專(zhuān)利名稱(chēng)：生物活性肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有促凝血活性的低分子量肽，用于治療FV、FVII, FVIII、FX和/或 FXI不足的病人。
背景技術(shù)：
凝血級(jí)聯(lián)涉及一系列絲氨酸蛋白酶(酶原)和蛋白質(zhì)輔助因子。當(dāng)需要時(shí)，無(wú)活 性的酶原前體被轉(zhuǎn)化為活性形式，該形式因此轉(zhuǎn)化級(jí)聯(lián)中的下一個(gè)酶。凝血級(jí)聯(lián)被分成三 個(gè)不同的部分內(nèi)在路徑(接觸激活)、外在路徑(組織因子)、以及普通路徑。在級(jí)聯(lián)的內(nèi)在路徑中，血友病是最明顯的出血病，其導(dǎo)致因子FIX (FIXa) /因子 FVIII (FVIIIa)復(fù)合體(內(nèi)在的Tenase復(fù)合體)產(chǎn)生的因子X(jué)a不足，因而形成凝血不足。 出血可能自然地發(fā)生或者在損傷后發(fā)生。已知血友病是遺傳性出血病，并且有兩個(gè)形式的血友病一甲型血友病和乙型血 友病。甲型血友病是FVIII不足造成的結(jié)果，并且特征為出血進(jìn)入關(guān)節(jié)和肌肉。FVIII在血 漿中以非常低的濃度進(jìn)行循環(huán)，并且被非共價(jià)結(jié)合于馮維勒布蘭特因子(vWF)上。在止血 期間，F(xiàn)VIII被凝血酶活化，從vWF上分離，并且作為輔助因子用于通過(guò)增強(qiáng)激活速度進(jìn)行 的被激活的FIXa調(diào)節(jié)的FX活化。FVIII少于正常值的病人被認(rèn)為具有嚴(yán)重的血友病，F(xiàn)VIII為正常值的 被認(rèn)為中等嚴(yán)重的血友病，并且FVIII大于5%但小于40%正常值的病人被認(rèn)為輕微的血 友病?，F(xiàn)在，用于甲型血友病安排的治療法的選擇是使用不同的血漿來(lái)源濃縮物或者重 組FVIII濃縮物的替代療法。盡管包括溶劑_洗滌劑處理或者液相熱處理的特定的病毒滅 活步驟可以用來(lái)失活病毒，但在血漿衍生濃縮物中很少表征的試劑(例如朊病毒)的可能 的傳輸仍然是本技術(shù)領(lǐng)域討論的論點(diǎn)。FVIII還被作為重組體蛋白進(jìn)行合成，用于出血病癥的治療用途。這樣的產(chǎn)品具有 降低的病毒污染風(fēng)險(xiǎn)。在市場(chǎng)上有許多重組產(chǎn)物用于甲型血友病的治療。這些濃縮物之一 是Advate FVIII組合物，其在CHO細(xì)胞中被生產(chǎn)出來(lái)，并且由巴克斯特保健公司制造。在 細(xì)胞培養(yǎng)工藝、純化、或該產(chǎn)品的最終配制中沒(méi)有加入人或動(dòng)物血漿蛋白。雖然在過(guò)去的十年中FVIII的生產(chǎn)已經(jīng)取得進(jìn)展以確保純度、效力和病毒安全 性，但是仍有一些局限性。首先，嚴(yán)重甲型血友病病人頻繁地受到抗FVIII抑制劑抗體形成 的影響，致使治療無(wú)效。大約30%的嚴(yán)重HA(甲型血友病)病人發(fā)展了能夠中和FVIII的同種抗體抑 制劑(Hay,血友病· 2006 ；12，增補(bǔ)版 6 :23_9 ；Peeriinck 禾口 Hermans,血友病· 2006 ；12 579-90)。這些抑制劑典型地是免疫球蛋白G(IgG)，主要是lgG4亞類(lèi)，其不會(huì)固定補(bǔ)體并 且不會(huì)導(dǎo)致觀察到循環(huán)免疫復(fù)合物的末端器官損傷。該抑制劑出現(xiàn)在幼小年齡(10歲大約 50% )，主要出現(xiàn)在具有少于FVIII的病人身上。另外，可能會(huì)出現(xiàn)獲得性血友病，該病 是在沒(méi)有FVIII不足歷史的人體內(nèi)發(fā)展的FVIII抗體抑制劑。該狀況可能是突發(fā)性的(在 人身上發(fā)生> 50歲)，其可能膠原血管病或者分娩前后期間與有關(guān)，或者其可能代表藥物 反應(yīng)(例如，對(duì)于青霉素的反應(yīng))。出于臨床目的，抗體反應(yīng)等級(jí)能夠通過(guò)功能性抑制劑測(cè) 定的表現(xiàn)被定量，由該測(cè)定可以得到Bethesda單位(BU)抑制劑滴度。國(guó)際血栓和止血學(xué) 會(huì)(ISTH)的高滴度應(yīng)答定義是> 5BUs，并且其低滴度應(yīng)答的定義是在0. 5和5BUs之間。已經(jīng)試驗(yàn)了用大劑量人類(lèi)FVIII壓制抑制劑的嘗試。而且，已經(jīng)給藥具有與人類(lèi) FVlII抗體低交聯(lián)反應(yīng)性的豬FVIII。更頻繁地，包括被活化的凝血酶原復(fù)合物濃縮物(例 如 FEIBA(Factor Eight Inhibitor Bypassing Agent, FVIII 抑制物旁路試劑)和重組的 被活化的因子FVII (FVIIa)在內(nèi)的FVIII旁路試劑也已被使用。因?yàn)槌艘种苿┌l(fā)展的缺陷之外，治療性的多肽藥物比如FVIII也會(huì)被蛋白水解 酶快速地降解，所以FVIII需要頻繁地進(jìn)行靜脈內(nèi)給藥?？紤]到各種FVIII產(chǎn)物在循環(huán)中 的平均半衰期，這通常能夠通過(guò)一周提供FVIII兩次至三次而實(shí)現(xiàn)。因此對(duì)于門(mén)診病人群 體、尤其是小孩子而言，該治療法是相當(dāng)復(fù)雜。因此，目前許多FVIII制造商的目標(biāo)是開(kāi)發(fā)下一代產(chǎn)品，其具有增強(qiáng)的藥效和藥 物動(dòng)力學(xué)特性，同時(shí)保持所有的其他產(chǎn)物特征。因?yàn)榫哂懈L(zhǎng)循環(huán)半衰期的改進(jìn)的多肽 藥物將會(huì)降低必要的給藥數(shù)量，多肽藥物的化學(xué)修飾或酶修飾是實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)的優(yōu)選方法之一。一個(gè)這樣的實(shí)施例是多肽藥物的PEG化，用于保護(hù)并提高它們的藥效和藥物動(dòng)力 學(xué)分布型(Harris 和 Chess,Nat Rev Drug Discov. 2003 ；2 :214_21)。US 6，037，452 描述 了一種聚(烯化氧)-FVIII或者FIX結(jié)合物，其中蛋白質(zhì)被通過(guò)所述FVIII的羰基共價(jià)結(jié) 合于聚(烯化氧)。即使這些方法降低了抑制劑發(fā)展，它們?nèi)匀徊粫?huì)廢除對(duì)靜脈注射給藥的需要。 為了廢除上述討論的血友病治療的大多數(shù)缺陷，最精致的選擇將是開(kāi)發(fā)低分子量的化合 物比如肽(肽類(lèi)模擬物)，該化合物有能力改善凝血并且能夠通過(guò)非靜脈注射途徑給藥。 盡管已經(jīng)討論了多年(例如Kaufman和Pipe，血友病.1998 ；4 370-9 ；Llung, Thromb. Haemost. 1999 ；82 :525_30)，但目前沒(méi)有可購(gòu)買(mǎi)的或者在臨床中開(kāi)發(fā)的這樣的試劑。在凝血中小肽應(yīng)用的技術(shù)的當(dāng)前狀態(tài)作為文獻(xiàn)記錄的例如有下述公開(kāi)DK Liles, DM Monroe 禾口 HR Roberts (1997). Blood. Vol 90 No. 10 增干Ij 1，463a 是 一則海報(bào)摘要，公開(kāi)了一種來(lái)自FVIII的肽698-712，其能夠促進(jìn)FIXa介導(dǎo)的FX在磷脂表 面上活化。然而，在存在FVIIIa的條件下，該肽可抑制FIXa介導(dǎo)的FX在磷脂表面上活化。 迄今為止，一直沒(méi)有這些作者相關(guān)述評(píng)的公開(kāi)來(lái)證實(shí)在這些海報(bào)摘要中公開(kāi)的結(jié)果。Blostein 等(2000)，Biochemistry. 39 12000-12006 公開(kāi)了兩親性 α 螺旋能夠 與FIXaGla結(jié)構(gòu)域相互作用，并且在沒(méi)有磷脂的情況下提高FX的活化。該肽通過(guò)模擬磷 脂與氨基酸序列無(wú)關(guān)地顯示其作用。沒(méi)有建議在治療中使用這些肽。在標(biāo)準(zhǔn)情況下，被活 化的血小板提供支持凝血的脂質(zhì)
表面。因?yàn)檠“灞荒富罨?，其在脈管損傷的位 點(diǎn)被形成，凝血過(guò)程被限制在受損傷位點(diǎn)。極不期望給身體提供作為促凝血脂質(zhì)的普通替代品的肽，因?yàn)樵撾幕蛟S會(huì)引起系統(tǒng)凝血并且最終導(dǎo)致彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)。因此，被 Blostein描述的肽在治療中不會(huì)被使用。美國(guó)專(zhuān)利No. 7，109，170和6，624，289公開(kāi)了 FIXa蛋白酶結(jié)構(gòu)域的與FVIIIa相互 作用的區(qū)域。該肽包含F(xiàn)IXa上的FVIIIa結(jié)合位點(diǎn)，并且抑制FIXa與FVIIIa的結(jié)合。然 而，它們僅被用作用于抑制或者治療血栓形成的抗凝血?jiǎng)S20010014456A1公開(kāi)了對(duì)于人類(lèi)FVIII和FVIII樣蛋白質(zhì)的結(jié)合性分子。這些 多肽結(jié)合FVIII和/或FVIII樣多肽，并且可用于人類(lèi)FVIII和/或FVIII樣多肽的檢測(cè) 和由溶液比如血液或者條件培養(yǎng)基中純化。在美國(guó)專(zhuān)利No. 7，033，590中，F(xiàn)IX/FIXa活化抗體和抗體衍生物被用于提高FIXa 的酰胺水解活性，并且用于治療凝血機(jī)能障礙比如甲型血友病和出血素質(zhì)。在美國(guó)專(zhuān)利No. 7，084，109中，公開(kāi)了 FVIIa拮抗劑。這些拮抗劑是可抑制FVIIa 活性的肽，并且是所述的可用于與溶解血栓療法結(jié)合來(lái)抑制動(dòng)脈血栓形成的肽。在本說(shuō)明書(shū)中的在前公開(kāi)的文獻(xiàn)的列表或討論將不會(huì)必須地被認(rèn)為是現(xiàn)有技術(shù) 狀態(tài)的文件或者是普通的常識(shí)。本技術(shù)領(lǐng)域仍極大地需要具有促凝血活性的低分子量肽，用于治療甲型血友病 (FVIII不足)病人。本發(fā)明提供了新穎的具有促凝血活性的低分子量肽，其可以用于甲型 血友病的非靜脈注射治療。本發(fā)明還提供了這些新穎的肽用于治療FV、FVII、FX和/或FXI 不足。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)方面提供了一種肽或者肽衍生物，其包含(i) WDLYFEIVff (SEQ ID NO 1)；或(ii)變體氨基酸序列，其包含在WDLYFEIVW(SEQ ID NO 1)中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè) 或四個(gè)L-氨基酸取代；或(iii)所述(i)部分和(ii)部分之一的肽或者肽衍生物的反倒型 (retro-inverso)變體，其中，所述肽或者肽衍生物具有促凝血活性。因?yàn)楸苊庖鹨闪x，序列WDLYFEIVff(SEQ ID NO :1)可以通過(guò)使用三個(gè)字母的氨基 酸代碼被表示為 L-氨基酸Trp-Asp-Leu-Tyr-Phe-Glu-IIe-Val-Trp。WDLYFEIVff (SEQ ID NO 1)的反倒型變體是wviefyldw，并且包含D-型氨基酸。本發(fā)明的第二個(gè)方面提供了一種肽或者肽衍生物，其包含(i)氨基酸序列，其包含imfwydcye ；或(ii)變體氨基酸序列，其包含在imfwydcye中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)、五個(gè)或 六個(gè)氨基酸取代，其中，所述肽或者肽衍生物具有促凝血活性。為了避免引起疑義，序列cimfwydcye可以通過(guò)使用三個(gè)字母的氨基酸代碼被表 不為 D-型氨基酸:ile-met-phe-trp-tyr-asp-cys-tyr-glUo本發(fā)明的第三個(gè)方面提供了 一種二元肽，其包含本發(fā)明的第一個(gè)方面或第二個(gè)方 面的一種肽或者肽衍生物，所述一種肽或者肽衍生物結(jié)合于另一種本發(fā)明的第一個(gè)方面或第二個(gè)方面的肽或者肽衍生物，其中，兩種肽/衍生物可以彼此相同或不同，并且其中該二 元肽具有促凝血活性。本發(fā)明的第四個(gè)方面提供了一種藥物組合物，其包含本發(fā)明的第一個(gè)方面或第二 個(gè)方面的肽或者肽衍生物、或者本發(fā)明的第三個(gè)方面的二元肽。本發(fā)明的第五個(gè)方面提供了一種本發(fā)明的第一個(gè)方面或第二個(gè)方面的肽或者肽 衍生物、或者本發(fā)明的第三個(gè)方面的二元肽用于治療FV、FVII、FVIII、FX和/或FXI不足 的病人的應(yīng)用。本發(fā)明的第六個(gè)方面提供了一種本發(fā)明的第一個(gè)方面或第二個(gè)方面的肽或者肽 衍生物、或者本發(fā)明的第三個(gè)方面的二元肽在藥物制造中的應(yīng)用，所述藥物用于治療在病 人中 FV、FVII、FVIlI、FX 禾口 / 或 FXI 的不足。本發(fā)明的第七個(gè)方面提供一種治療具有FV、FVII、FVIII、FX和/或FXI不足的病 人的方法，包括給藥治療有效量的第四個(gè)方面的藥物組合物。本發(fā)明的第八個(gè)方面提供了一種具有促凝血活性的肽或者肽衍生物，其中，該肽 或者肽衍生物不是FVIII或其片段，并且其中所述促凝血活性是25、50或100 μ M的肽、 肽衍生物或者二元肽的凝血酶產(chǎn)生時(shí)間，相當(dāng)于在限定內(nèi)在凝血酶產(chǎn)生測(cè)定(Defined Intrinsic Thrombin Generation Assay)中至少 lOOmU/mLFVIII 抑制物旁路活性(FEIBA)、 優(yōu)選至少300mU/mL FEIBA、更優(yōu)選至少900mU/mL FEIBA、最優(yōu)選至少1200mU/mL FEIBA的 促凝血活性。本發(fā)明的第九個(gè)方面提供了一種具有促凝血活性的肽或者肽衍生物，其中，該肽 或者肽衍生物不是FVIII或其片段，并且其中所述促凝血活性是在限定內(nèi)在凝血酶產(chǎn)生測(cè) 定中，25、50或者100 μ M的肽、肽衍生物或者二元肽在30分鐘內(nèi)、優(yōu)選在15分鐘內(nèi)、最優(yōu)選 在10分鐘內(nèi)出現(xiàn)峰值的凝血酶產(chǎn)生時(shí)間。本發(fā)明的第十個(gè)方面提供了一種具有促凝血活性的肽或者肽衍生物，其中，該肽 或者肽衍生物不是FVIII或其片段，并且其中當(dāng)在重型人甲型血友病動(dòng)物模型中給藥時(shí)， 該肽或者肽衍生物能夠至少部分地彌補(bǔ)生物活性FVIII的缺失。


圖1 在限定二元路徑凝血酶產(chǎn)生測(cè)定(defined Dual-pathway thrombin generation assay)中血友病治療證實(shí)了對(duì)凝血酶產(chǎn)生峰值以及凝血酶成峰時(shí)段的治療性影響。圖2 =AOl對(duì)FVIII-/-小鼠出血模型的影響-失血。
具體實(shí)施例方式在本發(fā)明范疇內(nèi)，術(shù)語(yǔ)“氨基酸”包括所有天然產(chǎn)生的L型α-氨基酸。在此使用 天然產(chǎn)生的氨基酸的一個(gè)字母和三個(gè)字母的縮寫(xiě)(Lehninger，生物化學(xué)。第2版，Worth出 版社，紐約，1995:71-92)。術(shù)語(yǔ)“氨基酸”也還包括天然產(chǎn)生氨基酸的立體異構(gòu)體(例如 D-型氨基酸)和修飾體、非蛋白(non-proteinogenic)氨基酸、以及模擬氨基酸的設(shè)計(jì)結(jié) 構(gòu)。修飾的氨基酸和非蛋白氨基酸一般在Grant的《合成肽使用指南》(牛津大學(xué)出
13版社，1992)中有描述。通過(guò)導(dǎo)入非天然產(chǎn)生的各種氨基酸，或者通過(guò)在此討論的氨基酸修飾，有可能提 供例如改進(jìn)的穩(wěn)定性和溶解度、對(duì)蛋白酶降解的抗性、以及肽活性。非蛋白氨基酸可以包括，但不限于β-丙氨酸(β-Ala)、正纈氨酸(Nva)、正 亮氨酸(Nle)、4_氨基丁酸(Y-Abu)、2-氨基異丁酸(Aib)、6_氨基己酸(ε-Ahx)、鳥(niǎo)氨 酸(orn)、羥脯氨酸(Hyp)、肌氨酸、瓜氨酸、磺基丙氨酸(Coh)、以及環(huán)己基丙氨酸、甲硫氨 酸亞砜(Meo)、甲硫氨酸砜(Moo)、高絲氨酸甲酯(Hsm)、炔丙基甘氨酸(Eag)、5_氟色氨 酸(5Fw)、6-氟色氨酸(6Fw)、3'，4' -二甲氧苯基丙氨酸(Ear)、3 ‘，4' -二氟苯丙氨 酸(Dff)、4'-氟苯基-丙氨酸(Pff)U-萘基-丙氨酸(INi)U-甲基色氨酸(IMw)、青 霉胺(Pen)、高絲氨酸(HSe)。另外，這樣的氨基酸可以包括但不限于α _氨基異丁酸、叔 丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸(Phg)、苯并噻吩基丙氨酸(Bta)、L-高半胱氨酸 (L-Hcys) ,N-甲基-苯丙氨酸(NMF)、2_噻吩丙氨酸(Thi)、3，3-二苯基丙氨酸(Ebw)、高苯 丙氨酸(Hfe)、S-苯甲基-L-半胱氨酸(Ece)或者環(huán)己基丙氨酸(Cha)。這些氨基酸及其 他非蛋白原氨基酸可以作為D-型或L-型異構(gòu)體存在。如果沒(méi)有給出異構(gòu)體的指示，則是 指L-型異構(gòu)體。被設(shè)計(jì)成模擬氨基酸的結(jié)構(gòu)是這樣的化合物其中氨基酸的氨基和/或羧基被 另一種基團(tuán)替代。非限制性的實(shí)施例是并入硫代酰胺、尿素、硫脲、?；ｋ?、酯、鏈烯烴、 磺酰胺、磷酸酰胺、酮、醇類(lèi)、硼酰胺、苯二氮及其他芳香或非芳香雜環(huán)(為了評(píng)述，參見(jiàn) Μ. A. Estiarte、D. H. Rich，《Burgers 藥物化學(xué)》第 6 版，第 1 卷，第 4 部分。John Wiley & Sons出版社，紐約，2002)。假如這些結(jié)構(gòu)被包含于肽衍生物中，它們通常是通過(guò)至少一種上 述官能團(tuán)代替酰胺鍵與肽衍生物的其余部分(the rest)相連接。對(duì)于術(shù)語(yǔ)“肽”，我們不僅包括其中氨基酸殘基通過(guò)肽鍵(-C0-NH-)連接的分子， 而且還包括其中肽鍵為反向的分子。“反向修飾的”肽是這樣一種肽其由其中氨基酸殘基 被沿與天然肽相反的方向組裝的氨基酸組成，就這點(diǎn)而論，其是反向修飾。如果天然肽包 含L-氨基酸，則“反向修飾”的肽將會(huì)也包含L-氨基酸。如果，如果天然肽包含D-型氨基 酸，則“反向修飾”的肽將會(huì)也包含D-型氨基酸。反向肽含有NH-CO鍵而不是CO-NH肽鍵。 “倒向修飾”肽是這樣一種肽其由其中氨基酸殘基被沿著與天然肽相同的方向組裝的氨基 酸組成，就這點(diǎn)而論，該肽是倒向修飾，但是氨基酸的手性是倒置的。因此，如果天然肽包 含L-氨基酸，則“倒向修飾”的肽將會(huì)包含D-型氨基酸。如果天然肽包含D-型氨基酸，則 “倒向修飾”的肽將會(huì)包含L-型氨基酸。倒向肽仍然具有CO-NH肽鍵?！胺吹剐托揎棥钡碾?指的是由這樣的氨基酸殘基組成的肽其被相對(duì)于天然肽沿相反的方向組裝并且具有倒置 的手性，就這點(diǎn)而論，該肽被反倒型修飾。反倒型同功異質(zhì)體具有反向末端和反方向的肽鍵 WPNH-CO)，同時(shí)大致維持如同在天然肽序列中的側(cè)鏈的拓?fù)鋵W(xué)。Guichard等(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91 =9765-9769描述到，反倒型肽模擬了天然的L-型肽IRGERA、但不是 D-型和反向肽的結(jié)構(gòu)和抗原活性。這些反倒型擬肽可以使用本技術(shù)領(lǐng)域已知的方法制備， 該方法比如是Meziere等(1997)在J. Immunol. 159，3230-3237中描述的方法，現(xiàn)將其引入 本發(fā)明作為參考。局部反倒型肽同功異質(zhì)體是多肽，其中僅部分序列是反向的并且被用對(duì) 映異構(gòu)的氨基酸殘基替代。用于制備這些同功異質(zhì)體的方法在文獻(xiàn)Pessi，A. ,Pinori,Μ.， Verdini,A. S.和VisComi，G. C. (1987) “含有反倒型肽鍵的肽的完全固相合成，使用交聯(lián)肌
14氨酸基共聚物作為支持物”、歐洲專(zhuān)利97994-B中有描述。通常，L-氨基酸通過(guò)使用大寫(xiě)體命名，而D-型氨基酸使用小寫(xiě)體命名。本發(fā)明的 肽和肽衍生物按照它們的優(yōu)選形式命名，但是并不限制它們?yōu)檫@些優(yōu)選形式。本發(fā)明第一 個(gè)方面的肽被指定為包含WDLYFEIVW(SEQ ID NO 1)或其變體。本發(fā)明第一個(gè)方面的肽也 可以是WDLYFEIVW(SEQ ID NO 1)或其變體的反倒型變體，即wviefyldw或其變體。本發(fā)明 第二個(gè)方面的肽被指定為包含cimfwydcye或其變體。通常，如果氨基酸被通過(guò)肽鍵連接，則肽被表示為N-端氨基出現(xiàn)在左側(cè)并且C-端 羧基出現(xiàn)在右側(cè)。根據(jù)本發(fā)明的肽和肽衍生物被用這樣的方式表示?！半难苌铩焙幸粋€(gè)以上氨基酸殘基的修飾或者連接物基團(tuán)或其他共價(jià)連接基團(tuán)。衍生物的例子包括氨基末端或另一種游離氨基的N-?；苌铩Ⅳ然┒嘶?另一種游離羧基或羥基的酯、羧基末端或另一種游離羧基的酰胺(通過(guò)與氨反應(yīng)或與合 適胺類(lèi)反應(yīng)而生產(chǎn))、糖基化衍生物、羥基化衍生物、核苷酸基化衍生物、ADP-核糖基化衍 生物、PEG化衍生物、磷酸化衍生物、結(jié)合于親脂性部分的衍生物、以及結(jié)合于抗體或其他 生物學(xué)配體的衍生物。在化學(xué)衍生物中還包括那些通過(guò)肽鍵-CO-NH-修飾例如通過(guò)還原 成-CH2-NH-或者烷基化成-CO-N (烷基)_而獲得的衍生物。優(yōu)選的衍生物是C-端酰胺化。肽的C-端酰胺化除去了 C-端的負(fù)電荷。具有 C-端酰胺的肽衍生物用在C-端處"NH2”表示，例如Ac-(乙酰)WDLYFEIW-NH2(SEQ ID NO 1)。另一種優(yōu)選的衍生物是N-端乙?；＿@要除去N-端的正電荷。封閉C-端或N-端， 比如通過(guò)C-端酰胺化或者N-端乙酰化，由于降低了對(duì)外部蛋白水解消化(exoproteolytic digestion)的敏感性，所以可以改進(jìn)蛋白水解穩(wěn)定性。合適的連接物包括柔韌的連接物4，7，10-三氧雜-1，13-十三烷二胺(Ttds)、甘氨 酸、6-氨基己酸、β-丙氨酸、或者Ttds、甘氨酸、6-氨基己酸和β-丙氨酸的組合。本發(fā)明的肽能夠通過(guò)如下方法制備化學(xué)合成、DNA重組技術(shù)、較大分子的生物化 學(xué)法或酶法分裂、上述方法的組合，或者通過(guò)任何其他的方法制備。肽(至少在氨基酸殘基之間含有肽鍵的那些肽)可以通過(guò)下述文獻(xiàn)和其中參照文 獻(xiàn)中描述的Fmoc策略的固相肽合成法合成《Fmoc固相肽合成-實(shí)用的方法》。W. C. Chan, P. D.White編，牛津大學(xué)出版社，紐約，2000。通過(guò)9-芴基甲氧羰基(Fmoc)基團(tuán)提供臨時(shí) N-氨基保護(hù)。通過(guò)使用在N，N-二甲基甲酰胺中20%哌啶來(lái)影響該高度堿基不穩(wěn)定的保 護(hù)基的重復(fù)性切割。側(cè)鏈官能團(tuán)可以被保護(hù)為它們的丁基醚(對(duì)于絲氨酸、蘇氨酸和酪氨 酸的情況)、丁基酯(就谷氨酸和天冬氨酸而言)、丁氧羰基衍生物(就賴氨酸和組氨酸而 言)、三苯甲基衍生物(就半胱氨酸、天門(mén)冬酰胺和谷氨酰胺而言)和4-甲氧基-2，3，6-三 甲苯磺?；苌?就精氨酸而言)。固相支持物是基于聚二甲基丙烯酰胺聚合物，該聚合 物由三種單體組成二甲基丙烯酰胺(骨架_單體)、二丙烯酰乙烯二胺(交聯(lián)劑)和丙烯 酰肌氨酸甲酯(功能化試劑)。使用的肽-樹(shù)脂可裂解的連接試劑是酸不穩(wěn)定性的4-羥甲 基-苯氧基乙酸衍生物，或者在C-端酰胺的情況下是Rink-酰胺連接物。除天門(mén)冬酰胺和 谷氨酰胺之外，所有氨基酸衍生物被加入作為它們的預(yù)成型對(duì)稱(chēng)的酸酐衍生物，天門(mén)冬酰 胺和谷氨酰胺是通過(guò)使用反向N，N- 二環(huán)己基-碳二亞胺/1-羥基苯并三唑介導(dǎo)的偶聯(lián)工 藝被加入的。所有偶聯(lián)和去保護(hù)反應(yīng)通過(guò)使用水合茚三酮、三硝基苯磺酸或者isotin測(cè)試步驟進(jìn)行監(jiān)控。一旦合成完成，通過(guò)用含有50%清除劑混合物的95%三氟乙酸處理，肽就 從樹(shù)脂支持物上解離，伴隨除去側(cè)鏈保護(hù)基。常用的清除劑是乙烷二硫醇、苯酚、苯甲醚和 水，精確的選擇取決于被合成肽的組分氨基酸。通過(guò)在真空下蒸發(fā)除去三氟乙酸，隨后用二 乙醚研制，得到粗肽。本發(fā)明的任何清除劑都可以通過(guò)簡(jiǎn)單的提取工藝被除去，水相凍干時(shí) 得到不含清除劑的粗肽。用于肽合成的試劑一般地可以購(gòu)自Calbiochem-Novabiochem(英 國(guó))有限公司，諾丁漢NG7 2QJ，英國(guó)。純化可能會(huì)受到下述技術(shù)中的任何一個(gè)、或其組合的 影響比如，大小排阻色譜法、離子交換層析、親和色譜法、差別溶解度法和(主要地)反相 高效液相色譜法。通過(guò)使用薄層色層分析法、反相高效液相色譜法、酸水解后氨基酸分析并 且通過(guò)快原子轟擊(Fab)質(zhì)譜分析，可以進(jìn)行肽的分析。也可能使用SPOT-合成法，其允許可設(shè)定位置，是在連續(xù)纖維素膜上肽的化學(xué)合 成法(R. Frank, Tetrahedron. (1992)48,9217)。作為固相肽合成技術(shù)的替換，也可以通過(guò)重組體蛋白表達(dá)或者體外翻譯系統(tǒng)而產(chǎn) 生肽(Sambrook等，《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》。2001，第三版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐 約)。當(dāng)然，僅是肽含有通過(guò)天然產(chǎn)生的肽鍵連接的可被多核苷酸編碼的天然產(chǎn)生的氨基酸 殘基。就固相肽合成技術(shù)而言這些方法是優(yōu)選的，其中肽尤其是大肽，比如大于50個(gè)氨基 酸、或者大于100個(gè)氨基酸。一種“變體”氨基酸序列作為相對(duì)于本發(fā)明的第一個(gè)方面的限定，可以包含在 WDLYFEIVff (SEQ ID NO 1)中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)L-氨基酸取代。優(yōu)選地，變體氨基酸序列包含一種氨基酸序列，其包含X1X2X3YX4EX5X6X7，其中X1是 W、L 或 P ;X2 是 D 或 S ;X3 是 L 或 F ;X4 是 F、Phg、L、Ebw、Pff、Thi、lNi、Hfe、Ece 或 Cha ；X5 是 I 或F;x6 是 S、V或G;并且父7是1或L(SEQ ID NO :1)。更優(yōu)選地，變體氨基酸序列包含一種氨基酸序列，其包含X1X2X3YX4EX5X6X7，其中X1 是W或L ;X2是D或S ;X3是L或F ;X4是F、Phg或L ;X5是I或F ;X6是S、V或G ；并且X7是 W 或 L(SEQ ID NO :1)。一種“變體”氨基酸序列作為相對(duì)于本發(fā)明的第二個(gè)方面的限定，可以包含在 imfwydcye中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)氨基酸取代。優(yōu)選地，在imfwydcye中的至少一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)所述的取代是
D-型氨基酸。在該變體內(nèi)部的任何取代可以是非保守型的或者保守型的。對(duì)于術(shù)語(yǔ)“保守性取代”，我們是指在下組內(nèi)部的取代Val、lie、Leu、Ala、Met ； Asp、Glu ；Asn、Gln ；Ser、Thr> Gly、Ala ；Lys、Arg、His ；以及 Phe> Tyr> Trp0優(yōu)選地，本發(fā)明第一個(gè)方面的肽或者肽衍生物包含RMEFDVWDLYFEIVW(SEQ IDNO 2)或RMKFDVWDLYFEIVW(SEQ ID NO 2)；或者一種變體氨基酸序列，其包含在 RMEFDVWDLYFEIVW (SEQ ID NO 2)或 RMKFDVWDLYFEIVW (SEQ ID NO :2)中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、 四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)氨基酸取代。為了避免引起疑義，序列RMEFDVWDLYFEIVW (SEQ ID NO :2)可以通過(guò)使用三個(gè)字母 的氨基酸代碼被表示為 Arg-Met-Glu-Phe-Asp-Val-Trp-Asp-Leu-Tyr-Phe-Glu-Ile-Val-T rp。RMKFDVWDLYFEIVW (SEQ ID NO 2)可以通過(guò)使用三個(gè)字母的氨基酸代碼被表示為Arg-M et-Lys-Phe-Asp-Val-Trp-Asp-Leu-Tyr-Phe-Glu—Ile—Val—Trpο
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更優(yōu)選地，變體氨基酸序列包含一種氨基酸序列，其包含 X8X9XiciFDVX1X2X3YX4EX5X6X7,其中 X8 是 R 或 P ;X9 是 M、Nva、Moo、N、Nle、Meo、Q、Eag ；X10 是 E、K 或D ；X1是W、L或P ;X2是D或S ；X3是L或F ;X4是F、Phg、L、Ebw、Pff、Thi、lNi、IIfc、Ecc、Cha;X5是I或F;X6是S、V或G;并且X7是W或L(PEQ ID NO :2)。更優(yōu)選地，變體氨基酸序列包含一種氨基酸序列，其包含 X8X9XiciFDVX1X2X3YX4EX5X6X7，其中 X8 是 R 或 P ;X9 是 M 或 Nva ；X10 是 E、K 或 D A1 是 W 或 L ;X2 是D或S ;X3是L或F ;X4是F、Phg或L ;X5是I或F ;X6是S、V或G ；并且X7是W或L (SEQ ID NO 2)。適當(dāng)?shù)?，本發(fā)明第一個(gè)方面的肽或者肽衍生物肽是在下表中所示的肽或者肽衍生 物，或者包含、或者由在下表1至3中所示的肽或者肽衍生物的氨基酸序列組成表1 最優(yōu)選的肽
權(quán)利要求
1.一種肽或肽衍生物，其包含(i)WDLYFEIVff (SEQ ID NO 1)；或(ii)變體氨基酸序列，其包含在WDLYFEIVW(SEQID NO :1)中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或四 個(gè)L-氨基酸取代；或(iii)所述(i)部分和(ii)部分之一的肽或者肽衍生物的反倒型變體， 其中，所述肽或者肽衍生物具有促凝血活性。
2.如權(quán)利要求1所述的肽或者肽衍生物，其特征在于，所述變體氨基酸序列包含一種 氨基酸序列，其包含X1X2X3YX4EX5X6X7，其中X1是W、L或P ;X2是D或S ;X3是L或F ;X4是F、 Phg、L、Ebw、Pff、Thi、INi、Hfe, Ece 或 Cha ;X5 是 I 或 F ;X6 是 S、V 或 G ;X7 是 W 或 L (SEQ ID NO :1)。
3.如權(quán)利要求1所述的肽或者肽衍生物，其特征在于，所述變體氨基酸序列包含一種 氨基酸序列，其包含X1X2X3YX4EX5X6X7，其中X1是W或L ;X2是D或S ;X3是L或F ;X4是F、Phg 或1^;父5是1 或F;X6 是 S、V 或6;父7是1或L(SEQ ID NO :1)。
4.如權(quán)利要求1所述的肽或者肽衍生物，其特征在于，包含(1)RMEFDVffDLYFEIVff(SEQ ID NO 2)；或(2)RMKFDVffDLYFEIVff(SEQID NO 2)(2) —種變體氨基酸序列，其包含在RMEFDVWDLYFEIVW(SEQ ID NO 2)或 RMKFDVffDLYFEIVff (SEQ ID NO 2)中的一個(gè)和六個(gè)之間的氨基酸取代。
5.如權(quán)利要求4所述的肽或者肽衍生物，其特征在于，所述變體氨基酸序列包含一種 氨基酸序列，其包含 X8X9XiqFDVX1X2X3YX4EX5X6X7，其中 X8 是 R 或 P ;X9 是 M、Nva, Moo、N、Nle、 Meo, Q、Eag ；X10 是 Ε、K 或 D J1 是 W、L 或 P ;X2 是 D 或 S ;X3 是 L 或 F ;X4 是 F、Phg、L、Ebw、 Pf 、Thi、lNi、Hfe、Ece、Cha;X5是I或F;X6是S、V或G;X7是W或L(SEQ ID NO :2)。
6.如權(quán)利要求5所述的肽或者肽衍生物，其特征在于，所述變體氨基酸序列包含一種 氨基酸序列，其包含 X8X9X10FDVX1X2X3YX4EX5X6X7,其中 X8 是 R 或 P ;X9 是 M 或 Nva ；X10 是 E、K 或D J1是W或L ;X2是D或S ;X3是L或F ;X4是F、Phg或L ;X5是I或F ;X6是S、V或G ；X7 是 W 或 L(SEQ ID NO 2)。
7.如權(quán)利要求1所述的肽衍生物，其特征在于，其在N-端處被乙?；?、在C-端處被酰 胺化，并且/或者在兩個(gè)末端之一處被PEG化。
8.如權(quán)利要求1所述的肽或者肽衍生物，其特征在于，其為環(huán)狀。
9.如權(quán)利要求1所述的肽或者肽衍生物，其特征在于，包含、或者如下所組成 Ac-RMKFDVffDLYFEIVff-NH2 (SEQ ID NO 2), Ac-PMKFDVffDLYFEIVff-NH2，Ac-RMDFDVffDLYFEIVff-NH2 (SEQ ID NO 2), Ac-RMEFDVffDLYFEIVff-NH2 (SEQ ID NO 2), Ac-WDLYFErVff-NH2 (SEQ ID NO 2), Ac-WDLYFEIVffE(SEQ ID NO 1), Ac-WDL YFEIVff-ttds-E(SEQ ID NO 3), ttds-RMEFDVWDLYFEIVW-ttds-NH2(SEQ ID NO 2), ERMEFDVffDLYFEIVff-NH2 (SEQ ID NO 4),ER(Nva)EFDVffDLYFEIVff-NH2 (SEQ ID NO 5), ttds-RMEFDVWDLY(Phg)EIVff-ttds-NH2, Ac-WSLYFEIVffE(SEQ ID NO :6)， Ac-WDLYFE ISff-ttds-E(SEQ ID NO 1), PEG5000-RMKFDVWDLYFEIVW-NH2 (SEQ ID NO :2)， PEG5000-WSLYFEIVWE(SEQ ID NO :6)， PEG5000-ERMEFDVWDLYFEIVW-NH2 (SEQ ID NO 4), Ac-VffDLYFEIVff-NH2 (SEQ ID NO :7)， Ac-FDVffDLYFEIVff-NH2 (SEQ ID NO :8)， EffDLYFEIVff-NH2 (SEQ ID NO :9)， E-ttds-WDLYFEIVW-NH2 (SEQ ID NO 1), Ac-WDLYFEIVW-ttds-E-NH2 (SEQ ID NO 1), Ac-RMEFDVffDL YFEIVff(SEQ ID NO :2)， RMEFDVffDLYFEIVff(SEQ ID NO :2)， Ac-K-ttds-RMEFDVWDLYFElVW-NH2(SEQ ID NO :2)， Ac-RMEFDVffDLYFEIVffK(SEQ ID NO: 10)， Ac-RMEFDVffDLYFEIVffK-NH2 (SEQ ID NO: 10)， Ac-RM EFDVffDLYFE I Vff-ttds-K-NH2 (SEQ ID NO :2)， Ac-WDLYFEISffE(SEQ ID NO: 11)， Ac-WDLYLEIVffE(SEQ ID NO: 12)， Ac-WDLYFEIVLE(SEQ ID NO: 13)， WDLYFEIVff(SEQ ID NO :1)， RMEFDVffDLYFEIVff-NH2 (SEQ ID NO :2)， Ac-RMEFDVWDLYFEIVW-ttds-NH2 (SEQ ID NO :2)， Ac-KRMEFDVffDLYFEIVff-NH2 (SEQ ID NO: 14)， K-ttds-RM EFDVffDLYFE IVff-NH2 (SEQ ID NO :2)， Ac-RMEFDVWDLYFEYFW-ttds-K(SEQ ID NO :2)， Ac-LDLYFEIVW-ttds-E(SEQ ID NO 1), Ac-WDLYFE I VL-ttds-E(SEQ ID NO 1), E-RMEFDVLDLYFEIVff-NH2 (SEQ ID NO: 15)， E-RMEFDVffDLYFEIVL-NH2 (SEQ ID NO: 16)，Ac-WDFYFEIVffE(SEQIDNO17),Ac-WDLYFEFVffE(SEQIDNO18),Ac-LDLYFEIVffE(SEQIDNO19),Ac-WDLYFEIGffE(SEQIDNO20),Ac-WDLYLEISLE(SEQIDNO21),Ac-WDLYXEIVLE, Ac-WSLYXEIVWE,Ac-LDLYFEIVLE(SEQ ID NO :22)，Ac-LDLYFEISLE(SEQ ID NO 23), Ac-LDLYXEISWE，AC-LSLYFEIVffE(SEQIDNO24),Ac-LSLYFEIVLE(SEQIDNO25),Ac-LSLYFEISLE(SEQIDNO26),Ac-WDLYFE I Vff-ttds-K(SEQ ID NO 1), Ac-DVffDLYFEIVff-NHa(SEQ ID NO :27)， Ac-wviefyIdwvdfkmr-NH2, Ac-WDLYFEIVff(SEQ ID NO 1), Ac-ttds-WDLYFEIVW-NH2 (SEQ ID NO 1), ttds-WDLYFEIVW-NH2 (SEQ ID NO 1), Ac-WDLYFEIVW-ttds-NH2 (SEQ ID NO 1), Ac-ttds-WDLYFEIVW-ttds-NH2 (SEQ ID NO 1), ttds-WDLYFEIVW-ttds(SEQ ID NO 1), ttds-WDLYFE IVff-ttds-NH2 (SEQ ID NO 1), Ac-KffDLYFE IVff-NH2 (SEQ ID NO :28)， Ac-K-ttds-WDLYFEIVW-NH2 (SEQ ID NO 1), Ac-WDLYFEIVffK(SEQ ID NO :29)， Ac-WDLYFE IVffK-NH2 (SEQ ID NO :29)， E-R(Moo)EFDVffDLYFEIVff-NH2， E-RNEFDVffDLYFEIVff-NH2 (SEQ ID NO :30)， ttds-RMEFDVWDLY(Ebw)EIVff-ttds-NH2, ttds-RMEFDVWDLY(Pff)EIVff-ttds-NH2,Ac-PDLYFEIVffE(SEQIDNO31),Ac-LSLYLEIVLE(SEQIDNO32),Ac-LSLYLEISLE(SEQIDNO33),Ac-LSLYXEIVLE,Ac-WDLYFEIVW-ttds-K-NH2 (SEQ ID NO 1),E-PMKFDVffDLYFEIVff-NH2 (SEQ ID NO :34)，ttds-RMDFDVWDLYFEIVW-ttds-NH2(SEQ ID NO :2)，PEG5000-RMKFDVWDLYFEIVW-NH2 (SEQ ID NO :2)，WDLYFEIVff-NH2 (SEQ ID NO 1),KRMEFDVffDLYFEIVff-NH2 (SEQ ID NO: 14)，ttds-PMKFDVWDLYFEIVW-ttds-NH2(SEQ ID NO :2)，E-RMDFDVffDLYFEIVff-NH2 (SEQ ID NO :35)，(Coh)-ttds-RMEFDVWDLYFEIVW-ttds-NH2,葡糖基 _ 氨氧基乙?；?ttds-RMEFDVWDLYFEIVW-ttds-NH2,Ac-P(Moo)KFDVffDLYFEIVff-NH2,Ac-P(Nle)KFDVffDLYFEIVff-NH2 (SEQ ID NO :2)，Ac-PNKFDVffDLYFEIVff-NH2 (SEQ ID NO 2), Ac-R(Moo)DFDVffDLYFEIVff-NH2， Ac-R(Nle)DFDVffDLYFEIVff-NH2 (SEQ ID NO 2), Ac-RNDFDVffDLYFEIVff-NH2 (SEQ ID NO 2), ttds-R(Nle)EFDVWDLYFEIVW-ttds-NH2 (SEQ ID NO :2)， ttds-RNEFDVWDLYFEIVW-ttds-NH2(SEQ ID NO :2)， E-R(Nle)EFDVffDLYFEIVff-NH2 (SEQ ID NO :321)， E-R(MeO)EFDVffDLYFEIVff-NH2， E-RQEFDVffDLYFEIVff-NH2 (SEQ ID NO :36)， E-R(Eag)EFDVffDLYFEIVff-NH2， ttds-RMEFDVWDLY(Thi)EIVff-ttds-NH2, ttds-RMEFDVWDLY(INi)EIVff-ttds-NH2, ttds-RMEFDVWDLY(Hfe)EIVff-ttds-NH2)， ttds-RMEFDVWDLY(Ece)EIVff-ttds-NH2, ttds-RMEFDVWDLY(Cha)EIVff-ttds-NH2, KffDLYFEIVff-NH2 (SEQ ID N0:28)，或 K-HdS-WDLYFEIVff-NH2 (SEQ ID NO 1),其中，-ttds-是4，7，10-三氧雜-1，13-十三烷二胺、(Nva)是正纈氨酸、(Phg)是苯基 甘氨酸、(Coh)是磺基丙氨酸、(Moo)是甲硫氨酸砜、(Ebw)是3，3-二苯基丙氨酸、(Pff)是 4'-氟苯基_丙氨酸、(Nle)是正亮氨酸、(Meo)是甲硫氨酸亞砜、(Eag)是炔丙基甘氨酸、 (Thi)是2-噻吩丙氨酸、(INi)是1-萘基-丙氨酸、(Hfe)是高苯丙氨酸、(Ece)是S-苯 甲基-L-半胱氨酸、(Cha)是環(huán)己基丙氨酸。
10.一種肽或者肽衍生物，其包含(i)氨基酸序列，其包含imfwydcye ；或(ii)變體氨基酸序列，其包含在imfwydcye中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)氨 基酸取代，其中，所述肽或者肽衍生物具有促凝血活性。
11.如權(quán)利要求10所述的肽或者肽衍生物，其特征在于，包含 (i)氨基酸序列，其包含cimfwydcye ；或(ii)變體氨基酸序列，其包含在cimfwydcye中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)、五個(gè)、六個(gè) 或七個(gè)氨基酸取代。
12.如權(quán)利要求10所述的肽或者肽衍生物，其特征在于，所述變體氨基酸序列包含一 種氨基酸序列，其包含X1X2X3X4X5X6X7X8X9Xltl，其中X1,當(dāng)存在時(shí)，是c、s、y、i D-Pen, C、t、 D-Nva> D-Nle 或 k ;X2 是 i、y、w 或 d ;X3 是 c 或 m ;X4 是 f、t、ν 或 c ;X5 是 w 或 c ;X6 是 y 或 c ;X7 是 d、e 或 f ；X8 是 c、e、f、y 或 d ;X9 是 y 或 w ；X10 是 e 或 i。
13.如權(quán)利要求12所述的肽或者肽衍生物，其特征在于，所述變體氨基酸序列包含一 種氨基酸序列，其包含X1X2X3X4WydXsye,其中，X1是C、C、D-Pen或s ;X2是i、y或w ;X3是c 或m ;X4是f、t、或ν ;X8是c或e。
14.如權(quán)利要求13所述的肽或者肽衍生物，其特征在于，所述變體氨基酸序列包含一種氨基酸序列，其包含X1X2HiX4WydX8ye,其中，X1是C、C、或D-Pen ；X2是i或y ;X4是f、t、或 ν ;X8 是 c 或 e。
15.如權(quán)利要求10所述的肽衍生物，其特征在于，其在N-端處被乙?；?、在C-端處被 酰胺化，并且/或者在兩個(gè)末端之一處被PEG化。
16.如權(quán)利要求11所述的肽衍生物，其特征在于，其在N-端處被乙?；?、在C-端處被 酰胺化，并且/或者在兩個(gè)末端之一處被PEG化。
17.如權(quán)利要求10所述的肽或者肽衍生物，其特征在于，其為環(huán)狀。
18.如權(quán)利要求10所述的肽或者肽衍生物，其特征在于，包含、或者如下所組成 Ac-cimfwydeye-NH2，二硫化-二聚(AC-Cimfwydeye-NH2)2，Ac-TTDS-(cymfwydc)-ye-NH2，K-TTDS- (cymfwydc) -ye_NH2，Ac~cimtwydcye-NH2，Ac~cimvwydcye-NH2，cymfwydcye,Ac- (cymfwydc)-yeG_NH2，Ac- (D-Pen) imfwydeye-NH2,－0 (CH2-CH2-O-CH2-CO-Imfwydeye-NH2)2,口比啶-3，5-(C0-imfwydeye-NH2)2，H2N-E-TTDS- (cymfwydc) -ye_NH2，Ac- (cymfwydc) -yeK,Ac-(cymfwydc)-ye-TTDS-K，Ac-Simfwydeye-NH2,Ac-Simfwydeye-NH2,Ac-ydmcwcefyi-NH2，Ac-idmccyfywe-NH2,Ac~cimfWyddye-NH2，Ac- (cymfwydc)-ye，Ac- (cymfwydc)-ye-TTDS_NH2，Ac-TTDS-(cymfwydc)-ye-TTDS_NH2，K- (cymfwydc)-ye-NH2，Ac-K- (cymfwydc)-ye-NH2，E- (cymfwydc)-ye-NH2，Ac-K-TTDS- (cymfwydc)-ye_NH2，Ac- (cymfwydc)-yeK_NH2，Ac-(cymfwydc)-ye-TTDS_K-NH2，Ac- (cymfwydc)-ye-TTDS_E-NH2，Ac-timfWydeye-NH2，Ac- (cimfwydc) -ye-NH2,Ac- (cymfwydc) -ye-NH2,Ac- (cwmfwydc) -ye-NH2,Ac-cicfwydcye-NH2,Ac- (D-Nva)imfwydeye-NH2,Ac-(D-Nle) imfwydeye-NH2,Ac- (Cys)imfwydeye-NH2,(cymfwydc) -ye-NH2,TTDS-(cymfwydc)-ye-TTDS_NH2，Ac-kimfwydeye-NH2,其中，-TTDS-是4，7，10-三氧雜-1，13-十三烷二胺、(D-Pen)是D-青霉胺、(D-Nva) 是D-正纈氨酸、(D-Nle)是D-正亮氨酸。
19.一種二元肽，其包含如權(quán)利要求1中限定的一種肽或者肽衍生物，所述肽或者肽衍 生物結(jié)合于在前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所限定的另一種肽或者肽衍生物，其中，所述一種 肽或者肽衍生物可以與所述另一種肽或者肽衍生物相同或者不同，并且其中該二元肽具有 促凝血活性。
20.一種二元肽，其包含如權(quán)利要求10中限定的一種肽或者肽衍生物，所述一種肽或 者肽衍生物結(jié)合于在前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所限定的另一種肽或者肽衍生物，其中，所 述一種肽或者肽衍生物可以與所述另一種肽或者肽衍生物相同或者不同，并且其中該二元 肽具有促凝血活性。
21.如權(quán)利要求1所述的肽或者肽衍生物，其特征在于，分子量在0.5和3. 5kD之間。
22.如權(quán)利要求10所述的肽或者肽衍生物，其特征在于，分子量在0.5和3. 5kD之間。
23.如權(quán)利要求1所述的肽或者肽衍生物，其特征在于，所述促凝血活性是25、50或 IOOyM的肽、肽衍生物或者二元肽的凝血酶產(chǎn)生時(shí)間，相當(dāng)于在限定內(nèi)在凝血酶產(chǎn)生測(cè)定 中至少100mU/mL因子八抑制物旁路活性(FEIBA)、優(yōu)選至少300mU/mL FEIBA、更優(yōu)選至少 900mU/mL FEIBA、最優(yōu)選至少1200mU/mL FEIBA的促凝血活性。
24.如權(quán)利要求10所述的肽或者肽衍生物，其特征在于，所述促凝血活性是25、50或 IOOyM的肽、肽衍生物或者二元肽的凝血酶產(chǎn)生時(shí)間，相當(dāng)于在限定內(nèi)在凝血酶產(chǎn)生測(cè)定 中至少100mU/mL因子八抑制物旁路活性(FEIBA)、優(yōu)選至少300mU/mL FEIBA、更優(yōu)選至少 900mU/mL FEIBA、最優(yōu)選至少1200mU/mL FEIBA的促凝血活性。
25.如權(quán)利要求1所述的肽或者肽衍生物，其特征在于，所述促凝血活性是在限定內(nèi)在 凝血酶產(chǎn)生測(cè)定中，25、50或100 μ M的肽、肽衍生物或者二元肽在30分鐘內(nèi)、優(yōu)選在15分 鐘內(nèi)、最優(yōu)選在10分鐘內(nèi)出現(xiàn)峰值的凝血酶產(chǎn)生時(shí)間。
26.如權(quán)利要求10所述的肽或者肽衍生物，其特征在于，所述促凝血活性是在限定內(nèi) 在凝血酶產(chǎn)生測(cè)定中，25、50或100 μ M的肽、肽衍生物或者二元肽在30分鐘內(nèi)、優(yōu)選在15 分鐘內(nèi)、最優(yōu)選在10分鐘內(nèi)出現(xiàn)峰值的凝血酶產(chǎn)生時(shí)間。
27.如權(quán)利要求1所述的肽和肽衍生物，其特征在于，當(dāng)給藥于重型人甲型血友病動(dòng)物 模型中時(shí)，其能夠至少部分地彌補(bǔ)生物活性FVIII的缺失。
28.如權(quán)利要求10所述的肽和肽衍生物，其特征在于，當(dāng)給藥于重型人甲型血友病動(dòng) 物模型中時(shí)，其能夠至少部分地彌補(bǔ)生物活性FVIII的缺失。
29.如權(quán)利要求1所述的肽或者肽衍生物，其特征在于，其在人類(lèi)血漿中在30分鐘時(shí)的 穩(wěn)定性是至少50%、優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少80%、最優(yōu)選至少90%。
30.如權(quán)利要求10所述的肽或者肽衍生物，其特征在于，其在人類(lèi)血漿中在30分鐘時(shí) 的穩(wěn)定性是至少50%、優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少80%、最優(yōu)選至少90%。
31.如權(quán)利要求1所述的肽或者肽衍生物，其特征在于，其在磷酸鹽緩沖鹽水PH7. 4中 的水溶性是至少25 μ Μ、優(yōu)選至少60 μ Μ、最優(yōu)選至少100 μ Mo
32.如權(quán)利要求10所述的肽或者肽衍生物，其特征在于，其在磷酸鹽緩沖鹽水ρΗ7.4 中的水溶性是至少25 μ Μ、優(yōu)選至少60 μ Μ、最優(yōu)選至少100 μ Mo
33.一種藥物組合物，其包含如權(quán)利要求1所述的肽或者肽衍生物和一種以上藥學(xué)可 接受的賦形劑、載體和/或稀釋劑。
34.一種藥物組合物，其包含如權(quán)利要求10所述的肽或者肽衍生物和一種以上藥學(xué)可 接受的賦形劑、載體和/或稀釋劑。
35.如權(quán)利要求33所述的藥物組合物，其特征在于，其適合于皮下注射、鼻腔、口腔、口 服或肺部給藥。
36.如權(quán)利要求34所述的藥物組合物，其特征在于，其適合于皮下注射、鼻腔、口腔、口 服或肺部給藥。
37.如權(quán)利要求35所述的藥物組合物，其特征在于，其適合于靜脈注射給藥。
38.如權(quán)利要求36所述的藥物組合物，其特征在于，其適合于靜脈注射給藥。
39.如權(quán)利要求1所述的肽或者肽衍生物用于藥物的應(yīng)用。
40.如權(quán)利要求10所述的肽或者肽衍生物用于藥物的應(yīng)用。
41.如權(quán)利要求1所述的肽或者肽衍生物用于治療FV、FVII、FVIII、FX和/或FXI不 足的病人。
42.如權(quán)利要求10所述的肽或者肽衍生物用于治療FV、FVII、FVIII、FX和/或FXI不 足的病人。
43.如權(quán)利要求1所述的肽或者肽衍生物在藥物制造中的應(yīng)用，所述藥物用于FV、 FVII、FVIII、FX和/或FXI不足的治療。
44.如權(quán)利要求10所述的肽或者肽衍生物在藥物制造中的應(yīng)用，所述藥物用于FV、 FVII、FVIII、FX和/或FXI不足的治療。
45.一種治療具有FV、FVII、FVIII、FX和/或FXI不足的病人的方法，包括給藥治療有 效量的如權(quán)利要求33所述的藥物組合物。
46.一種治療具有FV、FVII、FVIII、FX和/或FXI不足的病人的方法，包括給藥治療有 效量的如權(quán)利要求34所述的藥物組合物。
47.一種治療具有FV、FVII、FVIII、FX和/或FXI不足的病人的方法，包括給藥治療有 效量的如權(quán)利要求35所述的藥物組合物。
48.一種治療具有FV、FVII、FVIII、FX和/或FXI不足的病人的方法，包括給藥治療有 效量的如權(quán)利要求36所述的藥物組合物。
49.一種治療具有FV、FVII、FVIII、FX和/或FXI不足的病人的方法，包括給藥治療有 效量的如權(quán)利要求37所述的藥物組合物。
50.一種治療具有？￥、？￥11、？￥111、？乂和/或？乂1不足的病人的方法，包括給藥治療有效量的如權(quán)利要求38所述的藥物組合物。
51.如權(quán)利要求41所述的肽或者肽衍生物，其特征在于，所述病人具有抗FV、FVII, FVIII、FX和/或FXI的抑制劑抗體。
52.如權(quán)利要求43所述的應(yīng)用，其特征在于，所述病人具有抗FV、FVII、FVIII、FX和/ 或FXI的抑制劑抗體。
53.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述病人具有抗FV、FVII、FVIII、FX和/ 或FXI的抑制劑抗體。
54.一種通過(guò)固相合成制備如權(quán)利要求1所述的肽或者肽衍生物的方法。
55.一種通過(guò)固相合成制備如權(quán)利要求10所述的肽或者肽衍生物的方法。
56.一種具有促凝血活性的肽或者肽衍生物，其中所述肽或者肽衍生物不是FVIII或 其片段；并且其中所述促凝血活性是25、50或100 μ M的肽、肽衍生物或者二元肽的凝血 酶產(chǎn)生時(shí)間，相當(dāng)于在限定內(nèi)在凝血酶產(chǎn)生測(cè)定中至少lOOmU/mL因子八抑制物旁路活性 (FEIBA)、優(yōu)選至少 300mU/mL FEIBA、更優(yōu)選至少 900mU/mL FEIBA、最優(yōu)選至少 1200mU/mL FEIBA的促凝血活性。
57.一種具有促凝血活性的肽或者肽衍生物，其中所述肽或者肽衍生物不是FVIII或 其片段，并且其中所述促凝血活性是在限定內(nèi)在凝血酶產(chǎn)生測(cè)定中，25、50或100 μ M的肽、 肽衍生物或者二元肽在30分鐘內(nèi)、優(yōu)選在15分鐘內(nèi)、最優(yōu)選在10分鐘內(nèi)產(chǎn)生峰值的凝血 酶產(chǎn)生時(shí)間。
58.一種具有促凝血活性的肽或者肽衍生物，其中所述肽或者肽衍生物不是FVIII或 其片段，當(dāng)給藥于重型人甲型血友病動(dòng)物模型中時(shí)，所述肽或者肽衍生物能夠至少部分地 彌補(bǔ)生物活性FVIII的缺失。
全文摘要
一種肽或者肽衍生物，其包含(i)WDLYFEIVW(SEQ ID NO1)或(ii)變體氨基酸序列，其包含在WDLYFEIVW(SEQ ID NO1)中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)L-氨基酸取代；或(iii)所述(i)部分和(ii)部分之一的肽或者肽衍生物的反倒型變體，其中所述肽或者肽衍生物具有促凝血活性。一種肽或者肽衍生物，其包含(i)氨基酸序列，其包含imfwydcye；或(ii)變體氨基酸序列，其包含在imfwydcye中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)氨基酸取代，其中所述肽或者肽衍生物具有促凝血活性。
文檔編號(hào)C07K7/08GK102007140SQ200980114502
公開(kāi)日2011年4月6日 申請(qǐng)日期2009年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月17日
發(fā)明者弗里德里希·沙伊夫林格, 米夏埃爾·道卡爾 申請(qǐng)人:巴克斯特保健股份有限公司, 巴克斯特國(guó)際公司