專利名稱：使用通用抗體構架進行的兔抗體的人源化的制作方法
使用通用抗體構架進行的兔抗體的人源化相關信息本申請要求2008年6月25日提交的US 61/075, 697,2009年2月M日提交的US 61/155，041和2009年2月24日提交的US61/155, 105的優(yōu)先權。
背景技術：
單克隆抗體、其綴合物和衍生物作為治療性和診斷性試劑具有巨大的商業(yè)重要性。非人抗體通常在單次低劑量注射后在患者中引發(fā)強免疫應答(Schroff，1985 Cancer Res 45 :879-85, Shawler. J Immunol 1985 135 :1530-5 ；Dillman, Cancer Biother 19949 17-28)。因此，開發(fā)了減弱鼠和其他嚙齒類動物抗體的免疫原性的幾個方法以及使用例如轉基因小鼠或噬菌體展示產(chǎn)生完全人抗體的技術。改造嵌合抗體，所述嵌合抗體將嚙齒類動物可變區(qū)與人恒定區(qū)組合(例如，BoulianneNature 1984 312 :643-6)，顯著地減少了免疫原性問題(例如，LoBuglio, Proc Natl Acad Sci 1989 86 :4220-4 ；Clark, Immunol Today 2000 21:397-402)。還對人源化的抗體進行改造，其中改造可變區(qū)本身的嚙齒類動物序列以盡可能接近人序列同時保持至少原始CDR，或其中將來自嚙齒類動物抗體的CDR 移植入人抗體的構架(例如，Riechmann，Nature 1988 332 :323-7 ;US5, 693，761)。兔多克隆抗體被廣泛地用于生物測定例如ELISA或Western印跡。多克隆兔抗體由于其通常高得多的親和力而通常比多克隆嚙齒類動物抗體更有利。此外，兔通常能夠引發(fā)良好的對抗原的抗體應答，所述抗原在小鼠中具有較弱的免疫原性和/或當用于噬菌體展示時不產(chǎn)生良好的結合劑。由于兔抗體的這些熟知的有利方面，因而它們被理想地用于治療性抗體的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)。未普遍進行該應用的原因主要是由于單克隆兔抗體的產(chǎn)生的技術挑戰(zhàn)。因為骨髓瘤樣腫瘤在兔中是未知的，因此產(chǎn)生單克隆抗體的常規(guī)雜交瘤技術不適用于兔抗體。為表達兔抗體的細胞提供融合細胞系伴侶的開拓工作已由Knight和colleagues (Spieker-Polet等人，PNAS 1995,92 :9348-52)進行并且改善的融合伴侶細胞系已由 Pytela等人在2005年(參見例如美國專利74四487)進行了描述。然而，該技術未得到廣泛地推廣，因為相應的專門技術基本上由單個研究小組控制。用于產(chǎn)生單克隆抗體的可選擇的方法(其包括通過RT-PCR從選擇的表達抗體的細胞克隆抗體)描述于文獻中，但對于兔抗體從未有成功的報導。如果用于人治療，預期兔抗體(與鼠抗體一樣)引發(fā)強免疫應答，因此，兔抗體需要先進行人源化，然后才可將其用于臨床。然而，用于產(chǎn)生人源化的嚙齒類動物抗體的方法由于分別地兔與小鼠抗體之間以及兔與人抗體之間的結構差異而不能容易地推廣至兔抗體。例如，輕鏈⑶R3(⑶RL3)通常比之前已知的來自人或小鼠抗體的⑶RL3長得多。然而，存在少數(shù)幾個現(xiàn)有技術中描述的兔抗體人源化的方法，然而所述方法無其中將非人供體的CDR移植在人受體抗體上的經(jīng)典移植方法。WO 04/016740描述了所謂的 “表面再建(resurfacing)”策略。“表面再建”策略的目的是改造非人構架的溶劑可及的殘基以便它們變得更象人的殘基。WO 04/016740中所述的用于兔抗體的相似人源化技術在本領域內是已知的。W008/144757和W005/016950公開了用于人源化兔單克隆抗體的方法，其包括將親本兔抗體的氨基酸序列與相似人抗體的氨基酸序列相比較。然后，改變親本兔抗體的氨基酸序列以便其構架區(qū)在序列上與相似人抗體的等同構架區(qū)更相似。為了獲得良好的結合能力，對于每一種免疫結合劑，需要單獨地進行繁重的開發(fā)努力。上述方法的潛在問題是，不使用人構架而是改造兔構架以便其看起來更象人的。 此類方法具有風險包埋在蛋白質核心中的氨基酸區(qū)段仍可能包含免疫原性T細胞表位。迄今為止，本申請者仍未鑒定到通過應用現(xiàn)有技術移植方法而人源化的兔抗體。 這可由兔CDR可能與人或嚙齒類動物CDR顯著不同的事實來解釋。如本領域中已知的，許多兔VH鏈相對于鼠和人對應物具有額外配對的半胱氨酸。除了 cys22與cys92之間形成的保守二硫橋外，在一些兔鏈中還存在cyS21-cyS79橋以及在⑶R Hl的最后一個殘基與⑶R H2的第一個殘基之間形成的⑶R間S-S橋。除此以外，半胱氨酸殘基對通常見于⑶R-L3 中。此外，許多兔抗體⑶R不屬于任何之前已知的經(jīng)典結構。特別地，⑶R-L3通常比人或鼠對應物的⑶R-L3長得多。因此，非人⑶R抗體至人構架的移植是主要的蛋白質改造任務。必須將來自天然進化的構架的抗原結合環(huán)轉移至不同的人工選擇的人構架，以使天然環(huán)構象得到保持以進行抗原結合。通常抗原結合親和力在環(huán)移植后大大降低或消除。仔細選擇的人構架在移植抗原結合環(huán)中的使用使得在人源化分子中保持結合親和力的概率最大化(Roguzka等人 1996)。雖然可在文獻中獲得的許多移植實驗提供了 CDR移植的大致指導，但不可能使模式普遍化。典型的問題在于，在移植CDR環(huán)后喪失了特異性、穩(wěn)定性或可生產(chǎn)性。因此，存在對用于可靠且快速地人源化用作治療劑和診斷劑的兔抗體的改進的方法的迫切需要。此外，還存在對用于可靠地人源化兔抗體、提供具有藥物樣生物物理性質的功能性抗體和/或抗體片段的人受體構架的需要。發(fā)明概述已令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，通過質量控制OlC)測定(如WO 0148017中和Auf der Maur 等人Q001)，F(xiàn)EBS Lett 508，p. 407-412中公開的)鑒定的高度可溶的和穩(wěn)定的人抗體構架特別適合于容納來自其他非人動物物種的CDR例如兔CDR。因此，在第一方面，本發(fā)明提供了特定人抗體(所謂的“FW1.4”抗體)的輕鏈和重鏈可變區(qū)，其特別適合作為來自具有不同結合特異性的多種抗體的CDR，特別是來自兔抗體的CDR的通用受體，無論二硫橋是否存在于CDR中。此外，本發(fā)明提供了所述特定人抗體構架的兩個突變序列，即rFWl. 4和 rFWl. 4(V2)，兩者都是特別適合作為用于兔⑶R的移植的通用受體構架的構架。在另一個方面，本發(fā)明提供了使人構架適合于容納來自其他非人動物物種的CDR特別是兔CDR的構架殘基的基序。通過將兔⑶R移植入此類高度相容的可變輕鏈和重鏈構架產(chǎn)生的人源化免疫結合劑一致且可靠地保持供體CDR所來源的兔抗體的空間定位。因此，不必將供體免疫結合劑的結構相關位置引入受體構架。由于這些有利方面，可實現(xiàn)兔抗體的高通量人源化，無需進行或幾乎無需進行結合能力的優(yōu)化。因此，在另一個方面，本發(fā)明提供了將兔CDR和其他非人CDR移植入本文中公開的可溶和穩(wěn)定的輕鏈和/或重鏈人抗體構架序列，從而產(chǎn)生具有優(yōu)良生物物理性質的人源化抗體的方法。特別地，通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的免疫結合劑展示優(yōu)良的功能性質例如溶解性和穩(wěn)定性。附圖概述


圖1描述了本文中用于將抗原結合部位從兔單克隆抗體移植入高度可溶和穩(wěn)定的人抗體構架的⑶R Hl的界定。圖2示意性顯示了用熒光抗體2標記的B細胞1與用細胞內染料4染色的表達靶的細胞3相互作用。靶的選擇5 ；BCR :6。圖3 結合ESBA903可溶性靶的兔B細胞的FACS選擇方法。圖3A 根據(jù)前向和側向散射門控淋巴細胞。圖:3B 其中，選擇IgG+IgM-細胞(可能地記憶B細胞)(紅色門控)。 圖3C 用ESBA903-PE和ESBA903_PerCP雙染色的細胞(綠色門控)預期編碼高親和力的抗ESBA903的IgG。在96孔板中分選顯示最亮的熒光的細胞(粉紅色門控)。圖4.用抗TNF α抗體(PE標記的)包被的珠粒結合TNF α轉染的CHO細胞(上圖)。抗CD 19抗體(APC標記的)包被的對照珠粒不結合TNF α轉染的CHO細胞(中圖)。 用抗TNF α抗體包被的珠粒不結合野生型(Wt)CHO細胞(下圖)。左邊的散點圖(dot plot)顯示前向散射和側向散射，其分別表示事件的大小和粒度。單個珠粒( 3um)的群體被門控在P2中。最終結合至珠粒的CHO細胞( 30um)被門控在Pl中。中間的散點圖顯示就其PE或APC染色而言的Pl事件(CH0細胞)。因此，如果細胞與抗TNFa 珠粒相互作用，那么它們將示于P3門控中，如果它們與抗CD 19珠粒相互作用，那么它們將出現(xiàn)在P4門控中。在右邊，詳述了各樣品的統(tǒng)計數(shù)據(jù)。圖5.將用抗TNF α -PE包被的珠粒和用抗⑶19-APC包被的珠粒與TNF α轉染的 CHO細胞混合在一起。CHO細胞被門控(Pl)，并且其中結合抗TNF α -PE包被的珠?；蚩耿?19-APC包被的珠粒的細胞分別示于門控Ρ3和Ρ4中。未結合的珠?？稍陂T控Ρ2中看到。圖6.獲自Kabat數(shù)據(jù)庫的兔抗體序列的分析確認，可變重鏈的⑶R3通常比其鼠對應物長3個氨基酸。發(fā)明詳述定義為了可更容易地理解本發(fā)明，將如下定義某些術語。另外的定義示于本說明書的上下文中。術語“抗體”是指完整抗體和任何抗原結合片段。術語“抗原結合多肽”和“免疫結合劑”在本文中同時使用。“抗體”是指包含通過二硫鍵鏈間連接的至少兩個重鏈(H)和兩個輕鏈(L)的蛋白質(任選地被糖基化)或其抗原結合部分。各重鏈包含重鏈可變區(qū)(在本文中縮寫為Vh)和重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)包含3個結構域CH1、CH2和CH3。各輕鏈包含輕鏈可變區(qū)(在本文中縮寫為VJ和輕鏈恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)包含一個結構域C” Vh和八區(qū)可進一步細分為稱為互補決定區(qū)(CDR)的高變區(qū)，以及散布于其間的稱為構架區(qū)(FR) 的更保守的區(qū)域。各Vh和\由以下列順序從氨基末端至羧基末端排列的3個CDR和4個 FR組成FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)包含與抗原相互作用的結合結構域?？贵w的恒定區(qū)可介導免疫球蛋白對宿主組織或因子(包括免疫系統(tǒng)的各種細胞(例如，效應細胞)和經(jīng)典補體系統(tǒng)的第一組分(Clq))的結合。術語抗體的“抗原結合部分”(或簡稱“抗體部分”)是指抗體的保持特異性結合抗原(例如，TNF)的能力的一個或多個片段。已顯示可利用全長抗體的片段來進行抗體的抗原結合功能。術語抗體的“抗原結合部分”中包含的結合片段的實例包括(i)Fab片段， 由八、Vh、(^結構域組成的單價片段；(ii)F(ab' )2片段，包含通過鉸鏈區(qū)上的二硫橋
7連接的兩個Fab片段的二價片段，(iii)由V1^P CHl結構域組成的Fd片段；(iv)由抗體的單臂的Vh和八結構域組成的Fv片段；(ν)單結構域或dAb片段(Ward等人，(1989) Nature 341 :544-546),其由Vh結構域組成；和(vi)分離的互補決定區(qū)(CDR)或(vii)可任選地通過合成的接頭連接的兩個或更多個分離的CDR的組合。此外，雖然Fv片段的兩個結構域\ 和Vh由分開的基因編碼，但可使用重組方法，通過合成的接頭連接它們，從而使得其能夠產(chǎn)生為其中&和配對形成單價分子的單個蛋白質鏈(稱為單鏈Fv(SCFV)；參見，例如， Bird 等人(1988) Science 242 :423-426 ；和 Huston 等人(1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:5879-5883)。此類單鏈抗體也意欲包括在術語抗體的“抗原結合部分”中。使用本領域技術人員已知的常規(guī)技術獲得此類抗體片段，并且以與對于完整抗體的方式相同的方式就功用性篩選片段。可通過重組DNA技術或通過酶促或化學斷裂完整免疫球蛋白來產(chǎn)生抗原結合部分?？贵w可以是不同同種型的抗體，例如，IgG(例如，IgGl, IgG2，IgG3或IgG4亞型)，IgAl，IgA2，IgD, IgE 或 IgM 抗體。術語“免疫結合劑”是指分子，所述分子包含抗體的全部或部分抗原結合位置，例如重鏈和/或輕鏈可變結構域的全部或一部分，這樣免疫結合劑能夠特異性識別靶抗原。 免疫結合劑的非限定性實例包括全長免疫球蛋白分子和scFv，以及抗體片段，包括但不限于(i)Fab片段，由\、VH、Cl和ChI結構域組成的單價片段；(ii)F(ab' )2片段，包含通過鉸鏈區(qū)上的二硫橋連接的兩個Fab片段的二價片段，(iii)Fab'片段，其基本上是具有鉸鏈區(qū)的一部分的 Fab (參見，F(xiàn)undamentalImmunology (Paul 編輯，3. sup. rd ed. 1993)； (iv)由Vh和ChI結構域組成的Fd片段；(ν)由抗體的單臂的\和Vh結構域組成的Fv片段；(vi)單結構域抗體例如Dab片段(Ward等人，(1989)Nature 341 :544-546)，其由Vh 或八結構域組成，Camelid(參見 Hamers-Casterman 等人，Nature 363 :446-448(1993) 和 Dumoulin 等人，Protein Sciencell :500-515(2002))或 Shark 抗體(例如，shark Ig-NARs NanobodieS )；和(Vii)納米抗體(Nanobody)，包含單個可變結構域和兩個恒定結構域的重鏈可變區(qū)。術語“單鏈抗體”、“單鏈Fv”或“scFv”意指包含通過接頭連接的抗體重鏈可變結構域(或區(qū)域；VH)和抗體輕鏈可變結構域(或區(qū)域；^的分子。此類scFv分子可具有一般結構NH2-Vl_接頭-Vh-COOH或NH2-Vh-接頭-VfCOOH。合適的現(xiàn)有技術接頭由重復的GGGGS 氨基酸序列或其變體組成。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，使用具有SEQ ID No :8中所示的氨基酸序列的(GGGGS)4接頭，但也可使用1-3個重復的變體(Holliger等人(199;3)，PrOC. Natl. Acad. Sci. USA90 :6444-6448)。可用于本發(fā)明的其他接頭由 Alfthan 等人(1995)， Protein Eng. 8 :725-731, Choi 等人 Q001)，Eur. J. Immunol. 31 :94-106, Hu 等人(1996)， Cancer Res. 56 :3055-3061，Kipriyanov 等人(1999)，J. Mol. Biol. 293 :41-56 和 Roovers 等人 0001)，Cancer Immunol.描述。如本文中所使用的，術語“功能性質”是例如為了提高多肽的生產(chǎn)性質或治療功效，其提高(例如相對于常規(guī)多肽)對于本領域技術人員來說是期望的和/或有利的多肽 (例如，免疫結合劑)的性質。在一個實施方案中，功能性質是穩(wěn)定性(例如，熱穩(wěn)定性)。 在另一個實施方案中，功能性質是溶解性(例如，在細胞條件下)。在另一個實施方案中，功能性質是聚集行為。在另一個實施方案中，功能性質是蛋白質表達(例如，在原核細胞中)。 在另一個實施方案中，功能性質是在制造方法中內含體溶解后的重折疊行為。在某些實施
8方案中，功能性質不是抗原結合親和力的提高。在另一個優(yōu)選實施方案中，一個或多個功能性質的改善對免疫結合劑的結合親和力沒有顯著影響。術語“⑶R”是指抗體的可變結構域內主要促成抗原結合的6個高變區(qū)之一。所述 6 個 CDR 的最常用的定義之一由 Kabat Ε. A.等人，(1991) kquences of proteins of immunological interest. NIHPublication 91-3242)提供。如本文中使用的，CDR 的 Kabat 定義只應用于輕鏈可變結構域的⑶R1、⑶R2和⑶R3(⑶R Li、⑶R L2、⑶RL3或L1、L2、L3)， 以及重鏈可變結構域的⑶R2和⑶R3 (⑶R H2、⑶R H3或H2、H3)。然而，如本文中使用的， 根據(jù)下列殘基位置(Kabat編號)定義重鏈可變結構域的CDRl (CDR Hl或Hl)其始于位置 26并且終止于位置36之前。這基本上是由Kabat和Chotia分別定義的⑶R Hl的融合物 (關于示例說明，也參見圖1)。本文中使用的術語“抗體構架”，是指可變結構域VL或VH的一部分，其用作該可變結構域的抗原結合環(huán)(CDR)的支架。從本質上講，其是不具有CDR的可變結構域。術語“表位”或“抗原決定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗體特異性結合的部位 (例如，TNF分子上的特定部位)。表位通常以獨特的空間構象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10， 11，12，13，14或15個連續(xù)或非連續(xù)的氨基酸。參見，例如，Epitope Mapping Protocolsin Methods in Molecular Biology，第 66 卷，G. Ε· Morris，EcL (1996)。術語“特異性結合”、“選擇性結合”、“選擇性地結合”和“特異性地結合”是指抗體對預先確定的抗原上的表位的結合。通常，抗體以大約小于10_7m，例如大約小于10_8M、10_9M 或ΙΟ,Μ或更小的親和力(Kd)結合。術語〃 K/或“Kd”是指特定抗體-抗原相互作用的解離平衡常數(shù)。通常，本發(fā)明的抗體以小于大約1(ΓΜ，例如小于大約10_%、101或KTkiM或更小的解離平衡常數(shù)(Kd)結合TNF，例如，如使用表面等離子體共振(SPR)技術在BIAC0RE儀中測定的。本文中使用的術語“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但優(yōu)選是雙鏈DNA。當將核酸與另一個核酸序列置于功能關系中時，核酸是“有效連接的”。例如，如果啟動子或增強子影響編碼序列的轉錄，那么啟動子或增強子有效地連接至所述編碼序列。術語“載體”是指能夠運輸已與其連接的另一個核酸的核酸分子。在一個實施方案中，載體是“質?！?，其是指可將另外的DNA區(qū)段連接至其中的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。在另一個實施方案中，載體是病毒載體，其中可將另外的DNA區(qū)段連接至病毒基因組中。本文中公開的載體能夠在已引入它們的宿主細胞中自主復制(例如，具有細菌的復制起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)或可在引入宿主細胞后整合入宿主細胞的基因組，從而隨宿主基因組一起復制(例如，非附加型哺乳動物載體)。術語“宿主細胞”是指已向其中引入了表達載體的細胞。宿主細胞包括細菌、 微生物、植物或動物細胞，優(yōu)選大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)；酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、畢赤酵母(Pichia pastoris)、 CHO(中國倉鼠卵巢細胞系)和NSO細胞。術語"兔類動物"是指分類學兔形目(Lagomorpha)的成員，包括兔科 (Leporidae)(例如野兔和兔)和鼠兔科(Ochotonidae)(鼠兔)。在最優(yōu)選實施方案中，兔類動物是兔。本文中使用的術語“兔”是指屬于兔科的動物。
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如本文中所使用的，“同一性”是指兩個多肽、分子之間或兩個核酸之間匹配的序列。當兩個進行比較的序列中的位置都被相同的堿基或氨基酸單體亞單元占據(jù)(例如，如果兩個多肽的每一個中的位置都被賴氨酸占據(jù))時，各個分子在該位置上是同一的。兩個序列之間的“百分數(shù)同一性”是，在考慮為了進行兩個序列的最佳比對而必需引入的缺口的數(shù)目和各缺口的長度的情況下，由這兩個序列共有的同一的位置的數(shù)目的函數(shù)。通常，在將兩個序列進行比對以產(chǎn)生最大同一性時進行比較。這樣的比對可通過使用，例如，已整合入 GCG 軟件包中的 GAP 程序的 Needleman 和 Wunsch (J. Mol. Biol. 48 :444-453 (1970))算法的方法，利用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣以及16，14，12，10，8，6或4的缺口權重和1,2, 3，4，5或6的長度權重來提供。除非另外指出，本文中使用的所有技術和科學術語具有與本發(fā)明所屬領域內的技術人員通常理解的意義相同的意義。雖然與本文中描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可用于本發(fā)明的實踐或試驗中，但下面描述了適當?shù)姆椒ê筒牧稀Ｔ诿艿那闆r下，以本說明書(包括定義)為準。此外，材料、方法和實施例只是舉例說明性的而非限定性的。在下列部分更詳細地描述本發(fā)明的多個方面。應理解，可隨意組合不同實施方案、 參數(shù)和范圍。此外，取決于具體的實施方案，可不使用選擇的定義、實施方案或范圍。如果沒有另外指出，那么按照AHo編號方案標示氨基酸位置。AHo編號系統(tǒng)進一步描述于 Honegger, A.和 Pluckthun, A. (2001) J Mol. Biol. 309 :657-670)中。可選擇地，可使用如在 Kabat 等人(Kabat，E.A.，等人(1991) kquences of Proteins of ImmunologicalInterest,第 5 版，U. S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)中進一步描述的Kabat編號系統(tǒng)。用于確定抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)中氨基酸殘基位置的兩個不同編號系統(tǒng)的換算表提供于A. Honegger, J. Mol. Biol. 309(2001)657-670 中。在第一方面，本發(fā)明提供了用于從其他動物物種例如兔移植CDR的通用受體構架。之前已描述，包含在所謂的“質量控制”篩選(W00148017)中鑒定的人構架的抗體或抗體衍生物的特征在于普遍較高的穩(wěn)定性和/或溶解性。雖然人單鏈構架FWl. 4 (SEQ ID NO 1 (在 W003/097697 中稱為 a4!3)和 SEQ ID NO :2 (在 W003/097697 中稱為 KI27)的組合)在質量控制測定中明顯表現(xiàn)不佳，但令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，其具有固有的高熱力學穩(wěn)定性并且可良好地產(chǎn)生(即便與多種不同⑶R的組合)。該分子的穩(wěn)定性主要歸因于其構架區(qū)。還已顯示FWl. 4本質上可與兔抗體的抗原結合部位高度相容。因此，F(xiàn)Wl. 4代表了用于構建從兔環(huán)的移植衍生的穩(wěn)定的人源化scFv抗體片段的適當支架。因此，在一個方面，本發(fā)明提供了免疫結合劑受體構架，其包含與SEQID No. 1具有至少90%的同一性的VH序列和/或與 SEQ ID No. 2具有至少85%的同一性的VL序列，更優(yōu)選包含用于兔⑶R的移植的FWl. 4的序列(SEQ ID N0:3)，或與 SEQ ID NO 3 具有至少 60%，更優(yōu)選至少 65%，70%，75%，80%， 85%,90%,95%的同一性的序列。此外，已發(fā)現(xiàn)可通過置換FWl. 4的重鏈中的幾個殘基位置和/或通過置換FWl. 4 的輕鏈中的一個位置來優(yōu)化FWl. 4。從而，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，VH中許多種兔⑶R的環(huán)構象可得到完全保持，且很大程度上不依賴于供體構架的序列。FWl. 4的重鏈中的所述殘基以及輕鏈的所述一個位置中的所述殘基在兔抗體中是保守的。從兔庫集推導出重鏈中的位置以及輕鏈中的所述一個位置處的共有殘基并且將其引入人受體構架的序列。
因此，改進的構架1.4(在下文中稱為rFWl. 4)與幾乎任何兔⑶R相容。此外，包含不同兔⑶R的rFWl. 4與兔野生型單鏈相反，可良好地表達和良好地產(chǎn)生，并且仍然幾乎完全保持原始供體兔抗體的親和力。因此，本發(fā)明提供了 SEQ ID No. 1的可變重鏈構架，其還包含通常支持來源于兔免疫結合劑的CDR的構象的一個或多個氨基酸殘基。特別地，所述殘基存在于選自MH，25H， 56扎82!1，84!1，89!1和108!1仏!10編號)的一個或多個氨基酸位置上。已證明這些位置影響 CDR的構象，從而預期用于突變以容納供體CDR。優(yōu)選，所述一個或多個殘基選自位置M 處的蘇氨酸(T)、位置25處的纈氨酸(V)、位置56處的甘氨酸或丙氨酸(G或A)、位置82處的賴氨酸(K)、位置84處的蘇氨酸(T)、位置89處的纈氨酸(V)和位置108處的精氨酸(R) (AHo編號)。優(yōu)選，存在至少3個，更優(yōu)選4、5、6和最優(yōu)選所有7個殘基。令人驚訝地，已發(fā)現(xiàn)所述殘基的存在改善了免疫結合劑的穩(wěn)定性。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供了免疫結合劑受體構架，其包含與SEQ ID No. 4 具有至少50 %，更優(yōu)選至少55 %，60 %，65 %，70 %，75 %，80 %，85 %，90 %，95 %和更優(yōu)選 100%的同一性的VH，前提是存在由位置M處的蘇氨酸(T)、位置25處的纈氨酸(V)、位置 56處的丙氨酸(A)或甘氨酸(G)、位置84處的蘇氨酸(T)、位置82處的賴氨酸(K)、位置89 處的纈氨酸(V)和位置108處的精氨酸(R) (AHo編號)組成的組中的至少1個，更優(yōu)選至少3個，更優(yōu)選至少4、5、6和最優(yōu)選7個殘基。在優(yōu)選實施方案中，免疫結合劑受體構架是兔CDR的免疫結合劑受體構架。在優(yōu)選實施方案中，所述可變重鏈構架是或包含SEQ ID No. 4或SEQ ID No. 6?？蓪蓚€所述可變重鏈構架例如與任何適當?shù)妮p鏈構架組合。因此，本發(fā)明提供了免疫結合劑受體構架，其包含(i)與SEQ ID No. 4具有至少70%的同一性，優(yōu)選至少75%，80%，85%，90%，更優(yōu)選至少95%的同一性的可變重鏈構架；和/或(ii)與 SEQ ID No. 2 具有至少 70% 的同一性，優(yōu)選至少 75%，80%，85%，90%，更優(yōu)選至少95%的同一性的可變輕鏈構架。在非常優(yōu)選的實施方案中，可變重鏈構架包含位置M處的蘇氨酸(T)、位置56處的甘氨酸(G)、位置84處的蘇氨酸(T)、位置89處的纈氨酸(V)和位置108處的精氨酸(R) (AHo編號)。在優(yōu)選實施方案中，可變輕鏈包含位置87處的蘇氨酸(T) (AHo編號)。在優(yōu)選實施方案中，所述免疫結合劑受體構架包含(i)選自 SEQ ID No. 1，SEQ ID No. 4 和 SEQ ID No. 6 的可變重鏈構架；和 / 或(ii)SEQ ID No. 2 或 SEQ ID No. 9 的可變輕鏈構架。在優(yōu)選實施方案中，通過接頭將可變重鏈構架連接至可變輕鏈構架。接頭可以是任何適當?shù)慕宇^，例如包含1至4個重復的序列GGGGS的接頭，優(yōu)選(GGGGS) 4肽(SEQ ID No. 8)，或 Alfthan 等人(1995) Protein Eng. 8 :725-731 中公開的接頭。在另一個優(yōu)選實施方案中，免疫結合劑受體構架是與SEQ ID No. 5具有至少70%， 75%,80%,85%,90%,更優(yōu)選至少95%的同一性的序列，然而所述序列優(yōu)選不是SEQ ID No. 3。更優(yōu)選，免疫結合劑受體構架包含或是SEQ ID No. 5。在另一個優(yōu)選實施方案中，免疫結合劑受體構架是與SEQ ID No. 7具有至少70%，75%,80%,85%,90%,更優(yōu)選至少95%的同一性的序列，然而所述序列優(yōu)選不是SEQ ID No. 3。更優(yōu)選，免疫結合劑受體構架包含或是SEQ ID No. 7。此外，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，上述氨基酸基序的存在使得構架，優(yōu)選人構架特別適合于容納來自其他非人動物物種的CDR特別是兔CDR。所述基序對免疫結合劑的穩(wěn)定性不具有負面影響。CDR以與其在兔免疫結合劑中的天然空間定位相似的構象存在；從而，不必將結構相關位置移植至受體構架上。因此，人或人源化的免疫結合劑受體構架包含由位置M處的蘇氨酸(T)、位置25處的纈氨酸(V)、位置56處的丙氨酸(A)或甘氨酸(G)、位置82處的賴氨酸(K)、位置84處的蘇氨酸(T)、位置89處的纈氨酸(V)和位置108處的精氨酸(R) (AHo編號)組成的組中的至少3個氨基酸、優(yōu)選4、5、6和更優(yōu)選7個氨基酸。本文中所述的免疫結合劑受體構架可在重鏈構架，優(yōu)選在位置12、103和144 (AHo 編號)處包含增強溶解性的置換。優(yōu)選，可用更親水的氨基酸置換疏水性氨基酸。親水性氨基酸是例如精氨酸00，天冬酰胺(N)，天冬氨酸(D)，谷氨酰胺⑴)，甘氨酸(G)，組氨酸 (H)，賴氨酸(K)，絲氨酸( 和蘇氨酸(T)。更優(yōu)選，重鏈構架包含(a)位置12處的絲氨酸 ⑶、(b)位置103處的絲氨酸⑶或蘇氨酸⑴和/或(c)位置144處的絲氨酸⑶或蘇氨酸(T)。此外，增強穩(wěn)定性的氨基酸可存在于可變輕鏈構架的位置1，3，4，10，47，57，91和 103 (AHo編號)中的一個或多個位置上。更優(yōu)選，可變輕鏈構架包含位置1處的谷氨酸(E)、 位置3處的纈氨酸(V)、位置4處的亮氨酸(L)、位置10處的絲氨酸( 、位置47處的精氨酸 (R)、位置57處的絲氨酸( 、位置91處的苯丙氨酸(F)和/或位置103處的纈氨酸(V)。由于谷氨酰胺(Q)易于脫氨，因此在另一個優(yōu)選實施方案中，VH在位置141處包含甘氨酸(G)。該置換可改善蛋白質的長期貯存。例如，本文中公開的受體構架可用于產(chǎn)生人或人源化抗體，所述抗體保持非人CDR 所源自的非人抗體的結合性質。因此，在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明包括本文中公開的免疫結合劑受體構架，所述免疫結合劑受體構架還包括來自供體免疫結合劑，優(yōu)選來自哺乳動物免疫結合劑，更優(yōu)選來自兔類動物免疫結合劑和最優(yōu)選來自兔免疫結合劑的重鏈CDRl， ⑶R2和⑶R3和/或輕鏈⑶R1，⑶R2和⑶R3。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了特異于期望的抗原的免疫結合劑，其包含(i)兔類動物的可變輕鏈⑶R ；和(ii)與 SEQ ID NO. 4 具有至少 50 %，更優(yōu)選至少 55 %，60 %，65 %，70 %，75 %， 80%,85%,90%, 95 %和最優(yōu)選100 %的同一性的人可變重鏈構架。在一個優(yōu)選實施方案中，存在前提條件由位置M處的蘇氨酸(T)、位置25處的纈氨酸(V)、位置56處的丙氨酸(A)或甘氨酸(G)、位置84處的蘇氨酸(T)、位置82處的賴氨酸(K)、位置89處的纈氨酸(V)和位置108處的精氨酸(R) (AHo編號)組成的組中的至少一個氨基酸存在于所述人可變重鏈構架序列中。優(yōu)選，兔類動物是兔。更優(yōu)選，免疫結合劑包含來自供體免疫結合劑的重鏈CDR1， CDR2 和 CDR3 以及輕鏈 CDRl，CDR2 和 CDR3。如本領域中已知的，許多兔VH鏈具有相對于鼠和人對應物的額外配對的半胱氨酸。除了 cys22與cys92之間形成的保守二硫橋外，在一些兔鏈中還存在cyS21-cyS79橋以及在⑶R Hl的最后一個殘基與⑶R H2的第一個殘基之間形成的⑶R間S-S橋。除此以
12外，半胱氨酸殘基對通常見于⑶R-L3中。此外，許多兔抗體⑶R不屬于任何之前已知的經(jīng)典結構。特別地，⑶R-L3通常比人或鼠對應物的⑶R-L3長得多。如之前所述，非人CDR至本文中描述的構架的移植產(chǎn)生了其中以恰當?shù)臉嬒笳故?CDR的分子。需要時，可通過移植非人供體免疫結合劑的抗原相互作用構架殘基來提高免疫結合劑的親和力。此類位置可以例如通過下列方法來鑒定(i)鑒定各自的種系祖先序列，或可選擇地，在高度同源的構架序列的情況下通過使用共有序列；(ii)產(chǎn)生供體可變結構域序列與步驟(i)的種系祖先序列或共有序列的序列比對；和(iii)鑒定相異的殘基。在許多情況下在體內親和力產(chǎn)生過程中，分子表面上的相異殘基被突變，從而可能產(chǎn)生對抗原的親和力。在另一個方面，本發(fā)明提供了包含本文中所述的免疫結合劑受體構架的免疫結合劑。所述免疫結合劑可以是例如scFv抗體、全長免疫球蛋白、Fab片段、Dab或納米抗體。在優(yōu)選實施方案中，將免疫結合劑連接至一個或多個分子，例如治療劑例如細胞毒性劑、趨化因子、生長因子或其他信號轉導分子，成像劑或第二蛋白質例如轉錄激活因子或DNA結合結構域。本文中公開的免疫結合劑可以例如用于診斷應用、治療應用、靶標確認或基因治療。本發(fā)明還提供了編碼本文中公開的免疫結合劑受體構架或本文中公開的免疫結合劑的分離的核酸。在另一個實施方案中，提供了包含本文中公開的核酸的載體?？衫鐚⒈疚闹泄_的核酸或載體用于基因治療。本發(fā)明還包括包含本文中公開的載體和/或核酸的宿主細胞。此外，提供了包含本文中公開的免疫結合劑受體構架、本文中公開的免疫結合劑、 本文中公開的分離的核酸或本文中公開的載體的組合物。本文中公開的序列如下(X殘基是⑶R插入位置)SEQ ID NO. 1 :FW1. 4 的可變重鏈構架(a43)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (X) n = ^50WVRQAPGKGLEffVS (X) n = ^50RFT ISRDNSKNTLYL QMNSLRAEDTAVYYCAK (X) n = ^WGQGTLVTVSSSEQ ID NO. 2 :FW1. 4 的可變輕鏈構架(KI27)EIVMTQSPSTLSASV ⑶ RVIITC (X) n = ^WYQQKPGKAPKLLIY (X) n = ^50GVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYC (X) n = ^FGQGTKLT VLGSEQ ID NO. 3 :FW1. 4 的構架EIVMTQSPSTLSASV ⑶ RVIITC (X) n = ^WYQQKPGKAPKLLIY (X) n = ^50
GVPSRFSGSGSGAEFTLT I SSLQPDDFATYYC (X) n = ^FGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(X)n = ^50WVRQAPGKGLEffVS (X) n = ^50RFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK (X) n = hqWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO. 4 :rFffl. 4 的可變重鏈構架EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTAS(X)n =卜邪WVRQAPGKGLEffVG (X) n = ^50RFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (X) n = ^soffGQGTLV TVSSSEQ ID NO. 5 :rFffl. 4 的構架EIVMTQSPSTLSASV ⑶ RVIITC (X) n = ^WYQQKPGKAPKLLIY (X) n = ^50
GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC (X) n = ^FGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTAS(X)n = ^50WVRQAPGKGLEffVG (X) n = ^50RFT ISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (X) n = ^WGQGTLVTVSSSEQ ID NO. 6 :rFffl. 4(V2)的可變重鏈構架EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVS (X) n = ^50WVRQAPGKGLEffVG (X) n = ^50RFTISKDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (X) n = ^WGQGTLVTVSSSEQ ID NO. 7 :rFffl. 4(V2)的構架EIVMTQSPSTLSASV ⑶ RVIITC (X) n = ^WYQQKPGKAPKLLIY (X) n = ^50GVPSRFSGSGSGTEFTLT I SSLQPDDFATYYC (X) n = ^FGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVS(X)n = ^50WVRQAPGKGLEffVG (X) n = ^50RFT ISKDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (X) n = ^WGQGTLVTVSSSEQ ID NO. 8:接頭GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSEQ ID NO. 9 :FW1. 4的經(jīng)置換的可變輕鏈構架EIVMTQSPSTLSASV ⑶ RVIITC (X) n = ^WYQQKPGKAPKLLIY (X) n = ^50GVPSRFSGSGSGTEFTLT I SSLQPDDFATYYC (X) n = ^FGQGTKLTVLG在另一個方面，本發(fā)明提供了通過將非人供體抗體的CDR移植至穩(wěn)定和可溶的抗體構架來人源化非人抗體的方法。在特別優(yōu)選的實施方案中，來自兔抗體的CDR和所述構架是上述⑶R和構架。用于將⑶R移植入人受體構架的一般方法已由Winter在美國專利5，225，539中和由Queen等人在W09007861 Al (其以其全文通過引用合并入本文)中公開。用于將來自兔單克隆抗體的CDR移植入選擇的構架的一般策略與Winter等人和Queen等人的策略相關，但在某些關鍵方面有分歧。特別地，本發(fā)明的方法與本領域內已知的典型的Winter和 Queen的方法相異在于，本文中公開的人抗體構架特別適合作為人或非人供體抗體的通用受體。因此，與Winter和Queen的一般方法不同，用于本發(fā)明的人源化方法的構架序列不必是展示與供體CDR所源自的非人(例如，兔)抗體的序列的最大序列相似性的構架序列。 此外，不需要從供體序列移植構架殘基來支持CDR構象。至多，可引入位于構架中的抗原結合氨基酸或在體細胞高突變期間產(chǎn)生的其他突變。下面描述產(chǎn)生具有高溶解性和穩(wěn)定性的人源化兔源抗體的移植方法的具體內容。因此，本發(fā)明提供了人源化兔CDR供體免疫結合劑的方法，所述免疫結合劑包含重鏈⑶R1，⑶R2和⑶R3序列和/或輕鏈⑶R1，⑶R2和⑶R3序列。所述方法包括步驟
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(i)將由⑶R1、⑶R2和⑶R3序列組成的組中的至少1個，優(yōu)選2個，更優(yōu)選3個 ⑶R移植入重鏈上的人重鏈受體構架，所述受體構架與SEQ ID NO :1具有至少50%，優(yōu)選至少 55%，60%，65%，70%，75%，80%，85%，90%，更優(yōu)選至少 95% 的同一性；和 / 或(ii)將由⑶R1、⑶R2和⑶R3序列組成的組中的至少1個，優(yōu)選2個，更優(yōu)選3個 ⑶R移植入輕鏈上的人輕鏈受體構架，所述人輕鏈構架與SEQ ID NO: 2具有至少50%，優(yōu)選至少 55%，60%，65%，70%，75%，80%，85%，90%，更優(yōu)選至少 95% 的同一性。在優(yōu)選實施方案中，可變鏈受體構架包含(i)包含選自SEQ IDNO :1,SEQ ID NO 4和SEQ ID NO :6的構架氨基酸序列的人重鏈構架和(ii)包含SEQ ID NO :2或SEQ ID NO: 9的構架氨基酸序列的人輕鏈構架。在非常優(yōu)選的實施方案中，所述方法包括步驟(i)將重鏈⑶R1、⑶R2和⑶R3序列移植入免疫結合劑重鏈和(ii)將輕鏈CDRl、CDR2和CDR3序列移植入免疫結合劑輕鏈， 所述免疫結合劑與 SEQ ID No. 3,SEQ ID No. 5 或 SEQ ID No. 7 具有至少 75%，80%，85%， 90%，更優(yōu)選至少95%的同一性。更優(yōu)選，免疫結合劑是或包含SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 5 或 SEQ ID No. 7。在另一個實施方案中，為了改善抗原結合，所述方法還可包括用參與抗原結合的供體殘基置換受體構架殘基的步驟。在本發(fā)明的方法的示例性實施方案中，首先鑒定CDR供體抗體的氨基酸序列，然后使用常規(guī)序列比對工具(例如，Needleman-Wunsch算法和Blossum矩陣)比對序列?？墒褂贸Ｒ?guī)抗體編號系統(tǒng)進行缺口的引入和殘基位置的命名。例如，可使用用于免疫球蛋白可變結構域的AHo編號系統(tǒng)。還可使用Kabat編號系統(tǒng)，因為其是用于編號抗體中的殘基的最廣泛采用的標準?？衫缡褂肧UBIM程序分配Kabat編號。該程序分析抗體序列的可變區(qū)且按照由Kabat和同事(Deret等人1995)建立的系統(tǒng)給序列編號。通常按照基于序列的變異性的最常用的Kabat定義來進行構架和CDR區(qū)的界定。然而，對于CDR-H1，命名優(yōu)選是Kabat定義，通過分析一組3D復合物結構的抗體與抗原之間的接觸而產(chǎn)生的平均接觸數(shù)據(jù)(MacCallum等人，1996)和基于結構環(huán)區(qū)域的位置的Chotia' s定義的組合(也參見圖 1)。用于確定抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)中的氨基酸殘基位置的兩個不同編號系統(tǒng)的換算表提供于 A. Honegger, J. Mol. Biol. 309 (2001) 657-670 中。Kabat 編號系統(tǒng)進一步描述于 Kabat 等人(Kabat, Ε· A.,等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，U. S. Department of Health and Human Services,NIH Publication No. 91-3242)中。 AHo 編號系統(tǒng)進一步描述于 Honegger，Α.和 Pluckthun，A. (2001) JMol. Biol. 309 :657-670) 中?？墒褂美缧蛄蟹治鏊惴ê头诸惙椒ǖ腅XCEL工具，基于人抗體庫的分析 (Knappik等人，2000，J Mol Biol. Feb 11 ；296(1) :57-86)將兔單克隆抗體的可變結構域例如分類至相應的人亞組?？蓪ⅱ荝構象分配至供體抗原結合區(qū)，然后還可鑒定維持不同經(jīng)典結構所需的殘基位置。使用Chothia' s (1989)定義確定兔抗體的6個抗體高變區(qū)中的5個(L1、L2、L3、 Hl和H2)的⑶R經(jīng)典結構。在優(yōu)選實施方案中，按照下列方法產(chǎn)生、鑒定和分離CDR:將B細胞，優(yōu)選兔B細胞 (i)與靶抗原(優(yōu)選純化的)或(ii)與在其表面上表達靶抗原的細胞一起溫育。
在(ii)的情況下，表達靶抗原的所述細胞可以例如是天然表達選擇的靶或經(jīng)轉化在它們的表面上表達靶蛋白的哺乳動物細胞，優(yōu)選CHO或HEK293細胞，酵母細胞，優(yōu)選酵母球芽(spheroblast)或細菌細胞。當表達時，靶抗原可以以整合入或連接至細胞膜的形式在細胞表面上表達。可以例如以分離的株系在細胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)細胞，或可從其天然環(huán)境例如組織、器官或生物體分離所述細胞。靶抗原在細胞的表面上表達，即情況(ii)，對于跨膜蛋白是特別優(yōu)選的，對于多次跨膜蛋白例如GPCR(G蛋白偶聯(lián)受體)或離子通道或其天然構象在重組表達和純化后難以維持的任何其他蛋白是更優(yōu)選的。使用重組蛋白的常規(guī)免疫在這些情況下由于在純化過程中丟失完整膜蛋白/復合物的天然構象或由于純蛋白的量不足而不適宜或不可能。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，用DNA而非重組蛋白，例如通過W0/2004/087216中公開的DNA接種方案免疫哺乳動物，更優(yōu)選兔。DNA接種誘導快速的抗天然抗原的免疫應答。因為不需要重組蛋白，因此該技術一方面非常節(jié)約成本，另一方面，更重要地，該方法允許完整膜復合物和/或多次跨膜的膜蛋白的天然表達?？蓮乃鲆衙庖叩膭游?，優(yōu)選所述兔分離B細胞，或可選擇地B細胞是稚B細胞(naiveB-cell)。在所述方法的隨后步驟中，從已免疫的動物(優(yōu)選已免疫的兔)的淋巴器官(例如脾或淋巴結)分離B細胞，優(yōu)選記憶B細胞。將B細胞與在其表面上表達抗原的細胞或與熒光標記的可溶性抗原混合溫育。分離在其表面上表達靶特異性抗體并且因此結合靶抗原或在細胞表面上表達的靶抗原的B細胞。在非常優(yōu)選的實施方案中，對B細胞和/或靶細胞進行染色以允許通過基于流式細胞術的分選術分離B細胞/靶細胞或B細胞/抗原復合物。流式細胞術通常測量由單個細胞(當其穿過激光束時)發(fā)射的熒光。然而，一些研究者已使用細胞計數(shù)器來研究細胞-細胞相互作用，例如，由鈣粘蛋白(Panorchan等人，2006， J.Cell Science, 119,66-74 ；Leong et Hibma，2005，J. Immunol. Methods，302，116-124)或整聯(lián)蛋白(Gawaz等人，1991，J.Clin. Invest, 88,1128-1134)介導的粘著。因此，在(ii)的情況下，用胞內熒光染料(例如鈣黃綠素)染色表達選擇的靶的細胞。用結合細胞表面特異性標志物的熒光抗體染色B細胞。因此，可選擇包含通過B細胞受體-靶相互作用彼此粘著的兩個細胞的雙色“事件”(參見圖2)。由于IgG通常具有比IgM更高的親和力，因此優(yōu)選選擇在其表面上表達IgG而非 IgM(這是記憶B細胞的特征)的陽性B細胞。為了所述目的，優(yōu)選使用多色染色，其中例如分別用APC和FITC差異標記特異于IgG和IgM的抗體。在一個特定的實施方案中，B細胞分選的讀出還可選擇該相互作用功能性阻斷/ 激活受體信號轉導的能力。例如，可將B細胞與功能性表達GPCR(G蛋白偶聯(lián)受體)的細胞一起溫育?？上蚧旌衔镏屑尤胪ㄟ^GPCR發(fā)出信號的激動劑以誘導GPCR介導的Ca2+從內質網(wǎng)流出。如果存在于B細胞上的抗體功能性阻斷激動劑的信號轉導，那么Ca2+流出也將被該細胞間相互作用阻斷?？墒褂昧魇郊毎g定量測量Ca2+流出。因此，只有顯示Ca2+ 流出的增加或減少的B細胞/靶細胞聚集物可被分選。在選擇步驟之后，在適當?shù)臈l件下培養(yǎng)B細胞以使抗體能夠分泌入培養(yǎng)基。產(chǎn)生的抗體是單克隆抗體。培養(yǎng)可包括使用輔助細胞系例如胸腺瘤輔助細胞系(例如EL4-B5， 參見Zubler等人，1985，J. Immunol.，134(6) :3662-3668)。優(yōu)選，進行驗證步驟以就對靶的特異性結合測試產(chǎn)生的抗體，例如以排除抗除靶蛋白外的在細胞表面上表達的蛋白質
16的抗體。例如，其中使用完整細胞進行包被步驟的CELISA(即改進的酶聯(lián)免疫吸附測定 (ELISA))適合用于所述目的。所述方法允許估量抗體與配體競爭的能力和選擇性。然后分析上述步驟中產(chǎn)生的抗體以鑒定所述抗體的⑶R。這可包括步驟例如純化抗體、闡明其氨基酸序列和/或核酸序列。最后，可以例如通過使用寡核苷酸延伸法的基因合成將⑶R移植入受體構架，優(yōu)選上述受體構架。在一個實施方案中，本領域公認的CDR移植方法可用于將供體CDR移植入受體構架。在大多數(shù)情況下，將來自重鏈的所有3個CDR從供體抗體移植至單個受體構架和將來自輕鏈的所有3個CDR移植至不同受體構架。預期不應當總是必需移植所有CDR，因為一些CDR可能不參與對抗原的結合，并且具有不同序列(和相同長度)的CDR可具有相同的折疊(從而盡管序列不同，抗原接觸至主鏈接觸可得到保持)。事實上單個結構域(Ward等人，1989，Nature 341，pp. 544-546)或甚至單個 CDR(R. Taub 等人，1989，J. BiolChem 264, pp. 259-265)單獨可具有抗原結合活性。然而，無論是移植所有⑶R還是只移植一些⑶R， CDR移植的意圖是將相同或更確切地相同的抗原結合部位從動物移植至人抗體(參見，例如，美國專利 5，225，539 (Winter)) ο在另一個實施方案中，可在它們整合入受體構架之前或之后改變供體抗體的CDR?？蛇x擇地，只在其終免疫結合劑形式中進行抗體的表征。為了進行該方法，可通過 RT-PCR從培養(yǎng)的分選的B細胞或直接從單個分選的B細胞得到在分選的B細胞上表達的抗體的CDR序列。為了所述目的，B細胞的增殖和/或上述驗證步驟和/或上述分析步驟可能不是必須的。其中一個寡核苷酸庫編碼CDR并且第二庫編碼適當?shù)拿庖呓Y合劑支架的構架區(qū)的部分重疊的寡核苷酸的兩個庫的組合允許在一步PCR中產(chǎn)生人源化免疫結合劑。高通量測序、克隆和生產(chǎn)允許基于純化的人源化免疫結合劑的性能進行克隆選擇，而不表征細胞培養(yǎng)上清液中分泌的IgG。因此在優(yōu)選實施方案中，免疫結合劑是scFv。然而，CDR的移植可由于與抗原接觸的構架殘基而導致產(chǎn)生的免疫結合劑對抗原的親和力減弱。此類相互作用可以是體細胞高度突變的結果。因此，可能仍然需要將此類供體構架氨基酸移植至人源化抗體的構架。來自非人免疫結合劑的參與抗原結合的氨基酸殘基可通過檢查兔單克隆抗體可變區(qū)序列和結構來鑒定。CDR供體構架中與種系不同的的各殘基可被認為是相關的。如果不能確定最接近的種系，那么可將序列與亞型共有序列或具有高相似性百分數(shù)的兔序列的共有序列相比較。稀有構架殘基被認為可能是體細胞高度突變的結果，從而在結合中起著重要作用。還可進一步優(yōu)化本發(fā)明的抗體以顯示增強的功能性質例如增強的溶解性和 /或穩(wěn)定性。在某些實施方案中，按照2008年3月12日提交的PCT申請系列號PCT/ EP2008/001958 (名禾爾為〃 Sequence Based Engineering and Optimization of Single Chain Antibodies"，其通過引用合并入本文)中公開的“功能共有序列”方法優(yōu)化本發(fā)明的抗體。例如，可將本發(fā)明的免疫結合劑與功能性選擇的scFv的數(shù)據(jù)庫進行比較以鑒定比免疫結合劑中的相應位置更耐受變異性或更不耐受變異性的氨基酸殘基位置，從而表明此類鑒定的殘基位置可適合用于改造以改善功能性例如穩(wěn)定性和/或溶解性。用于置換的示例性構架殘基位置和示例性構架置換描述于2008年6月25日提交的 PCT 申請 PCT/CH2008/000285 (名稱為〃 Methods of Modifying Antibodies,
17and Modified Antibodies with Improved Functional Properties")禾口 2008 年 6 月 25 日提交的 PCT 申請 PCT/CH2008/00(^84(名稱為〃 kquence Based Engineering and Optimization of Single Chain Antibodies")中。例如，可在本發(fā)明的免疫結合劑的重鏈可變區(qū)中在氨基酸位置(對于下文列出的每一個氨基酸位置參照AHo編號)上引入一個或多個下列置換(a)氨基酸位置1處的Q或E ；(b)氨基酸位置6處的Q或E ；(c)氨基酸位置7處的T、S或A，更優(yōu)選T或A，更優(yōu)選T ；(d)氨基酸位置10處的A、T、P、V或D，更優(yōu)選T、P、V或D，(e)氨基酸位置12處的L或V，更優(yōu)選L，(f)氨基酸位置13處的V、R、Q、M或K，更優(yōu)選V、R、Q或M，(g)氨基酸位置14處的R，M，E，Q或K，更優(yōu)選R，M，E或Q，更優(yōu)選R或E ；(h)氨基酸位置19處的L或V，更優(yōu)選L ；(i)氨基酸位置20處的R，T，K或N，更優(yōu)選R，T或N，更優(yōu)選N ；(j)氨基酸位置21處的1，？，1^或￥，更優(yōu)選1，？或1^，更優(yōu)選1或1^;(k)氨基酸位置45處的R或K，更優(yōu)選K ；(1)氨基酸位置47處的T，P，V，A或R，更優(yōu)選T，P、V或R，更優(yōu)選R ；(m)氨基酸位置50處的K，Q、H或E，更優(yōu)選K、H或E，更優(yōu)選K ；(η)氨基酸位置55處的M或I，更優(yōu)選I ；(ο)氨基酸位置77處的K或R，更優(yōu)選K ；(ρ)氨基酸位置78處的Α、V、L或I，更優(yōu)選A、L或I，更優(yōu)選A ；(q)氨基酸位置82處的E，R，T或A，更優(yōu)選E，T或A，更優(yōu)選Ε;(r)氨基酸位置86處的T，S，I或L，更優(yōu)選T，S或L，更優(yōu)選Τ;(s)氨基酸位置87處的D，S，N或G，更優(yōu)選D，N或G，更優(yōu)選N;(t)氨基酸位置89處的A，V，L或F，更優(yōu)選A，V或F，更優(yōu)選V;(u)氨基酸位置90處的F，S，H，D或Y，更優(yōu)選F，S，H或D ；(ν)氨基酸位置92處的D，Q或E，更優(yōu)選D或Q，更優(yōu)選D ；(w)氨基酸位置95處的G，N，T或S，更優(yōu)選G，N或T，更優(yōu)選G ；(χ)氨基酸位置98處的Τ，Α，P，F(xiàn)或S，更優(yōu)選Τ，Α，P或F，更優(yōu)選F ；(y)氨基酸位置103處的R，Q，V，I、M，F(xiàn)或L，更優(yōu)選R，Q，I，M，F(xiàn)或L，更優(yōu)選Y， 更優(yōu)選L ；和(ζ)氨基酸位置107處的N，S或Α，更優(yōu)選N或S，更優(yōu)選N。另外地或可選擇地，可將一個或多個下列置換引入本發(fā)明的免疫結合劑的輕鏈可變區(qū)(aa)氨基酸位置1處的Q，D，L，E，S或I，更優(yōu)選L，E，S或I，更優(yōu)選L或E ；(bb)氨基酸位置2處的S，A，Y，1，？或1\更優(yōu)選々，￥，I，P或T，更優(yōu)選P或T ；(cc)氨基酸位置3處的Q，V，T或I，更優(yōu)選V，T或I，更優(yōu)選V或T ；(dd)氨基酸位置4處的V，L，I或M，更優(yōu)選V或L ；(ee)氨基酸位置7處的S，E或P，更優(yōu)選S或E，更優(yōu)選S ；
(ff)氨基酉射立置10處的T或I，更優(yōu)選I ；
(gg)氨基酉射立置11處的A或V，更優(yōu)選A ；
(hh)氨基酉射立置12處的S或Y，更優(yōu)選Y;
(ii)氨基酉射立置14處的T，S或A，更優(yōu)選T或S，更優(yōu)選T ；
(jj)氨基酉射立置18處的S或R，更優(yōu)選S;
(kk)氨基酉射立置20處的T或R，更優(yōu)選R ；
(11)氨基酉射立置M處的R或Q，更優(yōu)選Q ；
(mm)氨基酉射立置46處的H或Q，更優(yōu)選H;
(nn)氨基酉射立置47處的K，R或I，更優(yōu)選R或I，更優(yōu)選R ；
(OO)氨基酉射立置50 處的 R，Q，K，E，T 或 M，更優(yōu)選 Q，K，E，T 或 M ；
(PP)氨基酉射立置53 處的 K，T，S，N，Q 或 P，更優(yōu)選 T，S，N，Q 或 P ；
(qq)氨基酉射立置56處的I或M，更優(yōu)選M ；
(rr)氨基酉射立置57處的H，S，F(xiàn)或Y，更優(yōu)選H，S或F ；
(SS)氨基酉射立置74處的1，￥或1\更優(yōu)選￥或1\札更優(yōu)選丁；
(tt)氨基酉射立置82處的R，Q或K，更優(yōu)選R或Q，更優(yōu)選R ；
(UU)氨基酉射立置91處的L或F，更優(yōu)選F;
(VV)氨基酉射立置92處的G，D，T或A，更優(yōu)選G，D或T，更優(yōu)選T ；
(XX)氨基酉射立置94處的S或N，更優(yōu)選N;
(yy)氨基酉射立置101處的F，Y或S，更優(yōu)選Y或S，更優(yōu)選S ；和
(ZZ)氨基酉射立置103 處的 D，F(xiàn)，H，E，L，A，T，V、S，G 或 I，更優(yōu)選 H，E，L，A，T，V,S，G或[，更優(yōu)選A或V。
在其他實施方案中，本發(fā)明的免疫結合劑包含一個或多個2008年6月25日
提交的美國臨時申請系列號61/075，692 (名稱為"Solubility Optimization of Immunobinders")中描述的穩(wěn)定性增強突變。在某些優(yōu)選實施方案中，免疫結合劑在選自由12、103和144 (AHo編號約定)組成的重鏈氨基酸位置的氨基酸位置處包含溶解性增強突變。在一個優(yōu)選實施方案中，免疫結合劑包含一個或多個選自下列的置換(a)重鏈氨基酸位置12處的絲氨酸(S) ； (b)重鏈氨基酸位置103處的絲氨酸( 或蘇氨酸(T)；和(c) 重鏈氨基酸位置144處的絲氨酸( 或蘇氨酸(T)。在另一個實施方案中，免疫結合劑包含下列置換(a)重鏈氨基酸位置12處的絲氨酸(S) ； (b)重鏈氨基酸位置103處的絲氨酸 ⑶或蘇氨酸⑴；和(c)重鏈氨基酸位置144處的絲氨酸⑶或蘇氨酸⑴。在某些優(yōu)選實施方案中，免疫結合劑在根據(jù)AHo編號系統(tǒng)的輕鏈可變區(qū)的位置1， 3,4,10,47,57,91和103中的至少一個位置處的輕鏈受體構架的構架殘基上包含穩(wěn)定性增強突變。在優(yōu)選實施方案中，輕鏈受體構架包含一個或多個置換，所述置換選自(a)位置1 處的谷氨酸(E)、(b)位置3處的纈氨酸(V)、(c)位置4處的亮氨酸(L)、(d)位置10處的絲氨酸⑶、(e)位置47處的精氨酸(R)、(e)位置57處的絲氨酸⑶、(f)位置91處的苯丙氨酸(F)和(g)位置103處的纈氨酸(V)?？墒褂迷S多可獲得的方法中的任何方法產(chǎn)生包含上述突變的人源化抗體。因此，本發(fā)明的提供了按照本文中描述的方法人源化的免疫結合劑。在某些優(yōu)實施方案中，所述免疫結合劑的靶抗原是VEGF或TNF α。
本發(fā)明中描述的或通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的多肽可以例如使用本領域內已知的技術合成?？蛇x擇地，可通過重組方法來合成編碼期望的可變區(qū)的核酸分子和產(chǎn)生多肽。例如，一旦已確定人源化的可變區(qū)的序列，可通過分子生物學領域內熟知的技術制備包含其的可變區(qū)或多肽。更具體地，可使用重組DNA技術，通過用核酸序列(例如，編碼期望的可變區(qū)(例如，改進的重鏈或輕鏈；其可變結構域或其的其他抗原結合片段)的DNA 序列)轉化宿主細胞來產(chǎn)生多種多肽。在一個實施方案中，可制備包含與編碼至少Vh或Vl的DNA序列有效連接的啟動子的表達載體。必要時或需要時，可制備第二表達載體，所述載體包含與編碼互補可變結構域的DNA序列有效連接的啟動子(即，其中親本表達載體編碼Vh，第二表達載體編碼\，反之亦然)。然后可用一個或兩個表達載體轉化細胞系(例如，永生化的哺乳動物細胞系)，并在允許嵌合可變結構域或嵌合抗體表達的條件下培養(yǎng)所述細胞(參見，例如，Neuberger等人的國際專利申請PCT/GB85/00392)。在一個實施方案中，可制備包含供體CDR和受體FR氨基酸序列的可變區(qū)，然后可將變化引入核酸分子以進行CDR氨基酸置換。用于制備編碼多肽的的氨基酸序列變體的核酸分子的示例性本領域公認的方法包括但不限于，通過早期制備的編碼多肽的DNA的定點(或寡核苷酸介導的)誘變、PCR誘變和盒式誘變進行的制備。定點誘變是用于制備置換變體的優(yōu)選方法。該技術在本領域內是熟知的(參見， 例如，Carter 等人 Nucleic Acids Res. 13 :4431-4443(1985)和 Kunkel 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 :488 (1987))。簡而言之，在進行DNA的定點誘變時，通過首先將編碼期望的突變的寡核苷酸與這樣的親本DNA的單鏈雜交來改變親本DNA。雜交后，使用雜交的寡核苷酸作為引物并且使用親本DNA的單鏈作為模板，將DNA聚合酶用于合成完整第二鏈。從而，將編碼期望的突變的寡核苷酸整合入所得的雙鏈DNA。PCR誘變也適合用于制備多肽的氨基酸序列變體。參見Higuchi，in PCR Protocols, pp. 177-183(Academic Press,1990)；禾口 Vallette ·入，Nuc. Acids Res. 17 723-733 (1989)。簡而言之，當將少量模板DNA在PCR中用作起始材料時，可將在序列上與模板DNA中的相應區(qū)域略微不同的引物用于產(chǎn)生相對大量的特定DNA片段，所述DNA片段只在其中弓丨物與模板不同的位置處與模板序列不同。用于制備變體的另一個方法盒式誘變基于由Wells等人，Gene34 :315-323(1985) 描述的技術。起始材料是包含待突變的DNA的質粒(或其他載體)。確定待突變的親本DNA 中的密碼子。在鑒定的突變位置的每一側都必須存在獨特的限制性內切核酸酶位點。如果不存在這樣的限制性位點，那么可通過使用上述寡核苷酸介導的誘變法將其引入編碼多肽的DNA中的適當位置處來產(chǎn)生它們。在這些位置切割質粒DNA以使之線性化。使用標準方法合成編碼位于限制性位點之間但包含期望的突變的DNA序列的雙鏈寡核苷酸，其中分開合成寡核苷酸的兩條鏈，然后使用標準技術將其雜交在一起。該雙鏈寡核苷酸稱為盒。該盒經(jīng)設計具有與線性化的質粒的末端相容的5'和3'末端，以便其可直接連接至質粒。該質?，F(xiàn)包含突變的DNA序列?？筛脑觳⑶疫M一步改變通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的可變區(qū)以進一步增加抗原結合。 因此，可進行上述步驟或然后進行另外的步驟，包括親和力成熟。此外，可將經(jīng)驗結合數(shù)據(jù)用于進一步優(yōu)化。本領域技術人員將理解，可進一步改造本發(fā)明的多肽以便其在氨基酸序列上但不在期望的活性上產(chǎn)生變化。例如，可對蛋白質進行導致在“非必需”氨基酸殘基處的氨基酸置換的另外的核苷酸置換。例如，可用來自相同側鏈家族的另一種氨基酸殘基置換免疫球蛋白多肽中的非必需氨基酸殘基。在另一個實施方案，可用結構相似的、在側鏈家族成員的組成和/或順序上不同的串(string)替代氨基酸的串，即可產(chǎn)生其中用具有相似側鏈的氨基酸殘基替代氨基酸殘基的保守置換。已在本領域內定義了具有相似側鏈的氨基酸殘基的家族，包括堿性側鏈(例如， 賴氨酸、精氨酸和組氨酸)、酸性側鏈(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側鏈(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側鏈(例如， 丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分支側鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。除了氨基酸置換以外，本發(fā)明還涉及其他修飾，例如對Fc區(qū)氨基酸序列的修飾以產(chǎn)生具有改變的效應子功能的Fc區(qū)變體?？梢岳缛笔c區(qū)的一個或多個氨基酸殘基以削弱或增強對FcR的結合。在一個實施方案，可修飾一個或多個Fc區(qū)殘基以產(chǎn)生這樣的Fc 區(qū)變體。通常，按照本發(fā)明的該實施方案，缺失不超過1至大約10個Fc區(qū)殘基。本文中包含一個或多個氨基酸缺失的Fc區(qū)將優(yōu)選保持至少大約80%，優(yōu)選至少大約90%和最優(yōu)選至少大約95%的起始Fc區(qū)或天然序列人Fc區(qū)。還可制備氨基酸插入Fc區(qū)變體，所述變體具有改變的效應子功能。例如，可在與本文中鑒定為影響FcR結合的一個或多個Fc區(qū)位置相鄰的位置處引入至少一個氨基酸殘基(例如1至2個氨基酸殘基和通常不超過10個殘基)?！跋噜彙币庵冈诒疚闹需b定的Fc 區(qū)殘基的1至2個氨基酸殘基內。此類Fc區(qū)變體可展示增強的或減弱的Fcfoi結合。此類Fc區(qū)域變體通常將在Fc區(qū)域包含至少一個氨基酸修飾。在一個實施方案中， 可組合氨基酸修飾。例如，變異的Fc區(qū)可包括2、3、4、5個等本文中的置換，例如本文中鑒定的特定Fc區(qū)位置的置換。在另一個實施方案中，多肽可具有改變的對Fcfoi或對另一個 Fc受體的結合。在一個實施方案中，本發(fā)明中描述的或通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的多肽例如人源化 Ig可變區(qū)和/或包含人源化Ig可變區(qū)的多肽可通過重組方法產(chǎn)生。例如，可將編碼多肽的多核苷酸序列插入適當?shù)谋磉_載體中以進行重組表達。在多肽是抗體的情況下，可將編碼另外的輕鏈和重鏈可變區(qū)(任選地連接至恒定區(qū))的多核苷酸插入相同或不同的表達載體?？扇芜x地將親和標簽序列(例如His (6)標簽)連接至多肽序列或包含在所述序列中以幫助下游純化。將編碼免疫球蛋白鏈的DNA區(qū)段有效地連接至表達載體的控制序列，所述控制序列確保免疫球蛋白多肽的表達。表達控制序列包括但不限于啟動子(例如，天然結合的或異源啟動子)、信號序列、增強子元件和轉錄終止序列。優(yōu)選，表達控制序列是能夠轉化或轉染真核宿主細胞的載體中的真核啟動子系統(tǒng)。在已將載體整合入適當?shù)乃拗骱螅?在適合于高水平表達核苷酸序列的條件下維持宿主，然后收集和純化多肽。此類表達載體通常可在宿主生物中復制(作為附加體或作為宿主染色體DNA的組成部分)。通常，表達載體包含選擇標記(例如，氨芐青霉素抗性、潮霉素抗性、四環(huán)素抗性或新霉素抗性)以允許檢測用期望的DNA序列轉化的那些細胞(參見，例如，美國專利
214，704，362)。大腸桿菌(E.coli)是對于克隆本發(fā)明的多核苷酸(例如，DNA序列)特別有用的一種原核宿主。適合使用的其他微生物宿主包括桿菌(bacilli)例如枯草芽孢桿菌和其他腸桿菌科(enterobacteriaceae)例如沙門氏菌(Salmonella)、沙雷氏菌(Serratia)禾口各種假單胞菌(Pseudomonas)的種。其他微生物例如酵母也可用于表達。酵母屬(Saccharomyces)和畢赤酵母屬 (Pichia)是示例性酵母宿主，且需要時，適當?shù)妮d體具有表達控制序列(例如，啟動子)、復制起點、終止序列等。常見啟動子包括3-磷酸甘油酸激酶和其他糖酵解酶。誘導型酵母啟動子包括，特別地，來自醇脫氫酶、異細胞色素c和負責甲醇、麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動子。在本發(fā)明的范圍內，大腸桿菌和釀酒酵母是優(yōu)選宿主。除了微生物外，哺乳動物組織培養(yǎng)物還可用于表達和產(chǎn)生本發(fā)明的多肽(例如， 編碼免疫球蛋白或其片段的多核苷酸)。參見Winnacker，F(xiàn)rom Genes to Clones, VCH Publishers, N. Y.，N. Y. (1987)。真核細胞實際上是優(yōu)選的，因為本領域內已開發(fā)了能夠分泌異源蛋白質(例如，完整免疫球蛋白)的許多適當?shù)乃拗骷毎担–HO細胞系、各種Cos細胞系、HeLa細胞、293細胞、骨髓瘤細胞系、轉化的B細胞和雜交瘤。用于此類細胞的表達載體可包括表達控制序列例如復制起點、啟動子和增強子(Queen等人，Immunol. Rev. 89 :49(1986))以及必需的加工信息位點例如核糖體結合位點、RNA剪接位點、多腺苷酸化位點和轉錄終止序列。優(yōu)選的表達控制序列是來源于免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、 牛乳頭瘤病毒、巨細胞病毒等的啟動子。參見Co等人，J. Immunol. 148 :1149(1992)?？赏ㄟ^熟知的方法(所述方法視細胞宿主類型的變化而變化)將包含目的多核苷酸序列(例如，重鏈和輕鏈編碼序列和表達控制序列)的載體轉移入宿主細胞。例如，氯化鈣轉染通常用于原核細胞，而磷酸鈣處理、電穿孔、脂質轉染(lipofection)、基因槍(biolistics)或基于病毒的轉染可用于其他細胞宿主。(通常參見Sambrook等人， Molecular Cloning :A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press,第 2 版，1989)。 用于轉化哺乳動物細胞的其他方法包括使用聚凝胺、原生質體融合、脂質體、電穿孔和顯微注射(通常參見，Sambrook等人，同上)。為了產(chǎn)生轉基因動物，可將轉基因顯微注射入受精的卵母細胞，或可將其整合入胚胎干細胞的基因組，并且將此類細胞的細胞核轉移入去核卵母細胞。還可將受試多肽整合在轉基因中以引入轉基因動物的基因組和隨后在例如轉基因動物的奶中進行表達(參見，例如，Deboer等人5，741，957 ；Rosen 5，304，489 ；和Meade 5，849,99 。適當?shù)霓D基因包括與來自乳腺特異性基因例如酪蛋白或β-乳球蛋白的啟動子和增強子有效連接的輕鏈和/或重鏈的編碼序列?？墒褂脝蝹€載體或兩個載體表達多肽。例如，可將抗體重鏈和輕鏈克隆在分開的表達載體上并且共轉染入細胞。在一個實施方案中，可使用信號序列促進本發(fā)明的多肽表達。在表達后，可按照本領域內的標準方法包括硫酸銨沉淀法、親和柱(例如，蛋白A或蛋白G)、柱層析、HPLC純化、凝膠電泳等(通常參見Scopes，Protein Purification (Springer-Verlag, N. Y.，(1982))來純化多月太。
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可通過培養(yǎng)的宿主細胞或細胞系來表達人源化的Ig可變區(qū)或包含其的多肽。還可在體內在細胞中表達它們。被轉化(例如，轉染)以產(chǎn)生改變的抗體的細胞系可以是永生化的哺乳動物細胞系，例如，淋巴來源的細胞系(例如，骨髓瘤、雜交瘤、三源雜交瘤或四源雜交瘤(quadroma)細胞系)。細胞系還可包括已通過用病毒(例如，EB病毒)轉化而被永生化的正常淋巴細胞例如B細胞。雖然通常用于產(chǎn)生多肽的細胞系是哺乳動物細胞系，但還可使用來自其他來源 (例如細菌和酵母)的細胞系。特別地，可使用大腸桿菌來源的細菌菌株，尤其是例如噬菌體展示。一些永生化的淋巴細胞系例如骨髓瘤細胞系在其正常狀態(tài)下分泌分離的Ig輕鏈或重鏈。如果用表達在本發(fā)明的方法中制備的改變的抗體的載體轉化這樣的細胞系，則將不必進行所述方法的剩余步驟，只要正常分泌的鏈與由更早制備的載體編碼的Ig鏈的可變結構域互補。如果永生化的細胞系不分泌或不分泌互補鏈，則必需將編碼適當?shù)幕パa鏈或其片段的載體引入細胞。在其中永生化細胞系分泌互補輕鏈或重鏈的情況下，可以例如通過用載體轉化適當?shù)募毦毎?，然后將細菌細胞與永生化細胞系(例如，通過質體融合)融合來產(chǎn)生轉化的細胞系?？蛇x擇地，可通過電穿孔將DNA直接引入永生化細胞系。在一個實施方案中，本發(fā)明中描述的或通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的人源化的Ig可變區(qū)可存在于任何抗體的抗原結合片段中?？芍亟M產(chǎn)生片段，改造片段、合成片段或可通過用蛋白水解酶降解抗體來產(chǎn)生片段。例如，片段可以是Fab片段；使用木瓜蛋白酶的降解在連接兩個重鏈的鏈間(即，Vh-Vh) 二硫鍵之前的區(qū)域斷裂抗體。這導致形成包含輕鏈和重鏈 WVi^PChI結構域的兩個相同片段。可選擇地，片段可以是F(ab' )2片段?？赏ㄟ^用在鏈間二硫鍵之后斷裂重鏈從而產(chǎn)生包含兩個抗原結合部位的片段的胃蛋白酶降解抗體來產(chǎn)生此類片段。另一個可選擇的方案是使用“單鏈”抗體?？梢砸远喾N方式構建單鏈Fv(SCFV) 片段。例如，可將\的(端連接至八的N端。通常，將接頭(例如，(GGGGS)4)置于Vh與八之間。然而，鏈連接的順序可以是相反的，并且可包括幫助檢測或純化的標簽(例如Myc-、 His-或FLAG-標簽)(標簽例如可連接至本發(fā)明的任何抗體或抗體片段的標簽；其用途不限于scFv)。因此，并且如下文中指出的，標記的抗體在本發(fā)明的范圍內。在可選擇的實施方案中，本文中描述的或通過本文中所述的方法產(chǎn)生的抗體可以是重鏈二聚體或輕鏈二聚體。此外，可使用抗體輕鏈或重鏈或其部分，例如，單結構域抗體(DAb)。在另一個實施方案中，本發(fā)明中描述的或通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的人源化Ig可變區(qū)存在于單鏈抗體(ScFv)或微小抗體(minibody)(參見例如，美國專利5，837，821或 W094/09817A1)中。微小抗體是由兩條多肽鏈構成的二聚體分子，所述多肽各自包含kFv 分子(包含一個或多個抗原結合部位的單個多肽，例如，通過柔性接頭連接的\結構域和 Vh結構域(通過連接肽融合至CH3結構域))?？梢砸訴h-接頭方向或接頭-VhS 向構建^Fv分子。連接組成抗原結合部位的\和Vh結構域的柔性鉸鏈優(yōu)選包含大約10 至大約50個氨基酸殘基。用于該目的的示例性連接肽是(GlyJer)3(Huston等人(1988). PNAS，85 :5879)。其他連接肽在本領域內是已知的。制備單鏈抗體的方法在本領域內是熟知的，例如，Ho等人(1989)，Gene, 77 51 ；Bird 等人(1988)，Science 242 :423 ；Pantoliano 等人(1991)，Biochemistry 30 10117 ;Milenic 等人(1991)，CancerResearch, 51 6363 ；Takkinen 等人(1991), Protein Engineering4 :837。可通過使用本領域中描述的方法(參見，例如，美國專利5，837，821或 WO 94/09817A1)構建kFv組分和連接肽-CH3組分來制造微小抗體?？梢砸韵拗菩云蔚男问綇姆珠_的質粒分離此類組分，然后將其連接并且再克隆入適當?shù)妮d體?？赏ㄟ^限制性降解和DNA序列分析來驗證適當?shù)难b配。在一個實施方案中，本發(fā)明的微小抗體包含連接肽。在一個實施方案中，連接肽包含Gly/Ser接頭例如GGGSSGGGSGG。在另一個實施方案中，可構建四價微小抗體。除了使用柔性接頭(其例如具有氨基酸序列(G4S)4G3AS)連接兩AkFv分子外，可以以與微小抗體相同的方式構建四價微小抗體。在另一個實施方案中，本發(fā)明中描述的或通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的人源化可變區(qū)可存在于雙抗體(Diabody)中。雙抗體與scFv分子相似，但通常具有連接兩個可變結構域的短的(少于10個，優(yōu)選1至5個)氨基酸殘基接頭，以便相同多肽鏈上的\和Vh結構域不能相互作用。相反，一個多肽鏈的\和Vh結構域與第二多肽鏈上的Vh和\結構域(分別地)相互作用(W0 02/02781)。在另一個實施方案中，本發(fā)明的人源化可變區(qū)存在于有效地連接至FcR結合部分的抗體的免疫反應性片段或部分(例如，scFv分子、微小抗體、四價微小抗體或雙抗體)中。 在示例性實施方案中，F(xiàn)cR結合部分是完全Fc區(qū)域。優(yōu)選，本文中描述的人源化方法產(chǎn)生其中對于抗原的親和力與供體抗體相比較基本上未改變的Ig可變區(qū)。在一個實施方案中，包含本發(fā)明的可變區(qū)的多肽以大于(或等于)大約ΙΟ,—1、 IO6M-1UO7M-1UO8M-1UO9M-1UOkiM-1UO11M-1或IO12M.1 (包括介于這些值之間的親和力)的結合常數(shù)Ka的結合親和力結合抗原。可以以多種方法測量親和力、親合力和/或特異性。通常，無論其中確定和測量親和力的確切方法如何，本發(fā)明的方法，當它們產(chǎn)生在其臨床應用的任何方面優(yōu)于其所源自的抗體的抗體時，提高了抗體的親和力(例如，當修飾的抗體可以以比其所源自的抗體更低的劑量或更低的頻率或通過更方便的施用途徑施用時，本發(fā)明的方法被認為是有效或成功的)。更特別地，抗體與其結合的抗原之間的親和力可通過各種測定(包括例如ELISA 測定、BiaCore 測定或 KinExA 3000 測定(可從 Sapidynehstruments (Boise，ID)獲得)) 來測量。簡而言之，通過共價連接用抗原(用于本發(fā)明的方法的抗原可以是任何目的抗原 (例如，癌癥抗原；細胞表面蛋白或分泌蛋白；病原體的抗原(例如細菌或病毒抗原(例如， HIV抗原、流感抗原或肝炎抗原))或變應原))包被sepharose珠粒。制備待測試的抗體的稀釋物，并且將各稀釋物加至板上指定的孔中。然后向各孔中加入檢測抗體(例如，山羊抗人IgG-HRP綴合物)，然后加入生色底物(例如HRP)。然后在450nM處在ELISA酶標儀中讀取板，并且計算EC50值。(然而，應理解，此處描述的方法是可普遍應用的；它們不限于產(chǎn)生結合任何特定抗原或抗原種類的抗體)。本領域技術人員理解，測定親和力并非總是如看單個圖那樣簡單。因為抗體具有兩個臂，因此它們的表觀親和力通常比可變區(qū)與抗原之間的固有親和力高得多(這據(jù)信歸因于親合力)?？墒褂胹cFv或Fab片段測量固有親和力。在另一個方面，本發(fā)明表征了包含本發(fā)明的人源化兔抗體或其片段的雙特異性分子。可將本發(fā)明的抗體或其抗原結合部分衍生或連接至另一種功能性分子例如另一種肽或蛋白質(例如，受體的另一種抗體或配體)以產(chǎn)生結合至少兩個不同的結合位點或靶分子的雙特異性分子?？蓪⒈景l(fā)明的抗體衍生或連接至超過一個的其他功能性分子以產(chǎn)生結合超過兩個不同的結合位點和/或靶分子的多特異性分子；此類多特異性分子也意欲包括在本文中使用的術語“雙特異性分子”中。為了產(chǎn)生本發(fā)明的雙特異性分子，可將本發(fā)明的抗體功能性地連接(例如，通過化學偶聯(lián)、基因融合、非共價結合或其他方法)至一個或多個其他結合分子例如另一個抗體、抗體片段、腫瘤特異性或病原體特異性抗原、肽或結合模擬物，以便產(chǎn)生雙特異性分子。因此，本發(fā)明包括包含至少一個對于第一靶具有特異性的第一結合分子和對于一個或多個另外的靶表位具有特異性的第二結合分子的雙特異性分子。在一個實施方案中，本發(fā)明的雙特異性分子包含至少一個抗體或其抗體片段(包括例如Fab、Fab' F(ab' )2、Fv或單鏈Fv)作為結合特異性。抗體還可以是輕鏈或重鏈二聚體，或其任何最小片段例如Fv或單鏈構建體，如Ladner等人的美國專利4，946，778 (其內容通過引用合并入本文)中所描述的。雖然人單克隆抗體是優(yōu)選的，但可用于本發(fā)明的雙特異性分子的其他抗體是鼠單克隆抗體、嵌合單克隆抗體和人源化單克隆抗體。本發(fā)明的雙特異性分子可通過使用本領域已知的方法綴合組分結合特異性來制備。例如，可分開地產(chǎn)生雙特異性分子的各結合特異性，然后將其彼此綴合。當結合特異性是蛋白質或肽時，可將多種偶聯(lián)或交聯(lián)劑用于共價綴合。交聯(lián)劑的實例包括蛋白A、碳二亞胺、N-琥珀酰亞胺基-S-乙?；?硫代乙酸酯(SATA)、5，5' -二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、鄰-苯二馬來酰亞胺(oPDM)、N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)和4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亞胺酯(磺基-SMCC) (參見例如，Karpovsky 等人(1984) J. Exp. Med. 160 :1686 ；Liu，MA 等人(1985) Proc. Natl. Acad. Sci USA82 :8648)。其他方法包括 Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78,118-132 ； Brennan 等人(1985)kience 229 :81-83),和 Glennie 等人(1987) J. Immunol. 139 2367-2375)中描述的方法。優(yōu)選的綴合劑是SATA和磺基-SMCC，兩者都可從Pierce Chemical Co. (Rockford, IL)獲得。當結合特異性是抗體時，可通過兩個重鏈的C端鉸鏈區(qū)的巰基鍵合來綴合它們。 在特別優(yōu)選的實施方案中，修飾鉸鏈區(qū)以在綴合前包含奇數(shù)個(優(yōu)選1個)巰基殘基?？蛇x擇地，可在相同的載體中編碼兩個結合特異性，并且在相同的宿主細胞中進行表達和裝配。該方法在雙特異性是mAbxmAb、mAbxFab、FabxF (ab' ) 2或配體χ Fab融合蛋白的情況下特別有用。本發(fā)明的雙特異性分子可以是包含一個單鏈抗體和結合決定簇的單鏈分子，或包含兩個結合決定簇的單鏈雙特異性分子。雙特異性分子可包含至少兩個單鏈分子。用于制備雙特異性分子的方法描述于例如美國專利5，260, 203 ；美國專利5，455，030 ；美國專利4，881，175 ；美國專利5，132，405 ；美國專利5，091，513 ；美國專利 5，476，786 ；美國專利5，013，653 ；美國專利5，258，498和美國專利5，482，858。雙特異性分子對它們的特異性靶的結合可通過例如酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、 放射性免疫測定(RIA)、基于流式細胞術的單細胞分選(例如FACS分析)、生物測定(例如，生長抑制)或通過Western印跡測定來確認。每一種此類測定通常通過利用特異于目的復合物的標記試劑(例如，抗體)來檢測特定目的蛋白質-抗體復合物的存在。例如，可使用例如識別并且特異性結合抗體-VEGF復合物的酶聯(lián)抗體或抗體片段檢測抗體復合物?？蛇x擇地，可使用多種其他的免疫測定的任一種檢測復合物。例如，可放射性標記抗體并且將其用于放射免疫測定(RIA)(參見，例如，1Weintraub,B. ,Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand AssayTechniques, The Endocrine Society, March，1986，其通過引用合并入本文)?？赏ㄟ^這樣的方法如使用Y計數(shù)器或閃爍計數(shù)器或通過放射自顯影檢測放射性同位素。在另一個方面，本發(fā)明表征了綴合至治療性部分例如細胞毒素、藥物(例如，免疫抑制劑)或放射性毒素的人源化兔抗體或其片段。此類綴合物在本文中稱為“免疫綴合物”。包括一個或多個細胞毒素的免疫綴合物稱為“免疫毒素”。細胞毒素或細胞毒性劑 (cytotoxicagent)包括對細胞有害(例如，殺死細胞)的任意試劑。實例包括泰素、細胞松弛素B、短桿菌肽D、溴乙啶、吐根堿、絲裂霉素、依托泊苷、鬼白噻吩甙、長春新堿、長春堿、 秋水仙堿、多柔比星、柔紅霉素、二羥基蒽二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌、 光輝霉素、放線菌素D、l-去氫睪酮、糖皮質激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾和嘌呤霉素以及其類似物或同源物。治療劑還包括例如抗代謝物(例如，甲氨蝶呤、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶達卡巴嗪)、烷化劑(例如，氮芥、thio印a苯丁酸氮芥、美法侖、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、環(huán)磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、鏈脲霉素、絲裂霉素C和順-二氯二胺鉬(II) (DDP)順鉬)、蒽環(huán)類(例如，柔紅霉素(以前稱為道諾霉素)和多柔比星)、抗生素類(例如，放線菌素D (以前稱為放線菌素)、博來霉素、光輝霉素和氨茴霉素(AMC))以及抗有絲分裂劑(例如，長春新堿和長春堿)。可綴合至本發(fā)明的抗體的治療性細胞毒素的其他優(yōu)選的實例包括多卡米星、卡奇霉素(calicheamicin)、美坦辛和auristatin及其衍生物。卡奇霉素抗體綴合物的實例是可商購獲得的(Mylotarg ；Wyeth-Ayerst)?？墒褂每稍诒绢I域內獲得的接頭技術將細胞毒素綴合至本發(fā)明的抗體。已用于將細胞毒素綴合至抗體的接頭類型的實例包括但不限于腙類、硫醚、酯類、二硫化物類和包含肽的接頭?？蛇x擇例如對溶酶體區(qū)室中的低PH導致的切割易感或對蛋白酶例如腫瘤組織中優(yōu)先表達的蛋白酶例如組織蛋白酶類(例如，組織蛋白酶B、C、D)導致的切割易感的接頭。關于細胞毒素的類型、將治療劑綴合至抗體的接頭和方法的論述，也參見&iito， G.等人(2003)Adv. Drug Deliv. Rev. 55 :199-215 ；Trail, P. Α.等人(2003)Cancer Immunol.Immunother. 52:328-337 ；Payne, G. (2003)Cancer Cell 3 :207-212 ；Allen, Τ. Μ. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750—763 ；Pastan, I.禾口 Kreitman，R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3 :1089-1091 ；Senter, P. D.禾口 Springer，C. J. (2001)Adv. Drug Deliv. Rev. 53 :247-264o還可將本發(fā)明的抗體綴合至放射性同位素以產(chǎn)生也稱為放射免疫綴合物的細胞毒性放射性藥物?？杀痪Y合至用于診斷或治療的抗體的放射性同位素的實例包括但不限于碘131、銦m、釔9°和镥m。本領域已建立了用于制備免疫綴合物的方法。放射免疫綴合物的實例是可商購獲得的，包括kvalin (IDEC Pharmaceuticals)和Bexxar (Corixa
26!Pharmaceuticals)，并且可使用相似的方法，使用本發(fā)明的抗體來制備放射免疫綴合物。本發(fā)明的抗體綴合物可用于改變給定的生物學應答，并且藥物部分不被解釋為限定于經(jīng)典的化學治療劑。例如，藥物部分可以是具有期望的生物學活性的蛋白質或多肽。此類蛋白質可包括例如酶促活性毒素或其活性片段，例如相思豆毒蛋白、蓖麻蛋白 A、假單胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白質例如腫瘤壞死因子或干擾素-Y ；或生物應答調節(jié)劑例如淋巴因子、白細胞介素-1(" IL-I “)、白細胞介素-2(" IL-2")、白細胞介素-6(" IL-6")、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(“GM-CSF“)、粒細胞集落刺激因子 (“G-CSF“)或其他生長因子。用于將此類治療性部分綴合至抗體的技術是熟知的，參見，例如，Arnon等人，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy“， in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等人(eds.)，pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985) ；Hellstrom等人，"Antibodies For Drug Delivery"，in Controlled Drug Delivery ( ^ 2 ), Robinson ^A (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)； Thorpe，“ Antibody Carriers Of CytotoxicAgents In Cancer Therapy :A Review“， in Monoclonal Antibodies ' 84 !Biological And Clinical Applications，Pinchera 等人(eds.)，pp.475-506(1985) ； ” Analysis, Results，And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy “ ， in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin 等人(eds.)， pp. 303-16 (Academic Press 1985)，禾口 Thorpe 等人，“The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates"，Immunol. Rev.，62 :119-58 (1982)。在一個方面，本發(fā)明提供了含有用于治療疾病的人源化兔抗體的藥物制劑。術語"藥物制劑"是指以這樣的形式存在的制劑，所述形式允許抗體或抗體衍生物的生物學活性明確有效，并且所述制劑不包含對將給其施用所述制劑的受試者有毒的另外的成分。 “藥學上可接受的”賦形劑(媒介物、添加劑)是可適當?shù)亟o受試哺乳動物施用以提供有效劑量的使用的活性成分的那些?！胺€(wěn)定的”制劑是其中的抗體或抗體衍生物在貯存時基本上保持其物理穩(wěn)定性和/或化學穩(wěn)定性和/或生物學活性的制劑。用于測量蛋白質穩(wěn)定性的各種分析技術在本領域內是可獲得的并且綜述于例如Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed. , Marcel Dekker, Inc. , New York, N. Y. , Pubs. (1991)禾口 Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10 =29-90(1993)中?？稍谶x擇的溫度下測量穩(wěn)定性，并進行選擇的時間。優(yōu)選，制劑在室溫(大約30°C )或在40°C下穩(wěn)定至少1個月和/或在大約2-8°C下穩(wěn)定至少1年，至少2年。此外，制劑優(yōu)選在制劑的冷凍(至例如，-700C )和解凍后穩(wěn)定。如果抗體或抗體衍生物在顏色和/或澄清度的目測檢查時或如通過UV光散射或通過尺寸排阻層析所測量的，沒有顯示聚集、沉淀和/或變性的跡象，那么其在藥物制劑中 “保持其物理穩(wěn)定性”。如果在給定的時間上化學穩(wěn)定性是使蛋白質被認為仍然保持其生物學活性(如下文中所定義的)的化學穩(wěn)定性，那么抗體或抗體衍生物在藥物制劑中“保持其化學穩(wěn)定性”?？赏ㄟ^檢測和定量蛋白質的化學改變的形式來估量化學穩(wěn)定性?；瘜W變化可包括大小改變(例如，剪切(clipping))，其可使用例如尺寸排阻層析、SDS-PAGE和/或基質輔助激光解吸附電離/飛行時間質譜(MALDI/TOF MS)來評估。其他類型的化學變化包括可通過例如離子交換層析來評估的電荷變化(例如，由于脫酰胺作用而發(fā)生的)。如果在給定的時間上抗體的生物學活性在制備藥物制劑時所展示的生物學活性的大約10%內(在測定的誤差內)(如在例如抗原結合測定中所測定的)，那么抗體或抗體衍生物在藥物制劑中“保持其生物學活性”。在下文中詳盡地闡述抗體的其他“生物學活性” 測定?！暗葷B的^t指目的制劑具有與人血液大體上相同的滲透壓。等滲制劑通常具有大約250至350m0sm的滲透壓?？墒褂美缯羝麎夯虮鋬鲂蜐B透計(ice-freezing type osmometer)測量等滲性?！岸嘣肌笔蔷哂卸鄠€羥基的物質，其包括糖(還原性和非還原性糖)、糖醇和糖酸。本文中優(yōu)選的多元醇具有小于大約600kD(例如，在大約120至大約400kD的范圍內) 的分子量?！斑€原性糖”是包含可還原金屬離子或與蛋白質中的賴氨酸和其他氨基共價反應的半縮醛基團的糖，“非還原性糖”是不具有還原性糖的此類性質的糖。還原性糖的實例是果糖、甘露糖、麥芽糖、乳糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、鼠李糖、半乳糖和葡萄糖。非還原性糖包括蔗糖、海藻糖、山梨糖、松三糖和棉子糖。甘露糖醇、木糖醇、赤藻糖醇、蘇糖醇、山梨糖醇和甘油是糖醇的實例。至于糖酸，其包括L-葡糖酸和其金屬鹽。在期望制劑是冷凍-融化穩(wěn)定的情況下，多元醇優(yōu)選是在冷凍溫度(例如_20°C)下不結晶(結晶使得制劑中的抗體不穩(wěn)定)的多元醇。非還原性糖例如蔗糖和海藻糖是本文中優(yōu)選的多元醇，并且由于海藻糖的優(yōu)良的溶液穩(wěn)定性，海藻糖優(yōu)于蔗糖。如本文中使用的，“緩沖液”是指通過其酸堿共軛成分的作用抗pH變化的經(jīng)緩沖的溶液。本發(fā)明的緩沖液具有范圍在大約4. 5至大約6. 0、優(yōu)選大約4. 8至大約5. 5內的pH ； 和最優(yōu)選具有大約5.0的pH?？煽刂苝H在該范圍內的緩沖液的實例包括乙酸鹽(例如，乙酸鈉)、琥珀酸鹽(例如琥珀酸鈉)、葡糖酸鹽、組氨酸、檸檬酸鹽和其他有機酸緩沖液。在期望冷凍-融化穩(wěn)定的制劑的情況下，緩沖液優(yōu)選不是磷酸鹽。在藥理學意義上，在本發(fā)明的背景中，抗體或抗體衍生物的“治療有效量”是指在預防或治療病癥(所述抗體或抗體衍生物對于其的治療是有效的)中有效的量。“疾病/ 病癥”是可受益于使用抗體或抗體衍生物的治療的任何病況。其包括慢性和急性病癥或疾病，包括使哺乳動物易患所述病癥的那些病理學狀況?！胺栏瘎笔强砂谥苿┲幸燥@著減弱其中的細菌作用，從而有助于例如多用途制劑的產(chǎn)生的化合物?？赡艿姆栏瘎┑膶嵗ㄊ送榛谆S基氯化銨、氯己雙銨、苯扎氯銨(其中烷基是長鏈化合物的烷基芐基二甲基氯化銨的混合物)和芐索氯銨。其他類型的防腐劑包括芳香醇例如酚、丁基和苯甲醇、對羥苯甲酸烷基酯例如對羥基苯甲酸甲酯或丙酯、兒茶酚、間苯二酚、環(huán)己醇、3-戊醇和間-甲酚。本文中最優(yōu)選的防腐劑是苯甲醇。本發(fā)明還提供了包含一種或多種抗體或抗體衍生物化合物以及至少一種生理上可接受的載體或賦形劑的藥物組合物。藥物組合物可包含例如水、緩沖液(例如，中性緩沖鹽溶液或磷酸緩沖鹽溶液)、乙醇、礦物油、植物油、二甲基亞砜、碳水化合物(例如，葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)、甘露糖醇、蛋白質、佐劑、多肽或氨基酸例如甘氨酸、抗氧化劑、 螯合劑例如EDTA或谷胱甘肽和/或防腐劑中的一種或多種。如上文中所指出的，其他活性成分可以(但不是必須)包含在本文提供的藥物組合物中。
載體是可在施用給患者前與抗體或抗體衍生物結合的物質(通常用于控制化合物的穩(wěn)定性或生物利用度)。用于此類制劑中的載體通常是生物相容性的，并且還可以是生物可降解的。載體包括例如單價或多價分子例如血清白蛋白(例如，人或牛)、卵白蛋白、 肽、多聚賴氨酸和多糖例如氨基葡聚糖和聚酰胺胺(polyamidoamine)。載體還可包括固體支持材料例如包含例如聚乳酸聚乙醇酸、聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚丙烯酸酯、膠乳、淀粉、纖維素或葡聚糖的珠粒和微粒。載體可以以多種方式(包括共價結合(直接地或經(jīng)由接頭基團)、非共價相互作用或混合)攜帶化合物?？膳渲扑幬锝M合物以用于任何適當?shù)氖┯梅绞?，包括例如局部、口服、?jīng)鼻、直腸或胃腸外施用。在某些實施方案中，以適合于口服使用的形式存在的組合物是優(yōu)選的。 此類形式包括例如丸劑、片劑、糖錠、錠劑、水性或油性懸浮劑、可分散粉劑或粒劑、乳劑、 硬或軟膠囊或糖漿劑或酏劑。在其他實施方案中，可將本文提供的組合物配制為凍干劑 (lyophilizate)。本文中使用的術語胃腸外包括皮下、皮內、血管內(例如，靜脈內)、肌內、 經(jīng)脊柱、顱內、鞘內和腹膜內注射以及任何相似的注射或輸注技術?？砂凑毡绢I域內已知的用于制造藥物組合物的任何方法制備意欲用于口服施用的組合物，其可包含一種或多種試劑例如甜味劑、調味劑、著色劑和防腐劑以提供吸引人且可口的制劑。片劑包含與生理上可接受的適合用于制造片劑的賦形劑混合的活性成分。此類賦形劑包括例如惰性稀釋劑(例如，碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉)、?；瘎┖捅澜鈩?例如，玉米淀粉或海藻酸)、粘合劑(例如，淀粉、明膠或阿拉伯膠)和潤滑劑(例如，硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石)。片劑可以是無包被的，或它們可利用在胃腸道中延遲崩解和吸收從而在更長的時期內提供持續(xù)作用的已知技術進行包被。例如，可使用時間延遲材料例如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。用于口服施用的制劑還可以以硬明膠膠囊(其中將活性成分與惰性固體稀釋劑 (例如，碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土)混合)的形式或以軟明膠膠囊(其中將活性成分與水或油介質(例如，花生油、液體石蠟或橄欖油)混合)的形式提供。水性懸浮劑包含與適合用于制造水性懸浮劑的賦形劑混合的抗體或抗體衍生物。此類賦形劑包括混懸劑(例如， 羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羧丙基甲基纖維素、海藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、黃蓍膠(gum tragacanth)和阿拉伯膠)；和分散劑或濕潤劑(例如，天然存在的磷脂例如卵磷脂、烯烴氧化物與脂肪酸的縮合物例如聚氧乙烯硬脂酸酯、環(huán)氧乙烷與長鏈脂肪族醇的縮合物例如十七乙烯基氧鯨蠟醇(h印tadecaethyleneoxycetanol)、環(huán)氧乙烷與從脂肪酸和己糖醇衍生的部分酯的縮合物例如聚氧乙烯山梨醇單油酸酯，或環(huán)氧乙烷與從脂肪酸和己糖醇酐衍生的部分酯的縮合物例如聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯)。水性懸浮劑還可包含一種或多種防腐劑例如乙基或正丙基對羥基苯甲酸、一種或多種著色劑、一種或多種調味劑以及一種或多種甜味劑例如蔗糖或糖精?？捎锰鹞秳├绺视?、丙二醇、山梨醇或蔗糖配制糖漿劑和酏劑。此類制劑還可包含一種或多種緩和劑(demulcent)、防腐劑、調味劑和/或著色劑?？赏ㄟ^將活性成分懸浮于植物油(例如花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油)中或礦物油例如液體石蠟中來配制油性懸浮劑。油性懸浮劑可包含增稠劑例如蜂蠟、硬石蠟或鯨蠟醇?？杉尤胩鹞秳├缟鲜鎏鹞秳┖?或調味劑以提供可口的口服制劑?？赏ㄟ^加入抗氧化劑例如抗壞血酸來保存此類懸浮劑。適合于通過加入水來制備水性懸浮劑的可分散粉劑和粒劑提供了與分散劑或濕潤劑、混懸劑和一種或多種防腐劑混合的活性成分。適當?shù)姆稚┗驖駶檮┖突鞈覄┦抢缟衔奶峒暗脑噭＿€可存在另外的賦形劑例如甜味劑、調味劑和著色劑。藥物組合物還可以以水包油乳劑的形式存在。油相可以是植物油(例如橄欖油或花生油)、礦物油(例如，液體石蠟)或其混合物。適當?shù)娜榛瘎┌ㄌ烊淮嬖诘哪z(例如， 阿拉伯膠和黃蓍膠)、天然存在的磷脂(例如，大豆、卵磷脂和從脂肪酸和己糖醇衍生的酯或部分酯)、酐類(例如，去水山梨糖醇單油酸酯)以及從脂肪酸和己糖醇衍生的部分酯與環(huán)氧乙烷的縮合物(例如，聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯)。乳劑還可包含一種或多種甜味劑和/或調味劑?？蓪⑺幬锝M合物配制為無菌注射水性或油性懸浮液，其中取決于所用的媒介物和濃度，將調節(jié)劑懸浮或溶解在媒介物中。還可按照現(xiàn)有技術，使用適當?shù)姆稚駶檮┖?/或混懸劑例如上文提及的那些來配制這樣的組合物。其中可使用的可接受的媒介物和溶劑是水、1，3_ 丁二醇、林格氏溶液和等滲氯化鈉溶液。此外，無菌不揮發(fā)性油可用作溶劑或懸浮介質。為此，可使用任何非刺激性的不揮發(fā)性油，包括合成的甘油一酯或甘油二酯。此外，可將脂肪酸例如油酸用于制備可注射的組合物，并且可將佐劑例如局部麻醉藥、防腐劑和/或緩沖劑溶解于媒介物中。還可將藥物組合物配制為持續(xù)釋放制劑(即，在施用后進行調節(jié)劑的緩慢釋放的制劑例如膠囊)。通?？墒褂檬熘募夹g制備此類制劑，并且可通過例如口服、直腸或皮下植入，或通過在期望的靶位置植入來施用所述制劑。用于此類制劑中的載體是生物相容性的，并且還可以是生物可降解的；優(yōu)選地制劑提供相對恒定水平的調節(jié)劑釋放。持續(xù)釋放制劑中包含的抗體或抗體衍生物的量取決于例如植入的位置、釋放的速率和預期的持續(xù)時間以及待治療或預防的疾病/病癥的性質。通常以在體液(例如，血液、血漿、血清、CSF、滑液、淋巴、細胞間隙液、眼淚或尿) 中獲得足以可檢測地結合靶例如VEGF以及預防或抑制此類靶介導的疾病/病癥例如VEGF 介導的疾病/病癥的濃度的量施用本文中提供的抗體或抗體衍生物。如果劑量導致如本文中描述的可辨別的患者益處，則其被認為是有效的。優(yōu)選全身性劑量的范圍是大約0. Img 至大約140mg/千克體重/天(大約0. 5mg至大約7g/患者/天)，且口服劑量通常為靜脈內劑量的約5至20倍?？膳c載體材料組合以產(chǎn)生單個劑型的抗體或抗體衍生物的量將隨治療的宿主和具體的施用模式的變化而變化。劑量單位形式通?？砂蠹sImg至大約 500mg的活性成分?？砂b藥物組合物以治療響應抗例如VEGF的抗體或抗體衍生物的病癥。包裝的藥物組合物可包括容器(其裝有有效量的至少一種本文中所述的抗體或抗體衍生物)和說明書(例如，標簽)(其說明包含的組合物將用于治療響應一種抗體或抗體衍生物(在施用給患者后)的疾病/病癥)。還可化學修飾本發(fā)明的抗體或抗體衍生物。優(yōu)選的修飾基團是聚合物，例如任選地取代的直鏈或支鏈聚烯烴、polyalkenylene或聚氧烯烴聚合物或分支或不分支的多糖。 此類效應物基團可增加抗體的體內半衰期。合成的聚合物的具體實例包括任選地取代的直鏈或支鏈聚(乙二醇)(PEG)、聚(丙二醇)、聚(乙烯醇)或其衍生物。特定的天然存在的聚合物包括乳糖、直鏈淀粉、葡聚糖、糖原或其衍生物。需要時可改變聚合物的大小，但其平均分子量通常在500Da至50000Da的范圍內。對于其中抗體設計用于滲透組織的局部應用，聚合物的優(yōu)選分子量是約5000Da?？蓪⒕酆衔锓肿舆B接至抗體，特別是經(jīng)由W00194585 中所述的共價連接的鉸鏈肽連接至Fab片段重鏈的C末端。關于PEG部分的連接，參見 "Poly(ethyleneglycol)Chemistry, Biotechnological and Biomedical Applications”， 1992，J. MiltonHarris (ed), Plenum Press，New York 禾口 “Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences”，1998，M. Aslam 禾口 A. Dent，Grove Publishers, New York。在如上所述制備目的抗體或抗體衍生物后，制備包含其的藥物制劑。待配制的抗體未經(jīng)歷在前的冷凍干燥并且本文中的目的制劑是水性制劑。優(yōu)選制劑中的抗體或抗體衍生物是抗體片段，例如scFv。通過考慮例如期望的劑量容積和施用模式來確定存在于制劑中的抗體的治療有效量。大約0. lmg/ml至大約50mg/ml，優(yōu)選大約0. 5mg/ml至大約25mg/ ml和最優(yōu)選大約2mg/ml至大約10mg/ml是制劑中的示例性抗體濃度。在pH緩沖劑中制備包含抗體或抗體衍生物的水性制劑。本發(fā)明的緩沖劑具有大約4. 5至大約6. 0，優(yōu)選大約4. 8至大約5. 5的pH，最優(yōu)選具有大約5. O的pH。可控制pH 在該范圍內的緩沖劑的實例包括乙酸鹽(例如，乙酸鈉)、琥珀酸鹽(例如琥珀酸鈉)、葡糖酸鹽、組氨酸、檸檬酸鹽和其他有機酸緩沖劑。緩沖劑的濃度可以是大約ImM至大約50mM， 優(yōu)選大約5mM至大約30mM，取決于例如緩沖劑和制劑的期望的等滲性。優(yōu)選的緩沖劑是乙酸鈉(大約 IOmM), pH 5.0。將可用作張力劑(tonicifier)和可穩(wěn)定抗體的多元醇包含在制劑中。在優(yōu)選實施方案中，制劑不包含緊張(tonicifying)量的鹽例如氯化鈉，因為這可引起抗體或抗體衍生物沉淀和/或可導致在低PH下的氧化作用。在優(yōu)選實施方案中，多元醇是非還原性糖例如蔗糖或海藻糖。以可根據(jù)制劑的期望的等滲性而變化的量向制劑中加入多元醇。優(yōu)選水性制劑是等滲的，在該情況下制劑中適當?shù)亩嘣紳舛仍诶绱蠹s至大約15% w/v 的范圍內，優(yōu)選在大約2%至大約10% whv的范圍內。然而，高滲或低滲制劑也可以是合適的。加入的多元醇的量還根據(jù)多元醇的分子量而改變。例如，與二糖(例如海藻糖)相比較，可加入更低量的單糖(例如，甘露醇)。還可向抗體或抗體衍生物制劑中加入表面活性劑。示例性表面活性劑包括非離子型表面活性劑例如聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20，80等)或泊洛沙姆(例如泊洛沙姆 188)。加入的表面活性劑的量是使其減少配制的抗體/抗體衍生物的聚集和/或使制劑中顆粒的形成降至最低和/或減少吸附的量。例如，表面活性劑可以以大約0. 001%至大約 0. 5%，優(yōu)選大約0. 005%至大約0. 2%和最優(yōu)選大約0. 01%至大約0. 的量存在于制劑中。在一個實施方案中，制劑包含上文中鑒定的試劑(即，抗體或抗體衍生物、緩沖劑、多元醇和表面活性劑)并且基本上不含一種或多種防腐劑，例如苯甲醇、苯酚、間-甲酚、氯丁醇和芐索氯銨。在另一個實施方案中，可在制劑中包含防腐劑，特別是在制劑為多劑量制劑的情況下。防腐劑的濃度可在大約0. 至大約2%，最優(yōu)選大約0. 5%至大約 1 %的范圍內。可在制劑中包含一種或多種其他藥學上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑例如 Remington' s Pharmaceutical Sciences 第 21 版，Osol，A. Ed. (2006)中描述的試劑， 只要其不會不利地影響期望的制劑特征?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑在使用的劑量和濃度上對接受者無毒，并且包括另外的緩沖劑；共溶劑；抗氧化劑包括抗壞血酸和甲硫氨
31酸；螯合劑例如EDTA ；金屬復合物(例如Zn-蛋白質復合物)；生物可降解的聚合物例如聚酯；和/或形成鹽的抗衡離子例如鈉。用于體內施用的制劑必須是無菌的。這可通過在配制制劑之前或之后利用無菌濾膜進行過濾來容易地實現(xiàn)。按照已知的方法，例如以推注的形式靜脈內施用或通過在一段時間內的持續(xù)輸注，通過肌內、腹膜內、腦脊髓內、皮下、關節(jié)內、滑膜內、鞘內、口服、局部或吸入途徑給需要使用所述抗體的治療的哺乳動物優(yōu)選人施用制劑。在優(yōu)選實施方案中，通過靜脈內施用給哺乳動物施用制劑。為此，可使用例如注射器或通過IV線注射制劑。抗體的適當劑量(“治療有效量”)將取決于例如待治療的病癥、疾病的嚴重度和進程、是為了預防目的還是為了治療目的而施用抗體、以前的治療、患者的臨床史和對抗體的應答、使用的抗體類型以及主治醫(yī)生的判斷。適當?shù)卦谝淮位蛟谝幌盗兄委熤薪o患者施用抗體或抗體衍生物，并且可在診斷后任何時間給患者施用抗體或抗體衍生物?？贵w或抗體衍生物還可作為單一治療或與用于治療所述病癥的其他藥物或治療劑結合進行施用。作為一般建議，施用的抗體或抗體衍生物的治療有效量可在大約0. 1至大約 50mg/kg患者體重的范圍內(無論通過一次還是多次施用)，且使用的抗體的常見范圍為例如大約0. 3至大約20mg/kg，更優(yōu)選大約0. 3至大約15mg/kg (每天施用一次)。然而，可以使用其他給藥方案?？赏ㄟ^常規(guī)技術容易地監(jiān)控該治療的進展。在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供了包含容器的制品，所述容器裝有本發(fā)明的藥物制劑，優(yōu)選水性制劑，并且任選地提供關于其使用的說明書。適當?shù)娜萜靼ɡ缙孔?、小瓶和注射器。容器可由多種材料例如塑料或玻璃制成。示例性容器是3-20cc的一次性玻璃小瓶。可選擇地，對于多劑量制劑，容器可以是3-lOOcc的玻璃小瓶。容器裝有制劑， 并且在其上或與其結合的標簽可標明使用指導。制品還可包括從商業(yè)和用戶立場來看期望的其他材料，包括其他緩沖劑、稀釋劑、濾器、針、注射器和具有使用說明的產(chǎn)品說明書。在某些優(yōu)選實施方案中，制品包括本文中描述的或通過本文中描述的方法產(chǎn)生的凍干的免疫結合劑。
實施例本公開內容還通過下列實施例來舉例說明，所述實施例不應當解釋為進一步限定。本申請中提及的所有圖和所有參考資料、專利和公開的專利申請的內容以它們的全文通過引用明確地合并入本文。材料和方法一般而言，除非另外指出，否則本發(fā)明的實施使用化學、分子生物學、重組DNA 技術、免疫學(尤其是例如抗體技術)的常規(guī)技術和多肽制備的標準技術。參見，例如， Sambrook, Fritsch 禾口 Maniatis，Molecular Cloning :Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) ；Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology)，510， Paul，S.，Humana Pr(1996) ；Antibody Engineering :APractical Approach (Practical Approach Series，169)，McCafferty，Ed.，Irl Pr (1996) ；Antibodies :A Laboratory Manual，Harlow 等人，C. S. H. L. Press, Pub. (1999)；禾口 Current Protocols in Molecular Biology，eds. Ausubel等人，John Wiley & Sons (1992) 0用于將來自兔和其他非人單克隆抗體的CDR移植入選擇的人抗體構架的方法在上文中進行了詳細描述。此類移植實驗的實例示于下文中。為了更好地理解，命名為"min"的移植物是其中⑶R被移植至構架1. 4或其可變結構域的移植物，而稱為"max"的移植物是其中CDR被移植至構架1.4或其可變結構域并且其中所述構架還包含與抗原相互作用的供體構架殘基的移植物。實施例1 :rFWl. 4的設計1. 1. 一級序列分析和數(shù)據(jù)搜索1. 1. 1.兔免疫球蛋白序列的收集從不同的開源數(shù)據(jù)庫(例如Kabat數(shù)據(jù)庫和IMGT)收集兔成熟抗體和種系的可變結構域序列并且將其以單字母代碼氨基酸序列的形式輸入定制的數(shù)據(jù)庫。為了進行完整的分析，我們只使用相應于V(可變)區(qū)的氨基酸部分。棄去KDB數(shù)據(jù)庫中低于70%完整性或在構架區(qū)中包含多個未確定的殘基的序列。也排除與數(shù)據(jù)庫內的任何其他序列具有超過 95%同一性的序列以在分析中避免隨機嗓音。1. 1.2.兔序列的比對和編號使用基于Needleman-Wunsch算法和Blossum矩陣的常規(guī)序列比對工具比對兔抗體序列。按照免疫球蛋白的可變結構域的AHo編號系統(tǒng)進行缺口的引入和殘基位置的命名 (Honegger和Pluckthun，2001)。還平行地使用Kabat編號方案，因為其是最廣泛采用的用于編號抗體中的殘基的標準。使用SUBIM程序分配Kabat編號。該程序分析抗體序列的可變區(qū)并且按照由Kabat和同事(Deret等人1995)建立的系統(tǒng)給序列編號。按照基于序列可變性的最常用的Kabat定義進行構架和CDR區(qū)的界定。然而， ⑶R-Hl命名是不同定義(包括AbM' s、kabat' S、通過分析一組3D復合物結構的抗體與抗原之間接觸而產(chǎn)生的平均接觸數(shù)據(jù)(MacCallum等人，1996)和基于結構環(huán)區(qū)域的定位的 Chotia' s)之間的妥協(xié)(上述的和圖1中顯示的)。1. 1. 3.殘基位置的頻率和保守性使用一組423個兔序列(來自kabat數(shù)據(jù)庫)分析氨基酸序列多樣性。通過將在數(shù)據(jù)組中觀察到的特定殘基的次數(shù)除以序列的總數(shù)來計算成熟兔序列中每一個位置i的殘基頻率f(r)。使用辛普森指數(shù)(其考慮了不同氨基酸存在的數(shù)目以及各殘基的相對豐度)計算各位置i的保守程度。
γ ΣΓ-t w (Η -1)D = '“1 --
jYGV-ll其中N表示氨基酸的總數(shù)，r是存在于各位置處的不同氨基酸的數(shù)目以及η是特定氨基酸種類的殘基的數(shù)目。1. 1.4.兔V區(qū)的譜系分析使用系統(tǒng)發(fā)生分析工具研究兔庫集(r印ertoire)。使用聚類和拓撲學算法對V 區(qū)的氨基酸序列進行聚類。計算整個陣列的距離矩陣并且將其用作種系使用(germline usage)的指標。計算各聚類的共有序列并且鑒定最接近的兔種系序列對應物。還推算整個序列組的總體共有序列。1. 1. 5.人亞組的分配對于不同聚類的各兔代表性序列，使用序列分析算法和分類方法的EXCEL工具
33(Knappik等人，2000)基于人抗體庫集的分析鑒定最同源的人亞組。1.2.人受體構架的設計利用來自上述序列分析的兔庫集的藍圖，鑒定構架中通常參與兔CDR的定位的殘基。在相對于兔庫集和各個聚類具有較高的同源性的構架中，具有良好生物物理性質的一個構架選自完全人序列的庫。用作受體構架的所選擇的構架屬于可變輕鏈亞組κ 1和可變重鏈亞組III (相應地具有ESBATech' s ID KI 27，a43)。已使用稱為“質量控制”系統(tǒng)的基于酵母的篩選方法(Auf der Maur等人，2004)通過篩選人脾scFv文庫，鑒定了該穩(wěn)定且可溶的抗體構架，并且將其命名為“FW1. 4”。雖然穩(wěn)定且可溶的構架序列FWl. 4展示高同源性，但其不是可獲得的最同源的序列。將鑒定的殘基整合入所述受體構架以產(chǎn)生rFWl. 4。利用關于兔抗體的氨基酸序列多樣性、種系使用和結構特征的信息，我們就在新型人構架中保持CDR構象所需的殘基位置的相容性分析了 FWl. 4。我們就下列特征的相容性檢查了 FWl. 4的可變區(qū)i.作為環(huán)結構的經(jīng)典序列的一部分的殘基。ii.位于VL/VH界面的構架殘基iii.在⑶R正下方的殘基的平臺iv.上核心殘基和下核心殘基v.確定亞型的構架殘基。1.3.兔 CDR 的移植通過簡單地將來自一個抗體的⑶R序列(按照上述定義)與FWl. 4或rFWl. 4的構架序列組合來產(chǎn)生移植物。鑒定潛在地參與結合的殘基。對于每一個兔可變結構域序列， 鑒定最接近的兔種系對應物。如果不能確定最接近的種系，那么將序列與亞型共有序列或具有高相似性百分數(shù)的兔序列的共有序列相比較。罕見構架殘基被認為可能是體細胞高突變的結果，從而在結合中起作用。因此，將此類殘基移植至受體構架上。1.4 結果通過在結構、氨基酸序列多樣性和種系使用方面分析兔抗體庫集，在FWl. 4的輕鏈中發(fā)現(xiàn)了 5個經(jīng)改造維持兔⑶R的環(huán)構象的殘基位置。這些位置在兔抗體中是高度保守的。根據(jù)兔庫集推導出這5個位置的共有殘基并且將其引入人受體構架1.4。通過改造這些保守位置，所述構架實際上變得與任何兔⑶R的所有6個互補決定區(qū)(OTR)相容。包含不同兔⑶R的rFWl. 4，與野生型單鏈相反，良好地表達和良好地產(chǎn)生。產(chǎn)生通過組合該構架與兔CDR而衍生的16個成員，并進行詳細地表征，其顯示功能性。實施例2 =B細胞篩選系統(tǒng)為了選擇通過其B細胞受體(BCR)結合目的靶的B細胞，在ESBATech建立了基于FACS(基于流式細胞術的單細胞分選)的篩選系統(tǒng)。一個靶是例如可溶性蛋白質，即用熒光染料(PE和PerCP)標記的單鏈抗體(ESBA90!3)。從用重組靶免疫的兔的脾制備淋巴細胞懸浮液。然后將細胞與PE和PerCP標記的ESBA903以及與特異于IgG(APC_標記的) 或IgM(FITCSEW)的抗體一起溫育。在96孔板中分選在其表面上表達IgG而非IgM的 ESBA903陽性B細胞(圖3 ；表2)。通過胸腺瘤輔助細胞系(EL4-B5 參見^ibler等人， 1985，J. Immunol, 134 (6) :3662-3668)，選擇的B細胞增殖、分化成漿細胞并且分泌抗體。通過ELISA和Biacore測量確認此類IgG對于靶的親和力。7個選擇的克隆的動力學參數(shù)描述于表1中。來自大約200個分選的細胞的混合物的這些克隆顯示低納摩爾至皮摩爾范圍內的結合親和力。最后，從6個目的克隆分離mRNA，并且將⑶R移植在單鏈構架FWl. 4上。表1 :7個B細胞培養(yǎng)物上清液的動力學值。
權利要求
1.特異于期望的抗原的免疫結合劑，其包含(i)兔類動物的可變輕鏈CDR；和(ii)與SEQID NO. 4具有至少50%的同一性的人可變重鏈構架。
2.權利要求1的免疫結合劑受體構架，其中所述可變重鏈構架選自SEQID NO. 4和SEQ ID NO. 6。
3.前述權利要求的任一項的免疫結合劑受體構架，其還包含與SEQID NO. 2具有至少 85 %的同一性的可變輕鏈構架。
4.權利要求3的免疫結合劑受體構架，其在輕鏈可變構架的位置87處(AHo編號)包含蘇氨酸⑴。
5.前述權利要求的任一項的免疫結合劑受體構架，其包含通過接頭特別是SEQID NO. 8的接頭連接的可變重鏈構架和可變輕鏈構架。
6.前述權利要求的任一項的免疫結合劑受體構架，其包含與SEQIDNO. 3, SEQ ID NO. 5 或SEQ ID NO. 7具有至少70%的同一性的構架，特別是包含或為SEQ ID NO. 3,SEQ ID NO. 5 或SEQ ID NO. 7的構架。
7.人或人源化的免疫結合劑可變重鏈受體構架，其包含選自位置M處的蘇氨酸(T)、 位置25處的纈氨酸(V)、位置56處的丙氨酸㈧或甘氨酸(G)、位置82處的賴氨酸⑷、位置84處的蘇氨酸⑴、位置89處的纈氨酸(V)和位置108處的精氨酸(R) (AHo編號)的至少3個氨基酸。
8.前述權利要求的任一項的免疫結合劑受體構架，其中用親水性氨基酸置換位置12， 103和/或144 (AHo編號)處的氨基酸。
9.權利要求8的免疫結合劑受體構架，其在重鏈構架中具有(AHo編號)(a)位置12處的絲氨酸(S)，(b)位置103處的絲氨酸⑶或蘇氨酸⑴和/或(c)位置144處的絲氨酸⑶或蘇氨酸⑴。
10.前述權利要求的任一項的免疫結合劑受體構架，其在可變輕鏈構架(AHo編號)中具有位置1處的谷氨酸(E)、位置3處的纈氨酸(V)、位置4處的亮氨酸(L)、位置10處的絲氨酸( 、位置47處的精氨酸(R)、位置57處的絲氨酸( 、位置91處的苯丙氨酸(F)和/ 或位置103處的纈氨酸(V)。
11.前述權利要求的任一項的免疫結合劑受體構架，其還包含來自供體免疫結合劑，特別是哺乳動物免疫結合劑，優(yōu)選兔免疫結合劑的重鏈CDR1、CDR2和CDR3和/或輕鏈CDR1、 CDR2 和 CDR3。
12.權利要求11的免疫結合劑受體構架，其還包含參與抗原結合的供體構架殘基。
13.前述權利要求的任一項的免疫結合劑受體構架，其還包含可變重鏈的位置141處 (AHo編號)的甘氨酸(G)。
14.權利要求1至13的任一項的免疫結合劑受體構架用于兔CDR的移植的用途。
15.包含權利要求1至13的任一項的免疫結合劑受體構架的免疫結合劑。
16.權利要求15的免疫結合劑，其為scFv抗體。
17.權利要求15至16的任一項的免疫結合劑，其還包含一個或多個連接的分子，特別是治療劑例如細胞毒性劑、細胞因子、趨化因子、生長因子或其他信號轉導分子，成像劑或第二蛋白質，特別是轉錄激活因子或DNA結合結構域。
18.權利要求15至17的任一項的免疫結合劑在診斷應用、治療應用、靶標確認或基因治療中的用途。
19.編碼權利要求1至13的任一項的免疫結合劑受體構架或權利要求15至17的任一項的免疫結合劑的核酸，特別是分離的核酸。
20.包含權利要求19的核酸的載體。
21.包含權利要求20的載體的宿主細胞。
22.權利要求19的核酸或權利要求20的載體在基因治療中的用途。
23.包含權利要求1至13的任一項的免疫結合劑受體構架、權利要求15至17的任一項的免疫結合劑、權利要求19的核酸或權利要求20的載體的組合物。
24.人源化兔免疫結合劑的方法，所述兔免疫結合劑包含重鏈⑶R1、⑶R2和⑶R3序列和/或輕鏈⑶R1、⑶R2和⑶R3序列，所述方法包括(i)將由⑶RHI、⑶R H2和⑶R H3序列組成的組中的至少一個重鏈⑶R移植入與SEQ ID NO 1具有至少50%的同一性的人重鏈受體構架，和/或(ii)將由⑶RLi、⑶R L2和⑶R L3序列組成的組中的至少一個輕鏈⑶R移植入與SEQ ID NO 2具有至少50%的同一性的人輕鏈受體構架。
25.權利要求對的方法，其中(i)人重鏈構架包含SEQID NO 1, SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 6的構架氨基酸序列；和(ii)人輕鏈構架包含SEQID NO 2或SEQ ID NO 9的構架氨基酸序列。
26.權利要求M或25的方法，其還包括用參與抗原結合的兔免疫結合劑的構架殘基置換構架殘基。
27.權利要求對至沈的任一項的方法，其還包括用在重鏈氨基酸位置12，103和 144(AHo編號)中的至少一個位置處的置換來置換重鏈受體構架的構架殘基的步驟，特別是用親水性氨基酸進行置換，優(yōu)選置換選自(a)位置12處的絲氨酸(S) ； (b)位置103處的蘇氨酸⑴和(c)位置144處的蘇氨酸⑴。
28.權利要求M至27的任一項的方法，其還包括用在根據(jù)AHo編號系統(tǒng)的輕鏈可變區(qū)的位置1，3，4，10，47，57，91和103中的至少一個位置處的增強穩(wěn)定性的置換，特別是用選自下列的置換來置換輕鏈受體構架的構架殘基的步驟(a)位置1處的谷氨酸(E)、(b) 位置3處的纈氨酸(V)、(c)位置4處的亮氨酸(L)、(d)位置10處的絲氨酸⑶、(e)位置 47處的精氨酸(R)、(e)位置57處的絲氨酸⑶、(f)位置91處的苯丙氨酸(F)和(g)位置103處的纈氨酸(V)。
29.根據(jù)權利要求M至觀的任一項的方法人源化的免疫結合劑。
30.權利要求四的免疫結合劑，其中靶抗原是VEGF或TNF。
31.權利要求對至觀的任一項的方法，其中所述方法還包括按照下列步驟鑒定通過B 細胞產(chǎn)生的抗體可變結構域的供體CDR a)將兔B細胞與靶抗原一起溫育；b)選擇結合靶抗原的那些B細胞；和c)鑒定由B細胞產(chǎn)生的抗體可變結構域的CDR。
32.權利要求31的方法，其中所述B細胞分離自用所述靶抗原免疫的兔，優(yōu)選通過DNA 疫苗接種進行免疫。
33.權利要求31或32的任一項的方法，其中對所述B細胞和靶抗原進行差異染色，然后通過基于流式細胞術的單細胞分選來陽性選擇兩種染色的共發(fā)生。
34.權利要求31至33的任一項的方法，其中所述靶抗原是可溶性蛋白質。
35.權利要求31至33的任一項的方法，其中所述靶抗原在細胞的表面上表達，特別地其中所述靶抗原是跨膜蛋白，特別是多次跨膜蛋白。
36.權利要求35的方法，其中通過用細胞內熒光染料染色表達靶抗原的細胞來間接染色靶抗原。
37.權利要求31至36的任一項的方法，其中用一種或多種特異于B細胞表面標志物的經(jīng)標記的抗體染色B細胞。
38.權利要求31至37的任一項的方法，其中用標記的抗IgG抗體染色B細胞。
39.權利要求38的方法，其中用標記的抗IgG抗體和用差異標記的抗IgM抗體染色B 細胞。
40.權利要求39的方法，其中陰性地選擇用標記的抗IgM抗體染色的所述B細胞。
41.權利要求31至40的任一項的方法，其還包括培養(yǎng)權利要求31的步驟b)中選擇的所述B細胞的步驟，以便所產(chǎn)生的抗體分泌入培養(yǎng)基中，特別是在輔助細胞系存在的情況下。
42.權利要求41的任一項的方法，其還包括就對靶抗原的特異性結合測試所述分泌的抗體的步驟。
43.權利要求42的方法，其中擴增，特別地通過RT-PCR擴增所述抗體的CDR，然后將其移植入受體構架以產(chǎn)生隨后就對靶抗原的特異性結合進行測試的免疫結合劑。
44.包含與kq.ID NO. 1具有至少90%的同一性的序列和/或與SEQ ID NO. 2具有至少85%的同一性的序列的免疫結合劑受體構架用于兔CDR的移植的用途。
45.權利要求44的用途，其中所述構架包含通過接頭，特別地通過具有SEQID NO. 8的接頭連接的 SEQ ID NO. 1 和 SEQ ID NO. 2。
全文摘要
本發(fā)明涉及通用抗體受體構架以及使用通用抗體受體構架移植非人抗體，例如兔抗體的方法。通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的抗體可用于多種診斷和治療應用。
文檔編號C07K16/24GK102164958SQ200980124312
公開日2011年8月24日 申請日期2009年6月25日 優(yōu)先權日2008年6月25日
發(fā)明者D·厄里什, L·波拉斯 申請人:艾斯巴技術,愛爾康生物醫(yī)藥研究裝置有限責任公司