專(zhuān)利名稱(chēng)：經(jīng)修飾的細(xì)胞因子的純化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從異構(gòu)體混合物中分離達(dá)貝泊汀(darb印oetin)的低pi異構(gòu)體的方法。
背景技術(shù)：
促紅細(xì)胞生成素或EPO是糖基化的細(xì)胞因子，其由肝和腎細(xì)胞產(chǎn)生，并且調(diào)節(jié)紅 細(xì)胞的產(chǎn)生。純化的重組人EPO可給病人服用，以治療與紅細(xì)胞供給缺乏相關(guān)的疾病，例如 貧血和慢性腎衰竭。人EPO分子的多肽骨架具有不變的氨基酸序列；然而，糖側(cè)鏈在含糖量和結(jié)構(gòu)方 面呈現(xiàn)出微觀不均一性(Sasaki H 等人，J. Biol. Chem.，1987 ；262 :12059_76，Rush RS 等 人，Anal. Chem.，1995 ；67 1442-52 和 Rush RS 等人，Anal. Chem.，1993 ；65 1834-42)。帶 負(fù)電荷的唾液酸分子通常將糖鏈的每一個(gè)臂的末端封閉。因此，糖鏈的可變性質(zhì)(整體上) 和唾液酸的含量(特別地)會(huì)產(chǎn)生帶有不同電荷的EPO異構(gòu)體(Rush RS等人，Anal. Chem.， 1995 ；67 1442-52)。Egrie 及其同事(Egrie JC.和 Browne JK.，Br. J. Cancer, 2001 ；84， 3-10 和 Egrie 等人，Glycoconj. J.，1993 ；10 :263_269)發(fā)現(xiàn)了 rHuEPO 的糖部分上的唾液 酸基團(tuán)數(shù)量與其血清半衰期及生物活性之間的直接聯(lián)系。具有更多唾液酸殘基的促紅細(xì)胞 生成素異構(gòu)體顯示出更強(qiáng)的生物活性，因?yàn)橥僖核釟埢鶗?huì)阻止在體內(nèi)的快速清除。達(dá)貝泊汀是新的紅細(xì)胞生成促進(jìn)蛋白或具有五個(gè)N-連接的糖鏈和多至22個(gè)唾 液酸的EPO類(lèi)似物。相反，重組人EPO具有三個(gè)N-連接的糖鏈和最多14個(gè)唾液酸(Egrie JC.和 Browne JK.，Br. J. Cancer，2001 ;84，3-10 和 Elliot S 等人，Blood，2000 ；96 8 2a)。 由于額外的糖基化，達(dá)貝泊汀相對(duì)于重組人EPO顯示出長(zhǎng)三倍的血清半衰期和增加的體內(nèi) 活性。達(dá)貝泊汀的異構(gòu)體的產(chǎn)生主要是由于它們的糖基含量不同以及帶負(fù)電荷的末端唾液 酸殘基的數(shù)量不同。具有更高唾液酸含量的異構(gòu)體具有低Pl。這些具有低Pl的達(dá)貝泊汀 的異構(gòu)體已被證明具有更高的治療價(jià)值，例如Amgen Corporation的以ARANESP 形式銷(xiāo)售 的產(chǎn)品。 文獻(xiàn)公開(kāi)了通過(guò)單獨(dú)使用陰離子交換色譜或使用陰離子交換色譜與疏水相互作 用或排阻色譜技術(shù)的組合來(lái)純化EPO及其類(lèi)似物。國(guó)際申請(qǐng)公布號(hào)WO 00/27869公開(kāi)了促紅細(xì)胞生成素的純化方法，其由以下順序 的步驟組成疏水相互作用、陰離子交換、陽(yáng)離子交換和排阻色譜步驟。國(guó)際申請(qǐng)公布號(hào)WO 03/045996公開(kāi)了通過(guò)反相色譜、陰離子交換和排阻色譜的重組人促紅細(xì)胞生成素的色譜 純化。Gokana 等人，Journal of Chromatography，第 701 卷，1997，109-118 頁(yè)，描述了通過(guò) DEAE-S印hacel色譜的重組人促紅細(xì)胞生成素異構(gòu)體的色譜分離方法。因此，上述公開(kāi)具有一系列復(fù)雜的色譜步驟，用于促紅細(xì)胞生成素及其類(lèi)似物的 純化。然而，需要用于從異構(gòu)體混合物中分離達(dá)貝泊汀的低Pl異構(gòu)體的簡(jiǎn)單而有效的方 法。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一些方面提供了分離達(dá)貝泊汀的異構(gòu)體的方法。在一些實(shí)施方案中，所 述方法用于達(dá)貝泊汀的低Pi異構(gòu)體的分離。在一些具體的實(shí)施方案中，所述方法用于Pi 為約4. 5或更小的異構(gòu)體的分離。異構(gòu)體的分離或純化使用至少一個(gè)在流通模式(flow-through mode)下的陽(yáng)離子 交換色譜步驟來(lái)完成。所述方法使用一定范圍的PH和鹽濃度，以從達(dá)貝泊汀異構(gòu)體的混合 物中分離低Pl異構(gòu)體。一方面，本發(fā)明提供了從達(dá)貝泊汀異構(gòu)體的混合物中分離達(dá)貝泊汀的低Pl異構(gòu) 體的方法，所述方法包括至少一個(gè)在流通模式下的陽(yáng)離子交換色譜步驟。一方面，本發(fā)明提供了從達(dá)貝泊汀異構(gòu)體的混合物中分離達(dá)貝泊汀的低Pl異構(gòu) 體的方法，所述方法包括至少一個(gè)在流通模式下的陽(yáng)離子交換色譜步驟且進(jìn)一步包括至少 一個(gè)陰離子交換色譜步驟。一方面，本發(fā)明提供了從達(dá)貝泊汀異構(gòu)體的混合物中分離達(dá)貝泊汀的低Pl異構(gòu) 體的方法，所述方法包括至少一個(gè)在流通模式下的陽(yáng)離子交換色譜步驟和進(jìn)一步包括至少 一個(gè)混合模式交換色譜步驟。


圖1是實(shí)施例6的實(shí)驗(yàn)中得到的等電聚焦凝膠，其顯示了實(shí)施例5中描述的Q瓊 脂糖凝膠步驟的洗脫液中得到的低Pi異構(gòu)體。圖2是實(shí)施例6的實(shí)驗(yàn)中得到的等電聚焦凝膠，其顯示了如實(shí)施例4中所述進(jìn)行 的CM-瓊脂糖凝膠步驟的流通液(flow-through)中得到的低pi異構(gòu)體。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的一些方面涉及通過(guò)在流通模式下的陽(yáng)離子交換色譜分離達(dá)貝泊汀的低 Pi異構(gòu)體的方法。本發(fā)明包括包含至少一個(gè)在流通模式下的陽(yáng)離子交換色譜步驟的方法，其中從異 構(gòu)體的混合物中分離低Pl異構(gòu)體。這同時(shí)作為病毒滅活步驟，這是由于該步驟中使用低PH 范圍的緩沖劑，以得到所需的異構(gòu)體。此處使用的術(shù)語(yǔ)“異構(gòu)體”是指具有相同的氨基酸序列，但由于糖基化、?；?、脫 酰胺基或硫酸化的不同而具有不同的電荷，且因此具有不同的等電點(diǎn)的蛋白?！暗入婞c(diǎn)”或“pi”是其中特定的分子或表面不帶有凈電荷的pH值。多肽的“pi” 是指其中所述多肽的正電荷和其負(fù)電荷平衡的PH值?！皃i”可以通過(guò)各種已知的方法估算， 例如從多肽上的氨基酸和/或唾液酸殘基的凈電荷估算或通過(guò)使用等電聚焦、層析聚焦等 估算。低pi異構(gòu)體是具有約4. 5或更低的pi的異構(gòu)體。在一個(gè)實(shí)施方案中，低pi異構(gòu)體通過(guò)包括陰離子交換色譜步驟或混合模式色譜 步驟的方法分離得到，所述混合模式色譜步驟包括至少一個(gè)在流通模式下的陽(yáng)離子交換色 i普步馬聚ο在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)包括陰離子交換步驟或混合模式色譜步驟以及在流通模式下的陽(yáng)離子交換色譜步驟、任選存在的之后的另一個(gè)陰離子交換步驟或混合模式色譜 步驟的方法將低pi異構(gòu)體從異構(gòu)體混合物中分離。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)包括陰離子交換或混合模式色譜步驟、在流通模式下 的第一陽(yáng)離子交換色譜步驟以及在流通模式下的第二陽(yáng)離子交換色譜步驟的方法將低Pi 異構(gòu)體從其異構(gòu) 體混合物中分離。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)包括陰離子交換或混合模式色譜、在流通模式下的第 一陽(yáng)離子交換色譜和在流通模式下的第二陽(yáng)離子交換色譜、之后的另一個(gè)陰離子交換或混 合模式色譜步驟的方法將低Pi異構(gòu)體從其它異構(gòu)體混合物中分離或純化。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)包括陰離子交換色譜步驟、在流通模式下的第一陽(yáng)離 子交換色譜和在流通模式下的第二陽(yáng)離子交換色譜、之后的混合模式色譜步驟的方法將低 Pi異構(gòu)體從其它異構(gòu)體混合物中分離或純化出來(lái)。這里提到的實(shí)施方案在色譜步驟之間可以任選地包括切向流過(guò)濾、濃縮、滲濾或 超濾步驟中的任意步驟。這里提到的實(shí)施方案可以包括一個(gè)或多個(gè)病毒滅活步驟或無(wú)菌過(guò)濾或納濾步驟。實(shí)施方案中提到的陰離子交換色譜可以采用任何弱或強(qiáng)的陰離子交換色譜樹(shù)脂 或膜進(jìn)行，所述樹(shù)脂或膜起到弱或強(qiáng)的陰離子交換劑的作用。陰離子交換色譜樹(shù)脂或膜的 實(shí)例是Q-瓊脂糖凝膠色譜樹(shù)脂或膜。實(shí)施方案中提到的陽(yáng)離子交換色譜可以采用任何弱或強(qiáng)的陽(yáng)離子交換色譜樹(shù)脂 或膜進(jìn)行，所述樹(shù)脂或膜起到弱或強(qiáng)的陽(yáng)離子交換劑的作用。弱陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的實(shí)例是 羧甲基-瓊脂糖凝膠(CM-瓊脂糖凝膠)或具有類(lèi)似的羧甲基配體的樹(shù)脂。實(shí)施方案中提到的混合模式色譜是指其中包含一種以上色譜分離原理(通常為 離子和疏水原理)起作用的色譜樹(shù)脂。因此，混合模式樹(shù)脂是指具有陽(yáng)離子或陰離子、疏水 基團(tuán)或配體的固相。術(shù)語(yǔ)“固相”是指任何非水性基質(zhì)?；旌夏Ｊ缴V配體顯示出疏水或 電荷相互作用之一或兩者兼?zhèn)?。混合模式?shù)脂的實(shí)例是Captoadhere樹(shù)脂或通過(guò)類(lèi)似方式 起作用的任何混合模式樹(shù)脂。陽(yáng)離子交換步驟中的“流通模式”是指其中所期望的蛋白不與柱結(jié)合且在上樣或 上樣后的洗脫步驟中在流通溶液中獲得的過(guò)程。流通液中的期望的蛋白可以以各個(gè)級(jí)分的 形式收集并合并到一起或可以以單個(gè)級(jí)分的形式收集。在陽(yáng)離子交換色譜步驟中，用于將蛋白上樣的緩沖劑的pH值為約2至約5，或2. 8 至約4. 8，或約3至約3. 5。本文在洗脫步驟中用于獲得蛋白的緩沖劑的pH值為約2至約 5，或約2. 8至約4，或約3至約3. 5。在第一陽(yáng)離子交換步驟中的使用的緩沖劑的pH值可以與第二陽(yáng)離子交換步驟中 的使用的PH值不同。用于配制緩沖溶液的緩沖劑可以包括乙酸鈉或檸檬酸鈉或磷酸鹽緩沖劑，以及它 們的鹽或衍生物。在一些實(shí)施方案中，緩沖劑的濃度為約IOmM至約IOOmM,或約40至約 90mM,或約75至約85mM。參考以下實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的某些具體方面和實(shí)施方案進(jìn)行更詳細(xì)的描述，提供 以下實(shí)施例的目的僅用于解釋說(shuō)明。這些實(shí)施例不應(yīng)以任何方式被視為對(duì)本發(fā)明范圍的限 制。
實(shí)施例實(shí)施例1蛋白的表汰和收獲。

通過(guò)將CHO-S親本細(xì)胞系用獲自達(dá)貝泊汀α表達(dá)載體(pCS_達(dá)貝泊汀-WPE (新 ori))的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(retrovector)轉(zhuǎn)導(dǎo)得到中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary, CH0)生產(chǎn)細(xì)胞系。轉(zhuǎn)導(dǎo)后，在T型瓶中，10-14天后匯合的(pooled)細(xì)胞群表達(dá)多至 36 μ g/rl的達(dá)貝泊汀α。將匯合的細(xì)胞群稀釋至非常低的細(xì)胞密度(1_3活細(xì)胞/200 μ 1 培養(yǎng)基)并平鋪于96孔微量滴定板上以形成源于單一細(xì)胞的克隆細(xì)胞系。篩選用于達(dá)貝 泊汀α生產(chǎn)的克隆并選擇高產(chǎn)率的克隆用于表達(dá)。在被接種到生產(chǎn)反應(yīng)器前，在3個(gè)旋轉(zhuǎn)器(spinner)階段以及1個(gè)種子反應(yīng)器階 段中將表達(dá)達(dá)貝泊汀α的細(xì)胞從主細(xì)胞庫(kù)擴(kuò)展。PF CHO培養(yǎng)基用于在旋轉(zhuǎn)器中培養(yǎng)細(xì)胞，以得到良好的細(xì)胞生長(zhǎng)和高生存力。所 述PF-CHO培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基包括PF-CH0主粉末6. 0g，PF-CHO基礎(chǔ)粉末10. 4g，L-谷氨酰 胺0.58g，Pluronic F-68 1. 0g，碳酸氫鈉2. 0g。在接種前將培養(yǎng)基的pH值設(shè)定為7。將獲 自主細(xì)胞庫(kù)的細(xì)胞接種在包含PF-CHO培養(yǎng)基的旋轉(zhuǎn)器瓶中，初始細(xì)胞計(jì)數(shù)為0. 2百萬(wàn)細(xì)胞 /mL。將旋轉(zhuǎn)器瓶在保持在37°C下的5% CO2的溫育器中進(jìn)行溫育。溫育72小時(shí)后，當(dāng)細(xì)胞 密度達(dá)到1百萬(wàn)細(xì)胞/mL時(shí)，將細(xì)胞收獲并轉(zhuǎn)入另一階段。經(jīng)過(guò)在旋轉(zhuǎn)器瓶中轉(zhuǎn)換的3個(gè) 階段后，將細(xì)胞接種到包含4L SFM-6(1)培養(yǎng)基的6. 5L的種子反應(yīng)器中，初始細(xì)胞密度為 0. 2百萬(wàn)細(xì)胞/mL。所述SFM-6(1)培養(yǎng)基包括“DMEM/F-12”基礎(chǔ)培養(yǎng)基、氨基酸、胰島素、 維生素、微量元素、植物蛋白胨、碳酸氫鈉和果糖。在種子反應(yīng)器中，將PH值保持在7.0，將 培養(yǎng)溫度控制在37. 0°C。通過(guò)控制攪動(dòng)和曝氣使溶解氧保持在40%。72小時(shí)后當(dāng)細(xì)胞密 度達(dá)到1百萬(wàn)細(xì)胞/mL時(shí)，無(wú)菌收獲培養(yǎng)物且將細(xì)胞轉(zhuǎn)入IlL的包含10LSFM-6(2)培養(yǎng)基 的生產(chǎn)反應(yīng)器中，初始細(xì)胞密度為0. 2百萬(wàn)細(xì)胞/mL。12天后收獲培養(yǎng)物，以收集包含目標(biāo) 產(chǎn)物的上清液。實(shí)施例2通過(guò)陰離子交換餼譜或Captoadhere餼譜捕獲。在粗提取物澄清后，將澄清的細(xì)胞培養(yǎng)液濃縮，并通過(guò)使用pH值為7. 1的25mM 三羥甲基氨基甲烷、60mM NaCl緩沖劑進(jìn)行滲濾(使用截留分子量為30kDa的切向流過(guò)濾 (TFF))降低電導(dǎo)率。隨后將濃縮后的細(xì)胞培養(yǎng)液上樣至經(jīng)5個(gè)柱體積(CV)的25mM三羥甲 基氨基甲烷、60mM NaCl、pH值7. 1的緩沖劑預(yù)平衡的Q-瓊脂糖凝膠柱。然后，用5CV的平 衡緩沖劑(25mM三羥甲基氨基甲烷、60mMNaCl，pH值7. 1)洗滌柱。然后，用pH值為4.0的 SOmM乙酸鈉、40-120mM NaCl緩沖劑進(jìn)行低pH值洗滌。再次用平衡緩沖劑洗滌。上樣至柱 上的期望的蛋白用PH值為7. 1的25mM三羥甲基氨基甲烷、140-300mM NaCl緩沖劑洗脫。此外，可使用CaptoAdhere (混合模式色譜柱)替代Q-瓊脂糖凝膠柱。用5CV的 20mM磷酸鹽，60mM NaCl，pH值7. 1 士0. 2的緩沖劑預(yù)平衡CaptoAdhere柱。然后用5CV的平 衡緩沖劑(20mM磷酸鹽，60mM NaCl，pH值7. 1 士 0. 2)洗滌柱。接著用pH值為4. 0的80mM 乙酸鈉、40-120mM NaCl緩沖劑進(jìn)行低pH值洗滌。再次用平衡緩沖劑洗滌。上樣至色譜柱 上的期望的蛋白用PH值緩沖為7. 1 士0. 2的20mM磷酸鹽、140-300mM NaCl洗脫。實(shí)施例3
第一陽(yáng)離子交換餼譜。將由實(shí)施例2得到的洗脫液級(jí)分合并并濃縮，并通過(guò)使用PH值為4. 8的73mM乙 酸鈉緩沖劑的TFF步驟的滲濾過(guò)程使電導(dǎo)率降低。該步驟作為緩沖劑交換步驟，其中使所 述合并的Q-瓊脂糖凝膠柱洗脫液進(jìn)入到pH為4. 8的73mM乙酸鈉緩沖劑中。隨后將所述 緩沖劑交換樣品上樣至已用5CV的pH為4. 8的73mM乙酸鈉緩沖劑預(yù)平衡的CM-瓊脂糖凝 膠柱上。在上樣樣品時(shí)期望的產(chǎn)物在流通液中得到，而雜質(zhì)則結(jié)合到色譜柱上。上樣后，用 3CV的pH為4. 8的73mM乙酸鈉緩沖劑洗滌柱。期望的產(chǎn)物也在洗滌步驟中以流通液的形 式得到。結(jié)合在柱上的雜質(zhì)隨后用PH為7. 1的25mM三羥甲基氨基甲烷、500mM NaCl緩沖 劑洗脫。實(shí)施例4第二陽(yáng)離子交換餼譜。將由實(shí)施例3得到的流通液級(jí)分或由實(shí)施例2得到的洗脫液級(jí)分合并、濃縮并使 用TFF與包含83mM乙酸鈉(或80_85mM乙酸鈉)的pH為3. 3 (或pH 3. 0-3. 5)的緩沖劑交 換。將由TFF得到的樣品上樣至用5CV的pH為3. 3的83mM乙酸鈉緩沖液預(yù)平衡的CM-瓊 脂糖凝膠柱。在上樣樣品時(shí)期望的產(chǎn)物在流通液中得到。發(fā)現(xiàn)此步驟中使用的緩沖劑的PH 值對(duì)得到流通液中的所需的異構(gòu)體至關(guān)重要。此外，上述過(guò)程持續(xù)超過(guò)30分鐘，因此其同 時(shí)也作為病毒滅活步驟。上樣后，將色譜柱用9CV的pH為4. 8的73mM乙酸鈉緩沖劑洗滌。 期望的產(chǎn)物也在洗滌步驟中的流通液中得到。結(jié)合在柱上的雜質(zhì)隨后用PH為7. 1的25mM 三羥甲基氨基甲烷、500mM NaCl緩沖劑洗脫。實(shí)施例5 陰離子交換餼譜步驟或Captoadhere餼譜步驟。將由實(shí)施例4得到的流通液級(jí)分上樣至已用含有25mM三羥甲基氨基甲烷、60mM NaCl, pH為7. 1的緩沖劑預(yù)平衡的Q-瓊脂糖凝膠柱上。用相同的緩沖劑洗滌柱。期望的 產(chǎn)物結(jié)合到色譜柱上，并用PH緩沖為6. 0的40mM磷酸鹽，280mMNaCl洗脫?；蛘?，可使用CaptoAdhere (混合模式色譜柱)代替Q-瓊脂糖凝膠柱。在這種情 況下，該柱用5CV的pH為6. 0的20mM磷酸鹽緩沖劑預(yù)平衡，并再次用相同的緩沖劑(5CV) 洗滌。隨后用4CV的包含40mM磷酸鹽和280mMNaCl、pH為6. 0的緩沖劑洗脫結(jié)合在色譜柱 上的期望的蛋白。該步驟(實(shí)施例5)作為濃縮和緩沖劑交換步驟，因此不需要另一個(gè)TFF。此外，這 提供了比常規(guī)TFF更可控的環(huán)境。實(shí)施例6等電聚焦。通過(guò)等電聚焦(IEF)分析實(shí)施例4的流通液級(jí)分和由實(shí)施例5得到的洗脫液。使 用水、尿素、30%丙烯酰胺和兩性電解質(zhì)(pH范圍2-4和3-10)制備IEF凝膠。將上述組分 小心地混合并向混合物中加入10重量/體積％過(guò)硫酸氨和TEMED，將上述混合物注入凝膠 夾層裝置(gel sandwich apparatus,BIORAD Mini Protean Cell)并配備梳。使凝膠在室 溫下聚合45分鐘。將少量的蛋白溶液與等體積的樣品緩沖劑(甘油、兩性電解質(zhì)和Milli Q水)混合并載入到凝膠中。隨后將凝膠放入BIORAD Mini Protean Cell裝置中并在不同 的室中充入陰極緩沖劑(25mM氫氧化鈉)和陽(yáng)極緩沖劑(25mM正磷酸)。在室溫下，將由實(shí)施例4得到的流通液級(jí)分或由實(shí)施例5得到的洗脫液在200V恒壓下運(yùn)行1. 5小時(shí)，用于兩 性電解質(zhì)的預(yù)聚焦，然后在室溫下，將電壓增加到400V并再運(yùn)行1. 5小時(shí)。運(yùn)行后，將凝膠 小心地除去，并如現(xiàn)有技術(shù)中公開(kāi)的那樣，使用考馬斯藍(lán)染色或銀染色。圖1顯示了由根據(jù)以上所述進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)得到的等電聚焦凝膠，顯示了實(shí)施例5中 描述的Q瓊脂糖凝膠步驟的洗脫液中得到的低Pl異構(gòu)體。泳道A至F是根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行 的不同純化批次；即，使表達(dá)達(dá)貝泊汀α的細(xì)胞培養(yǎng)物的收獲物經(jīng)歷如實(shí)施例2所述的陰 離子交換色譜，然后經(jīng)歷如實(shí)施例4所示的在流通模式下的陽(yáng)離子交換色譜，然后經(jīng)歷如 實(shí)施例5所示陰離子交換色譜。

圖2顯示了由根據(jù)以上所述進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)得到的等電聚焦凝膠，顯示了如實(shí)施例4 中所述進(jìn)行的CM-瓊脂糖凝膠步驟的流通液中得到的低pi異構(gòu)體。圖中的泳道A至C和 F至I是根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行的不同純化批次；S卩，使表達(dá)達(dá)貝泊汀α的細(xì)胞培養(yǎng)物的收獲物 經(jīng)歷如實(shí)施例2所述的陰離子交換色譜，然后經(jīng)歷如實(shí)施例4所示的在流通模式下的陽(yáng)離 子交換色譜。泳道D和E是可商購(gòu)的達(dá)貝泊汀α樣品ARANESP 中觀察到的異構(gòu)體(pi 2. 8-3. 3)，并用作用于對(duì)比的標(biāo)準(zhǔn)品。
權(quán)利要求
1.從達(dá)貝泊汀異構(gòu)體的混合物中分離達(dá)貝泊汀的低Pi異構(gòu)體的方法，所述方法包括 至少一個(gè)在流通模式下的陽(yáng)離子交換色譜步驟。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述異構(gòu)體具有小于約4.5的pi值。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其進(jìn)一步包括至少一個(gè)陰離子交換色譜步驟。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中至少一個(gè)陰離子交換色譜步驟在至少一個(gè)陽(yáng)離子交 換色譜步驟之前。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其中至少一個(gè)陰離子交換色譜步驟在至少一個(gè)陽(yáng)離子交 換色譜步驟之后。
6.如權(quán)利要求3所述的方法，其中至少一個(gè)陰離子交換色譜步驟在至少一個(gè)陽(yáng)離子交 換色譜步驟之前且至少一個(gè)陰離子交換色譜步驟在至少一個(gè)陽(yáng)離子交換色譜步驟之后。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其包括兩個(gè)陽(yáng)離子交換色譜步驟。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中至少一個(gè)陰離子交換色譜步驟在至少一個(gè)陽(yáng)離子交 換色譜步驟之前。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其中至少一個(gè)陰離子交換色譜步驟在至少一個(gè)陽(yáng)離子交 換色譜步驟之后。
10.如權(quán)利要求7所述的方法，其中至少一個(gè)陰離子交換色譜步驟在至少一個(gè)陽(yáng)離子 交換色譜步驟之前且至少一個(gè)陰離子交換色譜步驟在至少一個(gè)陽(yáng)離子交換色譜步驟之后。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其進(jìn)一步包括至少一個(gè)混合模式色譜步驟。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中至少一個(gè)混合模式色譜步驟在至少一個(gè)陽(yáng)離子交 換色譜步驟之前。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，其中至少一個(gè)混合模式色譜步驟在至少一個(gè)陽(yáng)離子交 換色譜步驟之后。
14.如權(quán)利要求11所述的方法，其中至少一個(gè)混合模式色譜步驟在至少一個(gè)陽(yáng)離子交 換色譜步驟之前且至少一個(gè)混合模式色譜步驟在至少一個(gè)陽(yáng)離子交換色譜步驟之后。
15.如權(quán)利要求11所述的方法，其包括兩個(gè)陽(yáng)離子交換色譜步驟。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中至少一個(gè)混合模式色譜步驟在至少一個(gè)陽(yáng)離子交 換色譜步驟之前。
17.如權(quán)利要求15所述的方法，其中至少一個(gè)混合模式色譜步驟在至少一個(gè)陽(yáng)離子交 換色譜步驟之后。
18.如權(quán)利要求15所述的方法，其中至少一個(gè)混合模式色譜步驟在至少一個(gè)陽(yáng)離子交 換色譜步驟之前且至少一個(gè)混合模式色譜步驟在至少一個(gè)陽(yáng)離子交換色譜步驟之后。
19.如權(quán)利要求3所述的方法，其包括至少一個(gè)混合模式色譜步驟。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中至少一個(gè)混合模式色譜步驟在陽(yáng)離子交換色譜步 驟之前。
21.如權(quán)利要求19所述的方法，其中至少一個(gè)混合模式色譜步驟在陽(yáng)離子交換色譜步驟之后ο
22.如權(quán)利要求19所述的方法，其中至少一個(gè)混合模式色譜步驟在至少一個(gè)陽(yáng)離子交 換色譜步驟之前且至少一個(gè)陰離子交換色譜步驟在至少一個(gè)陽(yáng)離子交換色譜步驟之后。
23.如權(quán)利要求19所述的方法，其中至少一個(gè)陰離子交換色譜步驟在至少一個(gè)陽(yáng)離子交換色譜步驟之前且至少一個(gè)混合模式色譜步驟在至少一個(gè)陽(yáng)離子交換色譜步驟之后。
24.如權(quán)利要求19所述的方法，其包括兩個(gè)陽(yáng)離子交換色譜步驟。
25.如權(quán)利要求M所述的方法，其中所述混合模式色譜步驟在至少一個(gè)陽(yáng)離子交換色 譜步驟之前。
26.如權(quán)利要求M所述的方法，其中所述混合模式色譜步驟在至少一個(gè)陽(yáng)離子交換色譜步驟之后ο
27.如權(quán)利要求M所述的方法，其中所述混合模式色譜步驟在至少一個(gè)陽(yáng)離子交換色 譜步驟之前且所述陰離子交換色譜步驟在至少一個(gè)陽(yáng)離子交換色譜步驟之后。
28.如權(quán)利要求M所述的方法，其中所述陰離子交換色譜步驟在至少一個(gè)陽(yáng)離子交換 色譜步驟之前且所述混合模式色譜步驟在至少一個(gè)陽(yáng)離子交換色譜步驟之后。
29.如權(quán)利要求1- 之一所述的方法，其中所述流通液在約2-5.5的pH值下得到。
30.如權(quán)利要求四所述的方法，其中所述流通液在約3-5的pH值下得到。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述流通液在約3.3的pH值下得到。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述流通液在約4.8的pH值下得到。
全文摘要
本發(fā)明提供了純化經(jīng)修飾的細(xì)胞因子的有效方法。所述方法包括使用色譜技術(shù)純化期望的細(xì)胞因子。經(jīng)純化的細(xì)胞因子可用作治療組分。
文檔編號(hào)C07K14/52GK102076705SQ200980124118
公開(kāi)日2011年5月25日 申請(qǐng)日期2009年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月24日
發(fā)明者A·維韋克, C·羅伊, D·科蒂察 申請(qǐng)人:雷迪博士實(shí)驗(yàn)室公司, 雷迪博士實(shí)驗(yàn)室有限公司