專利名稱：用于提高質粒dna表達的凍干dna制劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及由包含質粒DNA、鹽和碳水化合物的組合物凍干而成的DNA制劑，其中 所述質粒DNA包含HGF基因或其變體。
背景技術：
凍干法常常是治療性物質的優(yōu)選配制方法，因為許多物質的長期穩(wěn)定性在凍干狀 態(tài)下增加。但是，對于質粒DNA來說，凍干制劑卻不是首選的制劑。在使用裸(非復合質 粒)DNA作為遞送載體的大多數(shù)臨床試驗中，優(yōu)選制劑是液體制劑。盡管凍干質粒DNA可能是優(yōu)選的保存形式，但是質粒DNA的凍干制劑被認為是造 成基因表達效率降低的原因。凍干法導致失去分子周圍的水化球(hydration sphere)。對 于DNA來說，似乎每個核苷酸對約有20個水分子緊密結合DNA，其在低溫冷卻時不形成冰 樣結構。在0%相對濕度下用吸濕性鹽對DNA脫水后，僅剩余五或六個水分子。因此，凍干 法可增加長期保存時DNA的穩(wěn)定性，但是在最初的凍干過程后也可造成一些損傷，這可能 是通過DNA 二級結構或反應性成分(例如雜質金屬)濃度的變化造成的。因此，凍干質粒 DNA基因之表達效率損失的一個可能機制是質粒的總體結構改變。在 Poxon 等，Pharmaceutical Development and Technology 5:115-122(2000) 中，作者證明了質粒DNA(pRL-CMV)的凍干導致轉染效率統(tǒng)計學顯著的損失。測量轉染活性 的生物功能性測定表明，與保持在溶液中的對照質粒相比，凍干后質粒DNA活性損失超過 75%。盡管Poxon等人使用碳水化合物改善了保存于EDTA緩沖液中的表達Renilla螢光 素酶的非治療性質粒PRL-CMV的體外轉染活性降低，但是Poxon等人并未提及使用凍干的 裸DNA制劑體內(nèi)用于疾病治療或預防。因此，本領域需要不影響基因表達效率的穩(wěn)定凍干制劑。本發(fā)明提供了這樣的質 粒DNA凍干制劑，其不但保留了所表達基因的生物活性而且在某些情況下能夠提高生物活 性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及凍干DNA制劑。在本發(fā)明的一個方面，在凍干前，DNA制劑包含質粒 DNA、鹽和碳水化合物；其中所述質粒DNA包含HGF基因或其變體。在本發(fā)明的另一方面中， 所述DNA制劑被凍干。在本發(fā)明的另一方面中，所述凍干DNA制劑被重構(reconstituted)。在一個實施方案中，本發(fā)明DNA制劑中的碳水化合物是單糖、寡糖或多糖，例如 蔗糖、葡萄糖、乳糖、海藻糖、阿拉伯糖、戊糖、核糖、木糖、半乳糖、己糖、艾杜糖、甘露糖、 塔羅糖、庚糖、果糖、葡糖酸、山梨醇、甘露醇、甲基α -吡喃葡萄糖苷、麥芽糖、異抗壞血 酸、抗壞血酸、內(nèi)酯、山梨糖、葡糖二酸、赤蘚糖、蘇糖(threose)、阿洛糖(allose)、阿卓 糖(altrose)、古洛糖(gulose)、赤蘚酮糖、核酮糖、木酮糖、阿洛酮糖(psicose)、塔格 糖(tagatose)、葡糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、葡糖胺、半乳糖胺、神經(jīng)氨酸、阿拉伯 聚糖、果聚糖、巖藻聚糖、半乳聚糖、半乳糖醛酸聚糖、葡聚糖、甘露聚糖、木聚糖、左聚糖(Ievan)、硫酸巖藻聚糖、角叉藻聚糖、半乳卡羅聚糖、果膠類、果膠酸類、直鏈淀粉、普魯蘭 多糖(pullulan)、糖原、支鏈淀粉、纖維素、右旋糖酐、環(huán)糊精、石耳素(pustulan)、甲殼素、 瓊脂糖、角質素(keratin)、軟骨素、皮膚素、透明質酸、海藻酸、黃原膠(xantham gum)或淀 粉。在本發(fā)明的某些實施方案中，所述碳水化合物是蔗糖或甘露醇。在另一實施方案中，本發(fā)明DNA制劑中的碳水化合物的量選自約0.05%至約 30%、約 0. 至約 15%、約 0. 2%至約 10%、約 0. 5%至 5%、約 0. 75%至 3%、約 0. 8%至 2%以及約0.8%至1.5%。在一些特定實施方案中，所述碳水化合物是蔗糖或甘露醇。在 某些另外的實施方案中，所述DNA制劑的碳水化合物的量約為1. 1%。在另一實施方案中，所述DNA制劑中的鹽選自NaCl或KCl。在另一些實施方案中， 所述DNA制劑中的鹽的量選自約0.01%至10%、約0. 至5%、約0. 至4%、約0. 5% 至2%、約0.8%至1.5%、約0.8%至1.2% (重量/體積)。在某些實施方案中，所述DNA 制劑中的鹽的量約為0.9% (重量/體積)。在另一實施方案中，本發(fā)明的質粒DNA包含HGF基因或其變體。在某些實施方 案中，所述HGF基因是哺乳動物HGF基因或其變體。在另一些實施方案中，所述HGF基因 是人HGF基因或其變體。在本發(fā)明的某些方面，所述HGF基因是雜合的HGF基因，例如包 含HGF cDNA和固有或外源內(nèi)含子或其片段(例如人HGF基因的固有內(nèi)含子4或其片段) 的雜合HGF基因。在一些特定實施方案中，所述雜合HGF基因包括HGF-X2 (SEQ ID NO: 13)、HGF-X3 (SEQ ID NO 14)、HGF-X6 (SEQID NO :8)、HGF-X7 (SEQ ID NO :9)或 HGF-X8 (SEQ ID NO :10)。在另一些實施方案中，包含雜合HGF基因的質粒DNA選自pCK-HGF-X2、 PCK-HGF-X3、pCK-HGF-X6、pCK_HGF_X7、pCK_HGF_X8、pCP_HGF_X2、pCP_HGF_X3、pCP_HGF_X6、 PCP-HGF-X7 和 pCP-HGF-X8，其中 HGF-X2、HGF-X3、HGF-X6、HGF_X7 和 HGF-X8 分別對應于 SEQ ID NO :13-14 禾口 8-10。所述凍干DNA制劑維持或提高質粒DNA的表達。在某些方面，所述凍干DNA制劑 提供了所表達蛋白質之生物活性的提高。在本發(fā)明的某些另外方面中，所述質粒DNA表達 的提高或者所表達蛋白質生物活性的提高是由于制劑中存在碳水化合物所致。在一些實施 方案中，該碳水化合物是蔗糖或甘露醇。本發(fā)明還提供了重構的凍干質粒DNA制劑。在某些實施方案中，所述凍干DNA在 可藥用溶液中重構。在另一些實施方案中，所述可藥用溶液選自水、PBS、TE、Tris緩沖液 和生理鹽水。在另一實施方案中，所述重構的凍干制劑中質粒DNA終濃度為約Ing/mL、約5ng/ mL、約 10ng/mL、約 50ng/mL、約 100ng/mL、約 250ng/mL、約 500ng/mL、約 1 μ g/mL、約 5 μ g/ mL、約 10 μ g/mL、約 50 μ g/mL、約 100 μ g/mL、約 200 μ g/mL、約 300 μ g/mL、約 400 μ g/mL、約 500 μ g/mL、約 600 μ g/mL、約 700 μ g/mL、約 800 μ g/mL、約 900 μ g/mL、約 lmg/mL、約 2mg/ mL、約 2. 5mg/mL、約 3mg/mL、約 3. 5mg/mL、約 4mg/mL、約 4. 5mg/mL、約 5mg/mL、約 5. 5mg/mL、 約 6mg/mL、約 7mg/mL、約 8mg/mL、約 9mg/mL、約 10mg/mL、約 20mg/mL 或約 30mg/mL。在另一 實施方案中，所述重構的凍干制劑中質粒DNA終濃度為約Ing/mL至約30mg/mL。在某些方 面中，所述重構的凍干制劑中質粒DNA終濃度為約100 μ g/mL至約2. 5mg/mL。在另一些方 面中，所述重構的凍干制劑之質粒DNA終濃度為約500 μ g/mL至約lmg/mL。
本發(fā)明還涉及治療或預防對象中缺血性疾病或肝臟疾病的方法，包括施用由凍干 的肝細胞生長因子(h印atocyte growth factor，HGF)DNA制劑重構的組合物，其中所述DNA 制劑包含質粒DNA、鹽和碳水化合物；其中所述質粒DNA包含HGF基因或其變體。在某些方 面，所述由凍干HGF DNA制劑重構的組合物通過直接注射進行施用。本發(fā)明還涉及制備凍干HGF DNA制劑的方法，包括(a)制備包含質粒DNA、鹽和碳 水化合物的DNA制劑，其中所述質粒DNA包含HGF基因或其變體；以及(b)凍干所述DNA制 劑。凍干步驟可包括對本發(fā)明的DNA制劑以零下溫度(例如-10°C至-50°C )進行 冷凍，然后進行一個或多個干燥循環(huán)，其包括逐漸加熱DNA制劑到約20°C至低于或等于約 30°C，其中凍干進行約50至約100小時。在本發(fā)明的另一方面中，凍干方法包括(a)形成 包含質粒DNA、鹽和碳水化合物的DNA含水制劑，其中所述質粒DNA包含HGF基因或其變體； (b)將該DNA制劑溶液冷卻到約-10°C至約_50°C的溫度，直至凍結；(c)通過加熱到約20°C 至約30°C來干燥所述DNA制劑；以及(d)回收凍干的DNA制劑組合物，其具有基于所回收 DNA制劑之總重量的約0. 1 (重量)％至約5 (重量)％的水含量。在某些實施方案中，依次在下列條件下進行DNA制劑凍干，所述條件包括(a)在高 于或等于約-50°C且低于約0°C的溫度下，約30小時至約50小時，和(b)在高于或等于約 0°C至低于或等于約30°C的溫度下，約20小時至約50小時，其中(a)中最低溫度為約_50°C 至約-30°C，(b)中最高溫度為約20°C至約30°C。在一個方面中，依次在下列條件下進行 DNA 制劑凍干-50°C 4 小時，-40°C 12 小時，_30°C 6 小時，_20°C 6 小時，_10°C 6 小時，0°C 6 小時，10°C 6小時以及30°C M小時。在另一方面中，依次在下列條件下進行DNA制劑凍干 50C 1 分鐘，-500C 2 小時，-400C 6 小時，-35°C 3 小時，-30°C 6 小時，-25°C 3 小時，-20°C 3 小時，-15°C 3小時，-10°C 6小時，-5°C 3小時，0°C 6小時，以及30°C 17小時。在另一方面 中，依次在下列條件下進行DNA制劑凍干5°C 1分鐘，-IO0C 1分鐘，-20°C 1分鐘，-30°C 1 分鐘，-500C 1 分鐘，-500C 2 小時，-450C 6 小時，-40°C 3 小時，-35°C 6 小時，-30°C 3 小 時，-25°C 6 小時，-20°C 3 小時，-15°C 6 小時，-10°C 3 小時，_5°C 6 小時，0°C 12 小時，10°C 3 小時，20°C 6小時以及300C 29小時。本發(fā)明還涉及如上所述的凍干核酸制劑或重構的凍干核酸制劑，其中所述核酸是 編碼HGF或其變體的RNA。


本發(fā)明的上述及其它目的和特征通過以下對本發(fā)明的描述并參考附圖得以顯現(xiàn)， 其中圖1顯示比較多種制劑中體外HGF表達的柱狀圖。使用ELISA測量分離自用凍干 質粒DNA pCK-HGF-X7轉染之細胞分離的培養(yǎng)物上清中的HGF表達水平，所述質粒配 制于0. 9 % NaCl中，DNA終濃度為0. 5mg/mL,并含有0. 25 % (第3泳道)、1. 1 % (第4泳 道)、5% (第5泳道)、10% (第6泳道)或20% (第7泳道)的蔗糖或者1.2% (第8泳 道)、4.85% (第9泳道)或10% (第10泳道)的甘露醇。使用利用陰性對照(第1泳 道)和非凍干DNA(第2泳道)的對照反應進行比較。圖2顯示比較非凍干和凍干PCK-HGF-X7之間體內(nèi)HGF表達的柱狀圖。將含有0. 9% NaCl 的 100 μ g 非凍干 pCK_HGF_X7 (NL-HGF-X7)或者與 1. 1 %蔗糖禾口 0. 9% NaCl 凍 干的pCK-HGF-X7(L-HGF-X7)注射到小鼠的脛骨前肌(tiabialis cranialis)中。在第7 天處死小鼠后，使用ELISA測量肌肉組織裂解物中HGF的表達水平。顯示了陰性對照(第 1泳道)、含有0. 9% NaCl的非凍干pCK-HGF-X7 (NL-HGF-X7 ；第2泳道)和與1. 1 %蔗糖和 0. 9% NaCl 凍干的 pCK-HGF-X7 (L-HGF-X7 ；第 3 泳道)的 HGF 表達水平。圖3顯示使用豬缺血性心臟病模型的實驗步驟示意圖。NL-HGF-X7對應于含有 0. 9% NaCl的非凍干pCK-HGF-X7。L-HGF-X7對應于與1. 1 %蔗糖和0. 9 % NaCl凍干的 PCK-HGF-X7。圖4是顯示非凍干和凍干PCK-HGF-X7對心肌灌注之作用的柱狀圖。顯示了當使 用豬缺血性心臟病模型時相比于基線的心肌灌注改善百分比。顯示了僅用質粒(pCK;第1 泳道)、用含有0. 9% NaCl的非凍干pCK-HGF-X7 (NL-HGF-X7 ；第2泳道)以及用與1. 1 %蔗 糖和0. 9% NaCl凍干的pCK-HGF-X7 (L-HGF-X7 ；第3泳道)注射豬的結果。圖5是顯示非凍干和凍干pCK-HGF-X7對壁增厚之作用的柱狀圖。顯示了當使用豬 缺血性心臟病模型時相比于基線的左心室所注射缺血性邊界區(qū)域中壁增厚之改善百分比。 顯示了僅用質粒(pCK ；第1泳道)、用含有0. 9% NaCl的非凍干pCK-HGF_X7 (NL-HGF-X7 ；第 2泳道)以及用與1. 1 %蔗糖和0. 9% NaCl凍干的pCK-HGF_X7 (L-HGF-X7 ；第3泳道)注射 豬的結果。發(fā)明詳述定義術語“DNA”或“核酸”或“核酸片段”是指多核苷酸或構建物中存在的任何一個或 多個核酸區(qū)段，例如DNA或RNA片段?？梢跃€性(例如mRNA)或環(huán)狀(例如質粒)形式以 及雙鏈或單鏈形式提供核酸或其片段?！胺蛛x”的核酸或多核苷酸旨在表示已從其天然環(huán)境 中取出的核酸分子、DNA或RNA。例如，就本發(fā)明的目的而言，載體中所含的重組多核苷酸被 認為是分離的。分離的多核苷酸的其它實例包括異源宿主細胞中維持的重組多核苷酸或者 溶液中的(部分地或基本上)純化多核苷酸。分離的RNA分子包括本發(fā)明多核苷酸的體內(nèi) 或體外RNA轉錄物。本發(fā)明的分離的多核苷酸或核酸還包括合成產(chǎn)生的此類分子。本文使用的“編碼區(qū)”是由翻譯成氨基酸之密碼子組成的核酸部分。盡管"終止 密碼子"(TAG、TGA或TAA)不翻譯成氨基酸，但也可認為是編碼區(qū)的一部分，而任何側翼序 列例如啟動子、核糖體結合位點、轉錄終止子等則不是編碼區(qū)的一部分。本發(fā)明的兩種或更 多種核酸或核酸片段可存在于單個多核苷酸構建物中(例如在單個質粒上)或者在分開的 多核苷酸構建物中(例如在分開的(不同的)質粒上)。此外，任何核酸或核酸片段可編碼 單個HGF多肽或其片段、衍生物或變體，例如，或者可編碼多于一種多肽，例如核酸可編碼 兩種或更多種多肽。另外，核酸可包含調(diào)節(jié)元件，例如啟動子、核糖體結合位點或轉錄終止 子，或者可編碼與HGF編碼區(qū)融合的異源編碼區(qū)，例如專門的元件或基序(例如分泌信號肽 或異源功能結構域)。對于DNA來說，包含編碼多肽之核酸的多核苷酸通常還包含與編碼所述多肽之核 酸片段有效連接的啟動子和/或其它轉錄或翻譯調(diào)控元件。有效連接是指編碼基因產(chǎn)物 (例如多肽)的核酸片段與一個或多個調(diào)節(jié)序列以使得將所述基因產(chǎn)物的表達置于該調(diào)節(jié) 序列的影響或控制之下的方式進行連接。
本發(fā)明的DNA多核苷酸可以是環(huán)狀或線性化的質?；蜉d體，或者是也可以為非感 染性和非整合性(即不整合進脊椎動物細胞的基因組中)的其它線性DNA。線性化質粒是 指先前為環(huán)狀但已被線性化(例如通過用限制性核酸內(nèi)切酶進行消化)的質粒。本文使用 的術語“質粒”和“載體”可互換地使用。術語“凍干的DNA ”是指通過快速冷凍和脫水制備的、在高度真空下呈冷凍狀態(tài)的、 干燥形式的任何DNA。“凍干”是指使溶液冷凍和干燥的方法。凍干的DNA常通過加入無菌 蒸餾水而進行使用?！拜d體”是指用于將核酸克隆和/或轉移進入宿主細胞的任何運載體(vehicle)。 載體可以是可與另一 DNA區(qū)段連接從而復制所連接區(qū)段的復制子?！皬椭谱印笔侵赣米鱀NA 體內(nèi)自主復制(即能夠在自身控制下進行復制)單元的任何遺傳元件(例如質粒、噬菌體、 粘粒、染色體、病毒)。術語“載體”包括體外、離體或體內(nèi)將核酸引入細胞的運載體。本領 域中已知的許多載體可用于操作核酸，將應答元件和啟動子摻入基因等?？赡艿妮d體包括 例如質粒(如PBR322或pUC質粒衍生物)或Bluescript載體。例如，可通過將合適DNA 片段連接進具有互補粘性末端的所選載體來實現(xiàn)將對應于響應元件和啟動子的DNA片段 插入合適載體?；蛘撸捎妹感揎桪NA分子的末端，或者可通過將核苷酸序列(接頭)連接 進DNA末端來產(chǎn)生任意位點。可改造這些載體使其含有提供對細胞進行選擇的選擇標記基 因。這些標記允許鑒定和/或選擇表達由所述標記編碼之蛋白質的宿主細胞。另外的載體包括lipoplex(陽離子脂質體-DNA復合物)、polypleX(陽離子聚合 物-DNA復合物)和蛋白質-DNA復合物。除了核酸之外，載體還可包含一個或多個調(diào)節(jié)區(qū) 和/或可用于選擇、測量和監(jiān)測核酸轉移結果(轉移至哪些組織、表達持續(xù)時間等)的選擇 標記。術語“質?！笔侵溉旧w外元件，其常常攜帶不作為細胞核心代謝機制之一部分的 基因，并且其通常是環(huán)狀雙鏈DNA分子的形式。這些元件可以是來自于任何來源的自主復 制序列、基因組整合序列、噬菌體或核苷酸序列，線性、環(huán)狀或超螺旋的單鏈或雙鏈DNA或 RNA，其中許多核苷酸序列已經(jīng)連接或重組為能夠將啟動子片段和所選基因產(chǎn)物之DNA序 列以及合適的3'非翻譯序列引入細胞的獨特構建物。本文使用的術語“質?！笔侵赣蛇z傳 物質(即核酸)構成的構建物。通常，質粒含有在細菌宿主細胞(例如大腸桿菌)中有功 能的復制起點，以及用于檢測包含該質粒之細菌宿主細胞的選擇標記。本發(fā)明的質?？砂疚乃龅倪z傳元件，其布置成使得所插入編碼序列可在真 核細胞中轉錄和翻譯。在本文所述的某些實施方案中，質粒是閉環(huán)DNA分子。術語“表達”是指使用生物方法產(chǎn)生由編碼序列編碼的產(chǎn)物。在大多數(shù)情況下，包 含編碼序列的DNA序列轉錄形成信使RNA (mRNA)。隨后，信使RNA翻譯形成具有相應生物活 性的多肽產(chǎn)物。同時，表達過程可包括對RNA轉錄產(chǎn)物的進一步加工步驟(例如剪接以除 去內(nèi)含子)和/或對多肽產(chǎn)物的翻譯后加工。術語“表達載體”是指設計成使得在轉化進宿主之后表達所插入核酸序列的載體、 質?；蜻\載體。通常將所克隆基因(即所插入的核酸序列，例如HGF基因或其變體)置于 調(diào)控元件(例如啟動子、最小啟動子、增強子等)的控制下。可用于驅動核酸在期望的宿 主細胞中表達的起始調(diào)控區(qū)或啟動子有很多種，并且為本領域技術人員所熟知。事實上， 任何能夠驅動這些基因表達的啟動子均可用于表達載體中，包括但不限于病毒啟動子、細菌啟動子、動物啟動子、哺乳動物啟動子、合成啟動子、組成型啟動子、組織特異性啟動子、 致病或疾病相關啟動子、發(fā)育特異性啟動子、可誘導啟動子、光調(diào)節(jié)啟動子；包括但不限于 SV40早期(SV40)啟動子區(qū)、勞氏肉瘤病毒的3'長末端重復(LTR)中所含的啟動子、腺病 毒(Ad)的ElA或主要晚期啟動子(MLP)、人巨細胞病毒(HCMV)立即早期啟動子、單純皰疹 病毒(HSV)胸苷激酶(TK)啟動子、桿狀病毒IEl啟動子、延伸因子la (EFl)啟動子、甘油 醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)啟動子、磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子、泛素C⑴be)啟動子、白 蛋白啟動子、小鼠金屬硫蛋白-L啟動子的調(diào)節(jié)序列和轉錄調(diào)控區(qū)、普遍表達啟動子(HPRT、 波形蛋白、肌動蛋白、微管蛋白等)、中間絲(結蛋白、神經(jīng)絲、角蛋白、GFAP等)的啟 動子、治療性基因(MDR、CFTR或VIII型因子等)的啟動子、致病或疾病相關啟動子以及 顯示出組織特異性以及已用于轉基因動物的啟動子，例如在胰腺腺泡細胞中有活性的彈性 蛋白酶I基因調(diào)控區(qū)；在胰腺β細胞中有活性的胰島素基因調(diào)控區(qū)，在淋巴樣細胞中有活 性的免疫球蛋白基因調(diào)控區(qū)，在睪丸、乳房、淋巴和肥大細胞中有活性的小鼠乳腺腫瘤病毒 調(diào)控區(qū)；在肝臟中有活性的白蛋白基因、Apo AI和Apo AII調(diào)控區(qū)，在肝臟中有活性的甲 胎蛋白基因調(diào)控區(qū)，在肝臟中有活性的a 1-抗胰蛋白酶基因調(diào)控區(qū)，在骨髓細胞中有活性 的β-珠蛋白基因調(diào)控區(qū)，在腦的少突膠質細胞中有活性的髓磷脂堿性蛋白基因調(diào)控區(qū)， 在骨骼肌中有活性的肌球蛋白輕鏈-2基因調(diào)控區(qū)以及在下丘腦中有活性的促性腺釋放激 素基因調(diào)控區(qū)，丙酮酸激酶啟動子、絨毛蛋白啟動子、與脂肪酸結合之腸蛋白的啟動子、平 滑肌細胞肌動蛋白的啟動子等。另外，這些表達序列可通過添加增強子或調(diào)節(jié)序列 等進行修飾。本發(fā)明表達載體的非限制性實例包括PCK(Lee等，Biochem. Biophys. Res. Commun. 272 :230(2000) ；WO 2000/040737)和 pCP(pCDNA3. 1，Invitrogen, USA)。本文使用的“構建物”一般表示在自然界中不存在的組成。構建物可通過合成技 術產(chǎn)生，例如重組DNA制備和表達或者針對核酸或氨基酸的化學合成技術。還可通過將一 種物質添加或歸屬到另一種物質而產(chǎn)生自然界中不存在之形式的構建物?！盎颉笔侵赴幋a功能性分子之核苷酸的多核苷酸，所述功能性分子包括由僅 由轉錄產(chǎn)生的功能性分子(生物活性RNA類別)或通過轉錄和翻譯產(chǎn)生的功能性分子(例 如多肽)。術語“基因”涵蓋cDNA和基因組DNA核酸?！盎颉边€指表達特定RNA、蛋白質或 多肽的核酸片段，其包含編碼序列之前(5‘非編碼序列)和之后(3'非編碼序列)的調(diào)節(jié) 序列?！疤烊换颉笔侵冈谧匀唤缰邪l(fā)現(xiàn)的、具有其自身之調(diào)節(jié)序列的任何基因。“嵌合基 因”是指并非天然基因的、包含自然界中未發(fā)現(xiàn)共同存在之調(diào)節(jié)和/或編碼序列的任何基 因。因此，嵌合基因可包含來自不同來源的調(diào)節(jié)序列和編碼序列，或者來自同一來源但以不 同于自然界中所發(fā)現(xiàn)之方式安排的調(diào)節(jié)序列和編碼序列。嵌合基因可包含來自不同來源的 編碼序列和/或來自不同來源的調(diào)節(jié)序列。“內(nèi)源基因”是指位于生物體基因組中其天然位 置的天然基因。“外源”基因或“異源”基因是指通常不在宿主生物體中發(fā)現(xiàn)而通過基因轉 移引入宿主生物體中的基因。外源基因可包括插入非本源生物體中的天然基因，或者嵌合 基因?！稗D基因”是已通過基因轉移方法引入細胞的基因。“異源DNA”是指并非天然位于細胞中或者細胞的染色體位點中的DNA。異源DNA 可包括對細胞而言外來的基因。短語“分離的”或“生物學上純的”是指物質基本上不含天然狀態(tài)下存在的通常伴 隨所述物質的組分。因此，本發(fā)明中“分離的肽”優(yōu)選不包含在其原位環(huán)境中通常與該肽相結合的物質。凍干的DNA制劑在凍干之前，本發(fā)明的DNA制劑與某些賦形劑(包括碳水化合物和鹽)配制在一起。如本文所述，待用作診斷或治療劑的DNA凍干制劑的穩(wěn)定性可通過在凍干前將所 述DNA與包含穩(wěn)定化量之碳水化合物的水溶液一起配制而提高。本發(fā)明DNA制劑中的碳水化合物是單糖、寡糖或多糖，例如蔗糖、葡萄糖、乳糖、海 藻糖、阿拉伯糖、戊糖、核糖、木糖、半乳糖、己糖、艾杜糖、甘露糖、塔羅糖、庚糖、果糖、葡糖 酸、山梨醇、甘露醇、甲基α -吡喃葡萄糖苷、麥芽糖、異抗壞血酸、抗壞血酸、內(nèi)酯、山梨糖、 葡糖二酸、赤蘚糖、蘇糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、赤蘚酮糖、核酮糖、木酮糖、阿洛酮糖、塔 格糖、葡糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、葡糖胺、半乳糖胺、神經(jīng)氨酸、阿拉伯聚糖、果聚 糖、巖藻聚糖、半乳聚糖、半乳糖醛酸聚糖、葡聚糖、甘露聚糖、木聚糖、左聚糖、硫酸巖藻聚 糖、角叉藻聚糖、半乳卡羅聚糖、果膠類、果膠酸類、直鏈淀粉、普魯蘭多糖、糖原、支鏈淀粉、 纖維素、右旋糖酐、環(huán)糊精、石耳素、甲殼素、瓊脂糖、角質素、軟骨素、皮膚素、透明質酸、海 藻酸、黃原膠或淀粉。在一個方面中，所述碳水化合物是甘露醇或蔗糖。凍干前的碳水化合物溶液可對應于僅在水中的碳水化合物，或者可包含緩沖液。 所述緩沖液的實例包括PBS、HEPES、TRIS或TRIS/EDTA。通常，碳水化合物溶液與DNA組合 至蔗糖終濃度約0. 05%至約30%，通常蔗糖為0. 至約15%，例如0. 2%至約5%、10% 或15%，優(yōu)選地蔗糖為約0.5%至10%、1%至5^^1%至3%，最優(yōu)選地蔗糖為約1. 1%。本發(fā)明DNA制劑中的鹽是NaCl或KCl。在某些方面，所述鹽是NaCl。在另一些方 面，所述DNA制劑中的鹽的量選自約0.001%至約10%，約0. 至5%，約0. 至4%， 約0.5%至2%，約0.8%至1.5%，約0.8%至1.2% (重量/體積)。在某些實施方案中， 所述DNA制劑中的鹽的量為約0. 9% (重量/體積)。在本發(fā)明的DNA制劑中，DNA終濃度為約Ing/mL至約30mg/mL的質粒。例如，本 發(fā)明的制劑可包含終濃度為約Ing/mL、約5ng/mL、約10ng/mL、約50ng/mL、約100ng/mL、約 200ng/mL、約 500ng/mL、約 1 μ g/mL、約 5 μ g/mL、約 10 μ g/mL、約 50 μ g/mL、約 100 μ g/mL、 約 200 μ g/mL、約 400 μ g/mL、約 500 μ g/mL、約 600 μ g/mL、約 800 μ g/mL、約 lmg/mL、約 2mg/ mL、約 2. 5mg/mL、約 3mg/mL、約 3. 5mg/mL、約 4mg/mL、約 4. 5mg/mL、約 5mg/mL、約 5. 5mg/mL、 約 6mg/mL、約 7mg/mL、約 8mg/mL、約 9mg/mL、約 10mg/mL、約 20mg/mL 或者約 30mg/mL 的質 粒。在本發(fā)明的某些實施方案中，DNA的終濃度為約100 μ g/mL至約2. 5mg/mL。在本發(fā)明 的一些特定實施方案中，DNA的終濃度為約0. 5mg/mL至lmg/mL。本發(fā)明的DNA制劑在本領域中已知的標準條件下進行凍干。凍干本發(fā)明DNA制劑 的方法可包括(a)將盛有DNA制劑(例如包含質粒DNA、鹽和碳水化合物的DNA制劑，其中 所述質粒DNA包含HGF基因或其變體)的容器(例如小瓶)裝入凍干機，其中凍干機具有 約5°C至約_50°C的起始溫度；(b)將DNA制劑冷卻至零下溫度(例如-10°C至_50°C )；以 及(c)使DNA制劑基本干燥。本領域技術人員考慮到影響凍干參數(shù)的因素(例如所用的凍 干機類型、所用的DNA量以及所用的容器大小)可以對本發(fā)明DNA制劑的凍干條件(例如 溫度和持續(xù)時間)進行調(diào)整。
然后，可將裝有凍干DNA制劑的容器密封，并在多種溫度(例如室溫至約-180°C， 優(yōu)選約2 8°C至約_80°C，更優(yōu)選_20°C至約_80°C，最優(yōu)選約_20°C )下長時間保存。在 某些方面，凍干的DNA制劑優(yōu)選在約2 8°C至約-80°C范圍內(nèi)在至少6個月期間是穩(wěn)定的， 沒有顯著的活性喪失。穩(wěn)定保存質粒DNA制劑還可對應于以穩(wěn)定形式保存質粒DNA至用于 研究或基于質粒之治療之前的長時間。保存時間可以長達數(shù)月、1年、5年、10年、15年或多 至20年。優(yōu)選地，所述制劑在至少約3年內(nèi)是穩(wěn)定的。HGF 質粒 DNA本發(fā)明提供了凍干的DNA制劑，其中在凍干之前所述DNA制劑包含質粒DNA，所述 質粒DNA包含HGF基因或其變體。肝細胞生長因子(HGF)是肝素結合糖蛋白，亦稱為“擴散因子(scatterfactor)，， 或“肝生成素-A”。編碼人HGF的內(nèi)源基因位于染色體7q21. 1，包含18個外顯子和17個內(nèi) 含子，具有 SEQ ID N0:1 的核苷酸序列(SekiT.等，Gene 102:213-219(1991))。由 HGF 基 因轉錄得到約61Λ的轉錄物，然后，由其合成由7 個氨基酸組成的多肽HGF前體(SEQ ID NO :2)。同時，由723個氨基酸組成的dHGF前體多肽也通過HGF基因的選擇性剪接而合成。 血清中的蛋白酶可將無生物學活性的前體轉變?yōu)榛钚孕问降囊远蜴I連接的異二聚體。在 所述異二聚體中，具有高分子量的α鏈形成四個kringle結構域和N端發(fā)夾環(huán)，類似于纖 溶酶原的前活化肽區(qū)域。由約80個氨基酸組成的三個以二硫鍵連接的環(huán)結構的kringle 結構域在蛋白質-蛋白質相互作用中起重要作用。低分子量β鏈形成無活性絲氨酸蛋白 酶樣結構域。由723個氨基酸組成的dHGF是在α鏈的第一 kringle結構域中缺失了五個 氨基酸(即F、L、P、S和S)的多肽。中胚層來源之細胞分泌的HGF具有多種生物學功能，例如1)誘導上皮細胞 形成管狀結構；2)在體外和體內(nèi)刺激來自內(nèi)皮細胞的脈管形成；3)肝和腎的再生， 由其抗凋亡活性所致；4)腎、卵巢和睪丸的器官發(fā)生；5)控制骨生成；6)刺激紅系造 血前體細胞(erythroid hematopoieticrecursor cell)的生長禾口分化；禾口 7)神經(jīng) 元的軸突出芽(Stella, Μ. C.禾口 Comoglio，P. Μ. ，The International Journal of Biochemistry&CellBiology 31 :1357-1362 (1999))?；谶@些不同功能，HGF 或者編碼 HGF 或其變體的基因可被開發(fā)成治療缺血性疾病或肝臟疾病的治療劑。事實上，在體內(nèi)，HGF可 以HGF或dHGF存在，因此HGF和dHGF的共表達對于使治療效果最大化來說十分重要?？?以基因治療的高效率同時表達HGF和dHGF的雜合HGF基因是HGF變體，其有利地用于本發(fā) 明的質粒DNA制劑中。雜合HGF基因先前已描述于國際專利申請No. WO 03/078568和美國專利公開 No. 2005/0079581A1中，其各自內(nèi)容通過引用并入本文。雜合HGF基因通過將固有的或外源 的內(nèi)含子插入到HGF cDNA的第4和第5外顯子之間來制備。雜合HGF基因具有高于HGF cDNA的表達效率，并同時表達兩種不同類型——HGF和dHGF(HGF缺失變體)。術語“HGF同工型”是指與動物中天然產(chǎn)生的HGF氨基酸序列具有至少80%同一 性(例如至少90%或95%同一性)的氨基酸序列的任何HGF多肽，包括所有等位基因變 體。在一個實施方案中，該術語是指已知具有細胞增殖活性的同工型。HGF的同工型包括但 不限于flHGF、dHGF、NKl、NK2和NK4(例如對應于SEQ ID NO 2~6)，以及其變體(例如NK2 變體，SEQ ID NO 11-12)。
術語“flHGF”是指動物(例如哺乳動物)的全長HGF蛋白，例如人HGF的1_7洲 位氨基酸(SEQ ID NO :2)。術語“dHGF”是指由動物(例如哺乳動物)中HGF基因選擇性剪接產(chǎn)生的HGF蛋 白缺失變體，例如由723個氨基酸(SEQ ID NO 3)組成的、在全長HGF序列中α鏈的第一 個kringle結構域中缺失五個氨基酸(F、L、P、S和S)的人HGF。術語“NK1”是指來自動物(例如哺乳動物(例如人))的HGF同工型，其由N端發(fā) 夾環(huán)和kringlel結構域組成。術語“NK2”是指來自動物(例如哺乳動物(例如人))的HGF同工型，其由N端發(fā) 夾環(huán)、kringlel和kringle2結構域組成。術語“NK4”是指來自動物(例如哺乳動物(例如人))的HGF同工型，其由N端發(fā) 夾環(huán)、kringlel、kringle2、kringle3 和 kringle4 結構域組成。HGF的結構和功能已被廣泛地研究，本領域技術人員知曉HGF序列中對于基本維 持該蛋白質全部生物活性來說重要的氨基酸，以及在HGF的任何序列變體中優(yōu)選不發(fā)生 改變或者僅保守性改變的氨基酸。參見例如Hartmann等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 11574(1992) ；Lokker 等，EMBO J. 11 :2503 (1992)，Zhou 等，Structure 6 :109(1998), Ultsch 等，Structure 6 1383 (1998), Shimizu 等，Biochem. Biophys. Res. Commun. 189 1329(1992), Yoshiyama 等，Biochem. Biophys. Res. Commun. 175 :660 (1991)，其均通過引用 以整體并入本文。例如N端發(fā)夾環(huán)和kringlel結構域似乎是細胞增殖活性所需的。對于 生物活性不關鍵的其它氨基酸可以缺失和/或更自由地替換。本領域技術人員可使用常規(guī) 誘變技術(例如上文引用的參考文獻中所記載地)制備HGF同工型的變體，以及鑒定基本 上保留HGF同工型全部生物學活性的變體。本發(fā)明中包含固有內(nèi)含子的雜合HGF基因的一個實施方案為7113bp長，并具有 SEQ ID NO 7的核苷酸序列。雜合HGF基因可包含固有內(nèi)含子片段，其任選地具有插入到HGFcDNA第4和第5 個外顯子之間的小重組序列。在本文中，包含固有內(nèi)含子片段的這些雜合HGF基因稱為 "HGF-X"ο 雜合 HGF 基因的實例包括:HGF-X2 (SEQ ID NO :13)、HGF-X3 (SEQ ID NO :14)、 HGF-X6 (SEQ IDNO :8)、HGF-X7 (SEQ ID NO :9)和 HGF-X8 (SEQ ID NO :10)。施用和治療方法如上所述，HGF具有多種生物學功能，基于這些不同的生物學功能，HGF、編碼HGF 的基因或其變體可被開發(fā)成治療缺血性疾病或肝臟疾病的治療劑。在本發(fā)明中，HGF DNA制 劑在重構經(jīng)凍干DNA制劑之后施用。術語“重構”是指將先前為了保存和存儲而改變的物質恢復成原始形式(例如通 過再水化來實現(xiàn))，例如將先前經(jīng)干燥和保存的DNA質粒制劑恢復成液體狀態(tài)。本發(fā)明的凍 干組合物可在產(chǎn)生適于施用的穩(wěn)定、單分散(mono-dispersed)溶液的任何水溶液中重構。 這類水溶液包括但不限于無菌水、TE、PBS、Tris緩沖液或生理鹽水。根據(jù)多種因素(包括待遞送制劑的量、對象的年齡和重量、遞送方法和途徑以及 所遞送抗原的免疫原性)來調(diào)節(jié)本發(fā)明方法中重構的凍干DNA的濃度。本發(fā)明的經(jīng)重構之凍干DNA制劑可通過下列途徑施用經(jīng)口或經(jīng)腸胃外途徑例如 靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、心內(nèi)膜內(nèi)、心肌內(nèi)、心包內(nèi)、心室內(nèi)、動脈內(nèi)、皮內(nèi)、腦內(nèi)、腎內(nèi)、肝內(nèi)、脾內(nèi)、淋巴內(nèi)、皮下、腹內(nèi)、睪丸內(nèi)、卵巢內(nèi)、子宮內(nèi)、胸骨、氣管內(nèi)、胸膜內(nèi)(intraplueral)、胸內(nèi)、硬 膜內(nèi)、脊柱內(nèi)、脊髓內(nèi)、壁內(nèi)(intramural)、陰囊內(nèi)(intrascorionic)和動脈的注射或輸 注，或者通過直腸、鼻內(nèi)、吸入或眼內(nèi)進行外部施用。在某些實施方案中，遞送方法是肌內(nèi)、 心肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、腦內(nèi)或腎內(nèi)。應理解，本發(fā)明經(jīng)重構之凍干DNA制劑的典型每日劑量應根據(jù)多種相關因素(包 括待治療的狀況，所選施用途徑，患者個體的年齡、性別和體重，以及患者癥狀的嚴重程度) 來確定，并且可以單一劑量或分開的劑量來施用。因此，每日劑量不應視為以任何方式對本 發(fā)明進行限制。本文使用的術語“治療”缺血性疾病或肝臟疾病是指以足以改善缺血性疾病或肝 臟疾病之一種或多種癥狀或者防止缺血性疾病或肝臟疾病發(fā)展的量向對象施用因子(例 如HGF (如雜合HGF)，或其變體)?！叭毖约膊　笔侵赣捎趧用}血流入阻塞所造成的(如痙攣或疾病導致的動脈狹 窄)向身體部分(如心或腦)供血不足有關的疾病。缺血性疾病的實例包括冠狀動脈病 (coronary artery disease，CAD)禾口夕卜周動脈病(peripheral artery disease，PAD)。術語“肝臟疾病”是指導致肝臟功能異常或停止發(fā)揮功能的多種疾病和病癥。HGF 是促進肝細胞增殖的主要物質，并且在肝臟再生期間與轉化生長因子- α和肝素結合表皮 生長因子共同作用。另外，HGF在暴發(fā)性肝衰竭動物模型中通過抗凋亡作用改善肝損傷，在 患有肝硬化的動物中減弱肝纖維化。因此，在患有難治性肝臟疾病的患者中，HGF被認為不 但誘導肝臟再生，還抑制疾病發(fā)展并改善肝纖維化。就肝臟疾病的治療而言，可根據(jù)上述遞 送方法施用本發(fā)明的經(jīng)重構之凍干DNA制劑。在某些實施方案中，肝臟疾病治療中的遞送 方法是靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)或肝內(nèi)的。在本發(fā)明的某些方面，經(jīng)重構的HGF DNA制劑可包含兩種或更多種HGF同工型。所 述HGF同工型可以之前分別凍干，或者在同一 DNA制劑中。這些凍干同工型在重構后可分 別施用或同時施用(即共施用)；可施用或共施用兩種或更多種HGF同工型的分開的經(jīng)重 構質粒DNA制劑用，或者可施用含有兩種或更多種HGF同工型并且能夠表達兩種或更多種 HGF同工型基因的單個表達質粒。例如，可使用兩種分開的質粒施用兩種同工型flHGF和 dHGF。或者，可使用含有flHGF和dHGF基因的兩種分開的質粒用于共施用。最后，可施用 含有flHGF和dHGF基因的單一表達質粒。在本發(fā)明的某些方面，單個表達質粒上的flHGF 和dHGF由同一多核苷酸編碼或者由分開的多核苷酸編碼。有多種方法可以在單個質粒上包含能夠表達HGF同工型的多于一種多核苷酸。這 些方法包括，例如，使用內(nèi)部核糖體進入位點(InternalRibosome Entry Site，IRES)序列、 雙啟動子/表達盒以及融合蛋白。如上所述，從同一質粒表達的或者在兩個分開質粒上表 達的兩種或更多種同工型選自打恥？、(1恥？、離1、離2和離4，或者選自SEQ ID N0:2至6。 所述兩種或更多種同工型還可包括本領域技術人員已知的其它HGF同工型。在本發(fā)明的某些方面，通過直接細胞內(nèi)注射施用質粒DNA，更優(yōu)選地，通過利用注 射器或導管來實現(xiàn)。導管已用于體內(nèi)引入重組基因(參見例如E. G. Nabel等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89,5157(1992) ；Ε. G. Nabel 等，Science 249,1285(1990) ；Ε. G. Nabel 等， Science 244,1342(1989) ；Ε. G. Nabel 等，J. Clin. Invest. 91，1822 (1993) ；G. Plautz 等， Circ. 83，578 (1991) ；Ε. G. Nabel 等，Nature (1993)(印制中))。利用導管提供了將質粒 DNA遞送到難以利用注射器到達的細胞中的能力?？赏ㄟ^動脈內(nèi)或靜脈內(nèi)注射施用質粒DNA，更優(yōu)選地，通過利用注射器或導管來實 現(xiàn)。例如，可利用股動脈來遞送質粒DNA到心臟；可利用門靜脈來遞送質粒DNA到肝臟。本發(fā)明質粒DNA的施用還可通過將基因原位轉移進靶細胞來實現(xiàn)，以優(yōu)化隨后的 體內(nèi)基因遞送。除非另有指明，本發(fā)明的實施會用到細胞生物學、細胞培養(yǎng)、分子生物學(包括 PCR)、疫苗學、微生物學、重組DNA和免疫學的常規(guī)技術，其在本領域的常規(guī)技術之內(nèi)。這 些技術在文獻中有充分的闡述。參見例如Molecular Cloning A Laboratory Manual，第 2 片反，Sambrook 等編，ColdSpring Harbor Laboratory Press (1989) ；DNA Cloning，卷 I 和 II(D. N. Glover 編，1985) ；Oligonucleotide Synthesis (Μ. J. Gait 編，1984) ；Mullis 等 U. S.專利 No :4，683，195 ;Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames&S. J. Higgins 編 1984) ；Transcription And Translation(B. D. Hames&S. J. Higgins 編 1984) ；Culture Of Animal Cells(R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc.,1987) ；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,1986) ；B. Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)； the treatise, Methods InEnzymology(Academic Press, Inc. , N. Y. ) ；Gene Transfer Vectors ForMammalian Cells(J. H. Miller 禾口 Μ· P. Calos 編，1987，Cold SpringHarbor Laboratory) ；Methods In Enzymology,卷 154 禾口 155 (Wu 等編)，Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer 禾口 Walker 編，Academic Press,London,1987)；以 及Ausubel等，GurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley禾口Sons，Baltimore， Maryland(1989)中。本段所引用的每篇參考文獻均通過引用以整體并入本文。下列實施例僅以舉例的目的給出，不旨在對本發(fā)明的范圍產(chǎn)生限制。實施例1 質粒的制備在本實驗中，使用設計用于表達肝細胞生長因子(HGF)蛋白的質粒 PCK-HGF-X7(WO 03/078568)。用pCK-HGF-X7轉化大腸桿菌(T0P10，Invitrogen, USA)，分離單菌落。然后將所 分離的單菌落在含有30 μ g/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)。使用EndoFree質粒Giga試 劑盒Oliagen，USA)純化質粒DNA，重懸于含有0. 9% NaCl的鹽水中，DNA終濃度為1. O 2. 0mg/mLo實施例2 凍干在含有0.9% NaCl以及蔗糖(0. 25、1. 1、5、10或20% (重量/體積))或甘露醇 (1. 2,4. 85或10% (重量/體積))的鹽水中制備pCK-HGF-X7，DNA終濃度為0. 5mg/mL或 lmg/mL。表IA和IB分別顯示所測試的pCK-HGF_X7制劑中蔗糖和甘露醇的百分比，以及對 應的碳水化合物/DNA (重量/重量)比值。表1A.蔗糖百分比
權利要求
1.包含質粒DNA、鹽和碳水化合物的DNA制劑，其中所述質粒DNA包含HGF基因或其變體。
2.權利要求2的DNA制劑，其中所述碳水化合物是選自以下的單糖、寡糖或多糖蔗 糖、葡萄糖、乳糖、海藻糖、阿拉伯糖、戊糖、核糖、木糖、半乳糖、己糖、艾杜糖、甘露糖、塔羅 糖、庚糖、果糖、葡糖酸、山梨醇、甘露醇、甲基α-吡喃葡萄糖苷、麥芽糖、內(nèi)酯、山梨糖、葡 糖二酸、赤蘚糖、蘇糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、赤蘚酮糖、核酮糖、木酮糖、阿洛酮糖、塔格 糖、葡糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、葡糖胺、半乳糖胺、神經(jīng)氨酸、阿拉伯聚糖、果聚糖、 巖藻聚糖、半乳聚糖、半乳糖醛酸聚糖、葡聚糖、甘露聚糖、木聚糖、左聚糖、硫酸巖藻聚糖、 角叉藻聚糖、半乳卡羅聚糖、果膠類、果膠酸類、直鏈淀粉、普魯蘭多糖、糖原、支鏈淀粉、纖 維素、右旋糖酐、石耳素、甲殼素、瓊脂糖、角質素、軟骨素、皮膚素、透明質酸、海藻酸、黃原 膠和淀粉。
3.權利要求1-2中任一項的DNA制劑，其中所述碳水化合物的量選自約0.05%至約 30%、約 0. 至約 15%、約 0. 2%至約 10%、約 0. 5%至 5%、約 0. 75%至 3%、約 0. 8%至 2%以及約0.8%至1.5%。.
4.權利要求1-3中任一項的DNA制劑，其中所述碳水化合物的量為約0.至約10%。
5.權利要求3或4的DNA制劑，其中所述碳水化合物的量為約1.1%。
6.權利要求1-5中任一項的DNA制劑，其中所述碳水化合物選自蔗糖和甘露醇。
7.權利要求1-6中任一項的DNA制劑，其中所述鹽選自NaCl和KCl。
8.權利要求1-7中任一項的DNA制劑，其中所述鹽的量選自約0.01%至10%、約 0. 至 5%、約 0. 5%至 2%、約 0. 8%至 1. 5%、約 0. 8%至 1. 2%。
9.權利要求8的DNA制劑，其中所述DNA制劑中所述鹽的量為約0.9%。
10.權利要求1-9中任一項的DNA制劑，其中所述HGF基因或其變體選自flHGF、dHGF、 NK1、NK2 禾口 NK4。
11.權利要求1-9中任一項的DNA制劑，其中所述質粒DNA包含雜合HGF基因。
12.權利要求11的DNA制劑，其中所述雜合HGF基因選自HGF_X2、HGF-X3、HGF-X6、 HGF-X7 禾口 HGF-X8。
13.權利要求12的DNA制劑，其中所述質粒DNA選自pCK-HGF_X2、pCK-HGF_X3、 PCK-HGF-X6、pCK-HGF-X7、pCK_HGF_X8、pCP_HGF_X2、pCP_HGF_X3、pCP_HGF_X6、pCP_HGF_X7 和 pCP-HGF-X8。
14.權利要求1-13中任一項的DNA制劑，其中所述DNA的濃度為約Ing/mL至約30mg/mLo
15.權利要求14的DNA制劑，其中所述DNA的濃度為約Ing/mL、約5ng/mL、約10ng/mL、 約 50ng/mL、約 100ng/mL、約 500ng/mL、約 1 μ g/mL、約 5 μ g/mL、約 10 μ g/mL、約 50 μ g/mL、 約 100 μ g/mL、約 200 μ g/mL、約 400 μ g/mL、約 500 μ g/mL、約 600 μ g/mL、約 800 μ g/mL、約 lmg/mL、約 2mg/mL、約 2. 5mg/mL、約 3mg/mL、約 3. 5mg/mL、約 4mg/mL、約 4. 5mg/mL、約 5mg/ mL、約 5. 5mg/mL、約 6mg/mL、約 7mg/mL、約 8mg/mL、約 9mg/mL、約 10mg/mL、約 20mg/mL 或約 30mg/mL 質粒。
16.權利要求14的DNA制劑，其中所述DNA濃度為約0.lmg/ml至約2. 5mg/mL。
17.權利要求1-16中任一項的DNA制劑，其中所述DNA制劑是凍干的。
18.權利要求17的凍干DNA制劑，其中所述DNA制劑的凍干包括(a)將盛有所述DNA 制劑的容器裝入凍干機；(b)將所述DNA制劑冷卻至零下的溫度；以及(c)干燥所述DNA制 劑。
19.權利要求17或18的凍干DNA制劑，其中所述凍干發(fā)生于下列條件下，所述條件依 次包括(a)高于或等于約-50°C且低于約0°C的溫度下約30小時至約50小時，和(b)在高 于或等于約0°C至低于或等于約30°C的溫度下約20小時至約50小時，其中(a)中最低溫 度為約-50°C至約-40°C，(b)中最高溫度為約20°C至約30°C。
20.權利要求17-19中任一項的凍干DNA制劑，其重構在可藥用緩沖液中。
21.權利要求20的凍干DNA制劑，其中所述可藥用緩沖液選自水、PBS、TE、Tris緩沖 液和生理鹽水。
22.治療或預防對象中缺血性疾病或肝臟疾病的方法，其包括施用由凍干DNA制劑重 構的組合物，其中所述凍干DNA制劑包含質粒DNA、鹽和碳水化合物；以及其中所述質粒DNA包含HGF基因或其變體。
23.權利要求22的方法，其中所述碳水化合物是選自以下的單糖、寡糖或多糖蔗糖、 葡萄糖、乳糖、海藻糖、阿拉伯糖、戊糖、核糖、木糖、半乳糖、己糖、艾杜糖、甘露糖、塔羅糖、 庚糖、果糖、葡糖酸、山梨醇、甘露醇、甲基α -吡喃葡萄糖苷、麥芽糖、內(nèi)酯、山梨糖、葡糖二 酸、赤蘚糖、蘇糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、赤蘚酮糖、核酮糖、木酮糖、阿洛酮糖、塔格糖、葡 糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、葡糖胺、半乳糖胺、神經(jīng)氨酸、阿拉伯聚糖、果聚糖、巖藻 聚糖、半乳聚糖、半乳糖醛酸聚糖、葡聚糖、甘露聚糖、木聚糖、左聚糖、硫酸巖藻聚糖、角叉 藻聚糖、半乳卡羅聚糖、果膠類、果膠酸類、直鏈淀粉、普魯蘭多糖、糖原、支鏈淀粉、纖維素、 右旋糖酐、石耳素、甲殼素、瓊脂糖、角質素、軟骨素、皮膚素、透明質酸、海藻酸、黃原膠或淀 粉。
24.權利要求22或23的方法，其中所述碳水化合物的量選自約0.05%至約30%、約 0. 至約15%、約0.2%至約10%、約0. 5%至5%、約0. 75%至3%、約0. 8%至2%以及 約 0. 8%至 1. 5%。.
25.權利要求22-24中任一項的方法，其中所述碳水化合物的量為約0.至約10%。
26.權利要求25的方法，其中所述碳水化合物的量為約1.1%。
27.權利要求23的方法，其中所述碳水化合物選自蔗糖和甘露醇。
28.權利要求22-27中任一項的方法，其中所述鹽選自NaCl和KCl。
29.權利要求22-28中任一項的方法，其中所述鹽的量選自約0.01%至10%、0. 至 5%、約 0. 至 4%、約 0. 5%至 2%、約 0. 8%至 1. 5%、約 0. 8%至 1. 2%。
30.權利要求四的方法，其中所述DNA制劑中所述鹽的量為約0.9%。
31.權利要求22-30中任一項的方法，其中所述HGF基因或其變體選自flHGF、dHGF、 NKl 禾口 NK2。
32.權利要求22-30中任一項的方法，其中所述質粒DNA包含雜合HGF基因。
33.權利要求32的方法，其中所述雜合HGF基因選自HGF-X2、HGF-X3、HGF-X6、HGF_X7 和 HGF-X8。
34.權利要求33的方法，其中所述質粒DNA選自pCK-HGF_X2、pCK-HGF_X3、PCK-HGF-X6、pCK-HGF-X7、pCK_HGF_X8、pCP_HGF_X2、pCP_HGF_X3、pCP_HGF_X6、pCP_HGF_X7 和 pCP-HGF-X8。
35.權利要求22-34中任一項的方法，其中所述DNA的濃度為約Ing/mL至約30mg/mL。
36.權利要求35的方法，其中所述DNA的濃度為約Ing/mL、約5ng/mL、約10ng/mL、 約 50ng/mL、約 100ng/mL、約 250ng/mL、約 500ng/mL、約 1 μ g/mL、約 5 μ g/mL、約 10 μ g/ mL、約 50 μ g/mL、約 100 μ g/mL、約 200 μ g/mL、約 400 μ g/mL、約 500 μ g/mL、約 600 μ g/mL、 約 800 μ g/mL、約 lmg/mL、約 2mg/mL、約 2. 5mg/mL、約 3mg/mL、約 3. 5mg/mL、約 4mg/mL、約 4. 5mg/mL、約 5mg/mL、約 5. 5mg/mL、約 6mg/mL、約 7mg/mL、約 8mg/mL、約 9mg/mL、約 10mg/mL、 約20mg/mL或約30mg/mL質粒。
37.權利要求35的方法，其中所述DNA濃度為約0.lmg/ml至約2. 5mg/mL。
38.權利要求22-37中任一項的方法，其中所述凍干DNA重構在可藥用緩沖液中。
39.權利要求38的方法，其中所述可藥用溶液選自水、PBS、TE、Tris緩沖液和生理鹽水。
40.權利要求22-39中任一項的方法，其中所述重構組合物通過直接注射來施用。
41.制備凍干DNA制劑的方法，其包括制備包含質粒DNA、鹽和碳水化合物的DNA制劑，其中所述質粒DNA包含HGF基因或其 變體；以及凍干所述DNA制劑，由此制備所述凍干DNA制劑。
42.權利要求41的方法，其中所述DNA制劑的凍干還包括(a)將盛有所述DNA制劑的 容器裝入凍干機；(b)將所述DNA制劑冷卻至零下的溫度；以及(c)干燥所述DNA制劑。
43.權利要求41或42的方法，其中所述DNA制劑在下列條件下凍干，所述條件依次包 括(a)高于或等于約-50°C且低于約0°C的溫度下約30小時至約50小時，和(b)在高于或 等于約0°C至低于或等于約30°C的溫度下約20小時至約50小時，其中(a)中最低溫度為 約-50°C至約-40°C，(b)中最高溫度為約20°C至約30°C。
44.權利要求41-43中任一項的凍干DNA制劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了由包含質粒DNA、鹽和碳水化合物之組合物凍干的DNA制劑，其中所述質粒DNA包含HGF基因或其變體。
文檔編號C07H21/04GK102046792SQ200980119962
公開日2011年5月4日 申請日期2009年4月9日 優(yōu)先權日2008年4月9日
發(fā)明者俞源善, 金水晶, 金鐘默, 韓熊 申請人:百療醫(yī)株式會社