專利名稱：抗體純化方法
抗體純化方法 發(fā)明領域本發(fā)明涉及重組表達抗體的純化。
背景技術：
抗體純化方法通常基于捕獲親和色譜，通常為Protein Α,然后是離子交換和/或 疏水作用和/或混合模式色譜步驟。此類方法通常還包括至少兩個病毒清除步驟，通常 通過親和步驟洗脫液的低pH和在所述方法合適位置放置病毒過濾器清除。mAb純化方法 去除的雜質(zhì)包括半抗體、抗體片段、二聚體、以及聚集體、DNA、病毒、HCP、Protein A滲漏物、內(nèi)毒素以及其它相關雜質(zhì)。ProteinA為一種最初發(fā)現(xiàn)于細菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)細胞壁 的40-60kDa表面蛋白。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，由于其結(jié)合免疫球蛋白，尤其是IgG的能力，該蛋白 已用于生物化學研究。該蛋白通過與重鏈相互作用結(jié)合免疫球蛋白的Fc區(qū)域。W09856808 和 W02005016968 描述了 Protein A 純化的示例。Protein A 純化還描述于 W02004076485、US20070060741 和 Kelley BD Biotechnol Bioeng.皿.(3) .553-66 (2008)。持續(xù)需要工業(yè)生產(chǎn)重組抗體的有效方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種從懸浮液中純化抗體復合物的方法，所述懸浮液包含所述抗體 復合物，其中i)所述懸浮液在某些條件下接觸Protein A衍生物/類似物，其中所述Protein A 衍生物/類似物結(jié)合所述抗體復合物，ii)使用合適的緩沖液洗滌所述ProteinA衍生物/類似物結(jié)合的抗體，以及iii)使用合適的緩沖液將所述抗體復合物從所述Protein A衍生物/類似物洗脫并 收集在所得洗脫物中。本發(fā)明涉及一種從懸浮液中純化抗體復合物的方法，所述懸浮液包含所述抗體 復合物，其中i)所述懸浮液在某些條件下接觸對所述抗體具有親和力的配體，其中所述配體 結(jié)合所述抗體復合物， )使用合適的緩沖液洗滌所述配體結(jié)合的抗體，iii)使用合適的緩沖液將所述抗體復合物從所述配體洗脫并收集在洗脫物中，以 及來自步驟iii)的洗脫物進行陽離子色譜。本發(fā)明涉及一種抗體純化平臺，所述平臺包含根據(jù)本發(fā)明的方法。本發(fā)明涉及一種工業(yè)生產(chǎn)抗體的方法，其中所述方法包含根據(jù)本發(fā)明的方法。詳細說明
抗體純化的常規(guī)方法為本領域所熟知，例如Pete Gagnon Purification Tools for monoclonal Antibodies(單克隆抗體的純化工具)(1996)ISBN_9653515-9-9中描述的方
法。本發(fā)明涉及開發(fā)抗體復合物純化的新方法。在本申請上下文中，抗體復合物為免疫球蛋白。術語“免疫球蛋白”系指一種分子，其屬于一類結(jié)構(gòu)相關的糖蛋白，由兩對 多肽鏈組成，一對輕(L)鏈和一對重(H)鏈，全部4條鏈通過二硫鍵相互連接。免疫球 蛋白的結(jié)構(gòu)已充分鑒定。參見例如Fundamental Immunology Ch.7 (Paul，W.,編輯，第2 版.Raven Press，N.Y. (1989))。簡而言之，每條重鏈通常由重鏈可變區(qū)(Vh)和重鏈恒定 區(qū)(通常包含3個結(jié)構(gòu)域，CH1、Ch2、和Ch3)組成。每條輕鏈通常由輕鏈可變區(qū)(VJ 和輕鏈恒定區(qū)(通常包含1個結(jié)構(gòu)域，CJ組成。在本發(fā)明上下文中術語“抗體復合物”系指免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分 子片段、或者兩者之一的衍生物，其具有在通常生理條件下長時間特異性結(jié)合抗原的能 力，結(jié)合時間例如至少約30分鐘，至少約45分鐘，至少約1小時，至少約2小時，至少 約4小時，至少約8小時，至少約12小時，約24小時或更長，約48小時或更長，約3、 4、5、6、7或更多天等等，或者任何其它相關功能限定的時間(例如足以引發(fā)、促進、 增強、和/或調(diào)節(jié)與抗體結(jié)合抗原相關的生理反應的時間)。免疫球蛋白分子重鏈和輕鏈的可變區(qū)包含與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？贵w (Abs)的恒定區(qū)可能介導免疫球蛋白結(jié)合宿主組織或因子，其包括免疫系統(tǒng)的多種細胞 (例如效應細胞)和經(jīng)典補體系統(tǒng)的第一組分(CIq)。如上面指出，術語抗體在本文中，除非另作說明或明顯與上下文矛盾，包括任 何合適全長抗體的片段，該片段保留特異性結(jié)合抗原的能力，且能夠結(jié)合Protein A，還 能夠結(jié)合Protein A衍生物/類似物?？贵w可能具有不同于上述“典型”免疫球蛋白結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)。其可為單鏈抗體、 雙特異性抗體、以及輕鏈和重鏈的所有種類的片段和組合。文獻中充滿此類抗體的描 述。對于本發(fā)明的目的來說，抗體復合物結(jié)合ProteinA和抗原即可。在一種實施方案中，所述抗體復合物為治療抗體。在一種實施方案中，所述抗體復合物為IgG抗體。在一種實施方案中，本發(fā)明提供了純化抗體復合物的方法，該方法包含使用基 于Protein A衍生物/類似物而不是常規(guī)Protein A柱的親和色譜。此類Protein A衍生物/ 類似物柱減少配體滲漏，改進日常生產(chǎn)成本并改進產(chǎn)品質(zhì)量。另外，使用比傳統(tǒng)Protein A步驟少鹽的洗脫條件可避免親和與離子交換步驟之間的任何濃縮步驟，例如UF/DF。在一種實施方案中，本發(fā)明提供了一種從懸浮液中純化抗體復合物的方法，所 述懸浮液包含所述抗體復合物，其中i)所述懸浮液在某些條件下接觸Protein A衍生物/類似物，其中所述Protein A 衍生物/類似物結(jié)合所述抗體復合物，ii)使用合適的緩沖液洗滌所述ProteinA衍生物/類似物結(jié)合的抗體，以及iii)使用合適的緩沖液將所述抗體復合物從所述Protein A衍生物/類似物洗脫并 收集在所得洗脫物中。在本發(fā)明上下文中，Protein A衍生物/類似物為Protein A衍生物/類似物配體，
其中Protein A的IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的堿不穩(wěn)定氨基酸已用對堿更加穩(wěn)定的氨基酸替換。在一種實施方案中，Protein A衍生物/類似物為Protein A分子，其中一個或多個天門冬 酰胺(Asn)殘基已被修飾以增加堿性條件下的蛋白穩(wěn)定性。在一種實施方案中，修飾兩 個或更多個Aot殘基。在一種實施方案中，修飾所有Asn殘基。在一種實施方案中，所 述Aot殘基用選自賴氨酸、天門冬氨酸和亮氨酸的氨基酸替換。在一種實施方案中，所 述Protein A衍生物/類似物為如本文前面所述修飾的結(jié)構(gòu)域Z。在一種實施方案中，所 述Protein A衍生物/類似物為如EP1123389A1和/或US6831161所述的Protein A衍生物 /類似物。母體ProteinA分子也可以其它方式修飾，該方式可能例如增強特性 。在一種實施方案中，所述Protein A衍生物/類似物與惰性樹脂共價結(jié)合。在 一種實施方案中，所述Protein A衍生物/類似物樹脂為MabSelect SuRe 。MabSelect SuRe 來自 GE Healthcare life Sciences (http://www.gelifesciences.com)。在一種實施方案中，使用Protein A衍生物/類似物的親和色譜在低于室溫的溫 度下進行。在一種實施方案中，使用ProteinA衍生物/類似物的親和色譜在2到25°C溫 度下進行，例如5到25°C，例如10到25°C，例如15到25°C，或者溫度為2到20°C，例 如5到20°C，例如10到20°C，例如15到20°C，或者溫度為2到15°C，例如5到15°C， 例如10到15°C，或者溫度為2到10°C，例如5到10°C，或者溫度為2到5°C。在一種 實施方案中，使用ProteinA衍生物/類似物的親和色譜在2、5、10、15、20或25°C的溫 度下進行。在一種實施方案中，步驟i)、ii)和iii)可使用膜或固體樹脂以流過 (flow-through)方式進行。在一種實施方案中，來自Protein A衍生物/類似物色譜的洗脫物進行病毒滅 活。在一種實施方案中，所述病毒滅活通過降低來自Protein A衍生物/類似物色譜的洗 脫物的pH進行。在一種實施方案中，所述洗脫物的pH降低至pH 3到4持續(xù)時間5分鐘 到1天。在一種實施方案中，所述pH降低至pH3.1到4，例如3.2到4，例如3.3到4， 例如3.4到4，例如3.5到4，例如3.6到4，例如3.7到4，例如3.8到4，例如降低至pH 4。在一種實施方案中，所述pH降低至pH3到3.9，例如3.1至Ij 3.9，例如3.2至Ij 3.9，例 如3.3至Ij 3.9，例如3.4至Ij 3.9，例如3.5至Ij 3.9，例如3.6至Ij 3.9，例如3.7至Ij 3.9，例如降 低至pH3.9。在一種實施方案中，所述pH降低至pH3到3.8，例如3.1至Ij 3.8，例如3.2 到3.8，例如3.3至Ij 3.8，例如3.4至Ij 3.8，例如3.5至Ij 3.8，例如3.6至Ij 3.8，例如降低至pH 3.8。在一種實施方案中，所述pH降低至pH3到3.7，例如3.1至Ij 3.7，例如3.2至Ij 3.7， 例如3.3至IJ 3.7，例如3.4至IJ 3.7，例如3.5至Ij 3.7，例如降低至pH3.7。 在一種實施方案 中，所述pH降低至pH 3至Ij 3.6，例如3.1至Ij 3.6，例如3.2至Ij 3.6，例如3.3至Ij 3.6，例如 3.4到3.6，例如降低至pH 3.6。在一種實施方案中，所述pH降低至pH 3到3.5，例如 3.1到3.5，例如3.2至IJ 3.5，例如3.3至Ij 3.5，例如降低至pH 3.5。在一種實施方案中，所 述pH降低至pH 3到3.4，例如3.1到3.4，例如3.2到3.4，例如降低至pH 3.4。在一種 實施方案中，所述pH降低至pH 3到3.3，例如3.1到3.3，例如降低至pH 3.3。在一種 實施方案中，所述pH降低至pH3到3.2，例如降低至pH 3.2，或者降低至pH 3.1，或者 降低至pH3。如上所述，來自Protein A衍生物/類似物色譜的洗脫物可在任一所述這些pH值 下保存5分鐘到1天時間。在一種實施方案中，所述時間為10分鐘到240分鐘，例如20到90分鐘。然后，所述洗脫物的pH調(diào)節(jié)至pH 4.5到5.5或者適合任意下列步驟的其它值。在一種實施方案中，來自ProteinA衍生物/類似物色譜的洗脫物在所述降低pH值之前和/或重新調(diào)節(jié)pH之后過濾。在本發(fā)明的一種實施方案中，來自Protein A衍生物/類似物色譜的所得洗脫 物，無論是否進行上述pH降低，都進行陽離子交換步驟。在親和步驟下游安排陽離子交 換步驟可能有利，因為所得洗脫物的pH低于7，所述洗脫物可直接處理而無需進一步調(diào) 節(jié)和可能的額外pH調(diào)節(jié)，所述調(diào)節(jié)可能跨過mAb的等電點。避免進一步pH調(diào)節(jié)可幫 助避免沉淀和聚集體形成?？蓪碜訮rotein A的洗脫物(可能地，在病毒滅活之后)集合裝填到在乙酸鈉緩 沖液中在pH 4.5-6.0下預先平衡的柱上進行陽離子色譜。未結(jié)合物質(zhì)從柱上洗去，mAb 使用乙酸鈉緩沖液中的0-0.3M氯化鈉的線性梯度洗脫。聚集體作為產(chǎn)品之后的峰值洗 脫。雜質(zhì)例如宿主細胞蛋白、DNA和ProteinA滲漏也顯著減少。在一種實施方案中，該陽離子色譜在低于室溫的溫度下進行。在一種實施方案 中，該陽離子色譜在2到25°C溫度下進行，例如5到25°C，例如10到25°C，例如15至Ij 25°C,或者溫度為2到20°C，例如5到20°C，例如10到20°C，例如15到20°C，或者溫 度為2到15°C，例如5到15°C，例如10到15°C，或者溫度為2到10°C，例如5到10°C， 或者溫度為2到5°C。在一種實施方案中，該陽離子色譜在2、5、10、15、20或25°C的 溫度下進行。在一種實施方案中，該陽離子色譜使用膜或固體樹脂以流過方式進行。在流過模式中，柱或膜在乙酸鈉緩沖液中在pH 4.5-6.0下平衡。裝填柱直至收 集集合(樣品/產(chǎn)品餾分)中出現(xiàn)HCP(宿主細胞蛋白)、聚集體或其它雜質(zhì)的不可接受 的增長。在一種實施方案中，在陽離子色譜之后進行病毒過濾。在一種實施方案中，病 毒過濾在低于室溫的溫度下進行。在一種實施方案中，病毒過濾在2到25°C溫度下進 行，例如5到250C，例如10到250C，例如15到25°C，或者溫度為2到20°C，例如5到 20°C,例如10到20°C，例如15到20°C，或者溫度為2到15°C，例如5到15°C，例如10 到15°C，或者溫度為2到10°C，例如5到10°C，或者溫度為2到5°C。在一種實施方案 中，所述病毒過濾在2、5、10、15、20或25°C的溫度下進行。病毒過濾可以如本領域已知的方式完成，例如使用病毒過濾器，例如如Pete Gagnon Purification Tools for monoclonal Antibodies (單克隆抗體的純化工具)(1996) ISBN-9653515-9-9 所述。在一種實施方案中，重復病毒過濾步驟，例如使用相似的病毒過濾器或不同的 病毒過濾器進行第二次病毒過濾。在一種實施方案中，第一過濾器比第二過濾器更為多 孔。這使在第一步更有效去除聚集體，在第二步更有效去除病毒。在一種實施方案中，來自陽離子色譜的洗脫物可進行陰離子色譜，可能地，在 如上所述的病毒過濾步驟之后。可將來自陽離子交換色譜步驟的集合裝填到在磷酸緩沖液中在pH 6-8下預先 平衡的柱或膜上進行所述陰離子色譜。裝填之前，所述物質(zhì)可使用水稀釋至電導率2-12mS/cm并調(diào)節(jié)pH至目標pH。產(chǎn)品在流出餾分收集。在一種實施方案中，在陰離子色譜之后進行病毒過濾?？扇缟纤鲞M行所述病 毒過濾。在一種實施方案中，在陽離子色譜之后和陰離子色譜之后都進行病毒過濾。在一種實施方案中，所述陰離子色譜使用膜或固體樹脂以流過方式進行。如果需要，緩沖液交換和抗體濃縮可在最后色譜步驟之后進行(參見例如Pete Gagnon Purification Tools for monoclonal Antibodies (單克隆抗體的純化工具)(1996) ISBN-9653515-9-9)，以及例如見于 W02009010269。如本領域已知，抗體樣品還可進一步配制成適于藥用的制劑中的藥物制劑 。本發(fā)明還提供了一種抗體純化平臺，即一種標準化方法，其可用于生產(chǎn)多種不 同抗體，一種通用方法，該平臺包含根據(jù)本發(fā)明的方法。所述標準化平臺在生產(chǎn)中具有多種優(yōu)點一節(jié)省開發(fā)/試驗成本和時間，因為每個項目可應用相同的方法一可應用相同的設備和原料、緩沖液等等，因此無需額外試驗以及獲得新的核 準供應商等等一病毒確認研究可在不同項目中重復使用一節(jié)省人力并確保產(chǎn)品質(zhì)量。在一種實施方案中，所述抗體為IgG抗體。包含本發(fā)明方法的抗體生產(chǎn)平臺可具有其它優(yōu)點，例如親和配體滲漏減少以及 在相同條件下洗脫不同IgG亞型的可能性。因此，本發(fā)明還提供了一種工業(yè)生產(chǎn)抗體的方法，其中所述方法包含根據(jù)本發(fā) 明的純化抗體復合物的方法。在一種實施方案中，所述抗體復合物為治療抗體。在一種 實施方案中，所述抗體復合物為IgG抗體。在一種實施方案中，本發(fā)明提供了一種工業(yè)生產(chǎn)抗體的方法，其中所述方法包 含根據(jù)本發(fā)明的純化抗體復合物的方法，其中從Protein A衍生物/類似物色譜洗脫之后 的步驟無需儲存罐以連續(xù)過程模式進行。下面是本發(fā)明實施方案的非限制性列表。實施方案1 一種從懸浮液中純化抗體復合物的方法，所述懸浮液包含所述抗 體復合物，其中i)所述懸浮液在某些條件下接觸Protein A衍生物/類似物，其中所述Protein A 衍生物/類似物結(jié)合所述抗體復合物，ii)使用合適的緩沖液洗滌所述ProteinA衍生物/類似物結(jié)合的抗體，以及iii)使用合適的緩沖液將所述抗體復合物從所述Protein A衍生物/類似物洗脫并 收集在所得洗脫物中。實施方案2:根據(jù)實施方案1所述的方法，其中所述ProteinA衍生物/類似物為 Protein A的衍生物/類似物，其中IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的堿不穩(wěn)定氨基酸已用對堿更加穩(wěn)定
的氨基酸替換。實施方案3:根據(jù)實施方案1或?qū)嵤┓桨?所述的方法，其中所述ProteinA衍生 物/類似物與惰性樹脂共價結(jié)合。實施方案4:根據(jù)實施方案3所述的方法，其中所述ProteinA衍生物/類似物樹脂為 MabSelect SuRe 。
實施方案5 根據(jù)實施方案1到4中任一實施方案所述的方法，其中步驟i)到 iii)中的一步或多步在低于室溫的溫度下進行。實施方案6 根據(jù)實施方案5所述的方法，其中所有步驟i)、ii)和iii)在低于室 溫的溫度下進行。實施方案7 根據(jù)實施方案5或?qū)嵤┓桨?所述的方法，其中所述低于室溫的溫 度為溫度2到250C，例如5到250C，例如10到25°C，例如15到25°C。實施方案8 根據(jù)實施方案5或?qū)嵤┓桨?所述的方法，其中所述低于室溫的溫 度為選自溫度2到20°C的溫度，例如5到20°C，例如10到20°C，例如15到20°C，或者 溫度為2到15°C,例如5到15°C,例如10到15°C。實施方案9 根據(jù)實施方案5或?qū)嵤┓桨?所述的方法，其中所述低于室溫的溫 度為選自溫度2到10°C的溫度，例如5到10°C。實施方案10 根據(jù)實施方案5或?qū)嵤┓桨?所述的方法，其中所述低于室溫的 溫度為2到5°C的溫度。實施方案11 根據(jù)實施方案1到7中任一實施方案所述的方法，其中所述色譜 使用膜或固體樹脂以流過方式進行。實施方案12 一種從懸浮液中純化抗體復合物的方法，所述懸浮液包含所述抗 體復合物，其中i)所述懸浮液在某些條件下接觸對所述抗體具有親和力的配體，其中所述配體 結(jié)合所述抗體復合物， )使用合適的緩沖液洗滌所述配體結(jié)合的抗體，iii)使用合適的緩沖液將所述抗體復合物從所述配體洗脫并收集在洗脫物中，以 及來自步驟iii)的洗脫物進行陽離子色譜。實施方案13 根據(jù)實施方案12所述的方法，其中所述配體為Protein A。實施方案14 根據(jù)實施方案1到11中任一實施方案所述的方法，其中來自步驟 iii)的洗脫物進行陽離子色譜。實施方案15 根據(jù)實施方案12到14中任一實施方案所述的方法，其中來自步 驟iii)的洗脫物在進行陽離子色譜之前進行病毒滅活。實施方案16:根據(jù)實施方案15所述的方法，其中來自步驟iii)的洗脫物的pH 降低至pH 3到4持續(xù)5分鐘到1天的時間，然后在陽離子色譜之前重新調(diào)節(jié)。實施方案17:根據(jù)實施方案16所述的方法，其中所述pH降低至pH3.4-3.9持 續(xù)20到90分鐘的時間。實施方案18 根據(jù)實施方案12到17中任一實施方案所述的方法，其中陽離子 色譜在低于室溫的溫度下進行。實施方案19 根據(jù)實施方案18所述的方法，其中所述低于室溫的溫度為溫度2 到25°C,例如5到25°C,例如10到25°C,例如15到25°C。實施方案20 根據(jù)實施方案18或?qū)嵤┓桨?9所述的方法，其中所述低于室溫 的溫度為選自溫度2到20°C的溫度，例如5到20°C，例如10到20°C，例如15到20°C，或者溫度為2到15°C,例如5到15°C,例如10到15°C。實施方案21 根據(jù)實施方案18或?qū)嵤┓桨?9所述的方法，其中所述低于室溫 的溫度為選自溫度2到10°C的溫度，例如5到10°C。實施方案22 根據(jù)實施方案18或?qū)嵤┓桨?9所述的方法，其中所述低于室溫 的溫度為2到5°C的溫度。實施方案23 根據(jù)實施方案12到22中任一實施方案所述的方法，其中所述陽離子色譜使用膜或固體樹脂以流過方式進行。實施方案24 根據(jù)實施方案1到7中任一實施方案所述的方法，其中來自步驟 iii)的洗脫物進行陰離子色譜。實施方案25:根據(jù)實施方案24所述的方法，其中裝填之前將來自步驟iii)的洗 脫物的電導率調(diào)節(jié)至2到12mS/cm的電導率。實施方案26:根據(jù)實施方案24或?qū)嵤┓桨?5所述的方法，其中來自步驟iii)的 洗脫物在進行陰離子色譜之前進行病毒滅活。實施方案27:根據(jù)實施方案26所述的方法，其中來自步驟iii)的洗脫物的pH 降低至pH 3到4持續(xù)5分鐘到1天的時間，然后在陰離子色譜之前重新調(diào)節(jié)。實施方案28:根據(jù)實施方案27所述的方法，其中所述pH降低至pH3.4_3.9持 續(xù)20到90分鐘的時間。實施方案29 根據(jù)實施方案12到23中任一實施方案所述的方法，其中來自陽 離子色譜的洗脫物進行陰離子色譜，其中來自陽離子色譜的洗脫物可選地在進行陰離子 色譜之前進行病毒過濾。實施方案30:根據(jù)實施方案29所述的方法，其中來自陽離子色譜的洗脫物在進 行陰離子色譜之前進行病毒過濾。實施方案31:根據(jù)實施方案30所述的方法，其中病毒過濾包含來自陽離子色譜 的洗脫物在第一過濾器然后在第二過濾器上過濾。實施方案32:根據(jù)實施方案42所述的方法，其中該第一過濾器比第二過濾器更 多孔。實施方案33:根據(jù)實施方案29所述的方法，其中裝填之前將來自陽離子色譜的 洗脫物的電導率調(diào)節(jié)至2到12mS/cm的電導率。實施方案34 根據(jù)實施方案24到33中任一實施方案所述的方法，其中所述陰 離子色譜在低于室溫的溫度下進行。實施方案35:根據(jù)實施方案34所述的方法，其中所述低于室溫的溫度為2到 25°C的溫度，例如5到25°C,例如10到25°C,例如15到25°C。實施方案36 根據(jù)實施方案34或?qū)嵤┓桨?5所述的方法，其中所述低于室溫 的溫度為選自溫度2到20°C的溫度，例如5到20°C，例如10到20°C，例如15到20°C， 或者溫度為2到15°C,例如5到15°C,例如10到15°C。實施方案37 根據(jù)實施方案34或?qū)嵤┓桨?5所述的方法，其中所述低于室溫 的溫度為選自溫度2到10°C的溫度，例如5到10°C。實施方案38 根據(jù)實施方案34或?qū)嵤┓桨?5所述的方法，其中所述低于室溫 的溫度為2到5°C的溫度。
實施方案39 根據(jù)實施方案24到38中任一實施方案所述的方法，其中所述陰 離子色譜使用膜或固體樹脂以流過方式進行。實 施方案40:根據(jù)實施方案24到39中任一實施方案所述的方法，其中來自陰 離子色譜的洗脫物進行病毒過濾。實施方案41:根據(jù)實施方案40所述的方法，其中病毒過濾包含來自陰離子色譜 的洗脫物在第一過濾器然后在第二過濾器上過濾。實施方案42:根據(jù)實施方案42所述的方法，其中該第一過濾器比第二過濾器更 多孔。實施方案43 根據(jù)實施方案1到42中任一實施方案所述的方法，其中最終洗脫 物進行滲濾和/或超濾。實施方案44 根據(jù)實施方案1到43中任一實施方案所述的方法，其中最終洗脫 物配制成藥物制劑。實施方案45 根據(jù)實施方案1到44中任一實施方案所述的方法，其中所述抗體 復合物為IgG抗體。實施方案46 根據(jù)實施方案1到45中任一實施方案所述的方法，其中所述抗體 復合物為治療抗體。實施方案47 一種抗體純化平臺，所述平臺包含一種根據(jù)實施方案1到46中任 一實施方案所述的方法。實施方案48: —種適合純化IgG抗體的抗體純化平臺，所述平臺包含一種根據(jù) 實施方案1到46中任一實施方案所述的方法。實施方案49:根據(jù)實施方案47或?qū)嵤┓桨?8所述的抗體純化平臺，其中所述 平臺用于生產(chǎn)IgG抗體。實施方案50 根據(jù)實施方案47到49中任一實施方案所述的抗體純化平臺，其 中所述平臺用于生產(chǎn)治療抗體。實施方案51 一種工業(yè)生產(chǎn)抗體的方法，其中所述方法包含根據(jù)實施方案1到 46中任一實施方案所述的方法。實施方案52:根據(jù)實施方案51所述的方法，其中從Protein A衍生物/類似物色 譜洗脫之后的步驟無需儲存罐以連續(xù)過程模式進行。本文引用的所有參考文獻，包括出版物、專利申請和專利，通過引用結(jié)合到本 文中，其范圍與每個參考文獻單獨并特定注明通過引用結(jié)合且其全部內(nèi)容所闡明的相 同。所有標題和副標題在本文中僅為方便使用，不應解釋為以任何方式限制本發(fā) 明。上述要素以其所有可能變化的任何組合包含在本發(fā)明中，除非本文另有說明或 者上下文明顯矛盾。術語“一種”和“一個”和“該”以及類似指代詞用于描述本發(fā)明的上下文 時，應解釋為包含單數(shù)和復數(shù)，除非本文另有說明或者上下文明顯矛盾。本文列舉的數(shù)值范圍僅意在作為單獨表示該范圍內(nèi)每個不同數(shù)值的簡短方法， 除非本文另有說明，每個不同數(shù)值結(jié)合到說明書中，如同其在本文中單獨列舉。除非另有說明，本文提供的所有精確數(shù)值代表對應的近似數(shù)值(例如對于特定因子或測量提供 的所有精確示例數(shù)值可認為也提供了對應的近似測量，在適當情況下用“約”修飾)。本文所述的所有方法可以任何合適的順序執(zhí)行，除非本文另有說明或者上下文 明顯矛盾。使用本文提供的任何和所有實例、或示例語言(“例如”)，僅意在更好地說明 本發(fā)明，而非對本發(fā)明的范圍進行限制，除非另有說明。本說明書中的語言不應解釋為 提示任何要素對本發(fā)明的實踐必不可少，除非明確說明如此。本文引用和結(jié)合專利文件僅為方便而為，并不反映此類專利文件的有效性、專 利性和/或可實施性的任何觀點。本文對本發(fā)明的任何方面或?qū)嵤┓桨傅拿枋?，其涉及一種要素或多種要素使用 術語例如“包含”、“具有”、“包括”或“含有”，意在對本發(fā)明的相似方面或?qū)?施方案提供支持，所述相似方面或?qū)嵤┓桨浮坝伞彼鎏囟ㄒ鼗蚨喾N要素“組成”、
“主要由”所述特定要素或多種要素“組成”、或者“主要包含”所述特定要素或多種 要素，除非另有說明或上下文明顯矛盾(例如本文所述的一種組合物包含一種特定要素 應理解為也描述了一種由所述要素組成的組合物，除非另有說明或上下文明顯矛盾)。本發(fā)明以適用法律允許的最大范圍包括本文描述的方面或權(quán)利要求中列舉的主 題的所有修改和等價物。
實施例實施例1抗體純化方法 從CHO細胞培養(yǎng)中純化mAb的方法(抗NKG2A，描述于例如W02006070286 和W02008009545，抗NKG2D，描述于例如W02005097160，以及抗C5aR，描述于例如 W02003062278和W02008022390)包含多個步驟。細胞培養(yǎng)上清液過濾并裝填到106ml MabSelect SuRe親和柱(長度Ilcm)上(關于溶劑和條件，參見下面)。洗脫產(chǎn)物集合 通過使用0.2M檸檬酸調(diào)節(jié)pH至pH 3.7進行病毒滅活并在室溫下保持1小時。也可使 用其它低pKa緩沖液例如5-lOOmM濃度的檸檬酸或乙酸進行洗脫。隨后，該集合使用 0.5M Na2HPO4調(diào)節(jié)至pH 5.0，然后裝填到94ml POROS 50HS陽離子交換柱(長度4.8cm) 上。pH調(diào)節(jié)之后，溶液中的雜質(zhì)可能發(fā)生沉淀，在裝填到陽離子柱之前必須通過過濾或 離心去除。使用包含超過IOCV的0-0.3mol/kg NaCl梯度的25mM CH3COONa, pH 5.0 洗脫緩沖液完成洗脫。此步驟的pH可根據(jù)實際mAb的pi調(diào)節(jié)。mAb集合使用0.5M Na2HPO4溶液調(diào)節(jié)至pH 7.0，并通過由0.1 μ m過濾器(4.52cm2)組成的過濾器串過濾， 緊接著用Planova 20N病毒過濾器(0.001m2)過濾。(Millex-W過濾器的替代品為0.1 μ m Millipore Opticap XLT 20 過濾器)。病毒濾液在裝填到 Sartobind Q SingleSep 膠囊(75cm2) 陰離子交換膜之前在室溫下用水稀釋至<7.0mS/cm。電導率降低也可通過UF/DF實現(xiàn)。 陰離子交換膜步驟在非結(jié)合條件下以流過方式進行，濾液最終使用50cm2 Biomax 30k膜 在Akta交叉流動儀器上超濾并滲濾至IOmM組氨酸緩沖液pH 6.2中，然后加入Tween 80至0.01%。藥物制劑的最終組成為40mgmAb/mL、25g/L蔗糖、0.01 % w/w Tween 80、IOmM組氨酸，pH6.2。抗NKG2A、抗NKG2D和抗C5aR的步驟產(chǎn)率和其它條件/結(jié)果分別在表1、2和3中提供。Q膜步驟和通過膜的裝填溶液的電導率和pH必須根 據(jù)每種mAb調(diào)節(jié)以達到具有最高可能產(chǎn)率的最大雜質(zhì)減少。因此電導率和pH可能分別 在2-12mS/cm(由NaCl含量控制)和pH 5.8-8.0范圍內(nèi)變化。溶劑和條件Protein A 衍生物 / 類似物捕獲-MabSelect SuRe 室溫 流速20倍柱容積每小時(CV/h) 裝填30g mAb/L樹脂，但可在l_50g/L樹脂范圍內(nèi)變化 平衡與洗滌緩沖液11.5mmol/kg NaH2PO4, 38.5mmol/kg Na2HPO4, 300mmol/kg N aCl 洗滌緩沖液6.5mmol/kg NaH2PO4, 43.5mmol/kg Na2HPO4, 1000mmol/kg NaCl 洗脫緩沖液10mmol/kg 甲酸，pH 3.5 使用分段梯度洗脫 在pH3.7(0.2M檸檬酸)病毒滅活1小時，然后使用0.5M Na2HPO4調(diào)節(jié)pH至 pH5.0CIEX-Poros 50HS, pH 5 室溫 流速25CV/h 裝填45g mAb/L樹脂，但可在40_120g/L樹脂范圍內(nèi)變化 平衡與洗滌緩沖液25mmol/kg CH3COONa 和 12.5mmol/kg CH3COOH 洗脫緩沖液25mmol/kg CH3COONa 和 10.lmmol/kg CH3COOH, 300mmol/ kg NaCl 使用平衡/洗脫緩沖液中的0-300_ol/kgNaCl線性梯度緩沖液pH 5洗脫病毒過濾-Planova20N 室溫 過濾時壓力0.8巴 裝填《110kg/m2，但可高達 5OOkgAn2 使用 0.5M Na2HPO4 溶液調(diào)節(jié) pH 至 7.0 平衡與洗滌緩沖液7.7mmol/kg NaH2PO4, 12.2mmol/kg Na2HPO4, 50mmol/ kg NaCl 使用0.1 μ m過濾器預過濾·使用 Planova 20N 過濾Q 膜流過，pH7 室溫 流速300CV/h 裝填483g/m2，但裝填可在200_3000g/m2范圍內(nèi)變化 用水稀釋集合至7mS/cm 平衡與洗滌緩沖液7.7mmol/kg NaH2PO4, 12.2mmol/kg Na2HPO4, 50mmol/
權(quán)利要求
1.一種從懸浮液中純化抗體復合物的方法，所述懸浮液包含所述抗體復合物，其中i)所述懸浮液在某些條件下接觸ProteinA衍生物/類似物，其中所述Protein A衍生 物/類似物與所述抗體復合物結(jié)合，ii)用合適的緩沖液洗滌所述ProteinA衍生物/類似物結(jié)合的抗體，以及iii)用合適的緩沖液將所述抗體復合物從所述ProteinA衍生物/類似物洗脫并收集在 所得洗脫物中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述ProteinA衍生物/類似物樹脂為MabSelect SuRe 。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的方法，其中步驟i)到iii)中的一步或多步在低 于室溫的溫度下進行。
4.一種從懸浮液中純化抗體復合物的方法，所述懸浮液包含所述抗體復合物，其中 i)所述懸浮液在某些條件下接觸對所述抗體具有親和力的配體，其中所述配體與所 述抗體復合物結(jié)合，ii)用合適的緩沖液洗滌所述配體結(jié)合的抗體，iii)用合適的緩沖液將所述抗體復合物從所述配體洗脫并收集在洗脫物中，以及來自步驟iii)的洗脫物進行陽離子色譜。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述配體為ProteinA。
6.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任一權(quán)利要求所述的方法，其中來自步驟iii)的洗脫物進行 陽離子色譜。
7.根據(jù)權(quán)利要求4到6中任一權(quán)利要求所述的方法，其中來自步驟iii)的洗脫物在進 行陽離子色譜之前進行病毒滅活。
8.根據(jù)權(quán)利要求4到7中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述陽離子色譜在低于室溫 的溫度下進行。
9.根據(jù)權(quán)利要求1到8中任一權(quán)利要求所述的方法，其中來自步驟iii)的洗脫物進行 陰離子色譜。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中來自步驟iii)的洗脫物在進行陰離子色譜之前 進行病毒滅活。
11.根據(jù)權(quán)利要求4到10中任一權(quán)利要求所述的方法，其中來自陽離子色譜的洗脫物 進行陰離子色譜，其中來自陽離子色譜的洗脫物在進行陰離子色譜之前任選進行病毒過濾ο
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中來自陽離子色譜的洗脫物在進行陰離子色譜之 前進行病毒過濾。
13.根據(jù)權(quán)利要求9到12中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述陰離子色譜在低于室 溫的溫度下進行。
14.根據(jù)權(quán)利要求9到13中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述陰離子色譜使用膜或 固體樹脂以流過方式進行。
15.根據(jù)權(quán)利要求9到14中任一權(quán)利要求所述的方法，其中來自陰離子色譜的洗脫物 進行病毒過濾。
16.根據(jù)權(quán)利要求1到15中任一權(quán)利要求所述的方法，其中最終洗脫物進行滲濾和/或超濾。
17.根據(jù)權(quán)利要求1到16中任一權(quán)利要求所述的方法，其中最終洗脫物配制成藥物制劑。
18.一種抗體純化平臺，所述平臺包含根據(jù)權(quán)利要求1到17中任一權(quán)利要求所述的方法。
19.一種適合純化IgG抗體的抗體純化平臺，所述平臺包含根據(jù)權(quán)利要求1到17中任 一權(quán)利要求所述的方法。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的抗體純化平臺，其中所述平臺用于生產(chǎn)治療IgG抗體。
21.—種工業(yè)生產(chǎn)抗體的方法，其中所述方法包含根據(jù)權(quán)利要求1到17中任一權(quán)利要 求所述的方法。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中從ProteinA衍生物/類似物色譜洗脫之后的 步驟無需儲存罐以連續(xù)過程模式進行。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗體的工業(yè)生產(chǎn)方法。
文檔編號C07K16/06GK102027010SQ200980118361
公開日2011年4月20日 申請日期2009年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月15日
發(fā)明者A·斯塔比, B·R·尼爾森, C·杰斯帕斯加爾德, D·E·拉斯姆森, E·哈爾克杰爾, H·克里斯滕森, J·S·尼爾森, R·C·尼爾森, T·B·漢森 申請人:諾沃-諾迪斯克有限公司