鐘后注射rhTNF- α (處于10 μ 1 PBS中)。為此，用50mg/ kg氯胺酮麻醉大鼠。在研究之前和研究過程中監(jiān)測大鼠，在研究前和在rhTNF-α注射后 48小時用測徑器(Dyer，Lancaster，PA)測量膝蓋直徑。為了進(jìn)行組織病理學(xué)評價(Bolon B, Campagnuolo G, Zhu L, Duryea D, Zack D, Feige U. Interleukin-Ibeta and tumor necrosisfactor-α produce distinct, time-dependent patterns of acutearthritis in the rat knee. Vet Pathol 2004/41 :235_243)，在第48小時對大鼠實(shí)施無痛致死術(shù)。在 HE或甲苯胺藍(lán)染色后評價脫鈣的膝切片。如之前所述(Bolon. B等人(2004)，參見上文)， 就炎癥(O至4)和軟骨(O至4)給切片評分。對于所有動物操作已獲得倫理批準(zhǔn)。生物分布研究。使用由 MDS Pharma Services Switzerland AG(Fehraltorf, Switzerland)提供的氯胺-T法用125碘(125I)標(biāo)記ESBA105至18. 6MBq/mg的起始比活性。在 Covance Laboratories Ltd. (Harrogate, UK)進(jìn)行生物分布研究，遵循 由優(yōu)良實(shí)驗(yàn)室規(guī)范(Codification Amendments Etc.)修正的英國(GLP監(jiān)督管理局， 藥品和醫(yī)療產(chǎn)品管理中心(MHRA))優(yōu)良實(shí)驗(yàn)室規(guī)范1999，制定法文件(Statutory Instrument) 1999No. 3106而進(jìn)行所述研究，并且所述研究由當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會批準(zhǔn)。雄性新 西蘭白兔接受在1000μg/動物的靶ESBA105劑量水平上的[125I]-ESBA105單個靜脈內(nèi)或 關(guān)節(jié)內(nèi)劑量。施用的劑量在884至1034 μ g/動物的范圍內(nèi)，相當(dāng)于0. 707和0. 827MBq之 間的放射性劑量。在給藥后，如表1中所述采集動物的樣品。表 1
1權(quán)利要求
用于軟骨退變的治療、預(yù)防和/或進(jìn)展的延遲的抗原結(jié)合多肽，其中所述多肽能夠滲入軟骨。
2.權(quán)利要求1的抗原結(jié)合多肽，其中所述多肽是單鏈抗體。
3.權(quán)利要求1或2的抗原結(jié)合多肽，其中所述多肽具有至少5mg/ml，更優(yōu)選至少10mg/ ml，和最優(yōu)選至少20mg/ml的溶解度。
4.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合多肽，其中所述多肽具有至少lOkDa并且低于 50kDa的分子量。
5.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合多肽，其中所述多肽特異性結(jié)合細(xì)胞因子，特別 是IL-1或TNFa、細(xì)胞因子受體或軟骨蛋白聚糖降解酶。
6.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合多肽，其包含與SEQ. ID. No. 1具有至少90%的同一性、更優(yōu)選至少95%的同一性的VL ；和/或與SEQ. ID. No. 2具有至少90%的同一性、更優(yōu)選至少95%的同一性的VH。
7.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合多肽，其中所述多肽具有序列SEQ.ID. No. 3。
8.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合多肽，其中所述抗原結(jié)合多肽的pi高于7.0，特 別地高于7. 4，更特別地是7. 8或更高。
9.權(quán)利要求1至8的任一項(xiàng)的抗原結(jié)合多肽用于軟骨退變、特別是骨關(guān)節(jié)炎的治療、預(yù) 防和/或進(jìn)展的延遲的用途。
10.權(quán)利要求1至8的任一項(xiàng)的抗原結(jié)合多肽用于生產(chǎn)藥劑或作為檢測軟骨退變、特別 是骨關(guān)節(jié)炎的體外診斷試劑的用途，所述藥劑用于軟骨退變、特別是骨關(guān)節(jié)炎的治療、預(yù)防 和/或進(jìn)展的延遲。
11.包含權(quán)利要求1至8的任一項(xiàng)的抗原結(jié)合多肽的組合物，特別是藥物組合物。
12.權(quán)利要求11的組合物，其包含pH高于6.0的pH經(jīng)緩沖的水溶液。
13.權(quán)利要求11或12的組合物，其具有適合用于關(guān)節(jié)內(nèi)施用的配方，特別是持續(xù)釋放 配方。
14.權(quán)利要求11至13中任一項(xiàng)的組合物，其具有為所述多肽提供總體正電荷的制劑。
15.權(quán)利要求11至14中任一項(xiàng)的組合物，其中所述多肽是scFv并且特異性結(jié)合 TNFa。
16.一種制品，其中包含裝載權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合多肽或權(quán)利要求11 至15的任一項(xiàng)的組合物的容器。
17.權(quán)利要求11至15中任一項(xiàng)的組合物用于軟骨退變和與其相關(guān)的任何病癥、特別是 骨關(guān)節(jié)炎的治療、預(yù)防和/或進(jìn)展的延遲的用途。
18.編碼權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合多肽的DNA序列。
19.包含權(quán)利要求18的DNA序列的克隆載體或表達(dá)載體。
20.用權(quán)利要求19的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的合適的宿主細(xì)胞。
21.用于產(chǎn)生權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合多肽的方法，所述方法包括在允許所 述抗原結(jié)合多肽合成的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求20的宿主細(xì)胞和從所述培養(yǎng)物回收所述抗原結(jié)合多肽。
22.用于軟骨退變的治療、預(yù)防和/或進(jìn)展的延遲的方法，其中局部施用、特別是通過 關(guān)節(jié)內(nèi)施用來施用權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合多肽。
全文摘要
本發(fā)明提供了能夠滲入軟骨的抗原結(jié)合多肽。所公開的多肽、組合物和方法適合于軟骨退變的治療、預(yù)防和/或進(jìn)展的延遲。
文檔編號C07K16/24GK101939335SQ200980104195
公開日2011年1月5日 申請日期2009年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月5日
發(fā)明者D·厄里什, P·利希特蘭 申請人:德勒尼克斯治療股份公司