專利名稱：生長因子-模擬肽及其用途的制作方法
生長因子-模擬肽及其用途
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有生長因子活性的生長因子-模擬肽，及包含所述模擬肽的皮膚 狀況改善用或創(chuàng)傷治療用組合物及皮膚狀況改善或創(chuàng)傷治療方法。
背景技術(shù)：
已知人垂體分泌的生長激素與細(xì)胞生長及分化直接相關(guān)，及由此影響各種細(xì)胞 反應(yīng)，例如包括促進(jìn)軟骨或骨骼的生長及發(fā)育，復(fù)原內(nèi)部器官，例如肌肉或肝臟，創(chuàng)傷 再生，及抗感染免疫應(yīng)答。而且，已報道生長激素量由于老化而逐漸減少，及60來歲的 組的生長激素水平僅為20來歲的組的1/4。因此，已常利用補(bǔ)充不足的生長激素的抗老 化激素治療。在細(xì)胞中生長激素直接結(jié)合于生長激素受體，或誘導(dǎo)胰島素樣生長因子 I(IGF-I)分泌，導(dǎo)致活化細(xì)胞信號分子，例如JAKs Cranus激酶)/STATs (轉(zhuǎn)錄信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子 及活化物)，MAPKs (絲裂原活化的蛋白激酶)，或PI3K(磷脂?；?3激酶)。結(jié)果，預(yù) 計生長激素促進(jìn)毛囊或皮膚中的成纖維細(xì)胞生長，及通過調(diào)節(jié)bcl-2樣基因來抑制凋亡。 生長因子的這些活性已被諸多研究人員闡明，且各公司基于其有用性已嘗試將生長因子 商業(yè)化。成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)被分為2種類型，即酸性FGF (aFGF)及堿 性FGF (bFGF)，已報道所述兩種類型均分離及純化自哺乳動物腦(Thomas and Gimenez-Gallego，TIBS 11 81-84(1986))。生長因子中，酸性成纖維細(xì)胞生長因子(aFGF)是由154個氨基酸構(gòu)成的蛋 白，其為組織復(fù)原及創(chuàng)傷愈合的生物醫(yī)學(xué)研究中的主要分子之一，例如調(diào)節(jié)動物細(xì)胞 (尤其是人細(xì)胞)生長的活性。酸性成纖維細(xì)胞的絲裂原首先被Trowell等人(J.Exp. Biol.16 60-70(1939))及 Hoffman (Growth 4 361-376 (1940))發(fā)現(xiàn)。此外，發(fā)現(xiàn)垂體 提取物具有促成纖維細(xì)胞的有絲分裂活性的能力(Amelin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 70 2702-2706(1973))。多個細(xì)胞應(yīng)對純化的aFGF的刺激一齊合成DNA及分裂，其包括原代成纖 維細(xì)胞、血管及角膜上皮細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成髓細(xì)胞、成肌細(xì)胞、平滑肌肉細(xì)胞、神 經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及成神經(jīng)細(xì)胞(Each et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82 6507-6511 (1985)； Kuo et al., Fed.Proc.44 695(1985) ； Gensburger et al., C.R.Acad.Sc.Paris 303
465-468(1986))。此外，aFGF不僅是血管上皮細(xì)胞的強(qiáng)促有絲分裂分子，還誘導(dǎo)血管體 內(nèi)生長(Thomas.et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82 6409-6413 (1985))。純化的 aFGF 的
促有絲分裂活性還可用于促進(jìn)創(chuàng)傷愈合(Thomas，美國專利No.4,444,760)。同時，角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子(KGF)是由163個氨基酸構(gòu)成的蛋白，且加速上 皮細(xì)胞分裂，貢獻(xiàn)于幾個創(chuàng)傷的快速再生。KGF作為成纖維細(xì)胞生長因子家族成員影響 各種細(xì)胞類型。KGF在治療幾種原因產(chǎn)生的細(xì)胞損傷中起關(guān)鍵作用，所述原因包括細(xì)胞 之間粘連，細(xì)胞分裂及老化。此外，KGF在毛發(fā)生長早期起重要的細(xì)胞之間的橋的作用。除了改善皮膚彈性，促進(jìn)毛發(fā)生長及加速創(chuàng)傷愈合之外，KGF還可用于各種用途。同樣，轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)是對于皮膚細(xì)胞的生長及分化具有重要活性的細(xì)胞 因子，其使皮膚的深位點維持非常年輕及健康。例如，通過轉(zhuǎn)化及復(fù)原，損傷的老化細(xì) 胞可被改變?yōu)榫哂懈叻至鸦钚缘姆浅＝】档募?xì)胞。TGF治療損傷的細(xì)胞，從而可預(yù)防 組織中瘢痕形成。TGF結(jié)合于EGF受體，導(dǎo)致基底膜蛋白的合成增加及刺激上皮細(xì)胞生 長。TGF除了增強(qiáng)皮膚彈性，促進(jìn)毛發(fā)生長，加速創(chuàng)傷愈合及誘導(dǎo)抗老化環(huán)境之外，還 可發(fā)揮多種功效。為了大量生產(chǎn)上述生長因子，許多研究人員對使用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)重組 蛋白進(jìn)行了銳意研究。但是，這些制劑面臨需要耗時及耗成本的再折疊過程及除去大腸 桿菌來源的污染物的復(fù)雜的純化過程。為了擺脫這樣的缺點，已通過固相合成方法制備 了生長因子樣肽。例如，Jameson等人提交的美國專利No.5,473,054公開了 JB2 (對應(yīng) 于IGF-I的氨基酸29 38)及JBl (對應(yīng)于氨基酸61 70)片段具有細(xì)胞增殖潛力，及 JB3 (JBl的對映體)對IGF-I具有抑制活性。Teruo等人提交的WO 03/048192教導(dǎo)了由 IGF-I的氨基酸33 37構(gòu)成的肽片段及物質(zhì)-P衍生的四肽在創(chuàng)傷愈合中起到互補(bǔ)功效。 此外，Kodama等人報道了由IGF-I的氨基酸50 70構(gòu)成的肽片段對小鼠的糖尿病具有 治療效果(Autoimmunity，37: 481-487(2004))。本說明通篇參照了多個論文及專利文獻(xiàn)及標(biāo)注了其索引。引用的論文及專利文 獻(xiàn)的公開內(nèi)容以其整體并入本文，從而更明確說明本發(fā)明所述領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)及本發(fā)明 的內(nèi)容。

發(fā)明內(nèi)容為開發(fā)與天然的角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子、酸性成纖維細(xì)胞生長因子或轉(zhuǎn)化生長 因子具有相同作用，且相比天然的角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子、酸性成纖維細(xì)胞生長因子或 轉(zhuǎn)化生長因子具有更顯著特征(例如活性，皮膚滲透性及穩(wěn)定性)的肽，本發(fā)明人進(jìn)行了 銳意研究。結(jié)果，本發(fā)明人基于天然的生長因子氨基酸序列合成了幾種具有上述優(yōu)良的 特征的生長因子-模擬(mimicking)肽，從而完成本發(fā)明。因此，本發(fā)明旨在提供具有生長因子活性的肽。本發(fā)明還旨在提供皮膚狀況改善用組合物。本發(fā)明又旨在提供創(chuàng)傷治療用組合物。本發(fā)明又旨在提供皮膚狀況改善方法。本發(fā)明又還旨在提供創(chuàng)傷治療方法。本發(fā)明的其他目的及優(yōu)點將通過以下詳述結(jié)合隨附的權(quán)利要求及附圖被本領(lǐng)域 技術(shù)人員明晰。本發(fā)明的一方面提供具有生長因子(GF)活性的肽，其源于GF，且含選自SEQ IDNO 1 4的氨基酸序列。 為開發(fā)與天然的角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子、酸性成纖維細(xì)胞生長因子或轉(zhuǎn)化生長 因子具有相同作用，且相比天然的角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子、酸性成纖維細(xì)胞生長因子或 轉(zhuǎn)化生長因子具有更顯著特征(例如活性，皮膚滲透性及穩(wěn)定性)的肽，本發(fā)明人進(jìn)行了 銳意研究。結(jié)果，本發(fā)明人基于天然的生長因子氨基酸序列合成了幾種具有上述優(yōu)良的特征的生長因子-模擬(mimicking)肽。本發(fā)明的肽含人生長因子衍生的選自SEQ ID NO 1 4的氨基酸序列。優(yōu)選 地，肽基本上由選自SEQ ID NO : 1 4的氨基酸序列構(gòu)成。最優(yōu)選地，肽由選自SEQ IDNO 1 4的氨基酸序列構(gòu)成。本文中的術(shù)語“肽”是指氨基酸殘基通過肽鍵連接形成的線性分子。本發(fā)明的肽可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)化學(xué)合成過程，尤其是，固相合 成技術(shù)制備(Merrifield，J.Amer.Chem.Soc.85 2149-54(1963) ； Stewart，et al.，Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd.ed.，Pierce Chem.Co. Rockford, 111(1984))。本發(fā)明的肽設(shè)計例示于圖1?？赏ㄟ^預(yù)測生長因子的能夠結(jié)合受體蛋白的部位及優(yōu)化預(yù)測的部位的氨基酸序 列來制備本發(fā)明的肽。例如，將氨基酸100 140(對于KGF(角質(zhì)形成細(xì)胞生長因 子))，氨基酸110 125(對于aFGF)，及氨基酸35 49 (對于TGF-α )預(yù)測為能夠結(jié) 合受體蛋白的部位。然后，參考上述氨基酸序列制備候選肽，然后篩選具有最優(yōu)良的活 性的肽，從而得到本發(fā)明的肽。 SEQ ID NO 1源于天然的人KGF (角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子)的氨基酸120 127。SEQIDNO 2源于天然的人aFGF的氨基酸111 122。SEQ ID NO 3及SEQ ID NO 4分別源于天然的人TGF- α的氨基酸10 20及38 49。盡管本發(fā)明的肽本身比天然的生長因子具有更高穩(wěn)定性，但它們的修飾能使它 們具有甚更高穩(wěn)定性。根據(jù)優(yōu)選實施方式，本發(fā)明的肽C端經(jīng)修飾而帶有羥基(-ΟΗ)或 氨基(-NH2)。根據(jù)優(yōu)選實施方式，本發(fā)明的肽N端經(jīng)保護(hù)基保護(hù)，所述保護(hù)基選自乙酰 基，芴基甲氧基羰基，甲?；?，棕櫚酰基，肉豆蔻酰基，硬脂?；蚓垡叶?PEG)。上述肽修飾大大增加本發(fā)明的肽的穩(wěn)定性。本文中的術(shù)語“穩(wěn)定性”是指體內(nèi) 穩(wěn)定性及保存穩(wěn)定性(例如于室溫的保存穩(wěn)定性)。上述保護(hù)基保護(hù)肽免受體內(nèi)蛋白酶攻
擊ο本發(fā)明另一方面提供皮膚狀況改善用組合物，其含本發(fā)明的生長因子-模擬肽 作為有效成分。本發(fā)明再一方面提供創(chuàng)傷治療用組合物，其含本發(fā)明的生長因子-模擬肽作為 有效成分。本發(fā)明再一方面提供皮膚狀況改善方法，包括給受試者施用含本發(fā)明的肽的組 合物。本發(fā)明又再一方面提供創(chuàng)傷治療方法，包括給受試者施用含本發(fā)明的肽的組合 物。因為本發(fā)明的組合物含上述本發(fā)明的生長因子-模擬肽作為有效成分，略去它 們之間的共同內(nèi)容，以避免本說明書的過度復(fù)雜。如下述實施例所述，本發(fā)明的生長因子-模擬肽與天然的生長因子(例如KGF， aFGF及TGF-α)具有相同的促進(jìn)成纖維細(xì)胞及角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，及生產(chǎn)膠原及纖連蛋 白的作用。因此，本發(fā)明的組合物對改善皮膚狀況具有優(yōu)良的功效。根據(jù)優(yōu)選實施方式，本發(fā)明的組合物可用于改善皮膚狀況，例如改善皺紋或皮膚彈性、防止皮膚老化、防止毛發(fā)脫落、促進(jìn)毛發(fā)生長、改善皮膚保濕、消除黑斑或治 療痤瘡。
有趣的是，如下述實施例所述，本發(fā)明的生長因子-模擬肽具有優(yōu)良的創(chuàng)傷愈合作用。
根據(jù)優(yōu)選實施方式，本發(fā)明的組合物可用于閉合的創(chuàng)傷及開放的創(chuàng)傷。例如， 閉合的創(chuàng)傷包括挫傷或擦傷，及開放的創(chuàng)傷包括擦破傷，撕裂傷，撕脫傷，穿透的創(chuàng)傷 及槍傷。
本發(fā)明的組合物可制備成藥學(xué)或化妝組合物。
根據(jù)優(yōu)選實施方式，組合物是藥物組合物，其含(a)藥學(xué)有效量的本發(fā)明的生 長因子-模擬肽；及(b)藥學(xué)可接受載質(zhì)。
本文中的術(shù)語“藥學(xué)有效量”是指足以顯示及實現(xiàn)本發(fā)明的肽的功效及活性的量。
含于本發(fā)明的藥物組合物中的藥學(xué)可接受載質(zhì)是藥學(xué)制劑時通常使用的，但不 限于，包括乳糖，右旋糖，蔗糖，山梨醇，甘露醇，淀粉，阿拉伯橡膠，磷酸鉀， 藻酸鹽，明膠，硅酸鉀，微晶纖維素，聚乙烯吡咯烷酮，纖維素，水，糖漿，甲基纖維 素，羥苯甲酯，羥苯丙酯，滑石，硬脂酸鎂，及礦物油。本發(fā)明的藥物組合物還可包括 潤滑劑，致濕劑，甜味劑，調(diào)味劑，乳化劑，懸浮劑，及防腐劑。適宜 藥學(xué)可接受載質(zhì) 及制劑的明細(xì)可見于 Remington' s Pharmaceutical Sciences(19th ed.，1995)，其通過引用 并入本文。
本發(fā)明的藥物組合物可口服或經(jīng)腸外施用，及優(yōu)選地，經(jīng)腸外施用，例如通過 靜脈內(nèi)，皮下，肌內(nèi)，腹膜內(nèi)，局部或透皮施用。
本發(fā)明的藥物組合物的適宜劑量可依賴于藥學(xué)制劑方法，施用方法，患者年 齡，體重，性別，患病狀態(tài)，飲食，施用時間，施用途徑，排泄速度及對所用藥物組合 物的敏感度而變化。優(yōu)選地，本發(fā)明的藥物組合物可以每日0.001 100mg/kg的劑量施用。
根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)，本發(fā)明的藥物組合物可與上述藥學(xué)可接 受載質(zhì)和/或媒質(zhì)制成制劑，最終提供幾種單位劑型及多劑型。制劑的非限制性例包 括，但不限于，溶液，懸浮液或油或水介質(zhì)中的乳液，提取物，酏劑，粉末，顆粒，片 劑及膠囊，及還可含分散劑或穩(wěn)定劑。
根據(jù)優(yōu)選實施方式，組合物是化妝組合物，其含(a)化妝學(xué)有效量的本發(fā)明的 生長因子-模擬肽；及(b)化妝學(xué)可接受載質(zhì)。
本文中的術(shù)語“化妝學(xué)有效量”是指足以實現(xiàn)改善上述皮膚狀況的功效的量。
本發(fā)明的化妝組合物可以廣泛多種形式制成制劑，例如，包括溶液，懸浮液， 乳液，糊劑，軟膏劑，凝膠，乳霜，洗劑，粉末，皂，含表面活性劑的清潔劑，油，粉 底，乳液底，蠟底及噴霧劑。具體而言，本發(fā)明的化妝組合物可制成柔潤化妝水，營養(yǎng) 化妝水，營養(yǎng)霜，按摩霜，精華液，眼霜，清潔霜，清潔泡沫，清潔水，面膜，噴霧劑 或粉末形式。
當(dāng)化妝組合物是糊劑，乳霜或凝膠形式時，其可含動物及植物脂肪，蠟，石 蠟，淀粉，黃著膠，纖維素衍生物，聚乙二醇，硅酮，皂粘土，硅石，滑石，氧化鋅或6這些物質(zhì)的混合物。
在粉末或噴霧劑制劑中，其可含乳糖，滑石，硅石，氫氧化鋁，硅酸鈣，聚酰 胺粉末及這些物質(zhì)的混合物。噴霧劑可再含慣用噴射劑，例如，氯氟烴，丙烷/ 丁烷或二甲酯。
溶液及乳液制劑可含溶劑，增溶劑及乳化劑，例如水，乙醇，異丙醇，碳酸 乙酯，醋酸乙酯，芐醇，苯甲酸芐酯，丙二醇，1，3-丁二醇，油，脂肪酸甘油酯，聚乙 二醇及山梨坦的脂肪酸酯。
懸浮液制劑可含液體稀釋劑，例如水，乙醇或丙二醇，懸浮劑，例如，乙氧基 化的異硬脂醇，聚氧基乙烯山梨醇酯及聚氧基乙烯山梨坦酯，微晶纖維素，偏氫氧化 鋁，皂粘土，瓊脂及黃著膠或這些物質(zhì)的混合物。
含表面活性劑的清潔組合物制劑可含脂肪醇硫酸，脂肪醇醚硫酸，磺基琥珀 酸單酯，異硫代磷酸酯，咪唑鐺衍生物，?；撬峒柞ィ“彼狨?，脂肪酸酰胺醚硫酸， 烷基氨基甜菜堿，脂肪醇，脂肪酸甘油酯，脂肪酸二乙醇酰胺，植物油，羊毛酯衍生 物，乙氧基化的脂肪酸甘油酯或這些成分的混合物。
而且，本發(fā)明的化妝組合物可含輔助劑及bFGF修飾劑作為有效成分，以及載 質(zhì)。輔助劑的非限制性例包括抗氧化劑，穩(wěn)定劑，增溶劑，維生素，著色劑，氣味改 善劑或這些物質(zhì)的混合物。
本發(fā)明的特征及優(yōu)點總結(jié)如下
(a)本發(fā)明的生長因子-模擬肽與天然的人生長因子具有相同功能或活性；
(b)本發(fā)明的肽比天然的生長因子具有甚更高穩(wěn)定性及皮膚滲透能力；
(c)因此，含肽組合物對要求生長因子活性的疾病或狀況表現(xiàn)出優(yōu)良的治療，預(yù) 防或改善功效；及
(d)本發(fā)明的肽的優(yōu)良的活性及穩(wěn)定性可有利地應(yīng)用于藥物組合物，準(zhǔn)藥品及化妝品。

圖1顯示天然的生長因子氨基酸序列及制備本發(fā)明的肽的選定區(qū)域。
圖&顯示實施例中制備的SEQ ID NO 1的肽的高效液相色譜分析。
圖沈顯示實施例中制備的SEQ ID NO 2的肽的高效液相色譜分析。
圖2c顯示實施例中制備的SEQ ID NO 3的肽的高效液相色譜分析。
圖2d顯示實施例中制備的SEQ ID NO 4的肽的高效液相色譜分析。
圖3a是顯示用實施例中制備的SEQ ID NO 1 4的肽處理對角質(zhì)形成細(xì)胞的 生長刺激效果的坐標(biāo)圖。
圖勸是顯示用實施例中制備的SEQ ID NO 1 4的肽處理對成纖維細(xì)胞的生 長刺激效果的坐標(biāo)圖。
圖4是顯示用實施例中制備的SEQ ID NO 1 4的肽處理對角質(zhì)形成細(xì)胞及成 纖維細(xì)胞的生長刺激效果的顯微圖像。
圖5a是顯示與本發(fā)明的肽(肽1 4)溫育的角質(zhì)形成細(xì)胞中升高的膠原水平的 坐標(biāo)圖。
圖5b是顯示與本發(fā)明的肽(肽1 4)溫育的角質(zhì)形成細(xì)胞中升高的纖連蛋白水 平的坐標(biāo)圖。
圖6是比較本發(fā)明的肽及天然的aFGF的熱穩(wěn)定性的坐標(biāo)圖。
圖7顯示含本發(fā)明的肽的水凝膠照片。
圖8是用含本發(fā)明的肽的水凝膠對Balb/C小鼠的創(chuàng)傷區(qū)處理10天后觀察Balb/ C小鼠創(chuàng)傷組織中的創(chuàng)傷愈合效果的組織照片。
實施方式
以下將通過實施例更詳細(xì)說明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員明晰，這些實施例僅旨 在更詳細(xì)闡釋本發(fā)明，權(quán)利要求給出的本發(fā)明的保護(hù)范圍不受這些實施例的限制。實施例
合成例 1Ac-Tyr-Lys-Ser-Lys-Lys-Gly-Gly-Trp-Thr-His (SEQID NO 1)的合成
將700mg 氯三苯甲基氯樹脂(CTL 樹脂，Nova Biochem Cat No.01-64-0021)導(dǎo) 入反應(yīng)容器，加入IOml 二氯甲烷(MC)，及攪拌3分鐘。除去溶液后，將IOml 二甲基 甲酰胺(DMF)加入生成物，然后進(jìn)行攪拌3分鐘，而后除去溶劑。將IOml 二氯甲烷溶 液加入反應(yīng)容器，然后將200mM Fmoc-His (Trt) -OH及400mM 二異丙基乙胺(DIEA)加 入反應(yīng)容器，而后將混合物攪拌溶解，然后一邊攪拌一邊進(jìn)行反應(yīng)1小時。反應(yīng)后，洗 滌生成物，及在溶于DCM的甲醇及DIEAO 1)中反應(yīng)10分鐘，之后用過量的DCM/ DMF(1 1)洗滌。除去溶劑后，將IOml DMF加入反應(yīng)容器及攪拌3分鐘，之后除去 溶劑。將IOml去保護(hù)溶液(20%哌啶/DMF)加入反應(yīng)容器，及于室溫攪拌10分鐘， 及除去溶液。加入相同體積去保護(hù)溶液后，進(jìn)行反應(yīng)10分鐘及除去溶液，之后依次 用DMFO次)，MC(1次)及DMF洗滌(每次3分鐘)以得到His-(Trt)-CTL樹脂。 將IOml DMF溶液加入新反應(yīng)容器，然后加入200mM Fmoc-Thr(tBu)-OH(Bachem, Swiss)、200mMHoBt及200mMBop，之后攪拌助溶。將400mM DIEA分兩次加入反應(yīng) 容器，及進(jìn)行攪拌至少5分鐘，溶解全部固體內(nèi)容物。將溶解的氨基酸溶液導(dǎo)入含去保 護(hù)的樹脂的反應(yīng)容器中，及于室溫一邊攪拌一邊進(jìn)行反應(yīng)1小時。除去反應(yīng)溶液后，用 DMF溶液攪拌生成物3次，每次5分鐘，以除去未反應(yīng)的殘留物。取少量反應(yīng)的樹脂通 過茚三酮測試評估反應(yīng)程度。使用去保護(hù)溶液，以如同上述的方式進(jìn)行去保護(hù)兩次，以 得到Thr (tBu)-His-(Trt)-CTL樹脂。用DMF及MC洗滌后，進(jìn)行茚三酮測試后，進(jìn)行 上述氨基酸附著?；谑居趫D1的氨基酸序列，將Fmoc-Trp、Fmoc-Gly、Fmoc-Gly、 Fmoc-Lys (Boc)、Fmoc-Lys (Boc)、Fmoc-Ser (tBu)、Fmoc-Lys (Boc)及 Fmoc-Tyr (tBu) 依次附著到樹脂。通過與去保護(hù)溶液溫育兩次(每次10分鐘)來除去Fmoc-保護(hù)基。 至于乙?；?，將乙酸酐，DIEA及HoBt與肽基樹脂溫育兩次(每次1小時)，及將制備 的肽基樹脂依次用DMF，MC及甲醇洗滌3次，在氮氣流下干燥，通過在P2O5下真空 干燥來完全干燥，然后在中速攪拌下于室溫與30ml離去溶液〔含81.5%TFA(三氟乙 酸)，5%蒸餾水，5%苯甲硫醚，5%苯酚，2.5% EDT及TIS〕反應(yīng)2小時。過濾 樹脂，及用小體積TFA溶液洗滌，而后將濾出物與母液合并。減壓蒸餾至減少到總體積 之一半后，使用50ml冷醚誘導(dǎo)沉淀，及通過離心收集形成的沉淀物，之后用冷醚洗滌兩8次。除去母液后，在氮氣氣氛下干燥生成物，以提供1.18g未純化的SEQ IDNO 1的 Ac_YKSKKGGWTH(產(chǎn)率，72.6% )。使用質(zhì)譜儀測定最終產(chǎn)物的分子量為1233.8(理 論 MW 1233.4)。
合成例2其他肽的合成
如合成例1所述過程合成SEQ ID NO 2 4的肽。SEQ ID NO 2 (Tyr-Ile -Ser-Lys-Lys-His-Ala-Gly-Lys-Asn-Trp-Phe YISKKHAGKNWF)對應(yīng)于 aFGF 的氨 基酸 111 122，SEQ ID NO 3 (Asp-Ser-His-Thr-Gln-Tyr-Cys-Phe-His-Gly-Thr DSHTQYCFHGT)對應(yīng)于 TGF- α 的氨基酸 10 20，及 SEQ ID NO 4 (Gly-Tyr-Val-Gl y-Va卜Arg-Cys-Glu-Ala-Ala-Asp-Leu-Asp-Ala GYVGVRCEAADLDA)對應(yīng)于 TGF- α 的氨基酸38 49。測定的肽的分子量總結(jié)于表1
表1
SEQ ID NO氨基酸序列分析值(質(zhì)譜儀)分析值理論值1Ac-YKSKKGGWTH1233.81233.42YISKKHAGKNWF1478.81478.73DSHTQYCFHGT1295.91295.44GYVGVRCEAADLDA1438.01437.實驗例1所述合成肽對HaCaT角質(zhì)形成細(xì)胞及ΝΙΗ3Τ3成纖維細(xì)胞的生長的 影響
為評估合成例1 2中制備的4種肽是否具有與生長因子-1相似的活性，使用 HaCaT角質(zhì)形成細(xì)胞及ΝΙΗ3Τ3成纖維細(xì)胞，根據(jù)Rizzino等人的方法進(jìn)行SRB (硫代羅 丹明 B; Sigma-Aldrich)比色測定(Rizzino，et al.Cancer Res., 48: 4266(1988))。
在含補(bǔ)充了10 % FBS (牛血清白蛋白)的 EMEM (Eagle ‘ s minimal essential media ； Gibco, U.S.A.)的250ml培養(yǎng)皿中培養(yǎng)HaCaT角質(zhì)形成細(xì)胞(韓國細(xì)胞系銀行) 及NIH3T3成纖維細(xì)胞(韓國細(xì)胞系銀行)。用0.25%胰蛋白酶溶液處理培養(yǎng)的細(xì)胞以 使細(xì)胞從培養(yǎng)皿底部脫離，及離心收集細(xì)胞沉淀。將細(xì)胞重懸浮于不含F(xiàn)BS的EMEM 中后，將其等份GX IO3細(xì)胞)加入96孔平板的各孔，及于37°C在7%032下培養(yǎng)對小 時。培養(yǎng)M小時后，將培養(yǎng)基用不含血清的新鮮培養(yǎng)基替換，及將細(xì)胞與人酸性成纖維 細(xì)胞生長因子(NIBSC，UK)和溶于水及10% DMSO的4種合成肽(10ng/ml或1,OOOng/ ml)在與上述相同條件下溫育72小時。除去上清后，將細(xì)胞使用PBS (磷酸緩沖液)洗 滌一次。除去洗滌溶液后用SRB溶液處理。用PBS充分洗滌細(xì)胞，及在顯微鏡想觀察 細(xì)胞活力。此外，測量590nm處的吸光度以分析細(xì)胞增殖。
圖3a及圖3b分別顯示角質(zhì)形成細(xì)胞及成纖維細(xì)胞生長的分析數(shù)據(jù)。圖4顯示 用肽處理72小時后在顯微鏡下觀察的角質(zhì)形成細(xì)胞及成纖維細(xì)胞的生長模式。
如圖3a所示，本發(fā)明的4種肽顯著促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞生長。尤其是，本發(fā)明的 肽1，3及4對角質(zhì)形成細(xì)胞生長有甚更優(yōu)效果。此外，如圖3b所示，觀察到本發(fā)明的49種肽促進(jìn)成纖維細(xì)胞生長。尤其是，本發(fā)明的肽1及2對成纖維細(xì)胞生長具有優(yōu)良的效 果。如圖4所示，本發(fā)明的肽被發(fā)現(xiàn)顯著促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞及成纖維細(xì)胞生長。
實驗例2所述合成肽對膠原及纖連蛋白生成的影響
將培養(yǎng)48小時的HaCaT角質(zhì)形成細(xì)胞與本發(fā)明的4種肽溫育72小時。使用原 膠原ELISA試劑盒(Takara，Japan)及纖連蛋白ELISA試劑盒(CHEMICON，USA)進(jìn)行原膠原及纖連蛋白水平(顯示皮膚皺紋改善的指示)的檢查和定量。如圖5a所示，本發(fā) 明的4種肽被發(fā)現(xiàn)升高角質(zhì)形成細(xì)胞中原膠原水平。首先，本發(fā)明的肽2表現(xiàn)出顯著促 進(jìn)原膠原生產(chǎn)。此外，如圖恥所示，本發(fā)明的肽被發(fā)現(xiàn)升高角質(zhì)形成細(xì)胞中纖連蛋白水 平。尤其是，本發(fā)明的肽1及4表現(xiàn)出顯著促進(jìn)原膠原生產(chǎn)。
從實驗1和2的結(jié)果得知，這些結(jié)果顯示本發(fā)明的肽表現(xiàn)出顯著改善皮膚狀況的 效果。
實驗例3制備的肽的熱穩(wěn)定性
將合成例1 2中制備的4種肽及購自NIBSC (UK)的標(biāo)準(zhǔn)品生長因子(KGF、 aFGF及TGF- α )溶于磷酸緩沖液至濃度0.11mg/ml。將制備的溶液(Iml)導(dǎo)入玻璃瓶 中，及保持在37°C。然后，在第0，5，10，20，25，30，40，60及100天時取出靜置 于37°C的溶液離心除去變性的肽或蛋白，之后取上清使用HPLC定量(圖6)。合成肽的 殘量比天然的生長因子更高。將殘余肽作為樣品根據(jù)與實施例1中所述相同方法處理細(xì) 胞，及利用 MTT 測定 Mcudiero，D.A.，et al.Cancer Res.48 4827-4833 (1988))來測定 肽及天然的生長因子的殘余活性。得知本發(fā)明的全部肽具有比天然的生長因子更優(yōu)的活 性。
實施例1納米化肽的制備
將50mg合成例中得到的4種肽通過劇烈攪拌溶于500ml蒸餾水。將肽溶液與 5g卵磷脂，0.3ml油酸鈉，50ml乙醇及少量油混合，及用蒸餾水調(diào)節(jié)其體積至1L。將得 到的溶液用微流化儀在高壓下乳化，由此提供具有IOOnm尺寸的納米體。將制備的納米 體以最終濃度約50ppm單獨或與其他物質(zhì)組合用于化妝品制備。
劑型例1柔潤化妝水
根據(jù)常規(guī)制備方法制備含實施例1中制備的4種肽納米體中的至少一種納米體、 且具有下列組成的柔潤化妝水。
表2
權(quán)利要求
1.具有生長因子活性的肽，其， 源于生長因子，且 含選自SEQ ID NO : 1 4的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求1的肽，其中所述肽C端經(jīng)修飾而帶有羥基(-0H)或氨基(-NH2)。
3.權(quán)利要求1的肽，其中所述肽N端經(jīng)保護(hù)基保護(hù)，所述保護(hù)基選自乙?；?基甲氧基羰基，甲酰基，棕櫚酰基，肉豆蔻?；?，硬脂?；熬垡叶?PEG)。
4.皮膚狀況改善用組合物，其含權(quán)利要求1 3中任一項的肽作為有效成分。
5.創(chuàng)傷治療用組合物，其含權(quán)利要求1 3中任一項的肽作為有效成分。
6.權(quán)利要求4的組合物，其中所述皮膚狀況改善是改善皺紋或皮膚彈性、防止皮 膚老化、防止毛發(fā)脫落、促進(jìn)毛發(fā)生長、改善皮膚保濕、消除黑斑或治療痤瘡。
7.皮膚狀況改善方法，包括給受試者施用含權(quán)利要求1 3中任一項的肽作為有效成 分的組合物。
8.創(chuàng)傷治療方法，包括給受試者施用含權(quán)利要求1 3中任一項的肽作為有效成分的 組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有生長因子活性的生長因子-模擬肽，及包含所述模擬肽的皮膚狀況改善用或創(chuàng)傷治療用組合物及皮膚狀況改善或創(chuàng)傷治療方法。本發(fā)明的生長因子-模擬肽與天然的人生長因子具有相同功能或作用，及比天然的生長因子更優(yōu)的穩(wěn)定性及皮膚滲透能力。因此，本發(fā)明的含肽組合物可對治療，預(yù)防及改善要求生長因子活性的疾病或狀況表現(xiàn)出優(yōu)良的功效。此外，本發(fā)明的肽的優(yōu)良的活性及穩(wěn)定性可有利地應(yīng)用于藥物組合物，準(zhǔn)藥品及化妝品。
文檔編號C07K14/71GK102027008SQ200980116904
公開日2011年4月20日 申請日期2009年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月11日
發(fā)明者崔俊英, 鄭镕池, 金榮德, 金銀美 申請人:凱爾格恩有限公司