專利名稱：蛋白質(zhì)純化用分離劑和蛋白質(zhì)純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有特定配體的新型蛋白質(zhì)純化用分離劑、及其制造方法以及使用該 分離劑的蛋白質(zhì)純化方法。
背景技術(shù)：
為了能夠從水性混合物中分離和純化目標(biāo)化合物，近年來(lái)，對(duì)多種技術(shù)進(jìn)行了開(kāi) 發(fā)和/或優(yōu)化。作為這種分離技術(shù)和/或純化技術(shù)，例如，已知有離子交換色譜法、疏水作 用色譜法(HIC)(例如，參照非專利文獻(xiàn)1)、吸附色譜法等。這些色譜技術(shù)的多樣性一方面 使分離和/或純化目標(biāo)化合物的復(fù)雜程度最小化，另一方面反映了進(jìn)行分離和/或純化的 困難程度。并且，上述各種技術(shù)存在其在工業(yè)規(guī)模上的廣泛利用受到限制的多種缺陷。例如，混合型色譜法用樹(shù)脂在以下領(lǐng)域中使用該樹(shù)脂能夠在疏水性條件下與目 標(biāo)化合物結(jié)合，能夠在靜電性(離子性)或親水性條件下從該樹(shù)脂放出目標(biāo)化合物(例如， 參照非專利文獻(xiàn)2 5)。現(xiàn)有的混合型色譜法用樹(shù)脂的典型問(wèn)題之一在于，在目標(biāo)化合物的溶液中，不使 用高鹽濃度時(shí)，疏水性不太高的目標(biāo)化合物對(duì)該樹(shù)脂的結(jié)合效率并不太高。例如，在非專利文獻(xiàn)2中，預(yù)試驗(yàn)級(jí)別的蛋白質(zhì)對(duì)該樹(shù)脂的結(jié)合通過(guò)使用IM NaCl 溶液實(shí)現(xiàn)。需要在含有目標(biāo)化合物的水性溶液中添加鹽的色譜技術(shù)，為了實(shí)現(xiàn)在工業(yè)規(guī)模 下的收率而需要大量的試劑，需要相當(dāng)多的工序。即，需要使用高濃度鹽的色譜法用樹(shù)脂并 不是用于回收和/或純化工業(yè)量的這種目標(biāo)化合物的、最有效且成本上效果較好的方法。因此，在專利文獻(xiàn)1中，通過(guò)利用特定的離子性配體、并利用組合而成的混合型色 譜法用樹(shù)脂上的高配體密度，能夠提供目標(biāo)化合物在高離子強(qiáng)度和低離子強(qiáng)度下與樹(shù)脂結(jié) 合的這種充分的疏水性性質(zhì)，所述特定的離子性配體由1個(gè)離子性官能團(tuán)和1個(gè)間隔物構(gòu) 成，該間隔物通過(guò)共價(jià)鍵將配體(Ligand)連結(jié)到樹(shù)脂的固體支撐基體上。另外，在專利文 獻(xiàn)1中，通過(guò)使離子性官能團(tuán)介導(dǎo)的樹(shù)脂上的電荷量增加，單純地改變放出溶液的PH值，從 而利用親水性或靜電性(離子性)相互作用而能夠?qū)崿F(xiàn)目標(biāo)化合物從樹(shù)脂上放出。然而，在專利文獻(xiàn)1記載的方法中，為了使間隔臂介于載體(固體支撐基體)與配 體之間，其制造方法中需要經(jīng)過(guò)許多非常復(fù)雜的工序，因而存在制造成本非常高的問(wèn)題。S卩，在專利文獻(xiàn)1記載的方法中，間隔臂是指通過(guò)共價(jià)鍵方式將離子性官能團(tuán)連 接到固體支撐基體上的原子團(tuán)或取代體。作為這種間隔臂，可列舉出亞烴基、芳香族基團(tuán)、 烷基芳香族基團(tuán)、酰胺基、氨基、脲基、氨基甲酸酯基、R1和&分別為1個(gè)亞烴基(例如，Ci C6)且Y為氧或硫的-R1-Y-R2-基、以及與這些基團(tuán)類似的基團(tuán)。并且，作為將上述間隔臂連接(鍵合)到載體上的方法，例如實(shí)施以下方法使用 羰基二咪唑(CDI)活化固體支撐基體，與氨基己酸反應(yīng)，形成氨基甲酸酯中性鍵(參照專利 文獻(xiàn)1)。另外，作為將配體連接(鍵合)到上述間隔臂上的方法，例如實(shí)施以下方法使用 碳二亞胺(EDC)，使胺配體與氨基己酸樹(shù)脂發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，形成酰胺鍵(參照專利文獻(xiàn)1)。
這樣，在專利文獻(xiàn)1記載的方法中，在制造色譜法用樹(shù)脂時(shí)，需要經(jīng)過(guò)繁雜的工 序。另外，根據(jù)配體、間隔臂、和固體支撐基體的選擇，需要控制為最合適的PH值范圍，還存 在工序更加繁雜化的問(wèn)題。另一方面，現(xiàn)有的蛋白質(zhì)純化用的色譜法用填充劑，在吸附蛋白質(zhì)時(shí)需要在緩沖 液中添加大量的鹽，并在之后將鹽除去，因此需要消耗成本和勞力，從而期望開(kāi)發(fā)出一種降 低了鹽的量的、利用簡(jiǎn)便的操作就能夠吸附蛋白質(zhì)的填充劑?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1 日本特表平10-506987號(hào)公報(bào)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)1 =Biochimie, Vol. 60，1 15 頁(yè)(1978)非專利文獻(xiàn)2 J. Chromatogr·，Vol. 510，149 154 頁(yè)(1990)非專利文獻(xiàn)3 J. Chromatogr.，Vol. 296,329 337 頁(yè)(1984)非專利文獻(xiàn)4 :Chem. Rev.，Vol. 89，309 319 頁(yè)(1989)非專利文獻(xiàn)5 J. Chromatogr.，Vol. 317,251 261 頁(yè)(1984)

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問(wèn)題本發(fā)明是鑒于上述背景技術(shù)而進(jìn)行的，其目的在于提供一種蛋白質(zhì)純化用的新型 分離劑、其簡(jiǎn)便且經(jīng)濟(jì)的制造方法、以及使用該分離劑的蛋白質(zhì)純化方法，所述分離劑能夠 在低鹽濃度的緩沖液中容易地吸附蛋白質(zhì)，其吸附量對(duì)于純化蛋白質(zhì)而言是充分的量，此 外，只要改變?cè)摼彌_液的PH值就能夠容易地洗脫蛋白質(zhì)。用于解決問(wèn)題的方案本發(fā)明人等對(duì)于蛋白質(zhì)純化用的分離劑進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在載體上具 有通過(guò)氨基甲酸酯鍵結(jié)合的特定的配體(Ligand)的分離劑可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，從而完 成了本發(fā)明。S卩，本發(fā)明為以下所示的蛋白質(zhì)純化用分離劑和使用其的蛋白質(zhì)純化方法。[1] 一種蛋白質(zhì)純化用分離劑，其特征在于，選自由下述式(1)所示的配體和下述 式(2)所示的配體組成的組中的1種或2種以上的配體通過(guò)氨基甲酸酯鍵結(jié)合到載體上，
權(quán)利要求
1. 一種蛋白質(zhì)純化用分離劑，其特征在于，選自由下述式(1)所示的配體和下述式(2) 所示的配體組成的組中的1種或2種以上的配體通過(guò)氨基甲酸酯鍵結(jié)合到載體上，
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)純化用分離劑，其特征在于，式(1)所示的配體用下述 式(3)表不，
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)純化用分離劑，其特征在于，式(2)所示 的配體用下述式(4)表示，
4.根據(jù)權(quán)利要求1至權(quán)利要求3中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)純化用分離劑，其特征在于，載 體上的配體的含量為ΙΟΟμπιοΙ/ml載體以上。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至權(quán)利要求4中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)純化用分離劑，其特征在于，載 體是由交聯(lián)高分子構(gòu)成的載體。
6.一種蛋白質(zhì)純化用分離劑的制造方法，其特征在于，其為制造權(quán)利要求1至權(quán)利要 求5中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)純化用分離劑的方法，在有機(jī)溶劑中使載體與活化劑反應(yīng)，將載體表面的羥基活化，然后在有機(jī)溶劑中使該 活化載體與選自由下述式( 所示的伯胺和下述式(6)所示的伯胺組成的組中的1種或2 種以上的胺反應(yīng)，
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的蛋白質(zhì)純化用分離劑的制造方法，其特征在于，式(5)所示的 伯胺用下述式(J)表示，
8.根據(jù)權(quán)利要求6或權(quán)利要求7所述的蛋白質(zhì)純化用分離劑的制造方法，其特征在于， 式(6)所示的伯胺用下述式(8)表示，
9.根據(jù)權(quán)利要求6至權(quán)利要求8中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)純化用分離劑的制造方法，其 特征在于，活化劑為羰基二咪唑。
10.一種蛋白質(zhì)純化方法，其特征在于，將純化目標(biāo)蛋白質(zhì)溶解于第一緩沖液中，在使 該蛋白質(zhì)溶液與權(quán)利要求1至權(quán)利要求5中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)純化用分離劑接觸而吸附 蛋白質(zhì)后，向該分離劑中通入與第一緩沖液PH值不同的第二緩沖液，從而將吸附于該分離 劑的蛋白質(zhì)洗脫。
全文摘要
本發(fā)明提供一種蛋白質(zhì)純化用的新型分離劑、其簡(jiǎn)便且經(jīng)濟(jì)的制造方法、以及使用該分離劑的蛋白質(zhì)純化方法，所述分離劑能夠在低鹽濃度的緩沖液中容易地吸附蛋白質(zhì)，其吸附量對(duì)于純化蛋白質(zhì)而言是充分的量，此外，只要改變?cè)摼彌_液的pH值就能夠容易地洗脫蛋白質(zhì)。將選自由下述式(1)(上述式中，m表示2～6的整數(shù)。)所示的配體和下述式(2)(上述式中，R1、R2表示氫原子或碳原子數(shù)1～4的烷基，n表示1～6的整數(shù)。)所示的配體組成的組中的1種或2種以上的配體，不介由間隔臂而通過(guò)氨基甲酸酯鍵固定在載體上。
文檔編號(hào)C07K1/22GK102056937SQ20098012196
公開(kāi)日2011年5月11日 申請(qǐng)日期2009年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月23日
發(fā)明者中村孝司, 小宮克夫, 益本誠(chéng)二 申請(qǐng)人:東曹株式會(huì)社