專利名稱：方法
方法發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及在完全受保護的肽上進行環(huán)合以產(chǎn)生受保護的環(huán)肽的方法，由所述方 法得到的產(chǎn)物及所述產(chǎn)物的用途。
發(fā)明背景
固相合成是眾所周知的生產(chǎn)肽的技術(shù)。固相肽合成(SPPS)中，氨基酸或肽基結(jié)合 到固體載體樹脂上。然后，連續(xù)的氨基酸或肽基與該載體結(jié)合肽連接直到形成所需的肽材 料。通常，所述載體結(jié)合肽接著從載體上裂解下來并進行進一步加工和/或純化。一些情 況下，固相合成產(chǎn)生成熟肽產(chǎn)物；其它情況下，將從載體裂解下來的肽用于制備較大的成熟 肽產(chǎn)物。
為了合成單一確定的肽序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員通常采用Merrifield法來“生長” 連接到固體載體的肽鏈。合成這些個別肽的方法已自動化。商業(yè)上可獲得的裝置可用于合 成長度為一百或更多個氨基酸的肽。為了獲得任意長度的肽，所得肽可相互連接，通過采用 側(cè)鏈上的合適保護基團和通過采用能除去固體載體上的合成肽而不使它們脫保護的技術(shù)。 因此，任意長度的個別肽的合成在本領(lǐng)域中是已知的。
保護和脫保護步驟(在這種固相肽合成中是必需的)，可理解為顯著地?fù)p害最終 肽產(chǎn)率。此外，可能必需保護肽的氨基酸的側(cè)鏈以防它們參與偶聯(lián)反應(yīng)。因此，可能采用能 在一系列條件下除去的保護基團。這能選擇性地將氨基酸脫保護?？稍谝幌盗袟l件下除去 的保護基團通常稱為“正交保護基團”。
在固相肽合成中，非常需要新的正交保護組(set)。已建立的正交脫保護組是以熟 知的氨基酸Fmoc和Boc保護為基礎(chǔ)的。復(fù)合肽或糖肽的制備通常需要側(cè)鏈氨基官能團的 第三正交保護基團，其去除不會影響其它正交組中保護基團，或反過來也是如此。因此，如 果所得肽從樹脂上裂解下來后將進行進一步的修飾，則除了在起始固相合成過程中需要保 護以外，官能團和側(cè)鏈可能需要保護。
由于許多原因，可能需要肽修飾。具體而言，可進行修飾來固定或減少肽可能采取 的構(gòu)象數(shù)目。其它情況下，在提高肽與特定目標(biāo)的結(jié)合的嘗試中，可對肽側(cè)鏈進行修飾，或 者在其它情況下，保護所述肽不被酶及類似物降解。
在一些情況下，已制備了包含環(huán)狀基團的肽，由此在氨基酸殘基的側(cè)鏈之間產(chǎn)生 鍵。在其它情況下，肽的末端被首尾連接從而該肽具有環(huán)或環(huán)形結(jié)構(gòu)。
通常，以一定的方式制備這些環(huán)肽使得所述環(huán)通過該肽鏈中存在的天然半胱氨酸 殘基氧化而形成，從而產(chǎn)生二硫鍵接結(jié)構(gòu)。這種技術(shù)模擬了天然肽和蛋白中最常見的環(huán)化 形式，但沒有提供制備其它類型環(huán)狀結(jié)構(gòu)的便利方法。
GB 1527252提供了包含半胱氨酸基團的肽的環(huán)化方法的一個實例。GB 1527252 中，將包含至少兩個半胱氨酸部分的肽保持在基本不含氧的溶液中直到所述兩個半胱氨酸 部分環(huán)化以產(chǎn)生環(huán)狀二硫鍵。制備帶有二硫鍵的環(huán)肽的其它方法實例在EP 1921087中提{共。
為了制備首尾連接的環(huán)肽，一種技術(shù)是采用具有正交保護官能團的氨基酸，使得一些可在另外一些存在下選擇性地除去。本領(lǐng)域技術(shù)人員可采用這些技術(shù)在溶液中制備 肽，其中氨基末端環(huán)化到羧基末端上以形成環(huán)。天然實例是抗生短桿菌肽?；蛘撸蓪Φ陌?胱氨酸殘基氧化成二硫鍵以形成一個或多個環(huán)；熟悉的天然環(huán)肽激素催產(chǎn)素是這種結(jié)構(gòu)的 例子，如已由0' Neil等人，Protein，14，509-515 (1992)制備的。然而，這個例子局限于二 硫形成環(huán)狀六肽的情況。
US 6，008，058公開了采用固相合成生產(chǎn)末端連接(頭尾相連)的環(huán)肽的方法。US 6，008，058的環(huán)肽在肽鏈仍然與樹脂載體相連時形成。這在US 6，008, 058中作為關(guān)鍵內(nèi)容 被教導(dǎo)，因為肽的裂解能產(chǎn)生其它問題，如產(chǎn)生二聚體和低聚結(jié)構(gòu)并使表征困難。為了促進 末端連接的環(huán)肽的形成，US 6，008，058要求存在與樹脂載體相連的多官能氨基酸。這使得 與樹脂相連的氨基酸也參與環(huán)化。
US 2003/0125243也公開了生產(chǎn)末端連接的肽的方法。采用1_丙烷磷酸環(huán)酐進行 環(huán)化。
WO 01/16162描述了制備環(huán)肽的方法，其中芳族基團與所述肽的末端連接，所述芳 族基團在所述肽上的氧、硫或氨基之間形成連接。
其它環(huán)肽可通過形成C-主鏈連接來制備。在這種方法中，在所述肽主鏈上的碳原 子之間形成連接，從而使得氨基酸側(cè)鏈上的官能團自由地與靶位點結(jié)合。US 2005/0267017 公開了環(huán)肽及其生產(chǎn)方法，其中在所述肽主鏈上存在的碳原子之間形成環(huán)鍵。US 5，723，575也公開了制備主鏈環(huán)化肽的方法。
現(xiàn)有技術(shù)中公開的環(huán)化方法存在一些缺點，這些缺點使得它們不適合用于生產(chǎn)某 些目標(biāo)物。例如，半胱氨酸環(huán)化僅在肽具有必需的游離半胱氨酸殘基的情況下合適；主鏈環(huán) 化僅在肽上存在合適的連接位點的情況下合適。
需要改進的生產(chǎn)方法的一種這樣的目標(biāo)物是α -促黑素細胞激素(α -MSH)的環(huán) 狀類似物。這種激素調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中下丘腦中黑皮質(zhì)素4受體(MC4)的信號傳輸。這 種激素促進提高的能量消耗和下降的食欲，導(dǎo)致減重。
現(xiàn)有技術(shù)中公開的生產(chǎn)環(huán)狀α -MSH類似物的方法存在一些缺點，這些缺點影響 最終產(chǎn)物的純度和產(chǎn)率。US 5，683，981公開了在α-促黑素細胞激素類似物上進行環(huán)合的 方法。具體而言，US 5，683，981公開了一種方法，其中Lys殘基和Glu殘基縮合而形成環(huán)結(jié) 構(gòu)。進行環(huán)合的方法包括采用“關(guān)鍵中間體Α”形成肽，所述關(guān)鍵中間體A包含一些受保護 的氨基酸殘基，具體而言，受保護的Lys殘基。接著，這種關(guān)鍵中間體與Glu殘基偶聯(lián)。一 旦所述Lys和Glu殘基相連接，采用BOP通過縮合進行環(huán)化。環(huán)化后，繼續(xù)氨基酸偶聯(lián)直到 獲得所需肽。然后將各種保護基脫保護同時從樹脂上裂解下來。關(guān)鍵的是，US 5，683，981 的方法要求在肽仍然與樹脂相連時進行環(huán)化步驟。此外，并不是肽中存在的所有氨基酸殘 基都受保護。因此，即使一些殘基沒有受保護也進行環(huán)化。
因此，以上方法產(chǎn)生相當(dāng)不受控制的環(huán)合。這種不受控制的環(huán)合能產(chǎn)生其它環(huán)合 而不是所需的那種。此外，所產(chǎn)生的雜質(zhì)會非常類似于所需的最終產(chǎn)物，并因此難以在純化 過程中除去。因此，現(xiàn)有技術(shù)的方法還需要相當(dāng)大量的純化步驟。
因此，希望提供一種生產(chǎn)環(huán)狀α -促黑素細胞激素類似物的方法，所述方法不會 存在與現(xiàn)有技術(shù)的方法有關(guān)的缺點。
此外，希望提供一種在肽上進行環(huán)合的方法，所述方法不會存在與現(xiàn)有技術(shù)的環(huán)合方法相關(guān)的缺點。
發(fā)明概述
在一個方面，提供了在完全受保護的肽上進行環(huán)合以形成受保護的環(huán)肽的方法， 所述方法包括如下步驟
i)將待閉合的環(huán)的連接部分選擇性地脫保護；
ii)使步驟i)的脫保護的連接部分相連以形成受保護的環(huán)肽。
在第二方面，提供了通過本發(fā)明方法生產(chǎn)的受保護的環(huán)肽。
在第三方面，提供藥物組合物，所述藥物組合物包含通過本發(fā)明方法生產(chǎn)的環(huán)肽 和任選一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑、佐劑、稀釋劑或載體。
在第四方面，提供了通過本發(fā)明方法生產(chǎn)的環(huán)肽或包含所述環(huán)肽的組合物，用于 治療肥胖癥。
在第五方面，提供了治療有需要的對象的糖尿病的方法，所述方法包括給予所述 對象有效量的通過本發(fā)明方法制備的環(huán)肽或包含所述環(huán)肽的組合物。
為了便于查閱，現(xiàn)在在合適的小節(jié)標(biāo)題下討論本發(fā)明的這些和其它方面。然而，各 小節(jié)下的教導(dǎo)并不必需局限于各具體小節(jié)。
優(yōu)點
本發(fā)明方法提供了經(jīng)濟上有利的生產(chǎn)受保護的環(huán)肽的方法。
本發(fā)明方法能以比已知現(xiàn)有技術(shù)方法大的產(chǎn)率生產(chǎn)環(huán)肽。
由于更受控的環(huán)合作用，本發(fā)明方法能生產(chǎn)純度比現(xiàn)有技術(shù)高的環(huán)肽。這樣減少 了非常類似于所需最終產(chǎn)物并因此難以通過分析方法檢測的雜質(zhì)。因此，本發(fā)明方法提供 了藥物應(yīng)用安全性提高的環(huán)肽。
本發(fā)明方法提供了進行環(huán)合的方法，所述方法不要求在環(huán)化過程中與載體樹脂相 連。因而，本發(fā)明方法不存在與在載體樹脂上進行環(huán)合相關(guān)的缺點。
縮寫
本文中可能使用以下縮寫。
權(quán)利要求
1.在完全受保護的肽上進行環(huán)合以形成受保護的環(huán)肽的方法，所述方法包括如下步驟i)將待閉合的環(huán)的連接部分選擇性地脫保護； )使步驟i)的脫保護的連接部分相連以形成受保護的環(huán)肽； 其中當(dāng)所述完全受保護的肽不與固相載體或固相連接分子相連時將保護基團從所述 完全受保護的肽的連接部分除去。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述方法包括如下步驟(a)提供完全受保護的肽；其中所述完全受保護的肽的第一連接部分用可除去的第一保護基團保護； 其中所述完全受保護的肽的第二連接部分用可除去的第二保護基團保護； 其中所述完全受保護的肽的側(cè)鏈官能團用一個或多個可除去的第三保護基團保護； 其中所述可除去的第三保護基團可在除去條件下除去，所述除去條件(a)不同于所述 可除去的第一保護基團的除去條件且(b)不同于所述可除去的第二保護基團的除去條件； 其中在除去所述第一保護基團和除去第二保護基團后，所述完全受保護的肽的第一連 接部分能與所述完全受保護的肽的第二連接部分相連，從而形成受保護的環(huán)肽；(b)除去所述第一保護基團并除去所述第二保護基團以形成包含所述第一連接部分和 所述第二連接部分的選擇性地脫保護的肽；(c)使所述選擇性地脫保護的肽的第一連接部分與所述選擇性地脫保護的肽的第二連 接部分相連，從而形成受保護的環(huán)肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述受保護的環(huán)肽進一步脫保護以形成環(huán)肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的方法，其中所述環(huán)合是內(nèi)部環(huán)合。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的方法，其中環(huán)化過程中，環(huán)合的進行不要求與所 述載體樹脂相連接。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的方法，其中所述連接部分包括氨基酸的側(cè)鏈。
7.根據(jù)實施方案1至6中任一項所述的方法，其中所述完全受保護的肽是α-促黑素 細胞激素的模擬物(mimic)或類似物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項所述的方法，其中所述環(huán)肽是{2-[2-(16-(四 唑-5-基)十六烷酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基-Gly-Ser-Gln-His-Dap-Nle-C [Glu-H yp-D-Phe-Arg-Trp-Lys]-NH20
9.根據(jù)實施方案1至8中任一項所述的方法，其中所述連接部分上的保護基團選自芐 氧基和芐氧羰基。
10.通過根據(jù)權(quán)利要求1至9中的任一項所述的方法制備的受保護的環(huán)肽。
11.通過根據(jù)權(quán)利要求1至10中的任一項所述的方法制備的環(huán)肽。
12.藥物組合物，所述藥物組合物包含權(quán)利要求11中定義的環(huán)肽和任選一種或多種藥 學(xué)上可接受的賦形劑、佐劑、稀釋劑或載體。
13.用于治療肥胖癥的如權(quán)利要求11或12中所定義的環(huán)肽或藥物組合物。
14.治療有需要的對象的糖尿病的方法，包括給予所述對象有效量的權(quán)利要求11中定 義的肽或權(quán)利要求12中定義的組合物。
15.一種方法，所述方法包括(i)通過權(quán)利要求1至9中的任一項所述的方法制備環(huán)肽；和(ii)采用所述環(huán)肽制備藥物。
全文摘要
在完全受保護的肽上進行環(huán)合以形成受保護的環(huán)肽的方法，所述方法包括如下步驟i)將待閉合的環(huán)的連接部分選擇性地脫保護；ii)使步驟i)的脫保護的連接部分相連以形成受保護的環(huán)肽。
文檔編號C07K14/685GK102037009SQ200980119573
公開日2011年4月27日 申請日期2009年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月22日
發(fā)明者C·克里斯托弗森, R·塞維林森 申請人:諾沃-諾迪斯克有限公司