專利名稱：突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)劑及它們的使用方法
突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)劑及它們的使用方法
背景技術(shù)：
神經(jīng)肌肉障礙的治療目前普遍集中于靶向神經(jīng)肌肉接頭突觸前(即，神經(jīng)元)側(cè) 的治療劑的開發(fā)與遞送。特別廣泛考察了各種梭狀芽孢桿菌毒素以其天然形式作為化學(xué)去 神經(jīng)劑。然后不幸的是，由于神經(jīng)元功能的多效性，本領(lǐng)域采用的突觸前治療方法除了對骨 骼肌的預(yù)期作用外能夠不利地影響平滑肌信號傳導(dǎo)和神經(jīng)元間信號傳導(dǎo)，從而產(chǎn)生不想要 的副作用和毒性。肉毒桿菌毒素特別說明突觸前靶向治療神經(jīng)肌肉障礙中固有的問題。過去十年 間，肉毒梭菌毒素的商業(yè)制品(包括BoTox )廣泛用作化學(xué)去神經(jīng)劑用于美容和臨床目 的。值得注意的是，由于泄漏毒性導(dǎo)致關(guān)鍵平滑肌細胞功能喪失，它們在治療臨床神經(jīng)肌肉 障礙癥狀的用途最近受到FDA更嚴格的審查。實際上，甚至與這些分子的美容使用相關(guān)的 一些更普遍的毒性(例如持續(xù)口干)也是由于毒素從施用位點泄漏和更遠端平滑肌細胞功 能的抑制。此外，許多最初對肉毒桿菌毒素療法應(yīng)答的患者隨后變得對治療無應(yīng)答。因此， 對于許多患者而雷，肉毒桿菌注射未能提供令人滿意的長期的病狀治療。然而，盡管存在這 些明顯的缺點，至今還沒有開發(fā)出替代的治療策略。已知從動物毒液分離的其他神經(jīng)毒素具有突出后作用機制。例如，已知來自海芋 螺(Conus marine snail)毒液的α -芋螺肽(α -conop印tide)突觸后作用于nAChR。還已 知稱為α-神經(jīng)毒素的蛇毒蛋白類是nAChR的競爭性拮抗劑。α-神經(jīng)毒素主要由于四個不 變的二硫鍵而具有高度保守的折疊并被分類為具有60-62殘基和四個二硫鍵的“短”類或 具有63-80殘基和第五個二硫鍵的“長”類。參見ffalkinshaw, M. D.等· Proc. Natl. Acad. Sci. USA77 :2400-04(1980)。所有這些毒素以高親和力結(jié)合于肌肉型nAChR，并且長鏈毒素 還以高親和力識別神經(jīng)元型nAChR的α 7受體(Servent D.等；Eur JPharmacol. 393(1-3) 197-204(2000)。經(jīng)改進而增強與含有α 7受體的神經(jīng)元nAChR結(jié)合的長鏈α -神經(jīng)毒素被特別 表明為特異性抑制神經(jīng)傳遞的最佳治療劑。參見例如美國專利號6，753，315。然而不幸的 是，這再次遵循了突觸前靶向的慣例并忽略了此類拮抗劑對神經(jīng)元間信號傳導(dǎo)和平滑肌活 性的成問題的影響。而且，此類拮抗劑可能由于α-7nAChR的分布而對免疫系統(tǒng)具有有害 作用。參見例如 Wang 等，“Nicotinic acetylcholine receptor alpha 7 subunit is an essential regulator of inflammation，，，Nature 421:384-8(2003)。來自海芋螺毒液的α-芋螺肽已被建議用于肌肉去神經(jīng)和麻痹(Olivera等.美 國專利號4，447，356)。然而，由于高解離速率和低生物穩(wěn)定性，α -芋螺肽實現(xiàn)的肌肉麻痹 僅持續(xù)15至20分鐘。對于有效的肌肉去神經(jīng)治療而言，持續(xù)數(shù)小時或數(shù)天的長期麻痹作 用是期望的。因此，α-芋螺肽還未開發(fā)為使用肉毒桿菌毒素的常規(guī)化學(xué)去神經(jīng)的可行的 替代，并且依然需要可以有效實現(xiàn)肌肉麻痹同時減少使用常規(guī)治療性神經(jīng)毒素觀察到的對 神經(jīng)元和平滑肌功能不利影響的治療神經(jīng)肌肉障礙的替代治療方法。發(fā)明概述與本領(lǐng)域已建立的慣例相反，本發(fā)明人開發(fā)了突觸后操作以實現(xiàn)直接即時、臨時且任選部分的骨骼肌麻痹的物質(zhì)。該化學(xué)去神經(jīng)的突觸后方法提供了勝過現(xiàn)有技術(shù)突觸前 方法(例如，使用肉毒桿菌毒素)的許多優(yōu)點。第一，本發(fā)明組合物與突觸前作用神經(jīng)毒素 相此減少了毒性。本文描述的突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽選擇性作用于骨骼神經(jīng)肌肉接頭 突觸后膜。對神經(jīng)肌肉接頭的肌肉組分的選擇性和對骨骼肌的限制使本發(fā)明組合物與突觸 前作用神經(jīng)毒素(例如肉毒桿菌毒素)相此毒性大大減少。第二，不同于突觸前方式，本文 描述的突觸后化學(xué)去神經(jīng)在施用和效應(yīng)之間不存在潛伏期。本文描述的突觸后化學(xué)去神經(jīng) 是即時的。第三且相關(guān)地，突觸后化學(xué)去神經(jīng)肽的有效劑量是可立即確定的。相反，突觸前 化學(xué)去神經(jīng)的延遲效應(yīng)使其不可能實時計量有效劑量。第四，突觸后化學(xué)去神經(jīng)產(chǎn)生長持 續(xù)但臨時的麻痹。突觸后化學(xué)去神經(jīng)產(chǎn)生的效應(yīng)持續(xù)時間介于短持續(xù)的a-芋螺毒素和基 本上永久麻痹的神經(jīng)毒素(例如肉毒桿菌毒素)之間。這是非常希望的效應(yīng)持續(xù)時間，因 為可以不需要頻繁再施用而實現(xiàn)延長的麻痹，并且臨時和部分麻痹是可行的。而且，本發(fā)明 提供了具有一系列效價的多種突觸后去神經(jīng)劑，擴大了使用該類物質(zhì)可實現(xiàn)的麻痹的持續(xù) 時間范圍。因此，本發(fā)明提供了突觸后化學(xué)去神經(jīng)多肽，制備突觸后化學(xué)去神經(jīng)多肽的方法， 以及使用突觸后化學(xué)去神經(jīng)多肽治療神經(jīng)肌肉障礙的方法。本發(fā)明突觸后化學(xué)去神經(jīng)多肽 包括優(yōu)先結(jié)合人類肌肉nAchR而非含a 7/4/3/2的人類神經(jīng)元nAChR的短鏈a -神經(jīng)毒素 和長鏈a-神經(jīng)毒素。本發(fā)明多肽對含a 1亞基的人類肌肉nAChR表現(xiàn)出比對任何含a 7、 a 3、a 4、a 2-亞基的人類神經(jīng)元nAChR至少100倍更高的親和力，更優(yōu)選至少500倍更高 的親和力，和更優(yōu)選至少1000倍更高的親和力。如本文所述，a-神經(jīng)毒素對特定人類受 體的親和力表示為使用標記毒素分子進行的受體結(jié)合分析測量的平衡解離常數(shù)的倒數(shù)(1/ Kd)。用于本發(fā)明組合物和方法的優(yōu)選神經(jīng)毒素分子進一步特征為從人類肌肉nAChR 亞型緩慢的平衡解離速率。如本文所述，解離常數(shù)代表50%神經(jīng)毒素以游離解離分子存在 并且50%保持與受體結(jié)合時的分子濃度。本發(fā)明突觸后化學(xué)去神經(jīng)多肽有利地用于組合物和方法以非永久和局部抑制肌 肉細胞功能，并用于減少神經(jīng)肌肉接頭處的神經(jīng)遞質(zhì)效應(yīng)，從而誘導(dǎo)骨骼肌的臨時麻痹。這 些效應(yīng)用于治療異常或不希望的肌肉收縮，尤其用于美容治療面部皺紋、斜視、眼瞼痙攣、 各種肌張力障礙和具有神經(jīng)肌肉組分的其他病狀，以及用于在需要部分患者固定的手術(shù)環(huán) 境(例如各種整形外科介入)中暫時麻痹肌肉。在一些實施方案中，本發(fā)明組合物基本上由具有本文提出的結(jié)合常數(shù)化學(xué)去神經(jīng) 特征的突觸后神經(jīng)毒素多肽組成。本文使用的“基本上...組成”及其語法等同物將權(quán)利 要求范圍限制為指定物質(zhì)和不實質(zhì)影響要求保護的發(fā)明的基本特征和新特征的那些物質(zhì)。 例如，基本由多肽組成的組合物可以不含實質(zhì)影響組合物作為整體的預(yù)期活性的元素。在一個實施方案中，本發(fā)明突觸后化學(xué)去神經(jīng)多肽是長鏈a-神經(jīng)毒素。長鏈 a -神經(jīng)毒素一般包含五個二硫鍵并且固定包含10個半胱氨酸殘基。(參見Walkinshaw， 同上，供參考)。示例性天然長鏈a-神經(jīng)毒素序列提供于本文表1。相反，本發(fā)明采用的 長鏈a-神經(jīng)毒素分子僅具有四個二硫鍵并且缺失環(huán)II (指II)末端的典型二硫鍵。在一 個實施方案中，自然缺乏第五個二硫鍵的分離的天然長鏈a-神經(jīng)毒素分子根據(jù)本發(fā)明教 導(dǎo)用作化學(xué)去神經(jīng)劑，其實例提供于本文表2。在替代實施方案中，在從N末端第四個和第
4五個半胱氨酸殘基之間具有第五個二硫鍵的天然長鏈a-神經(jīng)毒素被修飾以消除所述二 硫鍵。如

圖1所示，長鏈a-神經(jīng)毒素中固定的四個二硫鍵產(chǎn)生0鏈三指折疊，在第二個 環(huán)末端形成第五個二硫鍵，該二硫鍵缺失或根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)被消除。在一個實施方案中，本發(fā)明突觸后化學(xué)去神經(jīng)多肽是長鏈a-神經(jīng)毒素，其中從N 末端數(shù)第四和/或第五個半胱氨酸殘基的至少一個用非半胱氨酸的氨基酸替代，優(yōu)選用選 自由甲硫氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、精氨酸、賴氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苯丙氨酸、 酪氨酸、色氨酸組成的組的氨基酸替代，更優(yōu)選用選自由絲氨酸、丙氨酸、蘇氨酸和甘氨酸 組成的組的氨基酸替代。在一個實施方案中，本發(fā)明突觸后化學(xué)去神經(jīng)多肽是短鏈a-神經(jīng)毒素，并且更 優(yōu)選是從適合宿主/載體系統(tǒng)表達并純化為同質(zhì)單一毒素組合物的重組短鏈a-神經(jīng)毒 素。短鏈a-神經(jīng)毒素包含四個二硫鍵并固定包含8個半胱氨酸殘基。(參見Walkinshaw， 同上，供參考)。示例性天然短鏈a-神經(jīng)毒素序列提供于本文表3?？筛鶕?jù)本發(fā)明教導(dǎo)分離和/或修飾的優(yōu)選的長鏈和短鏈a-神經(jīng)毒素分子 包括a -神經(jīng)毒素，其來自眼鏡蛇目的蛇，優(yōu)選來自屬于眼鏡蛇屬(Naja)、樹眼鏡蛇 屬(Dendroaspis)、擬眼鏡蛇屬(Pseudonaja)、大眼鏡蛇屬(Ophiophaghus)、金環(huán)蛇 屬(Bungarus)、扁尾海蛇屬(Laticauda)、澳洲銅頭蛇屬(Austrelaps)、平頦海蛇屬 (Lapemis)、擬蝮蛇屬(Pseudechis)、虎蛇屬(Notechis)、尖尾蛇屬(Oxyuranus)、澳東蛇屬 (Tropidechis)、棘蛇屬(Acanthophis)、盾眼鏡蛇屬(Aspidelaps)、黃海蛇屬(Astrotia) 和褐眼鏡蛇屬(Demansia)的眼鏡蛇，更優(yōu)選來自孟加拉眼鏡蛇(Naja kaouthia)、印度眼 鏡蛇(Naja naja)、爪哇噴毒眼鏡蛇(Naja sputatrix埃及眼鏡蛇(Naja haje haje)、中 亞眼鏡蛇(Naja oxiana)、黃金眼鏡蛇(Naja nivea)、森林眼鏡蛇(Naja melanoleuca)、 眼鏡蛇王(Ophiophagus Hannah)、東部擬眼鏡蛇(Pseudonaja textiles)、綠曼巴蛇 (Dendroaspis viridis)、簡氏曼巴蛇(Dendroaspis jamesoni)、參錄曼巴蛇(Dendroaspis viridis)、黑曼巴蛇(Dendroaspis polylepis)、南部棘蛇(Acanthophis antarcticus)、 zj、it # (Aspidelaps scutatus)、€ (Astrotia stokesiim)、 _ yjfl IH € (Austrelaps superbus)、馬來環(huán)蛇(Bungarus candidus)、環(huán)節(jié)水目艮鏡蛇(Boulengerina annulata) > tE ^； i^F ^ (Bungarus flaviceps) > ISi^^ (Bungarus multicinctus) > ISi^F ！^ (Bungarus multicinctus) > ffi-S；^!^ (Demansia vestigiata) > jroU^!^ (Laticauda laticaudata)(Laticauda colubrine)、—(Lapemis hardwickii) > ^if jffiM^^S (Laticauda semifasciata)、！(Notechis scutatus)、^;(Oxyuranus scutellatus) > M M X^ ^ (Oxyuranus microlepidotus)、胃 _ € (Pseudechis australis)和粗鱗澳東蛇(Tropidechis carinatus)。本文描述的a-神經(jīng)毒素可通過許多公知技術(shù)產(chǎn)生，包括例如分離的天然a-神 經(jīng)毒素的翻譯后有限的半光氨酸還原，隨后對還原的半胱氨酸殘基進行穩(wěn)定的化學(xué)修飾； 或者天然核酸序列的基因工程聯(lián)合重組生成，和/或化學(xué)合成相應(yīng)的修飾的a “神經(jīng)毒素 氨基酸序列。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明突觸后化學(xué)去神經(jīng)多肽被提供為單一 a-神經(jīng)毒素種 類的同質(zhì)組合物或者被提供為兩種或多種序列和活性已知的a-神經(jīng)毒素種類的確定混合 物。重組a-神經(jīng)毒素是特別優(yōu)選的，通過在適合的宿主/載體系統(tǒng)中重組表達而產(chǎn)生并純化至同質(zhì)性。重組a-神經(jīng)毒素可以從克隆進表達質(zhì)粒載體的cDNA表達并且個體a-神 經(jīng)毒素分子的cDNA可以從毒腺總RNA或mRNA制品克隆，使用本領(lǐng)域公知的標準技術(shù)。一方面，本發(fā)明提供使用本發(fā)明突觸后化學(xué)去神經(jīng)多肽局部抑制骨骼肌功能和減 少神經(jīng)肌肉接頭處神經(jīng)遞質(zhì)效應(yīng)的方法。在一個實施方案中，提供了暫時麻痹外科手術(shù)涉 及的預(yù)期肌肉或肌肉群的方法。該方法包括向外科手術(shù)涉及的肌肉或肌肉群施用有效固定 所述肌肉或肌肉群預(yù)期時段(例如外科手術(shù)持續(xù)時間或其部分或延長至外科手術(shù)之后)的 量的突觸后化學(xué)去神經(jīng)多肽。本發(fā)明多肽顯著提高外科醫(yī)生實現(xiàn)組織修復(fù)和骨修復(fù)的能力 而不需要延長麻醉和/或全身麻醉。根據(jù)本發(fā)明另一方面，提供了促進皮膚組織松弛或放松的方法。該方法包括將根 據(jù)本發(fā)明的突觸后化學(xué)去神經(jīng)多肽以有效促進皮膚組織皮下存在的骨骼肌或骨骼肌群去 神經(jīng)而促進皮膚組織的松弛或放松的量局部施用于皮膚組織。在一些實施方案中，所述多 肽皮下施用。在其他實施方案中，所述多肽肌肉內(nèi)或經(jīng)皮施用。優(yōu)選地，皮膚組織的松弛或 放松導(dǎo)致皮膚皺紋或細紋的減少在一些實施方案中，所述方法還包括共同施用選自由含氧酸和類視黃醇組成的組 的抗皺劑。在優(yōu)選實施方案中，含氧酸選自由可以是直鏈、支鏈或環(huán)狀的和飽和或不飽和的 a -含氧酸和3 -含氧酸組成的組，并且類視黃醇選自由視黃酸、視黃醇、視黃醇酯、透明質(zhì) 酸和/或膠原組成的組。根據(jù)本發(fā)明另一方面，提供了治療受治療者肌肉或肌肉群的痙攣或不自主收縮的 方法。該方法包括將突觸后化學(xué)去神經(jīng)多肽以有效抑制受治療者肌肉或肌肉群的痙攣或不 自主收縮的量施用于需要這種治療的受治療者的肌肉或肌肉群。在一些實施方案中，需要這種治療的受治療者具有眼瞼痙攣、眼瞼痙攣、斜視、痙 攣性斜頸、局部肌張力障礙、顎肌張力障礙、職業(yè)性肌張力障礙、角膜潰瘍(保護性下垂)、 痙攣性發(fā)聲困難(喉肌張力障礙)或面部運動障礙，例如Meige綜合征、半面痙攣、面部神 經(jīng)異常再生或眼皮開放失用。一方面，本發(fā)明提供了包含突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽和藥學(xué)上可接受載體的藥 物組合物。一方面，提供了制備用于治療神經(jīng)肌肉障礙的藥物的方法。本發(fā)明的這些和其他方面以及各種優(yōu)點和效用將參考優(yōu)選實施方案的詳細描述 而更加明顯。附圖簡述圖1描繪了長鏈a -神經(jīng)毒素中常見的0三指折疊和五個二硫鍵，第五個二硫鍵 顯示在第二指和環(huán)的末端。發(fā)明詳述如這里詳述，本發(fā)明人已經(jīng)確定突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽與現(xiàn)有技術(shù)突觸前作 用神經(jīng)毒素相比是優(yōu)良的化學(xué)去神經(jīng)劑。本發(fā)明突觸后化學(xué)去神經(jīng)多肽有利地用于組合物 和方法以局部抑制肌肉細胞功能，并用于減少神經(jīng)肌肉接頭處的神經(jīng)遞質(zhì)效應(yīng)，從而誘導(dǎo) 骨骼肌的麻痹。在本文稱為“化學(xué)去神經(jīng)”的這些效應(yīng)用于治療異?；虿幌胍募∪馐湛s， 尤其用于美容治療面部皺紋、斜視、眼瞼痙攣、各種肌張力障礙和具有神經(jīng)肌肉組分的其他 病狀，以及用于在需要部分患者固定的手術(shù)環(huán)境(例如各種整形外科介入)中暫時麻痹肌
6肉。突觸后化學(xué)去神經(jīng)多肽本發(fā)明突觸后化學(xué)去神經(jīng)多肽對含有a 1亞基的nAChR具有比對含有a 7亞基的 nAChR至少100倍更高的親和力，更優(yōu)選至少500倍更高的親和力，和更優(yōu)選至少1000倍更 高的親和力。本發(fā)明突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽優(yōu)選具有小于1x10_8M、更優(yōu)選小于1X10_9M、更 優(yōu)選小于lxlO^M和在一些實施方案中小于1X10_"M的平衡解離常數(shù)(Kd)。在一個實施方案中，本發(fā)明突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽優(yōu)選具有小于 1 x 10_3mi rT1、更優(yōu)選小于1 x 10_4mi rT1、更優(yōu)選小于1 x 10_5mi rT1和在一些實施方案中小于 lxlO^min-1的平衡解離速率(k.)。在一個實施方案中，本發(fā)明突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽優(yōu)選具有大于 lxKy^mirT1、更優(yōu)選大于lxlCfM—imirT1的平衡締合速率常數(shù)(k締合)。在一個實施方案中，提供分離的短鏈a-神經(jīng)毒素作為突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多 肽。在另一實施方案中，提供在環(huán)2指末端部分缺少典型二硫鍵的分離的天然長鏈a-神 經(jīng)毒素作為突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽。在另一實施方案中，提供在環(huán)2指末端部分缺少 典型二硫鍵的分離的修飾長鏈a _神經(jīng)毒素作為突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽。因此，本發(fā)明涵蓋分離的短鏈a -神經(jīng)毒素，環(huán)2指末端部分缺少典型二硫鍵 (即，正常存在于從多肽N端第四個半胱氨酸殘基和第五個半胱氨酸殘基之間的二硫鍵) 的分離的天然長鏈a -神經(jīng)毒素，和在環(huán)2指末端部分缺少典型二硫鍵的分離的修飾長鏈 a-神經(jīng)毒素。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明a-神經(jīng)毒素是重組的。如本文使用，天然長鏈a -神經(jīng)毒素分子的“功能性變體”、“變體”或“修飾”(即， “修飾長鏈a-神經(jīng)毒素”)是含有至少63個氨基酸殘基并與相應(yīng)天然多肽中五個二硫鍵 相比僅具有四個二硫鍵的分子。如本文使用，“天然"長鏈a-神經(jīng)毒素分子是各種蛇類 毒液中存在的野生型分子，包括顯示完整氨基酸序列的表2中公開的那些。短鏈a-神經(jīng) 毒素天然缺乏第五個二硫鍵。本發(fā)明還包括修飾的短鏈a-神經(jīng)毒素(例如，包含保守氨 基酸取代的變體)，其中所述變體保持其選擇性結(jié)合a "lnAChR的能力，優(yōu)選具有與天然短 鏈a-神經(jīng)毒素相當(dāng)?shù)挠H和力。使用公開的序列信息并采用常規(guī)重組DNA技術(shù)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以容易地 獲得編碼天然長鏈a-神經(jīng)毒素和短鏈a-神經(jīng)毒素的DNA克隆，所述重組DNA技術(shù)例如 基因合成，RNA提取，從分離的總RNA或mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并使用根據(jù)公開的序列信息設(shè) 計的神經(jīng)毒素特異性引物通過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)從cDNA庫擴增個體的a-神經(jīng)毒素 編碼序列。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)，具有突觸后作用機制的神經(jīng)毒素提供了用于麻痹骨骼肌的優(yōu)良 的化學(xué)去神經(jīng)劑。該劑提供超過現(xiàn)有技術(shù)突觸前作用劑的幾個優(yōu)點。這些優(yōu)點包括較低毒 性和較少副作用，沒有麻痹效應(yīng)潛伏期，可即時確定有效劑量，以及臨時但長持續(xù)的麻痹。 而且，提供了具有一系列效價的多種突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽，其擴大了該類物質(zhì)可實 現(xiàn)的麻痹持續(xù)時間的范圍。本文使用的“親和力”表示為個體a _神經(jīng)毒素與靶向nAChR的平衡解離常數(shù)的 倒數(shù)。在一個實施方案中，本發(fā)明組合物和方法中采用的長鏈a-神經(jīng)毒素表現(xiàn)出比典型
7短鏈a -神經(jīng)毒素(例如半環(huán)扁尾蛇毒素b或a _芋螺毒素)至少10倍更低的與人類肌 肉nAChR的平衡解離常數(shù)，優(yōu)選至少100倍更低的平衡解離常數(shù)，和更優(yōu)選至少500倍更低 的平衡解離常數(shù)。在一個實施方案中，本發(fā)明組合物和方法中采用的突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽在 體內(nèi)表現(xiàn)出持續(xù)至少2、4或6小時，更優(yōu)選至少8、12或24小時，優(yōu)選至少48小時，更優(yōu)選 至少3-7天的肌肉去神經(jīng)效應(yīng)。本發(fā)明組合物包括分離的本發(fā)明突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽。本文提及多肽時使 用的“分離的”指從其天然環(huán)境分離并以足以允許其鑒定或使用的量存在。當(dāng)指蛋白或多 肽時，分離的指例如(i)通過表達克隆選擇性產(chǎn)生的，或(ii)通過色譜或電泳純化的。分 離的蛋白或多肽可以但不一定是基本上純的。術(shù)語“基本上純的”指蛋白或多肽基本上不 含可能在天然或體內(nèi)系統(tǒng)中與它們一起存在的其它物質(zhì)，達到實際和適合它們預(yù)期用途的 程度?；旧霞兊亩嚯目梢酝ㄟ^本領(lǐng)域公知技術(shù)產(chǎn)生。因為分離的蛋白可以與藥物制品中 的藥學(xué)上可接受載體混合，因此蛋白可能僅占制品重量的小百分比。蛋白仍然是分離的，因 為它已經(jīng)與活體系統(tǒng)中可與之締合的物質(zhì)分離，即，與其他蛋白分離。修飾的a-神經(jīng)毒素在一個實施方案中，本發(fā)明突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽是修飾的a-神經(jīng)毒素分 子。對a-神經(jīng)毒素的修飾可以對編碼多肽的核酸進行，并且包括缺失、點突變、截 短、氨基酸取代和氨基酸添加?；蛘?，修飾可以直接對多肽本身進行，例如通過二硫鍵中半 胱氨酸的不可逆化學(xué)還原、切割、添加接頭分子、添加可檢測部分(例如生物素)、添加脂肪 酸、聚乙二醇化、一個氨基酸取代另一個氨基酸、以及類似修飾。本發(fā)明a-神經(jīng)毒素可以 由彼此通過肽鍵或修飾的肽鍵(即，肽等構(gòu)物)結(jié)合的氨基酸構(gòu)成，并且可以含有除20種 基因編碼氨基酸以外的氨基酸。a-神經(jīng)毒素可以通過天然過程(例如翻譯后加工)或者 通過本領(lǐng)域公知的化學(xué)修飾技術(shù)修飾。此類修飾很好地描述于基礎(chǔ)教科書中并更詳細描述 于專題論文以及大量研究文獻中。修飾可以發(fā)生在多肽的任何位置，包括肽骨架、氨基酸側(cè)鏈和氨基或羧基末端。 將理解，相同類型的修飾可以相同或不同的程度存在于給定多肽的幾個位點。而且，給定 多肽可以含有許多類型的修飾。多肽可以例如由于遍在蛋白化而是分支的，并且它們可 以是有或沒有分支的環(huán)狀的。環(huán)狀、分支和分支環(huán)狀多肽可以產(chǎn)生自翻譯后天然過程或 者可以通過合成方法制備。修飾包括乙酰化、?；DP-核糖基化、酰胺化、黃素的共價 連接、血紅素部分的共價連接、核苷酸或核苷酸衍生物的共價連接、脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物的 共價連接、磷脂酰肌醇的共價連接、交聯(lián)、環(huán)化、二硫鍵形成、二甲基化、共價交聯(lián)形成、半 胱氨酸形成、焦谷氨酸形成、甲?；Ⅳ然?、糖基化、GPI錨形成、羥化、碘化、甲基化、 豆蔻?；?、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、異戊二烯化、外消旋化、硒化、硫酸 化、轉(zhuǎn)運RNA介導(dǎo)的氨基酸添加至蛋白質(zhì)(例如精氨酰化)和遍在蛋白化。(參見，例如 Proteins—Structure and Molecular Properties,第 2 版，T. E. Creighton, W.H. Freeman 禾口Company,New York(1993) ；Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson，編，Academic Press,New York，第 1-12 頁(1983) ；Seifter 等，Meth Enzymol 182:626-646(1990) ；Rattan 等，Ann NY Acad Sci 663:48-62(1992)。)
天然和修飾a _神經(jīng)毒素分子的功能性變體包括多肽分子的片段。本文使用的片 段是缺乏天然a-神經(jīng)毒素氨基酸序列的一個或多個氨基酸的a-神經(jīng)毒素。片段可以去 除a-神經(jīng)毒素分子一端或兩端的氨基酸，或者去除分子內(nèi)部序列的氨基酸，及這些的組 合。本發(fā)明采用的片段必須保留衍生所述片段的全長a-神經(jīng)毒素分子(天然或修飾的長 鏈a-神經(jīng)毒素分子)的肌肉nAchR結(jié)合活性的至少大部分。測試片段以確定片段的結(jié)合 活性在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的技能范圍內(nèi)。在下面實施例中提供了確定nAchR結(jié)合的示例 性方法以及用于此類方法的優(yōu)選細胞系。當(dāng)天然長鏈a _神經(jīng)毒素序列包括從多肽N端第四個半胱氨酸殘基和第五個半胱 氨酸殘基之間形成的第五個二硫鍵時，優(yōu)選的修飾將導(dǎo)致該鍵的永久消除以增強對人類肌 肉nAChR的選擇性。在一個實施方案中，采用巰基反應(yīng)性脂環(huán)化(alcylation)試劑化學(xué)還 原來永久消除分離的天然長鏈a-神經(jīng)毒素中第五個二硫鍵。在替代和優(yōu)選實施方案中， 采用基因工程來改變天然序列N端下游第四個半胱氨酸或第五個半胱氨酸的至少一個的 編碼序列，以便所得多肽僅形成四個二硫鍵。特別優(yōu)選的變體將用不同于半胱氨酸的氨基 酸，優(yōu)選用選自由纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、精氨酸、賴氨酸、天冬酰胺、谷氨酸胺、苯丙氨 酸、酪氨酸、色氨酸組成的組的氨基酸，更優(yōu)選用選自由絲氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸 和甘氨酸組成的組的氨基酸替代第四個半胱氨酸或第五個半胱氨酸的至少一個。如果修飾的a -神經(jīng)毒素分子包括其他氨基酸取代而不改變結(jié)合特異性，則保守 氨基酸取代通常是優(yōu)選的，即，保留原始氨基酸性質(zhì)(例如電荷、疏水性、極性、構(gòu)型等)的 取代。保守氨基酸取代的實例包括下述組內(nèi)氨基酸中進行的取代(a)M、I、L、V ； (b)F、Y、W ； (c)K、R、H;(d)A、G;(e)S、T ;(f)Q、N;和(g)E、D。此類保守取代還可以在衍生短鏈a-神 經(jīng)毒素變體中進行。本發(fā)明還包括使用包括編碼a-神經(jīng)毒素分子相同氨基酸殘基的替代密碼子的 核酸序列。例如，亮氨酸殘基可以由密碼子(說、(^(、(肌、(而、而4和而6編碼。這六個密 碼子的每一個對于編碼亮氨酸殘基的目的而言是等效的。因此，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員 明顯的是，殼氨酸編碼核苷酸三聯(lián)體的任何一個可以用于指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成裝置在體外或體 內(nèi)加入亮氨酸殘基。類似地，編碼其他氨基酸殘基的核苷酸序列三聯(lián)體包括GUA、⑶C、GUG 和GUU (纈氨酸密碼子)；GGU、GGA、GGG、GGC (甘氨酸密碼子)；UAC和UAU (酪氨酸密碼子)。 其他氨基酸殘基可以類似地由多個核苷酸序列編碼。因此，本發(fā)明涵蓋密碼子序列由于遺 傳密碼簡并性而不同于編碼天然a“神經(jīng)毒素分子的核酸的簡并核酸。還應(yīng)理解，本發(fā)明涵蓋使用所述序列于表達載體中以及轉(zhuǎn)染宿主細胞和細胞系， 是這些原核的(例如大腸桿菌)或真核的(例如，諸如畢赤酵母和釀酒酵母的酵母表達系 統(tǒng)、CH0細胞、COS細胞和昆蟲細胞中的重組桿狀病毒表達)。表達載體要求相關(guān)序列(即， 上述那些)與啟動子可操作連接。本文使用的“載體”可以是許多核酸的任何一個，所需序列可以通過限制酶切和連 接而插入其中以在不同遺傳環(huán)境之間運輸或在宿主細胞中表達。載體通常由DNA構(gòu)成，然 而RNA載體也是可用的。載體包括但不限于質(zhì)粒、噬菌粒、細菌基因組和病毒基因組。克隆 載體是能夠在宿主細胞中復(fù)制或者在其整合入宿主基因組之后被復(fù)制的載體，并且其進一 步特征為一個或多個內(nèi)切核酸酶限制位點，載體可以在所述位點以確定方式切割并且所需 DNA序列可以連接入所述位點，使得新的重組載體保留其在宿主細胞中復(fù)制的能力。在質(zhì)
9粒的情況下，所需序列的復(fù)制可以在質(zhì)?？截悢?shù)在宿主細菌內(nèi)增加時發(fā)生多次或者僅在宿 主通過有絲分裂繁殖之前每個宿主發(fā)生一次。在噬菌體情況下，復(fù)制可以在溶解期間主動 發(fā)生或者在溶原期間被動發(fā)生。表達載體是所需DNA序列可以通過限制酶切和連接而插入 其中而使得所述序列與調(diào)控序列可操作連接并且可以表達為RNA轉(zhuǎn)錄物的載體。載體可以 進一步含有適合用于鑒定已經(jīng)或尚未被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染載體的細胞的一個或多個標志序列。標 志包括例如編碼提高或降低對抗生素或其他化合物抗性或敏感性的蛋白的基因，編碼其 活性可通過本領(lǐng)域已知的標準分析檢測的酶(例如，半乳糖苷酶、熒光素酶或堿性磷酸 酶)的基因，以及可視化影響轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細胞、宿主、集落或噬菌斑的表型的基因(例如， 綠色熒光蛋白)。優(yōu)選的載體是能夠自主復(fù)制和表達與它們可操作連接的DNA區(qū)段中存在 的結(jié)構(gòu)基因產(chǎn)物的那些載體。如本文使用，當(dāng)編碼序列和調(diào)控序列以使編碼序列的表達或轉(zhuǎn)錄處于調(diào)控序列的 影響或控制之下的方式共價連接時被稱為“可操作”連接。如果需要編碼序列翻譯成功能 性蛋白，則在下述條件下稱兩個DNA序列為可操作連接在5'調(diào)控序列引入啟動子導(dǎo)致編 碼序列的轉(zhuǎn)錄并且兩個DNA序列之間的連接性質(zhì)不(1)導(dǎo)致移碼突變的引入，(2)干擾啟 動子區(qū)指導(dǎo)編碼序列轉(zhuǎn)錄的能力，或(3)干擾相應(yīng)RNA轉(zhuǎn)錄物被翻譯成蛋白質(zhì)的能力。因 此，如果啟動子區(qū)能夠?qū)崿F(xiàn)編碼序列的轉(zhuǎn)錄而使得產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物可以被翻譯成所需蛋白或 多肽，則啟動子區(qū)與編碼序列可操作連接?；虮磉_所需的調(diào)控序列的確切性質(zhì)可以根據(jù)物種或細胞類型而不同，但是必要 時一般包括分別參與轉(zhuǎn)錄起始和翻譯起始的5'非轉(zhuǎn)錄序列和5'非翻譯序列，例如TATA 盒、加帽序列、CAAT序列及類似物。優(yōu)選地，此類5'非轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列將包括啟動子區(qū)，包括 轉(zhuǎn)錄控制可操作連接的基因的啟動子序列。如果需要，調(diào)控序列還可以包括增強子序列或 上游的激活子序列。本發(fā)明載體可以任選包括5'前導(dǎo)序列或信號序列。適合載體的選擇 和設(shè)計在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力和判斷之內(nèi)。含有所有表達必要元件的表達載體可商業(yè)途徑獲得并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員已 知的。參見例如 Sambrook 等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989。通過將編碼突觸后化學(xué)去神經(jīng)多肽分子的異源 DNA(RNA)引入細胞而遺傳改造細胞。異源DNA(RNA)被置于轉(zhuǎn)錄元件的可操作控制之下以 允許異源DNA在宿主細胞中表達。用于在哺乳動物細胞中mRNA表達的優(yōu)選系統(tǒng)是如下那些pcDNA3. 1(可獲自 Invitrogen, Carlsbad, Calif.)，含有諸如賦予G418抗性(其有利于篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞 系)的基因的選擇性標志和人類巨細胞病毒(CMV)增強子_啟動子序列。選擇與宿主生物體相容的表達載體。多種宿主/表達載體組合可以用于表達編碼 突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽的DNA。許多宿主細胞系、表達載體和表達載體組成部分可商 業(yè)途徑獲得。相容的宿主/表達載體組合可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地選擇。在本發(fā)明優(yōu)選 實施方案中，宿主生物體是畢赤酵母，表達載體是PPIC系列載體(Invitrogen ；Carlsbad, Calif.；還參見實施例部分)之一。在本發(fā)明另一實施方案中，宿主生物體是大腸桿菌，并 且表達載體是pET系列載體(Novagen ；Madison, Wisconsin ；還參見實施例部分)之一，特 別是提供用于將重組a "神經(jīng)毒素輸出到周質(zhì)間隙的分泌信號前序列的PET載體。獲得用于本發(fā)明的突觸后化學(xué)去神經(jīng)多肽的優(yōu)選方法是通過重組生成，包括使用
10編碼根據(jù)本教導(dǎo)的突觸后化學(xué)去神經(jīng)多肽的重組DNA載體遺傳轉(zhuǎn)化，重組DNA在轉(zhuǎn)化的宿 主細胞中表達，以及收集和純化多肽。優(yōu)選地，宿主生物體是單細胞的。更優(yōu)選地，宿主生 物體是酵母，特別是畢赤酵母，或細菌，特別是大腸桿菌。盡管天然a -神經(jīng)毒素可通過從蛇毒液純化而直接獲得，但可從單一樣本獲得的 個體a-神經(jīng)毒素的量非常少。此外，從毒液將個體a-神經(jīng)毒素純化為同質(zhì)是非常昂貴 且艱巨的。從蛇毒液純化大量個體神經(jīng)毒素的嘗試還受到如下事實阻礙任何蛇毒液含有 大量具有相似理化性質(zhì)的三指毒素多肽，彼此難以分離。這必然存在類似三指神經(jīng)毒素交 叉污染的可能性。由于不同三指毒素發(fā)揮的毒性效應(yīng)的廣譜，這種交叉污染可導(dǎo)致不可預(yù) 測且可能嚴重的副作用。因此，本發(fā)明突觸后化學(xué)去神經(jīng)多肽優(yōu)選提供為單一 a-神經(jīng)毒 素分子的同質(zhì)組合物，或者為序列和活性已知并被表征的兩種或多種a-神經(jīng)毒素種類的 確定混合物。使用固相策略的化學(xué)合成是活的基本上純的突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽的另一 替代方案，其已經(jīng)被Mourier G.等成功證明(Protein Eng. 2000年3月；13(3) :217_25)。 然而，由于本發(fā)明多肽的尺寸范圍60-80氨基酸，該方法較不優(yōu)選用于商業(yè)生產(chǎn)。所需的基本上純的突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽最好實際上以商業(yè)上有價值的量 獲得，通過在適合宿主生物體中重組表達，隨后色譜純化。突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽可以 通過本領(lǐng)域公知的重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。此類技術(shù)由Sambrook等(1989)描述。編碼a-神 經(jīng)毒素多肽的核酸序列可使用常規(guī)技術(shù)分離和克隆?；蛘?，編碼a-神經(jīng)毒素多肽的核酸 序列可基于多肽氨基酸序列和已知的遺傳密碼簡并性而合成。多肽核酸可以被設(shè)計為在 給定宿主系統(tǒng)中實現(xiàn)最高表達。如本文詳細描述，以該方式產(chǎn)生的多肽被分離、還原(如必 要)并氧化而形成四個需要的二硫鍵。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的根據(jù)體內(nèi)正確折疊和二硫鍵 形成而優(yōu)化的多種可商業(yè)途徑獲得的宿主-載體系統(tǒng)可用于該目的。Lyukmanova E.N.，等 (J Biol Chem. 2007 年 8 月 24 ；282 (34) :24784_91.)、Peng L. S.等(Toxicon. 2003 年 12 月；42 (7) 753-61)和 Wang Y.等(J Biotechnol. 2002 Apr 11 ；94 (3) :235_44)，在此引入 作為參考，已經(jīng)成功證明生物活性的長鏈和短鏈a-神經(jīng)毒素分子在大腸桿菌和畢赤酵母 中的高產(chǎn)量表達。在本發(fā)明a -神經(jīng)毒素中形成二硫鍵的一種方法是在冷室溫或室溫下空氣氧化 線性肽延長的時段。該過程導(dǎo)致大量生物活性的二硫鍵連接肽的產(chǎn)生。氧化的肽使用反相 高效液相色譜(HPLC)或類似物分級分離以分離具有不同連接構(gòu)型的肽。之后，通過比較這 些級分與天然物質(zhì)的洗脫物，或者通過使用簡單分析，容易確定具有最大生物效價正確連 接的特定級分。還發(fā)現(xiàn)，線性肽或具有超過一種級分的氧化產(chǎn)物有時可以用于體內(nèi)施用，因 為已經(jīng)發(fā)現(xiàn)體內(nèi)發(fā)生的交聯(lián)和/或重排產(chǎn)生生物學(xué)有效的a-神經(jīng)毒素分子。然而，因為 較低生物效價的其他級分的存在而導(dǎo)致的稀釋，可能需要某種程度上更高的劑量。對肌肉nAChR特異性的肽類似物和肽模擬物也可根據(jù)本文公開的教導(dǎo)來制備，使 用常規(guī)的藥物模擬、藥物設(shè)計和重組化學(xué)。適合的技術(shù)包括但不限于描述于下述的那些美 國專利號 5，571，698、W0 95/21193、Ecker 和 Cook (Bio/Technology 13:351-360(1995)、 Persidis和 Persidis (Bio/Technology 15 :1035_1036 (1997))、Johnson 等 (" Peptide Turn Mimetics “ ，Biotechnology and Pharmacy, Pezzato 等’編，Chapman and Hall, New York (1993) )、Sun 和 Cohen (Gene 137 127-132 (1993))以及其中引用的參考文獻。肽類似物和肽模擬物的開發(fā)使用可商業(yè)途徑獲得的藥物設(shè)計軟件制備，包括Persidis和 Persidis參考文獻中提出的那些。這些肽類似物和肽模擬物具有與本文所述和公開文獻中 的a-神經(jīng)毒素相同的活性。肽類似物和衍生物可以根據(jù)常規(guī)技術(shù)制備。適合肽合成的技 術(shù)描述于美國專利號5，514，774以及其中引用的參考文獻。肽模擬物通過常規(guī)技術(shù)類似地 合成。在本文涉及核酸使用的術(shù)語“分離的”指⑴通過例如聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)體 內(nèi)擴增；(ii)通過克隆重組產(chǎn)生；(iii)通過裂解和凝膠分離而純化；或(iv)通過例如化 學(xué)合成而合成。分離的核酸是可容易通過本領(lǐng)域公知的重組DNA技術(shù)操縱的核酸。因此， 其中5'和3'限制酶切位點已知或聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)引物序列已經(jīng)公開的載體中含 有的核苷酸序列被認為是分離的，但是以其天然狀態(tài)在其天然宿主中存在的核酸序列被認 為不是分離的。分離的核酸可以但不一定是基本上純化的。例如，在克隆或表達載體中分 離的核酸不是純的，因為它可以包含僅微小百分比的其所在細胞中的物質(zhì)。然而如該術(shù)語 在本文所使用的，這種核酸是分離的，因為它可容易地通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的標 準技術(shù)操縱。本文使用的分離的核酸不是天然存在的染色體。本發(fā)明還涵蓋修飾的短鏈a -神經(jīng)毒素其中變體保持其選擇性結(jié)合a -InAChR的 能力，優(yōu)選具有與天然短鏈a-神經(jīng)毒素相當(dāng)?shù)挠H和力。包含保守氨基酸取代的此類變體 是優(yōu)選的。使用方法本發(fā)明突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽有利地用于組合物和方法以局部抑制肌肉細 胞功能，并用于減少神經(jīng)肌肉接頭處的神經(jīng)遞質(zhì)效應(yīng)，從而誘導(dǎo)骨骼肌的麻痹。在本文稱為 “化學(xué)去神經(jīng)”的這些效應(yīng)用于治療異常的肌肉收縮，尤其用于美容治療面部皺紋、斜視、眼 瞼痙攣、各種肌張力障礙和具有神經(jīng)肌肉組分的其他病狀，以及用于在需要部分患者固定 的手術(shù)環(huán)境(例如各種整形外科介入)中暫時麻痹肌肉。在一個實施方案中，提供了治療受治療者肌肉或肌肉群的痙攣或不自主收縮的方 法。該方法包括將突觸后化學(xué)去神經(jīng)多肽以有效抑制受治療者肌肉或肌肉群的痙攣或不自 主收縮的量施用于需要這種治療的受治療者的肌肉或肌肉群。本發(fā)明突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽的局部施用是非常需要的?？赏ㄟ^局部施用 本文提出的組合物治療的疾患的實例包括但不限于皺紋(例如額頭皺紋)、頭痛(例如偏 頭痛)、頭疼、頸部肌張力障礙、手局部肌張力障礙、神經(jīng)源性炎癥、眼瞼痙攣、斜視、半面痙 攣、眼瞼障礙、大腦性麻痹、局部痙攣、肢體痙攣、抽搐、顫抖、磨牙、肛裂、纖維性肌痛、吞咽 困難、流淚和肌肉痙攣疼痛。本發(fā)明突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽的局部施用減少了患者在 施用多肽時經(jīng)歷的疼痛，因為患者不需要扎針，而針頭激活皮下感覺疼痛神經(jīng)元。本文公開 的組合物提供本發(fā)明突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽的局部緩解，而不冒全身施用本發(fā)明突觸 后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽的風(fēng)險。其中希望引起肌肉麻痹的許多其他病狀包括目前使用肉毒桿菌病毒施用的那 些疾病狀態(tài)。此類疾病狀態(tài)和施用方法的實例詳細描述于下述美國專利B0r0dic的 5,298,019 (decreasing spasm or involuntary contraction in a muscle or group of muscles of a patient induced by pathologic neural stimulation caused by cerebrospinal injury or stroke) ；Aoki 等的 5，721，215 (treatment of neuromuscular
12disorders) ；Binder StJ 5, 714, 468 (reduction of migraine headache pain) ；Binder 白勺 5, 670, 484(treating skin lesions associated with a cutaneous cell-proliferative disorder)；和前述專利族的其他專利，其內(nèi)容在此通過引用以其整體明確并入。本發(fā)明突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽還可用于治療大腦性麻痹相關(guān)的下肢 痙攣(Koman 等，J. Pediatr. Orthop. 20(1) :108_115，2000)、弛緩不能(Kolbasnik 等，Am. J. Gastroenterol. 94(12) :3434-3439，1999)、病理流淚(Riemann 等， Ophthalmology 106(12) -.2322-2324,1999),聲帶肉芽腫(Orloff 等，Otolaryngol. Head Neck Surg. 121(4) :410_413，1999)、胰腺分裂和急性復(fù)發(fā)性胰腺炎(Wehrmann 等， Gastrointest. Endosc. 50(4) :545_548,1999)、acute-onset esotropia (Dawson 等， Ophthalmology 106(9) :1727_1730，1999)以及其他病狀，特別是受益于異常肌肉控制改 善的那些。本發(fā)明突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽還用于美容治療，包括單獨(Carruthers等， J. Am. Acad. Dermatol. 34(5Pt 1) 788-977,1996 ；Frankel 等，Arch. Otolaryngol Head Neck Surg. 124(3) :321_323，1998)、與用于美容皮膚治療的其他抗皺劑(例如肉毒桿菌毒 素)組合或與激光平滑和外科手術(shù)的組合療法(Carruthers等，Dermatol. Surg. 24(11) 1244-7,1998)及類似治療。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知，抗皺劑還可包括可以是直鏈、支鏈 或環(huán)狀和飽和或不飽和的a-含氧酸和含氧酸，包括視黃酸、視黃醇和視黃醇酯在內(nèi)的 類視黃醇，膠原和透明質(zhì)酸，以及美國專利號5，869，068中描述的物質(zhì)。肉毒桿菌毒素A已經(jīng)表明的其他適應(yīng)癥可以包括脊柱側(cè)凸。參見Borodic的美國 專利號5，053，005。更一般地，肉毒桿菌毒素A作為松弛骨骼肌的治療已經(jīng)表明的所有適 應(yīng)癥包括在可由本發(fā)明突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽治療的現(xiàn)有適應(yīng)癥中。對于使用A型肉毒桿菌毒素治療斜視，參見Elston，J. S.，等，British Journal of Ophthalmology, 1985，69，718-724和891-896。對于使用A型肉毒桿菌毒素治療眼瞼痙 攣參見 Adenis，J. P.，等，J. Fr. Ophthalmol. ,1990,13(5)第 259-264 頁。對于治療斜視， 參見ElSton，J. S. ,Eye, 1990,4(4) :VII。對于治療痙攣性和口與下頌肌張力障礙斜頸參見 Jankovic 等，Neurology,1987，37，616—623。痙攣性發(fā)聲困難已經(jīng)使用A型肉毒桿菌毒素治療。參見Blitzer等，Ann. Otol. Rhino. Laryngol，1985，94，591-594。舌肌張力障礙使用A型肉毒桿菌毒素治療，根據(jù)Brin 等，Adv. Neurol. (1987) 50，599-608。最后，Cohen 等，Neurology (1987) 37 (增刊 1)，123-4 公開了使用A型肉毒桿菌毒素治療指痙攣。根據(jù)本發(fā)明的治療方法包括施用本發(fā)明突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽以有效導(dǎo)致 化學(xué)去神經(jīng)和臨時的肌肉麻痹。本發(fā)明突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽以有效量施用。有效量是足以提供醫(yī)療或美容 所需結(jié)果的本發(fā)明多肽的劑量。有效量將根據(jù)待治療特定病狀、待治療受治療者的年齡和 身體狀況、病狀的嚴重度、治療持續(xù)時間、共存療法(如果有)的性質(zhì)、具體施用途徑和護理 從業(yè)人員知識和經(jīng)驗范圍內(nèi)的類似因素而變化。例如，在治療受治療者中肌肉或肌肉群的 痙攣或不自主收縮時，有效量是抑制或減少痙攣或不自主收縮的量。同樣，減少皮膚皺紋或 細紋出現(xiàn)的有效量是足以減少或抑制皺紋皮膚表面之下皮下存在的肌肉群的肌肉收縮張 力以允許皮膚表面松弛并增強其光滑度的量。因此，要理解，本發(fā)明突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽可用于根據(jù)下述優(yōu)選施用方式治療上述病狀。一般優(yōu)選的是使用最大劑量，即根據(jù)合 理醫(yī)學(xué)判斷的最高安全劑量?？梢詢?yōu)選重復(fù)施用小劑量以減少、溢出、及由此對非靶向組 織的不必要效應(yīng)。有利地，本發(fā)明突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽在施用和麻痹之間缺少潛伏期。因此， 有效劑量可即時確定。施用這可以第一劑量開始治療，在發(fā)現(xiàn)麻痹低于預(yù)期水平之后可以 逐步增加劑量以實現(xiàn)預(yù)期的麻痹水平或程度。本文使用的受治療者指具有需要抑制神經(jīng)元活性、導(dǎo)致延長的麻痹時段的病狀 (例如上述病狀)的任何哺乳動物(優(yōu)選人類，并且包括非人靈長類、牛、馬、豬、綿羊、山羊、 狗、貓或嚙齒類)。美容除皺面部表情線(例如橫向額頭線或鼻唇褶)是通過將面部肌肉輪廓連接到真皮中而 產(chǎn)生的。一般公知面部肌肉的收縮產(chǎn)生面部表情的各種特征形式，例如笑、做鬼臉等。此外， 面線放大也與衰老過程有關(guān)。本發(fā)明突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽應(yīng)用的一般原則是限制面 部肌肉張力收縮狀態(tài)以減少肌肉張力并改善或改變面部表情的質(zhì)量和特征。在優(yōu)選的實施方案中，橫向額頭線強度可以通過在額頭上緣和眉毛上方約15mm 點處的四個注射位點注射擴散區(qū)域約5至10mm的量的本發(fā)明突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽 而減輕。這在額頭兩側(cè)對稱進行。眉間線(額頭中間位置的皺眉線)可以通過用產(chǎn)生5至 10mm去神經(jīng)區(qū)域的量治療眉間肌來靶向。本發(fā)明突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽在額頭中間 位置眉線上方15mm注射。鼻唇褶線強度可以通過治療從顴弓出發(fā)并對角延伸至鼻唇褶位 置的主要和次要顴肌來減輕。沿這些肌肉上緣擴散5至10mm距離的本發(fā)明多肽的注射將 有效減輕這條線。而且，唇位置可以通過注射主要和次要顴肌來控制。上唇的突起可以通 過這些肌肉的注射而減輕和甚至逆轉(zhuǎn)。此外，下唇突起可以通過以產(chǎn)生在下唇之下約15mm 的下巴水平5至10mm的去神經(jīng)區(qū)域的劑量在距中線約5mm的點注射頦肌而被減輕。或者，與肉毒桿菌病毒相此有利地，經(jīng)皮系統(tǒng)也可用于遞送本發(fā)明突觸后靶向化 學(xué)去神經(jīng)多肽以實現(xiàn)與注射類似的去神經(jīng)區(qū)域。該方法可進一步包括共同施用選自由含氧酸和類視黃醇組成的抗皺劑組成的組。 在優(yōu)選實施方案中，含氧酸選自由可以是直鏈、支鏈或環(huán)狀和飽和或不飽和的a -含氧酸和 3 “含氧酸組成的組，并且類視黃醇選自由視黃酸、視黃醇、視黃醇酯、透明質(zhì)酸和/或膠原 組成的組。抑制牙齒磨損真正磨牙癥的不自主磨牙特征是由咬肌、顳肌和翼狀肌的不自主收縮引起的。當(dāng) 肌肉經(jīng)歷化學(xué)去神經(jīng)時，咬肌和顳肌通常被靶向。它們被注射以限制本發(fā)明突觸后靶向化 學(xué)去神經(jīng)多肽滲入肌肉體積和本體。擴散應(yīng)優(yōu)選限于不超過25至35mm的距離。優(yōu)選地， 單位劑量注射在這些肌肉的每個的表面的多個點經(jīng)皮膚或經(jīng)粘膜給予。當(dāng)然，應(yīng)當(dāng)在應(yīng)用 本發(fā)明多肽之前進行適當(dāng)?shù)难例X評價以評估對牙齒損傷或潛在損傷的程度。中風(fēng)和腦脊髓損傷腦血管損傷(中風(fēng)和腦脊髓損傷)可以引起痙攣和由麻痹和痙攣導(dǎo)致的收縮。盡 管本發(fā)明突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽產(chǎn)生麻痹，但它們可用于減少肌肉量并幫助痙攣。癥 狀性痙攣可以導(dǎo)致慢性不自主運動以及肢體收縮姿勢或收縮的困難。本發(fā)明多肽對這些痙攣狀態(tài)的應(yīng)用涉及肢體肌肉神經(jīng)支配區(qū)的了解。異常姿勢或異常運動中涉及的肌肉可以使 用肌電針識別?；诮?jīng)驗和對關(guān)于肢體位置和運動能力的肌肉收縮狀態(tài)的理解，此類肌肉 還可以識別為引起姿勢畸形。這些肌肉在靠近神經(jīng)支配區(qū)的位點用針頭刺入。在一些情形 下，可能有必要使用刺激電流經(jīng)聚四氟乙烯涂層肌電針刺激肌肉以確保注射的正確定位。 本發(fā)明突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽以適合產(chǎn)生去神經(jīng)區(qū)域的劑量水平注射，所述去神經(jīng)區(qū) 域涵蓋肌肉的神經(jīng)支配區(qū)或整個肌肉。沿長肌肉的多點注射可能是必要的，以孤立對該肌 肉的效應(yīng)。大腦性麻痹大腦性麻痹源于與通常在出生時的缺氧或血管功能不全相關(guān)的各種形式的腦損 傷。中樞運動系統(tǒng)的中樞皮層的破壞導(dǎo)致不自主的運動痙攣、異常姿勢和不希望的肌肉攣 縮。物理療法和有時解痙藥物用于治療大腦性麻痹。在痙攣涉及疼痛、畸形、不自主運動或 患者功能能力限制的情形下，可以使用本發(fā)明突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽。應(yīng)用包括靶向 對患者殘疾至關(guān)重要的肌肉群，例如產(chǎn)生肢體變形或自主運動損害的肌肉，或者在攣縮似 乎發(fā)展成異常姿勢的情形下。該疾病的治療劑量將包括靶向這些肌肉并使用與用于治療腦血管疾病類似的制 劑。大肌肉應(yīng)用的原型是痙攣性斜頸。靶向肌肉用足以涵蓋肌肉神經(jīng)支配區(qū)的劑量注射。多發(fā)性硬化多發(fā)性硬化是中樞神經(jīng)系統(tǒng)腦白質(zhì)疾病。其包括導(dǎo)致腦干中皮質(zhì)脊髓軌道和聯(lián)想 軌道損害的脫髓鞘過程。這導(dǎo)致脊髓損傷和導(dǎo)致的痙攣。多發(fā)性硬化中的痙攣可能因為不 自主運動、攣縮、姿勢畸形以及在某些情形下的疼痛而是衰減的。此類肌肉麻痹可以用本發(fā) 明突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽治療。同樣，本發(fā)明突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽靶向表現(xiàn)過度活躍的肌肉，由醫(yī)生、神經(jīng) 病學(xué)家、腳病專家或整形外科醫(yī)生來確定。肌肉注射足以在容量上涵蓋肌肉或其神經(jīng)支配 區(qū)或兩者的量。實施者需要肌肉解剖、神經(jīng)支配和功能性解剖的工作知識來實現(xiàn)最佳結(jié)果。帕金森病帕金森病特征為三個基本缺陷運動不能(缺乏運動)；顫抖(不自主運動)；和 僵化(肌肉群中肌張力增加)。本發(fā)明突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽可用于改善帕金森病中 存在的震顫程度和僵化，盡管本發(fā)明多肽可能不適合運動不能。在帕金森病的某些情形下，患者肢體發(fā)生嚴重的肌張力障礙。在這些情形下，不自 主運動是放大的、痙攣的并通常是疼痛的。本發(fā)明突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽以足以涵蓋 肌肉容積或其神經(jīng)支配區(qū)或兩者的量被注射入肌肉。這優(yōu)選使用EMG機的刺激電極針或結(jié) 合EMG機的刺激電極針進行以確保針頭在肌肉中的正確定位。本發(fā)明突觸后靶向化學(xué)去神 經(jīng)多肽優(yōu)選在大肌肉的多個注射點給予以確保涵蓋足夠百分比的神經(jīng)支配區(qū)。頭痛緊張性頭痛可以產(chǎn)生于骨骼肌應(yīng)激，公開于美國專利號5，714，468。本發(fā)明突觸后 靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽可用于通過靶向化學(xué)去神經(jīng)涉及肌肉來幫助緩解頭痛癥狀外科手術(shù)臨時麻痹本文使用的“臨時麻痹”或“暫時麻痹”指靶向肌肉響應(yīng)與本發(fā)明突觸后靶向化學(xué)
15去神經(jīng)多肽接觸而表現(xiàn)出麻痹的許多不同可能的時間段。本發(fā)明提供具有一系列效價的許 多此類突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽。不受理論束縛，麻痹持續(xù)時間取決于特定多肽的結(jié)合 動力學(xué)、可用肌肉nAChR的數(shù)目、受體翻轉(zhuǎn)動力學(xué)和新受體展示以及肌肉活性的閾值信號。 因此，較短的麻痹持續(xù)時間可以通過例如以下來實現(xiàn)使用相對低效價的突觸后靶向化學(xué) 去神經(jīng)多肽，施用小量多肽以減少效應(yīng)所需的最小的受體對肌肉面積的占據(jù)，施用多肽持 續(xù)短時段以減少減少效應(yīng)所需的最小的受體對肌肉面積的占據(jù)，或進行多肽的單次施用或 不頻繁施用，或這些方法的組合。例如，可以選擇短鏈a-神經(jīng)毒素，而不是對a-lnAChR 表現(xiàn)出更高親和力和/或?qū)-lnAChR表現(xiàn)出不可逆結(jié)合的修飾的長鏈a-神經(jīng)毒素。還 可以選擇潛在的短鏈a-神經(jīng)毒素組中對a-lnAChR具有相對低的親和力的一類。相反， 為了實現(xiàn)較長的麻痹持續(xù)時間，可以使用相對高效的修飾長鏈a-神經(jīng)毒素，可以使用大 量毒素來提高受體對肌肉面積的占據(jù)，施用時段(例如，持續(xù)施用)可以被增加以提高受體 隨時間對肌肉面積的占據(jù)，或者可以進行重復(fù)施用，或者可以使用這些方法的組合。配制和施用許多施用途徑是可用的。當(dāng)然，選擇的特定方式取決于待治療病狀的性質(zhì)和治療 效力所需的劑量。一般而言，本發(fā)明方法可以使用醫(yī)學(xué)可接受的任何施用方式來實施，醫(yī)學(xué) 可接受的施用方式指產(chǎn)生活性化合物的有效水平而不引起臨床上不可接受的副作用的任 何方式。通常，此類施用方式包括胃腸外途徑。術(shù)語“胃腸外”包括皮下、肌內(nèi)、皮內(nèi)、經(jīng)皮 或局部輸注。經(jīng)皮、皮下和肌內(nèi)途徑是最優(yōu)選的。由于與本發(fā)明物質(zhì)相關(guān)的毒性，應(yīng)該避免 口服和靜脈內(nèi)施用。因此，突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽可以通過肌內(nèi)注射直接施用至局部區(qū)域，例如 痙攣肌肉，優(yōu)選在神經(jīng)肌肉接頭的區(qū)域?；蛘?，如果合適，可以采用皮下遞送將突觸后靶向 化學(xué)去神經(jīng)多肽直接遞送至患病區(qū)域。有利地，如本文所述，可以采用經(jīng)皮遞送和/或常規(guī) 微注射技術(shù)來影響緊靠皮膚的骨骼肌。突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽可以被提供為無菌無熱 原水溶液或分散體以及用于重構(gòu)成無菌溶液或分散體的無菌粉末。如果需要，可以添加張力調(diào)節(jié)劑(例如氯化鈉、甘油和各種糖)，還可以包括穩(wěn)定 劑(例如人血清白蛋白)。制劑可以借助適合的藥學(xué)上可接受的防腐劑(例如對羥基苯甲 酸)來保存，盡管優(yōu)選其不被保存。優(yōu)選地，突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽以單位劑量形式配制；例如，其可以提供為管 形瓶中的無菌溶液或提供為含有用于重構(gòu)適合注射的媒介物(例如鹽水)的凍干粉末的管 形瓶或藥袋。施用于突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽患者的突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽的劑量取 決于病狀嚴重度；例如，需要治療的肌肉群數(shù)目，患者年齡和體重以及毒素效價。毒素效價 表示為小鼠LD5(I值的倍數(shù)，基于小鼠，多肽的一個單位(U)定義為等于殺死體重為17至22 克Swiss-Webster小鼠組的50%的量。人類治療應(yīng)用中使用的劑量大致與被注射肌肉量成比例。通常，施用于患者的劑 量可以達約0. 01至約1，000單位；例如，達約500單位，并且優(yōu)選范圍是每次治療每例患者 約80至約460單位，盡管在適當(dāng)情況下可以施用更小或更大的劑量。當(dāng)醫(yī)生比較熟悉該產(chǎn)品的使用后，可以改變劑量。本發(fā)明突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng) 多肽施用量及其施用頻率可以根據(jù)負責(zé)治療的醫(yī)生判斷并且與特定多肽和施用方式產(chǎn)生
16的安全問題和效應(yīng)相稱。有利地，本發(fā)明突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽在施用和麻痹之間缺少潛伏期。因此， 有效劑量可即時確定。施用者可以用第一劑量開始治療，發(fā)現(xiàn)麻痹低于預(yù)期水平后，可以逐 步增加劑量以實現(xiàn)預(yù)期的麻痹水平或程度。藥物組合物本發(fā)明突觸后化學(xué)去神經(jīng)多肽可以單獨施用或作為藥物組合物的部分施用。此類 藥物組合物可以包括與本領(lǐng)域已知的任何標準的藥理學(xué)和/或藥學(xué)上可接受載體結(jié)合的本 發(fā)明突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽。參見例如Remington' s Pharmaceutical Sciences，第 18版.(1990, Mack Publishing Co.，Easton，Pa.)。載體可以根據(jù)施用(例如，肌內(nèi)、皮下 或胃腸外)所需的制劑形式而采用多種形式。組合物可進一步含有抗氧化劑、穩(wěn)定劑、防腐 劑及類似物。組合物應(yīng)該是無菌的并且含有治療有效量的以適合施用至患者的體重或體積 單位的本發(fā)明突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽。本文使用的術(shù)語“藥學(xué)上可接受載體”指一種或多種適合施用于人或其他動物的 相容的固體或液體填充劑、稀釋劑或封裝物質(zhì)。術(shù)語“載體”指天然或合成的有機或無機成 分，活性化合物與其結(jié)合以促進應(yīng)用。藥物組合物的組分還能夠以不存在實質(zhì)影響預(yù)期藥 學(xué)效力的相互作用的方式與本發(fā)明分子混合和彼此混合。藥學(xué)上可接受的進一步指無毒性 物質(zhì)，其與諸如細胞、細胞培養(yǎng)物、組織或生物體等生物系統(tǒng)是相容的。載體特征取決于施 用途徑。藥理學(xué)和藥學(xué)上可接受載體包括稀釋劑、填充劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑、增溶劑和本領(lǐng)域 公知的其他物質(zhì)。適合胃腸外施用的組合物適宜包含本發(fā)明突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽的無菌水 性制劑和非水性制劑。所述水性制劑可以根據(jù)公知方法使用適合的分散劑或潤濕劑和懸浮 劑配制。水性載體包括水、醇/水溶液、乳狀液或懸浮液，包括鹽水和緩沖介質(zhì)。非水性溶 劑的實例有丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄欖油)和可注射有機酯(例如油酸乙酯)， 并且包括合成的單_或二-甘油酯。無菌注射制劑還可以是在無毒胃腸外可接受稀釋劑或 溶劑中的無菌注射溶液或懸浮液，例如1，3_ 丁二醇中的溶液。此外，脂肪酸(例如油酸) 可用于注射制劑。優(yōu)選的胃腸外媒介物包括氯化鈉溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化鈉、 乳酸林格氏或固定油。適合皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)等施用的載體制劑可以參見Remington' s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.，Easton，Pa。 以防冑齊ll禾口胃 添加劑，例如抗微生物及、抗氧化劑、螫合劑和惰性氣體及類似物。藥物組合物可適宜以單位劑量形式與使用說明書一起提供于包裝、藥盒及類似物 中，并且可以通過藥學(xué)領(lǐng)域公知的任何方法制備。所有方法包括使本發(fā)明突觸后靶向化 學(xué)去神經(jīng)多肽與構(gòu)成一種或多種輔助成分的載體形成結(jié)合的步驟。一般而言，組合物通過 使本發(fā)明突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽與液體載體、細碎固體載體或兩者形成均勻且緊密結(jié) 合，然后必要時定型產(chǎn)物來制備。其他遞送系統(tǒng)可以包括定時釋放、延遲釋放或持續(xù)釋放遞送系統(tǒng)。此類系統(tǒng)可以 避免重復(fù)施用本發(fā)明突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽，提高受治療者和醫(yī)生的便利。許多類型 的釋放遞送系統(tǒng)是可用的并且對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言是已知的。它們包括基于聚合 物的系統(tǒng)，例如聚(丙交酯-乙交酯)、共聚草酸酯、聚己酸內(nèi)酯、聚酰胺酯、聚原酸酯、聚羥 基丁酸和聚酸酐。含有藥物的前述聚合物的微膠囊描述于例如美國專利號5，075，109。遞送系統(tǒng)還可以包括非聚合物系統(tǒng)，它們是脂質(zhì)，包括留醇(例如膽固醇)、膽固醇酯和脂肪 酸或中性脂肪(例如單_、二-和三甘油酯)；水凝膠釋放系統(tǒng)；sylastic系統(tǒng)；基于肽的系 統(tǒng)；賭包衣；使用常規(guī)粘合劑和賦形劑的壓制片；部分融合的植入體；及類似物。具體實例 包括但不限于(a)其中a-神經(jīng)毒素分子以基質(zhì)內(nèi)形式包含的侵蝕系統(tǒng)，例如描述于美國 專利號4，452，775,4, 675，189和5，736，152中的那些，和(b)其中活性組分以控制速率從 聚合物滲透的擴散系統(tǒng)，例如描述于美國專利號3，854，480,5, 133，974和5，407，686中的 那些。此外，可以使用基于泵的硬件遞送系統(tǒng)，其中一些適于植入。長期持續(xù)釋放植入劑的使用可能特別適合治療慢性病狀。本文使用的長期釋放指 植入劑被構(gòu)建并安排以持續(xù)至少30天、優(yōu)選60天遞送治療水平的活性成分。長期持續(xù)釋 放植入劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且包括上文所述的一些釋放系統(tǒng)。本發(fā)明還提供了本發(fā)明突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽的化學(xué)修飾的衍生物，其可以 提供其他優(yōu)點，例如增加多肽的溶解度、穩(wěn)定性和循環(huán)時間或增加的免疫原性(參見，例如 美國專利號4，179，337)。因此，本發(fā)明涵蓋本發(fā)明突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽的衍生化，例 如使用可發(fā)揮穩(wěn)定功能的化合物(例如，增加多肽在溶液中的半衰期，使多肽更溶于水，增 加多肽的親水或疏水特征等)。用作穩(wěn)定物質(zhì)的聚合物可以是天然、半合成(修飾的天然) 或合成來源的。示例性天然聚合物包括天然存在的多糖，例如阿拉伯聚糖、果聚糖、巖藻 聚糖、半乳聚糖、聚半乳糖醛酸、葡聚糖、甘露聚糖、木聚糖(例如菊糖)、果聚糖、巖藻依聚 糖、角叉菜膠、galatocarolose、果膠酸、果膠，包括直鏈淀粉、出芽短梗霉聚糖、糖原、支鏈 淀粉、纖維素、葡聚糖、糊精、右旋糖、葡萄糖、聚葡萄糖、聚右旋糖、石耳素、殼多糖、瓊脂糖、 角蛋白、軟骨素、皮膚素、透明質(zhì)酸、藻酸、黃質(zhì)膠、淀粉和各種其他天然同聚物或異聚物，例 如含有下述醛糖、酮糖、酸或胺的一種或多種的那些赤蘚糖(erythose)、蘇糖、核糖、阿拉 伯糖、木糖、來蘇糖、阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、右旋糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖、塔羅 糖、赤蘚酮糖、核酮糖、木酮糖、阿洛酮糖、果糖、山梨糖、塔格糖、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、 蔗糖、海藻糖、麥芽糖、纖維二糖、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷 氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、葡糖醛酸、葡糖酸、葡糖二酸、半乳糖醛 酸、甘露糖醛酸、葡糖胺、半乳糖胺和神經(jīng)氨酸及其天然存在的衍生物。因此，適合的聚合 物包括例如蛋白質(zhì)，例如白蛋白、聚藻酸酯、丙交酯-乙交酯共聚物。示例性半合成聚合物 包括羧甲基纖維素、羥甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、甲基纖維素和甲氧基纖維素。示例 性合成聚合物包括聚磷腈、羥基磷灰石、氟磷灰石聚合物、聚乙烯(例如，聚乙二醇(包括 例如稱為Pluronics 的化合物類，可商業(yè)途徑獲自BASF，Parsippany, N. J.)、聚氧乙烯和 聚對苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene ter印hthlate))、聚丙烯(例如聚丙二醇)、聚氨 酯(例如，聚乙烯醇(PVA)、聚氯乙烯和聚乙烯吡咯烷酮)、聚酰胺、包括尼龍、聚苯乙烯聚乳 酸、氟化烴聚合物、氟化碳聚合物(例如，聚四氟乙烯)、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、和聚甲基 丙烯酸甲酯及其衍生物。鑒于本公開內(nèi)容，結(jié)合本領(lǐng)域已知信息，例如Unger，美國專利號 5，205，290 (其公開內(nèi)容在此通過引用整體并入)中描述和提及的那些信息，采用聚合物作 為穩(wěn)定化合物制備本發(fā)明衍生的長鏈a-神經(jīng)毒素的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是明 顯的。用于衍生化的化學(xué)部分可以選自水溶性聚合物，例如聚乙二醇、乙二醇/丙二醇 共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇及類似物。多肽可以在分子內(nèi)隨機位置修飾或者在分子內(nèi)預(yù)定位置修飾，并且可以包括一個、兩個、三個或更多個連接的化學(xué)部分。在一些實施方案中，本發(fā)明本發(fā)明突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽的化學(xué)衍生化使用 親水性聚合物殘基進行。示例性親水性聚合物，包括衍生物，可以是包括如下的那些其中 重復(fù)單元含有一個或多個羥基(聚羥基聚合物)的聚合物，包括例如聚(乙烯醇)；其中重 復(fù)單元含有一個或多個氨基的聚合物(聚胺聚合物)，包括例如肽、多肽、蛋白質(zhì)和脂蛋白， 例如白蛋白和天然脂蛋白；其中重復(fù)單元含有一個或多個羧基的聚合物(聚羧基聚合物)， 包括例如羧甲基纖維素、藻酸及其鹽，例如藻酸鈉和藻酸鈣、糖胺聚糖及其鹽，包括透明質(zhì) 酸鹽、碳水化合物的磷酸化和磷酸化衍生物以及硫代磷酸酯寡聚物；和其中重復(fù)單元含有 一個或多個糖部分的聚合物(多糖聚合物)，包括例如碳水化合物。親水聚合物的分子量可以變化并且一般是約50至約5，000, 000,分子量約100至 約50，000的聚合物是優(yōu)選的。聚合物可以是分支或未分支的。更優(yōu)選的聚合物具有約150 至約10，000的分子量，200至約8，000的分子量是更優(yōu)選的。對于聚乙二醇而言，優(yōu)選的分子量是約lkDa至約lOOkDa(術(shù)語“約”表示在制備 聚乙二醇中，一些分子可以此所述分子量更重或更輕)以易于操作和生產(chǎn)。可以根據(jù)預(yù)期 治療特征(例如，所需的持續(xù)釋放持續(xù)時間、對生物活性的效應(yīng)(如果有)、易于操作、抗原 性程度或缺乏以及聚乙二醇對治療性蛋白或類似物的其他已知效應(yīng))使用其他大小?？捎糜谘苌景l(fā)明突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽的其他優(yōu)選聚合物包括例如聚 (乙二醇)(PEG)、聚(乙烯吡咯烷)、p0ly0X0merS、聚山梨酯和聚(乙烯醇)，PEG聚合物是 特別優(yōu)選的。PEG聚合物中優(yōu)選的是分子量約100至約10，000的PEG聚合物。更優(yōu)選地， PEG聚合物具有約200至約8，000的分子量，且分子量分別為2，000,5, 000和8，000的PEG 2，000、PEG 5，000和PEG 8，000是更優(yōu)選的。除了上述示例的那些，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù) 本公開內(nèi)容容易知道其他適合的透明質(zhì)酸聚合物。一般而言，使用的聚合物可以包括可通 過烷基化或?；磻?yīng)連接到本發(fā)明突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽的聚合物。鑒于對蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)域或抗原結(jié)構(gòu)域的效應(yīng)，聚乙二醇分子(或其他化學(xué)部 分)應(yīng)該連接到本發(fā)明突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽。有許多本領(lǐng)域技術(shù)人員可用的連接 方法，例如EP0401384，在此通過引用并入(將PEG偶聯(lián)至G-CSF)，還參見Malik等，Exp. Hematol. 20 1028-1035 (1992)(報道了使用三氟乙烷磺酰氯PEG化GM-CSF)。例如，聚乙 二醇可通過經(jīng)由反應(yīng)基因(例如游離氨基或羧基)的氨基酸殘基共價鍵合。反應(yīng)基因是活 化聚乙二醇分子可以結(jié)合的那些基團。具有游離氨基的氨基酸殘基可以包括賴氨酸殘基和 N末端氨基酸殘基；具有游離羧基的氨基酸殘基可以包括天冬氨酸殘基、谷氨酸殘基和C末 端氨基酸殘基。硫氫基也可用作連接聚乙二醇分子的反應(yīng)基團。治療目的優(yōu)選的是在氨基 連接，例如在賴氨酸基團的N末端連接?？赡芴貏e需要在N末端化學(xué)修飾的蛋白質(zhì)。使用聚乙二醇作為本發(fā)明組合物的實 例說明，可以從多種聚乙二醇分子選擇(根據(jù)分子量、分支等)反應(yīng)混合物中聚乙二醇分子 與蛋白(多肽)分子的比例、要進行的PEG化反應(yīng)的類型以及獲得選擇的N末端PEG化蛋 白的方法。獲得N末端PEG化制劑(即，必要時將該部分與其他單PEG化部分分離)的方 法可以通過從PEG化蛋白分子群純化N末端PEG化物質(zhì)。在N末端修飾的化學(xué)修飾的選擇 性蛋白可以通過還原烷基化實現(xiàn)，還原烷基化利用可用于特定蛋白衍生化的不同類型的主 要氨基(賴氨酸對N末端)的差異反應(yīng)性。在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件下，實現(xiàn)了在N末端用含羧
19基的聚合物對蛋白的基本上選擇性的衍生化。與上述示例的各種聚合物一樣，預(yù)期聚合物殘基還可以含有官能團，例如通常參 與連接聚合物殘基與本發(fā)明多肽的基團。此類官能團包括例如羧基、胺、羥基和硫醇基團。 如果需要，聚合物殘基上的這些官能團可以進一步與一般與此類官能團反應(yīng)性并且可以幫 助體內(nèi)靶向特定組織(例如患病組織)的物質(zhì)反應(yīng)。可以與其他官能團反應(yīng)的示例性物質(zhì) 包括例如蛋白，包括抗體，碳水化合物、肽、糖肽、糖脂、凝集素和核苷。除了親水聚合物殘基外，用于衍生化本發(fā)明突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽的化學(xué)物 質(zhì)可以是糖殘基?？梢匝苌氖纠蕴前ɡ鐔翁腔蛱谴?，例如赤蘚糖、蘇糖、核糖、 阿拉伯糖、木糖、來蘇糖、果糖、山梨糖醇、甘露糖醇和景天庚酮糖，優(yōu)選的單糖是果糖、甘露 糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖醇和山梨糖醇；二糖，例如乳糖、蔗糖、麥芽糖和纖維二糖。其他 單糖包括例如肌醇和神經(jīng)節(jié)苷脂頭基。除了上述示例的那些，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本公開 內(nèi)容將容易知道其他適合的糖。一般而雷，可用于衍生化的糖包括可通過烷基化或?；?應(yīng)與本發(fā)明突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽連接的糖。還包括用多糖(例如殼多糖)衍生化。而且，本發(fā)明還涵蓋例如脂質(zhì)(包括陽離子脂質(zhì)、陰離子脂質(zhì)、聚合脂質(zhì)、帶點脂 質(zhì)、合成脂質(zhì)、飽和脂質(zhì)、不飽和脂質(zhì)和上述任何組合、等)穩(wěn)定劑衍生化本發(fā)明突觸后靶 向化學(xué)去神經(jīng)多肽。而且，本發(fā)明涵蓋本發(fā)明突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽的其他修飾。此類其他修飾 是本領(lǐng)域已知的，并且連同衍生化方法等具體提供于美國專利號6，028，066，其在此通過引 用整體并入。顯然，不同于本領(lǐng)域常規(guī)采用的肉毒桿菌毒素，鑒于本發(fā)明多肽獲得的顯著尺寸 減小和穩(wěn)定性提高，本發(fā)明突觸后化學(xué)去神經(jīng)多肽還可以有利地通過經(jīng)皮遞送而施用。可 以有利地使用生物相容性植入物(例如美國專利號6，306，423和6，312，708中描述的那 些)以及經(jīng)皮貼片系統(tǒng)(例如美國專利公布2004/0009180)和固體溶液穿孔器(例如美 國專利公布)及類似物可以有利地使用。常規(guī)微注射技術(shù)(例如Martanto等，Pharm. Res. 21 947(2004) ；Wang 等，J. Inv. Derm. 126 1080-87 (2006)禾P Xie 等，Nanomedicine， Biotechnology and Medicine, 1 1-190 (200)提供的那些)可以結(jié)合本文提供的a-神經(jīng) 毒素組合物和方法使用。超聲技術(shù)(例如Mitragotri等，Science5225 :850-853(1995)描 述的那些)可以與本文描述的組合物和方法一起使用。附加或者可選地，還可以有利地使用例如Chen等Nature Biotechnology, 24 455-60(2006)和 / 或 Prausnitz，Nature Biotechnology24 416-17 (2006)描述的肽伴侶 分子的共同施用。在一個實施方案中，特別考慮與經(jīng)皮肽序列ACSSSPSKHCG的共同施用，因 為已經(jīng)顯示其促進類似大小的蛋白分子通過完整皮膚的有效經(jīng)皮蛋白藥物遞送。參見Chen 等，同上。本發(fā)明突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽可隨時間單獨施用或與上述藥物療法組合施 用(共同施用)，通過任何常規(guī)途徑，包括注射、重復(fù)注射、局部應(yīng)用等。施用可以例如是腹 膜內(nèi)、肌內(nèi)、腔內(nèi)、皮下或經(jīng)皮的。當(dāng)使用本發(fā)明突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽時，優(yōu)選直接施 用至患病部位(例如，不自主痙攣的肌肉、皺紋等)，例如注射施用。術(shù)語“共同施用”指與另一物質(zhì)基本上同時施用?；旧贤瑫r是指突觸后靶向化學(xué) 去神經(jīng)多肽在與施用其他物質(zhì)(例如，抗皺劑等)時足夠近的時間被施用至受治療者。其
20他物質(zhì)可以存在于與突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽不同的制劑中，或者其可以是相同制劑的 一部分。共同施用的物質(zhì)可以與本發(fā)明突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽合作、附加或協(xié)同起作 用以產(chǎn)生預(yù)期效應(yīng)，例如減少皺紋。其他物質(zhì)以有效量施用。此類量可能小于當(dāng)物質(zhì)單獨 施用和不與本發(fā)明突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽組合施用時足以提供治療益處的量。本領(lǐng)域 普通技術(shù)人員能夠確定需要的有效量。參考下述實施例將更全面理解本發(fā)明。然而，這些實施例僅是要實例說明本發(fā)明 的實施方案并不被解釋為限制本發(fā)明的范圍。表1-下面公開了長鏈a-神經(jīng)毒素多肽。這些多肽的分離和/或修飾形式可以 結(jié)合本文所述組合物和方法使用。
物種序列 Id#序列孟加拉眼鏡蛇1IRCHTPDITSKDCPNGHVCYTKTWCDAFCSIRGKRVDLGCAATCPT VKTGVDIQCCSTDNCNPFPTRKRP孟加拉眼鏡蛇2IRCHTPDITSKDCPNGHVCYTKTWCDAFCSIRGKGVDLGCAATCPT VKTGVDIQCCSTDNCNPFPTRKRP孟加拉眼鏡蛇3IRCnTPDITSKDCPNGHVCYTKTWCDAFCSIRGKRVDLGCAATCPT VKTGVDIQCCSTDNCT孟加拉眼鏡蛇4IRCnTPDITSKDCPNGRVCYTKTWCDAFRSIRGKRVDLGCAATCPT VKTGVDIQCCSTDNCNPFPTRKRP印度眼鏡蛇5IRCnTPDITSKDCPNGHVCYTKTWCDAFCSIRGKRVDLGCAATCPT VKTGVDIQCCSTDDCDPFPTRKRP印度眼鏡蛇6IRCnTPDITSKDCPNGHVCYTKTWCDGFCSIRGKRVDLGCAATCPT YRTGVDIQCCSTDDCDPFPTRKRP印度眼鏡蛇7IRCnTPDITSKDCPNGHVCYTKTWCDGFCRIRGERVDLGCAATCPT VKTGVDIQCCSTDDCDPFPTRKRP印度眼鏡蛇8IRGnTPDITSKDCPNGHVCYTKTWCDGFCSRRGERVDLGCAATCPT VKTGVDIQCCSTDDCDPFPTRKRP印度眼鏡蛇9IRCnTPDITSKDCPNGHVCYTKTWCDGFCSSRGKRVDLGCAATCPT VRTGVDIQCCSTDDCDPFPTRKRP爪哇噴毒眼鏡蛇10IRCFITPDVTSTDCPNGHVCYTKTWCDGFCSSRGRRVELGCAATCPT VKPGVDIQCCSTDNCNPFPTRP埃及眼鏡蛇11IRCHTPDVTSQACPDGQNICYTKTWCDNFCGMRGKRVDLGCAATC PTVKPGVDIKCCSTDNCNPFPTRERS埃及眼鏡蛇12IRCHTPDVTSQACPDGHVCYTKMWCDNFCGMRGKRVDLGCAATC PTVKPGVDIKCCSTDNCNPFPTRKRS中亞眼鏡蛇13ITCYKTPIPITSETCAPGQNLCYTKTWCDAWCGSRGKVIELGCAATC PTVESYQDIKCCSTDDCNPHPKQKRP黃金眼鏡蛇14IRCFITPDVTSQACPDGHVCYTKMWCDNFCGMRGKRVDLGCAATC PKVKPGVNIKCCSRDNCNPFPTRKRS森林眼鏡蛇15IRCnTPDVTSQICADGHVCYTKTWCDNFCASRGKRVDLGCAATCP TVKPGVNIKCCSTDNCNPFPTRNRP
權(quán)利要求
1.一種分離的突觸后化學(xué)去神經(jīng)多肽，其中所述多肽對含有α-1的人類肌肉nAChR表 現(xiàn)出的Kd比所述多肽對包括a7nAChR、a 3nAChR、a 4nAChR和a 2nAChR在內(nèi)的任一神經(jīng) 元nAChR的Kd小至少100倍。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)去神經(jīng)多肽，其中所述化學(xué)去神經(jīng)多肽包括天然短鏈 a -神經(jīng)毒素。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)去神經(jīng)多肽，其中所述化學(xué)去神經(jīng)多肽包括缺少三指折 疊環(huán)II中第五個二硫鍵的天然長鏈a -神經(jīng)毒素。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)去神經(jīng)多肽，其中所述化學(xué)去神經(jīng)多肽包括缺少三指折 疊環(huán)II中第五個二硫鍵的修飾長鏈a -神經(jīng)毒素。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的化學(xué)去神經(jīng)多肽，包括重組α-神經(jīng)毒素。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)去神經(jīng)多肽，其中所述突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽以小 于KT8M4的平衡解離常數(shù)(Kd)與含有a 1的人類肌肉煙堿性乙酰膽堿受體(nAChR)解離。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)去神經(jīng)多肽，其中所述突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽以小 于KT41Iiirr1的平衡解離速率(I^w)基本上不可逆地結(jié)合含有a 1的人類肌肉煙堿性乙酰 膽堿受體(nAChR)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)去神經(jīng)多肽，其中所述突觸后靶向化學(xué)去神經(jīng)多肽以大 于IO6M-1HiirT1的平衡締合速率(k^^)快速結(jié)合含有a 1的人類肌肉煙堿性乙酰膽堿受體 (nAChR)。
9.一種藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項所述的突觸后化學(xué)去神經(jīng)多肽。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其中所述化學(xué)去神經(jīng)多肽是單一α-神經(jīng)毒 素種類。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其中所述化學(xué)去神經(jīng)多肽是是兩種或多種 a-神經(jīng)毒素種類的確定混合物。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物組合物，還包含經(jīng)皮的肽。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的藥物組合物，其中所述經(jīng)皮的肽包含序列ACSSSPSKHCG。
14.一種通過選擇性阻斷骨骼肌神經(jīng)肌肉接頭中肌肉a InAChR來誘導(dǎo)暫時骨骼肌麻 痹的方法，包括向有需要的患者施用根據(jù)權(quán)利要求9-13中任一項所述的藥物組合物。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述患者經(jīng)歷外科手術(shù)并且所述藥物組合物在 外科手術(shù)之前、外科手術(shù)過程中或外科手術(shù)之后施用。
16.一種松弛皮膚組織的方法，包括將根據(jù)權(quán)利要求9-12中任一項所述的藥物組合物 以有效促進皮膚組織皮下存在的骨骼肌或骨骼肌群去神經(jīng)而促進皮膚組織的松弛或放松 的量局部施用至患者皮膚組織。
全文摘要
提供了改進的化學(xué)去神經(jīng)劑以及藥物組合物和使用方法，所述改進的化學(xué)去神經(jīng)劑包含對人類肌肉α1nAChR而不是人類神經(jīng)元α7nAChR具有高結(jié)合特異性和選擇性的多肽α-神經(jīng)毒素。
文檔編號C07K14/46GK102007142SQ200980114492
公開日2011年4月6日 申請日期2009年2月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月19日
發(fā)明者L·E·彼得斯, T·勞倫斯 申請人:麥歐賽普特股份有限公司