專利名稱：官能化的多肽的制作方法
官能化的多肽相關(guān)申請本申請要求提交于2008年6月30日的題為〃 Methods And Compositions For Modifying Immunobinders〃的美國臨時(shí)申請No. 61/076, 775的優(yōu)先權(quán)，將其內(nèi)容通過引用 整體并入本文。
背景技術(shù)：
治療性多肽的功效常大大受限于它們固有的藥代動力學(xué)性質(zhì)。例如，治療性抗體 的情況中，組織滲透，組織停留及血清半衰期的問題常被報(bào)道。治療性多肽的藥代動力學(xué)性 質(zhì)的改善可導(dǎo)致改善的功效及減少的劑量方案。調(diào)節(jié)治療性多肽的藥代動力學(xué)性質(zhì)的現(xiàn)有 方法一般限于解決血清半衰期的問題。而且這些方法一般涉及耗時(shí)或既有多肽的非特異性 化學(xué)改變。因此，本領(lǐng)域中有對提供氨基酸修飾的快速及特異手段，及除了半衰期之外，也獲 得藥代動力學(xué)參數(shù)的調(diào)節(jié)治療性多肽的藥代動力學(xué)性質(zhì)的改良的方法的需求。發(fā)明概述本發(fā)明提供官能化的多肽，尤其是治療性多肽(例如，scFv)。本發(fā)明的多肽包括 可通過添加一個(gè)或官能部分(例如，PEG)和/或結(jié)合特異性(例如，有特定結(jié)合特異性的 氨基酸序列)來快速及特異性地官能化的接頭序列。所述官能化的多肽的優(yōu)點(diǎn)在于，相比 非官能化的多肽具有改善的藥代動力學(xué)性質(zhì)(例如，改善的體內(nèi)半衰期，組織滲透及組織 停留時(shí)間)。還提供了快速及可再現(xiàn)產(chǎn)生官能化的多肽的方法。因此，一方面，本發(fā)明提供多肽，例如免疫結(jié)合子(例如scFv)，包括通過氨基酸接 頭連接的2個(gè)結(jié)構(gòu)域。接頭通常包括能形成鏈內(nèi)二硫鍵的2個(gè)半胱氨酸，及當(dāng)2個(gè)半胱氨 酸通過二硫鍵彼此鍵合時(shí)，這2個(gè)半胱氨酸之間的接頭序列中的氨基酸形成環(huán)。特定實(shí)施 方式中，接頭包括SEQ ID NO :1或2所示的序列。某些實(shí)施方式中，接頭含結(jié)合靶分子，例如1 修飾劑(例如，透明質(zhì)酸，及血清白 蛋白)的環(huán)。通過結(jié)合到靶分子，包括多肽的接頭的血清半衰期和/或滲透進(jìn)組織的功效 和/或特定結(jié)合特異性增強(qiáng)。特定實(shí)施方式中，接頭包括SEQ ID NO :3或4所示的氨基酸 序列。優(yōu)選實(shí)施方式中，多肽包括SEQ ID NO :6或8所示的氨基酸序列。某些實(shí)施方式中，接頭中的至少一個(gè)半胱氨酸殘基共價(jià)連接到官能部分。特定實(shí) 施方式中，接頭中的2個(gè)半胱氨酸殘基共價(jià)連接到相同的官能部分。適宜官能部分包括，例 如，PEG，碳水化合物分子及羥乙基淀粉(HEQ。將官能部分例如PEG或HES共價(jià)連接到多 肽之后，所述多肽在受試者中的半衰期延長。另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包括本發(fā)明的一或多種多肽及藥學(xué)可接受的載質(zhì)的 組合物。其他實(shí)施方式中，本發(fā)明提供編碼本發(fā)明的多肽的核酸分子(例如載體)，及含所 述核酸分子的宿主細(xì)胞。另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供生產(chǎn)官能化的多肽的方法。所述方法通常包括提供肽序列庫，從庫中鑒定結(jié)合靶分子的至少一種肽序列，及修飾含接頭的多肽的環(huán)區(qū)，以包括 鑒定的至少一種肽序列。期望的肽序列可通過任何本領(lǐng)域已知的方法鑒定，包括，例如，噬 菌體展示，酵母展示，或mRNA展示。

圖1示各種處理的ESBA105分子的SDS-PAGE (泳道3 10)。泳道1 標(biāo)記物；泳道2 未標(biāo)出；泳道3 用DTT還原的；泳道4 還原的及透析的； 泳道5 還原的，半胱氨酸-聚乙二醇化的；泳道6 半胱氨酸-聚乙二醇化的，透析的；泳道 7 對照；泳道8 賴氨酸-聚乙二醇化的；泳道9 賴氨酸-聚乙二醇化的，透析的；泳道10， 對照。PEG的分子大小約為0. 7kDa/PEG。圖2顯示㈧半胱氨酸-聚乙二醇化的ESBA105及⑶賴氨酸-聚乙二醇化的 ESBA105的TNF α結(jié)合活性的ELISA分析。A 對于ESBA105的EC50為0，9833 ；對于還原的 ESBA105 1, 291 ；及對于 Cys 聚乙二醇化的 ESBA105 :1，164。對于 ESBA105 的 R2 為 0，9814 ； 對于還原的 ESBA105 0, 9891 ；Cys 聚乙二醇化的 ESBA105 :0，9857。B 對于 ESBA105 的 EC50 為0，8073，及對于Lys聚乙二醇化的ESBA105 :1，326。對于ESBA105的R2為0，9870，及對 于聚乙二醇化的ESBA1050, 9640。圖3顯示(a)未修飾的，氧化的ESBA105-SS-接頭的示意圖，(b)使用單官能PEG 化劑1聚乙二醇化的ESBA105-SS-接頭(ESBA105_S2_PEG2)，及(c)使用雙官能PEG化劑2 聚乙二醇化的 ESBA105-SS-接頭(ESBA105-S2-PEG)。圖4顯示(A)ESBA105及ESBA105-SS-接頭的TNF α結(jié)合活性的ELISA分析；(B) ESBA105的SDS-PAGE凝膠經(jīng)歷各種處理 ’及(C)使用兔抗-PEG抗體蛋白印跡評定ESBA105 及ESBA105-SS-接頭的聚乙二醇化程度。圖4(B)泳道1 還原的+透析的+上限濃縮的 ESBA105 SS接頭；泳道2 還原的+透析的ESBA105 SS接頭；泳道3 還原的+聚乙二醇化 的ESBA105 SS接頭；泳道4 還原的+聚乙二醇化的+透析的ESBA105 SS接頭；泳道5: ESBA105 SS 接頭。圖5顯示圖示以噬菌體展示的目的在噬菌體2表面上的scFv分子1的肽環(huán)的展 現(xiàn)(scFv分子及噬菌體不成比例)的示意圖。圖示的情況中，環(huán)包括可與靶分子3，例如血 清白蛋白(半衰期延長)，F(xiàn)cRx(胎盤轉(zhuǎn)運(yùn))，粘蛋白(上皮停留時(shí)間延長)，整聯(lián)蛋白(RGD 肽)，補(bǔ)體，緊密連接蛋白，多聚化，等相互作用的7個(gè)氨基酸。圖6顯示ESBA105及半胱氨酸-聚乙二醇化的ESBA105-SS-接頭的TNFα結(jié)合 活性的ELISA分析。對于ESBA105的EC50為0，9980 ；及對于有聚乙二醇化的SS接頭的 ESBA105 1, 181。對于ESBA105的R2為0，9397 ；及對于有聚乙二醇化的SS接頭的ESBA105 0，9851。圖 7a 顯示 ESBA903 的 VEGF 結(jié)合動力學(xué)。Fit :1 1 結(jié)合；ka(I/Ms) :7，68E+5 ； kd(l/s) 4, 310E-5 ；KD (M) :5，608E-11。圖 7b 顯示 ESBA903-P印 1 的結(jié)合動力學(xué)。Fit :1 1 結(jié)合；ka (I/Ms) :1. 133E+6 ；kd(l/s) :5,026E-5o 對于 7a 及 7b 兩者，X 軸的值以秒給出，Y 軸的值以共振單位(RU)給出。發(fā)明詳述定義
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術(shù)語"結(jié)構(gòu)域"，對于多肽，取本領(lǐng)域認(rèn)可的意義，及指獨(dú)立的三級結(jié)構(gòu)單元。結(jié) 構(gòu)域之例包括但不限于抗體VH或VL結(jié)構(gòu)域，纖連蛋白結(jié)構(gòu)域及錨蛋白-重復(fù)結(jié)構(gòu)域。術(shù)語"接頭"是指連接2個(gè)結(jié)構(gòu)域的線性氨基酸序列。本發(fā)明的接頭可遺傳和/ 或化學(xué)融合到結(jié)構(gòu)域。某些實(shí)施方式中，接頭含環(huán)。術(shù)語"環(huán)"是指由接頭內(nèi)鏈內(nèi)二硫鍵形成的環(huán)狀氨基酸序列。術(shù)語"聚乙二醇"或"PEG"是指有化學(xué)式HO-(CH2CH2O)n-H的線性或分支的中 性聚醚，及其反應(yīng)性衍生物。反應(yīng)性PEG衍生物為本領(lǐng)域熟知，及包括但不限于偶聯(lián)于甲 基-PE012-馬來酰亞胺，N-羥基湖泊酰亞胺碳酸酯，N-羥基湖泊酰亞胺丙酸酯，ρ-硝基 苯-碳酸酯，苯并三唑-碳酸酯，及醛的PEG。特定實(shí)施方式中，氨基-反應(yīng)性PEG衍生物是 能與二硫鍵特異反應(yīng)的雙-砜-偶聯(lián)的PEG (見例如，Brocchini eta\, Nature Protocols, 2006 1(5), 241)。適宜PEG分子的分子大小在0，5kDa及50kDa之間。術(shù)語"靶分子"是指被本發(fā)明的多肽環(huán)區(qū)特異結(jié)合的任何分子。靶分子，包括，例 如，糖類，蛋白及脂類。術(shù)語"官能部分"是指給其所連接的分子(例如PEG分子，一或多個(gè)碳水化合物 分子或羥乙基淀粉(HEQ)附加額外的官能性的生物或化學(xué)實(shí)體。術(shù)語"1 修飾物"是指當(dāng)結(jié)合到蛋白時(shí)改變蛋白的藥代動力學(xué)性質(zhì)的任何分 子。Hi修飾物一般(但不必需)是存在于受試者(例如患者)的天然存在的，內(nèi)源性分子。 所述Hi修飾物在受試者內(nèi)的定位及豐度可為生理或病理的(例如在癌細(xì)胞表面，或在發(fā)炎 位點(diǎn)過表達(dá))。適宜Hi修飾物包括，例如，透明質(zhì)酸，II型膠原，血清白蛋白，抗體Fc受體 (例如，F(xiàn)cRx)，抗體Fc區(qū)，粘蛋白，整聯(lián)蛋白，緊密連接蛋白，轉(zhuǎn)鐵蛋白，及補(bǔ)體因子。術(shù)語"修飾的"或"修飾"，對于多肽的氨基酸序列，是指添加氨基酸到多肽序 列或置換多肽序列中既有的氨基酸。適宜于修飾多肽的氨基酸包括全部已知的天然氨基 酸，非天然氨基酸，及其官能化的衍生物(見例如，美國專利7，045，337及7，083，970，將其 通過引用整體并入本文)。術(shù)語"免疫結(jié)合子"是指含抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)的全部或部分(例如，重鏈和/或 輕鏈可變區(qū)的全部或部分)的分子，從而免疫結(jié)合子特異性地識別靶抗原。免疫結(jié)合子 的非限定例包括全長免疫球蛋白分子及scFv，以及抗體片段，包括但不限于(i)Fab片段， 由I VH, 結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的單價(jià)片段；(ii)F(ab' )2片段，包括于鉸鏈區(qū)通過二硫鍵 連接的2個(gè)Fab片段的二價(jià)片段；(iii)Fab'片段，其基本上為有部分鉸鏈區(qū)的Fab (見， Fundamental Immunology (Paul ed. ,3. sup. rd ed. 1993)) ； (iv)由 Vh 及 ChI 結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的 Fd片段；(ν)由抗體單臂的\及Vh結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的Fv片段；及(vii)納米抗體，含單個(gè)可變 區(qū)及2個(gè)恒定區(qū)的重鏈可變區(qū)。本文所用的術(shù)語"抗體"是"免疫球蛋白"的同義詞。本發(fā)明的抗體可為全免 疫球蛋白或其包括至少一個(gè)免疫球蛋白可變區(qū)的片段，例如本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的單可變 區(qū)，F(xiàn)v (Skerra A. and Pluckthun, Α. (1988) Science 240 :1038-41), scFv (Bird, R. Ε. et al. (1988) Science 242 :423-26 ；Huston, J. S. et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA85 5879-83)，F(xiàn)ab，(Fab' )2 或其他片段。術(shù)語"單鏈抗體"或"scFv"是指包括通過接頭連接的抗體重鏈可變區(qū)(Vh)及 抗體輕鏈可變區(qū)(V的分子。所述SCFv分子可具有如下共同結(jié)構(gòu)NH2-Vf接頭-Vh-COOH或 NH2-Vh-接頭-V^C00H。本文中的術(shù)語"官能性質(zhì)"是多肽(例如，免疫結(jié)合子)性質(zhì)，包括但不限于，穩(wěn) 定性(例如，熱穩(wěn)定性)，溶解度(例如，體內(nèi)及細(xì)胞內(nèi)培養(yǎng))，及抗原結(jié)合親和力。術(shù)語"特異性結(jié)合"，“選擇性結(jié)合"，“選擇性結(jié)合"及"特異性結(jié)合"是指 抗體結(jié)合到預(yù)定抗原上的表位。一般而言，抗體以大致小于約10- 的親和力(K73)，例如 大致小于約10_8M，10_9M或10_1(IM的親和力結(jié)合。術(shù)語"核酸分子"是指DNA分子及RNA分子。核酸分子可為單鏈或雙鏈，但優(yōu)選 為雙鏈DNA。當(dāng)與另一核酸序列置于功能關(guān)系時(shí)，核酸為"可操作連接的"。例如，如果啟 動子或增強(qiáng)子影響序列的轉(zhuǎn)錄，其可操作連接到編碼序列。術(shù)語"載體"是指能轉(zhuǎn)運(yùn)其所連接的另一核酸的核酸分子。一種類型的載體是" 質(zhì)粒"，其是指向其中可連接額外的DNA段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一類型的載體是病毒載 體，其中，額外的DNA段可連接到病毒基因組。某些載體能在導(dǎo)入有其的宿主細(xì)胞中自主復(fù) 制(例如，具有細(xì)菌復(fù)制原點(diǎn)及附加體哺乳動物載體的細(xì)菌載體)。其他載體(例如，非附 加體哺乳動物載體)可在導(dǎo)入宿主細(xì)胞之后整合到宿主細(xì)胞基因組，由此隨著宿主基因組 復(fù)制。術(shù)語"宿主細(xì)胞"是指向其中已導(dǎo)入表達(dá)載體的細(xì)胞。宿主細(xì)胞可包括細(xì)菌，微 生物，植物或動物細(xì)胞。細(xì)菌，其易受轉(zhuǎn)化，包括腸桿菌科成員，例如大腸埃希氏菌或沙門氏 菌屬；芽孢桿菌科，例如芽孢桿菌；腸炎球菌；鏈球菌屬，及流感嗜血菌的株。適宜微生物包 括釀酒酵母及畢赤酵母。適宜動物宿主細(xì)胞系包括CHO(中國倉鼠卵巢細(xì)胞系)及NSO 細(xì)胞。除非另有定義，本文所用的全部技術(shù)及科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技 術(shù)人員通常理解的含義相同的含義。盡管與本文所述類似或等同的方法和材料可用于本發(fā) 明的實(shí)踐或測試，以下描述了適宜方法和材料。如有沖突，以本說明書，包括定義為準(zhǔn)。此 外，材料、方法和實(shí)施例僅旨在說明及不旨在限制。本發(fā)明的各方面更詳細(xì)描述于下文。應(yīng)知，可根據(jù)需要組合各實(shí)施方式。多肽接頭一方面，本發(fā)明提供包括2個(gè)結(jié)構(gòu)域的多肽，其中所述結(jié)構(gòu)域通過氨基酸接頭連 接，及其中所述接頭含能形成鏈內(nèi)二硫鍵的2個(gè)半胱氨酸殘基。所述接頭的優(yōu)點(diǎn)特別在于， 它們使定點(diǎn)添加官能部分(例如，PEG)，和/或向多肽添加一或多種結(jié)合親和力。本發(fā)明 的接頭優(yōu)選通過遺傳加工，更優(yōu)選2個(gè)結(jié)構(gòu)域之間，由此將它們連接形成單個(gè)多肽，從而遺 傳連接到結(jié)構(gòu)域。或者，本發(fā)明的接頭可使用任何本領(lǐng)域明晰的用于實(shí)現(xiàn)氨基酸連接的化 學(xué)方法化學(xué)連接到結(jié)構(gòu)域。官能部分可通過任何本領(lǐng)域明晰的化學(xué)方法連接到接頭。優(yōu)選 地，它們連接到存在于接頭中的一或多個(gè)半胱氨酸。某些實(shí)施方式中，氨基酸接頭的通式為(X)a-C-(X)b-C_(X)。，其中C是半胱氨酸； X是任何氨基酸，包括天然、非天然氨基酸，及其化學(xué)衍生物；及，a，b，及c對應(yīng)氨基酸數(shù)，及 可為任意自然數(shù)。優(yōu)選地，a及c是1 25之間的數(shù)，b是3 250之間的數(shù)。更優(yōu)選地， a及c是1 20之間的數(shù)，b是3 100之間的數(shù)。在一實(shí)施方式中，接頭在環(huán)形成區(qū))(b中包括肽序列。這種情況下，b優(yōu)選為3 30 的任意數(shù)個(gè)氨基酸，即 3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，對，25，沈，27，觀，四或30。最優(yōu)選，b是7或12。優(yōu)選地，環(huán)形成區(qū)釙不包括半胱氨酸殘基。某些實(shí)施方式中，接頭包括折疊的多肽結(jié)構(gòu)域。通式(X)a-C-(X)b-C-(X)e中，b優(yōu) 選為30與250之間的數(shù)，例如50 200，100 200，125 225，75 225，125 225，例如 30,40,50,60,70,80,90,100，110，120，120，130，140，150，160，170，180，190，200，210，220， 230，240或250。需知，本文公開了指定范圍內(nèi)的任意自然數(shù)。因此，氨基酸接頭有通式(X) a-c-結(jié)構(gòu)域-C- (X) b，其中C是半胱氨酸；X是任何氨基酸，包括天然、非天然氨基酸，及其化 學(xué)衍生物；結(jié)構(gòu)域是如上定義的結(jié)構(gòu)域；及，a, b對應(yīng)氨基酸數(shù)，及可為任意自然數(shù)。某些實(shí)施方式中，氨基酸接頭有通式(X)n = s-15-C-00n = 3^5O-C-(X)n = 3_是 (表1中的SEQ ID NO :1)，其中C是半胱氨酸；X是任何氨基酸，包括天然、非天然氨基酸， 及其化學(xué)衍生物；及，η是氨基酸數(shù)。接頭各區(qū)中的氨基酸殘基數(shù)可隨著其所連接的多肽結(jié) 構(gòu)變化，前提是接頭中的半胱氨酸殘基能在非還原性條件下形成鏈內(nèi)二硫鍵。而且，接頭長 度及序列必需為接頭不實(shí)質(zhì)上損害以其作為一部分的多肽的一或多種官能性質(zhì)。特定實(shí)施 方式中，氨基酸接頭包括SEQ ID NO :2，3，及4任之一所示的氨基酸序列(見表1)。本發(fā)明的接頭特別良好適宜于在scFv (尤其是高度穩(wěn)定及可溶的scFv)中連接VH 及VL結(jié)構(gòu)域，例如W009/000098中所述的那些，將其內(nèi)容通過引用并入本文。包括本發(fā)明 的接頭的例示scFv多肽的氨基酸序列示于SEQ ID NO :6及8 (見表1)。多肽本發(fā)明提供官能化的多肽，尤其是治療性多肽(例如，scFv)。本發(fā)明的多肽包括 可通過添加一或多個(gè)官能部分(例如，PEG)和/或結(jié)合特異性(例如，有特定結(jié)合特異性 的氨基酸序列)來快速及特異性地官能化的接頭序列。任何多肽可使用本發(fā)明的方法和組合物官能化，包括但不限于，包括免疫球蛋白 結(jié)構(gòu)域(例如，VH或VL結(jié)構(gòu)域)的多肽。特定實(shí)施方式中，多肽是免疫結(jié)合子，(例如， scFv)ο優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的多肽有以下通式結(jié)構(gòu)域1-(X)a-C-(X)b-C-(X)。_結(jié)構(gòu) 域2，其中C是半胱氨酸；結(jié)構(gòu)域1及2是如上定義的結(jié)構(gòu)域；X是任何氨基酸，包括天然、非 天然氨基酸，及其化學(xué)衍生物 ’及,a，b，及c是氨基酸數(shù)。優(yōu)選地，結(jié)構(gòu)域1及2分別是Vh 及\結(jié)構(gòu)域，或&及Vh結(jié)構(gòu)域。向接頭添加官能部分本發(fā)明的接頭含在非還原性條件下形成鏈內(nèi)二硫鍵的至少2個(gè)半胱氨酸殘基(見 圖3)。此二硫鍵使使用本文所述的方法將官能部分(例如，PEG)定點(diǎn)添加到接頭。特別 是，二硫鍵中的半胱氨酸殘基可共價(jià)連接到官能部分(例如，PEG)。隨著暴露的半胱氨酸使 甚更好定向的聚乙二醇化，實(shí)現(xiàn)相比常規(guī)PEG附著位點(diǎn)的制備優(yōu)勢，其常成倍產(chǎn)生有關(guān)PEG 附著位點(diǎn)的不均一的群。如果采用含單官能反應(yīng)性基團(tuán)的官能部分，官能部分會連接到單 個(gè)半胱氨酸殘基。但是，如果采用含二硫鍵特異性雙官能反應(yīng)性基團(tuán)的官能部分，官能部分 會連接到鏈內(nèi)二硫鍵的兩個(gè)半胱氨酸殘基。所述雙官能試劑為本領(lǐng)域熟知，及包括，雙-砜 (見例如，Brocchini et a\, Nature Protocols，2006 1 (5)，241)。某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包括SEQ ID NO :2，3，4，6及8所示的氨基酸序列的 多肽(見表1)，其中接頭中的至少一個(gè)半胱氨酸殘基共價(jià)連接到官能部分(例如，PEG)。其
7他實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包括SEQ ID N0:2，3，4，6及8所示的氨基酸序列的多肽(見表 1)，其中接頭中的兩個(gè)半胱氨酸殘基使用雙官能反應(yīng)性基團(tuán)，(例如，雙-砜)共價(jià)連接到 相同的官能部分(例如，PEG)。環(huán)的官能化由本發(fā)明的接頭中的半胱氨酸殘基的鏈內(nèi)二硫鍵形成導(dǎo)致接頭半胱氨酸殘基之 間的氨基酸序列環(huán)化形成環(huán)(見圖3及幻。此環(huán)結(jié)構(gòu)的優(yōu)點(diǎn)尤其在于，其可修飾為包括有 一或多種特定結(jié)合特異性的氨基酸序列，由此將額外的官能性添加到部分是環(huán)的多肽。環(huán)序列可例如具有對于任何靶分子的結(jié)合特異性。適宜靶分子包括但不限于1 修飾物，例如，透明質(zhì)酸，血清白蛋白，整聯(lián)蛋白，抗體Fc區(qū)，轉(zhuǎn)鐵蛋白，等。例如，結(jié)合到血 清白蛋白延長多肽的半衰期。結(jié)合到FcRx改良多肽向胎盤的轉(zhuǎn)運(yùn)，然而結(jié)合到粘蛋白延長 在上皮中的停留時(shí)間。有對抗原的特異性的免疫結(jié)合子的情況中，某些實(shí)施方式中，VH及 VL結(jié)構(gòu)域之間的環(huán)區(qū)可加工為結(jié)合抗原，從而提高免疫結(jié)合子的親和力。另一實(shí)施方式中， 靶分子是多肽本身。換言之，環(huán)可提供導(dǎo)致多肽建立二聚體，三聚體或更多聚的多聚體的多 聚化功能。多聚體相比單體具有更強(qiáng)親合力。此外，多聚體使交聯(lián)，及最后活化例如細(xì)胞表 面上的受體。另一實(shí)施方式中，靶分子是在其接頭內(nèi)呈現(xiàn)互補(bǔ)環(huán)的另一免疫結(jié)合子，即2個(gè) 分子的環(huán)彼此結(jié)合，然而環(huán)可相同或不同。這使形成雙特異性或多特異性免疫結(jié)合子復(fù)合 物。雙特異性或多特異性復(fù)合物使募集分子或細(xì)胞到另一細(xì)胞或分子，例如募集T細(xì)胞到 癌細(xì)胞導(dǎo)致殺癌細(xì)胞(Cancer Res. volume 69 page 4941)。可將任何有針對期望的靶分子的結(jié)合特異性的短氨基酸序列導(dǎo)入本發(fā)明的環(huán)。優(yōu) 選實(shí)施方式中，環(huán)序列由5 15個(gè)氨基酸構(gòu)成(即在通式⑴a-C-⑴b-C- (X)。中，b是5 15)，及不含半胱氨酸?？珊先氕h(huán)的適宜氨基酸序列包括但不限于透明質(zhì)酸結(jié)合肽(例如， 包括表1中SEQ ID NO 4的殘基12 23的肽)，及整聯(lián)蛋白結(jié)合肽(例如，RGD肽)?？赏ㄟ^本領(lǐng)域熟知的方法鑒定有對期望的靶分子的結(jié)合特異性的適宜于合入環(huán) 的新肽，例如，噬菌體展示，酵母展示及mRNA展示。所述展示系統(tǒng)為本領(lǐng)域熟知(見，例如， 美國專禾Ij 66258558,6699658 ；及7118879，將其通過引用并入本文)。例如，為執(zhí)行噬菌體 展示帥選，可將由接頭的2個(gè)半胱氨酸形成的環(huán)融合到用于噬菌體表面展示的噬菌體殼蛋 白(見圖5的示意圖)。將在理想情況下包括5 15之間的氨基酸及不含不同于需要于形 成環(huán)的半胱氨酸的半胱氨酸的環(huán)序列隨機(jī)化，以提供環(huán)序列庫，以進(jìn)行篩選。適宜噬菌體庫 可商購，例如，自New England Biolab的二硫鍵連接的七肽0 . D.-C7C)庫。用于所述噬 菌體篩選的靶分子包括，例如，PK修飾物，例如，II型膠原，白蛋白，抗體Fc區(qū)，抗體Fc受體 (例如，F(xiàn)cRx)，粘蛋白，整聯(lián)蛋白，緊密連接蛋白及補(bǔ)體因子。修飾的多肽此外，本發(fā)明的多肽可于接頭區(qū)外側(cè)的一或多個(gè)氨基酸殘基共價(jià)連接到官能部分 (例如，PEG)?？刹捎貌粚?shí)質(zhì)上損害多肽的一或多種官能性質(zhì)的任何氨基酸殘基，例如，表 面暴露的賴氨酸及半胱氨酸殘基。如果需要，多肽可修飾(通過添加或置換)為導(dǎo)入適宜 于連接到官能部分的額外的反應(yīng)性氨基酸。特定實(shí)施方式中，多肽修飾為含至少一對半胱 氨酸殘基，及其中至少一對半胱氨酸殘基在成熟的多肽內(nèi)形成鏈內(nèi)二硫鍵。官能部分可使 用單官能反應(yīng)性基團(tuán)(例如，半胱氨酸)連接到單個(gè)反應(yīng)性殘基，或使用雙官能二硫鍵特異 性反應(yīng)性基團(tuán)(例如，雙-砜)連接到2個(gè)二硫鍵鍵合的半胱氨酸。
因此，在一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包括SEQ ID NO :5所示的氨基酸序列的多肽， 其中選自 Lys40，Lys43, Lys46, Lysl07, Lysl76, Lysl97 及 Lys208 的至少一個(gè)氨基酸殘基 共價(jià)連接到官能部分(例如，PEG)。另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包括SEQ ID NO :5所示的氨基酸序列的多肽，其中 選自CM C89及ClM 的至少一對半胱氨酸殘基共價(jià)連接到相同的官能部分(例 如，PEG)。另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包括SEQ ID NO :6所示的氨基酸序列的多肽，其中選 自Cysl23及Cysl36的至少一個(gè)氨基酸殘基共價(jià)連接到官能部分(例如，PEG)。另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包括SEQ ID NO :6所示的氨基酸序列的多肽，其中所 述對半胱氨酸殘基Cysl23 Cysl36共價(jià)連接到相同的官能部分(例如，PEG)。另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包括SEQ ID NO :7所示的氨基酸序列的多肽，其中選 自 Lys44, Lys47, Lysl05, Lysl09, Lysl42, Lysl43, Lysl49, Lysl73, Lysl93 及 Lysl95 的至 少一個(gè)氨基酸殘基共價(jià)連接到官能部分(例如，PEG)。另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包括SEQ ID NO :7所示的氨基酸序列的多肽，其中選 自Cys25 Cys90及Cysl52 Cys2^的至少一對半胱氨酸殘基共價(jià)連接到相同的官能部 分(例如，PEG)。另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包括SEQ ID NO :8所示的氨基酸序列的多肽，其中選 自Cysl21及CysU9的至少一個(gè)氨基酸殘基共價(jià)連接到官能部分(例如，PEG)。另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包括SEQ ID NO :8所示的氨基酸序列的多肽，其中所 述對半胱氨酸殘基Cysl21 CysU9共價(jià)連接到相同的官能部分(例如，PEG)。另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包括SEQ ID N0:5，6，7，或8所示的氨基酸序列的多 肽，其中所述多肽修飾為含至少一個(gè)反應(yīng)性氨基酸(例如，半胱氨酸或賴氨酸)。所述反應(yīng) 性氨基酸可共價(jià)連接到官能部分(例如，PEG)。另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包括SEQ ID N0:5，6，7，或8所示的氨基酸序列的多 肽，其中所述多肽修飾為含至少一對半胱氨酸殘基，及其中至少一對半胱氨酸殘基能在成 熟的多肽內(nèi)形成鏈內(nèi)二硫鍵。特定實(shí)施方式中，至少一對半胱氨酸殘基共價(jià)連接到相同的 官能部分(例如，PEG)雙官能反應(yīng)性基團(tuán)(例如，雙-砜)。如本領(lǐng)域所知，PEG的連接不改變它們的功能地改良生物醫(yī)藥的某些特性，由此增 強(qiáng)它們的治療效果。例示效果是(i)通過增強(qiáng)的溶解度，改善的穩(wěn)定性，持續(xù)的吸收和/或 連續(xù)的生物醫(yī)藥作用的改善的藥代動力學(xué)；(ii)降低治療有效量和/或施劑頻度的增加的 循環(huán)時(shí)間；和/或(iii)降低的毒性，例如由于改善的安全性特征，降低的免疫原性，降低的 抗原性和/或降低的蛋白水解。多肽組合物和制劑本發(fā)明的另一方面涉及本發(fā)明的多肽(例如ScFv)組合物藥物制劑。所述制劑 一般包括多肽(例如組合物及藥學(xué)可接受的載質(zhì)。本文所用的"藥學(xué)可接受的載 質(zhì)“包括生理相容的任何及全部溶劑，分散介質(zhì)，涂層，抗細(xì)菌及抗真菌劑，等滲劑及吸收 延遲劑，等。優(yōu)選地，載質(zhì)適宜于，例如，靜脈內(nèi)，肌內(nèi)，皮下，局部(例如，到眼，皮膚，或表皮 層)，吸入，經(jīng)腸外，脊柱或表皮施用(例如，通過注射或輸注)。取決于施用途徑，多肽(例 如kFv)可包于材料，以保護(hù)化合物免于酸及可滅活化合物的其他天然條件的作用。
本發(fā)明的藥物化合物可包括一或多種藥學(xué)可接受的鹽?！八帉W(xué)可接受的鹽"是指 保持母化合物的期望的生物活性及不附加任何不期望的毒理學(xué)效果的鹽(見例如，Berge, S.M.，et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66 1-19)。所述鹽之例包括酸加成鹽及堿加成鹽。酸 加成鹽包括源于非毒性無機(jī)酸的鹽，所述無機(jī)酸例如鹽酸，硝酸，磷酸，硫酸，氫溴酸，氫 碘酸，亞磷酸等，以及源于非毒性有機(jī)酸的鹽，所述有機(jī)酸例如脂肪族單羧酸和二羧酸， 苯基-取代的鏈烷酸，羥基鏈烷酸，芳族酸，脂肪族及芳族磺酸等。堿加成鹽包括源于堿土 金屬的鹽，所述金屬例如鈉，鉀，鎂，鈣等，以及源于非毒性有機(jī)胺類的鹽，所述胺例如N， N' -二芐乙烯二胺，N-甲基葡萄糖胺，氯普魯卡因，膽堿，二乙醇胺，乙二胺，普魯卡因等。本發(fā)明的藥物組合物也可包括藥學(xué)可接受的抗氧化劑。藥學(xué)可接受的抗氧化劑之 例包括(1)水溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸，半胱氨酸鹽酸鹽，硫酸氫鈉，焦亞硫酸鈉，亞 硫酸鈉等；( 油溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸棕櫚酸酯，丁羥茴醚(BHA)，丁羥甲苯(BHT)， 卵磷脂，掊酸丙酯，α-生育酚，等；及⑶金屬螯合劑，例如檸檬酸，乙二胺四乙酸(EDTA)， 山梨糖醇，酒石酸，磷酸，等?？捎糜诒景l(fā)明的藥物組合物的適宜水和非水載質(zhì)之例包括水，乙醇，多元醇(例 如甘油，丙二醇，聚乙二醇，等)，及其適宜混合物；植物油，例如橄欖油；及可注射的有機(jī)酯 類，例如油酸乙酯?？衫纾ㄟ^使用包被材料(例如卵磷脂)，通過維持所需的顆粒尺寸 (分散液的情況中)，及通過使用表面活性劑來維持適當(dāng)?shù)牧鲃有?。這些組合物還可含佐劑，例如防腐劑，潤濕劑，乳化劑及分散劑?？赏ㄟ^之前的滅 菌過程，及通過包含各種抗細(xì)菌及抗真菌劑(例如，對羥基苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚山 梨酸，等)來確保防止微生物的存在。組合物中還可期望包括等滲劑，例如糖類，氯化鈉， 等。此外，可通過包含延緩吸收的試劑(例如單硬脂酸鋁及明膠)來實(shí)現(xiàn)可注射的藥物形 式的延長的吸收。藥學(xué)可接受的載質(zhì)包括用于臨時(shí)制備無菌可注射溶液或分散液的無菌水溶液或 分散液及無菌粉末。所述介質(zhì)及試劑用于藥學(xué)活性物質(zhì)為本領(lǐng)域所知。除非任何常規(guī)介質(zhì) 或試劑與活性化合物不相容，考慮其用于本發(fā)明的藥物組合物。補(bǔ)充性活性化合物也可合 入組合物。治療性組合物一般必需在制備及保存的條件下無菌及穩(wěn)定。組合物可制成溶液， 微乳劑，脂質(zhì)體，或適宜于高藥物濃度的其他有序結(jié)構(gòu)。載質(zhì)可為含，例如，水，乙醇，多元醇 (例如，甘油，丙二醇，及液體聚乙二醇，等)，及其適宜混合物的溶劑或分散介質(zhì)?？衫?， 通過使用涂層(例如卵磷脂)，通過維持所需的顆粒尺寸(分散液的情況中)，及通過使用 表面活性劑來維持適當(dāng)?shù)牧鲃有?。許多情況下，組合物中會優(yōu)選包括等滲劑，例如，糖類，多 元醇(例如甘露糖醇，山梨糖醇)，或氯化鈉?？赏ㄟ^組合物中包括延緩吸收的試劑(例如， 單硬脂酸鹽及明膠)來實(shí)現(xiàn)可注射的組合物的延長的吸收。根據(jù)需要，可通過將活性化合物以所需量合入含上列成分之一或它們的組合的適 當(dāng)?shù)娜軇﹣碇苽錈o菌可注射溶液，然后滅菌微過濾。一般而言，通過將活性化合物合入含基 礎(chǔ)分散介質(zhì)及所需的其他以上所列的成分的無菌媒質(zhì)來制備分散液。用于制備無菌可注射 溶液的無菌粉末的情況中，優(yōu)選的制備方法是由之前無菌過濾的其溶液產(chǎn)生活性成分加任 何其他所需成分的粉末的真空干燥及冷凍干燥(冷凍干燥)?？膳c載質(zhì)物質(zhì)組合來產(chǎn)生單劑型的活性成分的量會依賴于被治療的受試者，及特
10定施用模式而變化。可與載質(zhì)物質(zhì)組合來產(chǎn)生單劑型的活性成分的量會通常是產(chǎn)生治療效 果的組合物的量。一般而言，以百分率計(jì)，此量會為從約0.01%到約99%的活性成分，優(yōu)選 從約0. 到約70%，最優(yōu)選從約到約30%的活性成分與藥學(xué)可接受的載質(zhì)組合。調(diào)整劑量方案以提供最佳所需反應(yīng)(例如，治療性反應(yīng))。例如，可施用單個(gè)藥丸， 可經(jīng)時(shí)施用幾個(gè)份劑，或劑量可根據(jù)治療狀況的急迫程度按比例減少或增加。就施用容易 度及劑量均一性，以劑量單元形式配制經(jīng)腸外組合物尤其有優(yōu)勢。本文所用的劑量單元形 式是指適于作為針對待治療的受試者的單元?jiǎng)┬偷奈锢黼x散的單元；各單元含計(jì)算為結(jié)合 所需藥物載質(zhì)產(chǎn)生所需治療效果的預(yù)定量的活性化合物。本發(fā)明的劑量單元形式的規(guī)格取 決于及直接依賴于(a)待達(dá)到的活性化合物的獨(dú)特性質(zhì)及特定治療效果，及(b)就個(gè)體中 所述活性化合物的治療靈敏度的配藥領(lǐng)域固有的限制。表1 接頭和scFv序列
權(quán)利要求
1.多肽，其包括通過氨基酸接頭連接的2個(gè)結(jié)構(gòu)域； 其中所述接頭包括能形成鏈內(nèi)二硫鍵的2個(gè)半胱氨酸，且其中當(dāng)2個(gè)半胱氨酸通過二硫鍵彼此鍵合時(shí)，所述接頭序列中的半胱氨酸之間的氨基 酸形成環(huán)。
2.權(quán)利要求1的多肽，其中所述接頭包括SEQID NO :1所示的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1的多肽，其中所述接頭包括SEQID NO :2所示的氨基酸序列。
4.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的多肽，其中所述環(huán)結(jié)合靶分子。
5.權(quán)利要求5的多肽，其中所述靶分子是1 修飾物。
6.權(quán)利要求5的多肽，其中所述1 修飾物是血清白蛋白。
7.權(quán)利要求5的多肽，其中所述1 修飾物是透明質(zhì)酸。
8.權(quán)利要求1的多肽，其中所述接頭包括SEQID NO :3所示的氨基酸序列。
9.權(quán)利要求1的多肽，其中所述接頭包括SEQID NO :4所示的氨基酸序列。
10.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的多肽，其中所述多肽是免疫結(jié)合子。
11.權(quán)利要求10的多肽，其為scFv。
12.權(quán)利要求1的多肽，其包括SEQID NO :6或8所示的氨基酸序列。
13.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的多肽，其中所述接頭中的至少一個(gè)半胱氨酸殘基共價(jià)連 接到官能部分。
14.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的多肽，其中所述接頭中的2個(gè)半胱氨酸殘基共價(jià)連接到 相同的官能部分。
15.權(quán)利要求13或14的多肽，其中所述官能部分是PEG。
16.組合物，其包括前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的多肽，及藥學(xué)可接受的載質(zhì)。
17.分離的核酸分子，其編碼前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的多肽。
18.表達(dá)載體，其包括權(quán)利要求17的核酸分子。
19.宿主細(xì)胞，其包括權(quán)利要求18的表達(dá)載體。
20.產(chǎn)生官能化的多肽的方法，包括(a)提供肽序列的庫；(b)從所述庫中鑒定結(jié)合靶分子的至少一種肽序列；(c)修飾含接頭的多肽的環(huán)區(qū)，以包括步驟(b)中鑒定的至少一種肽序列，由此生產(chǎn)官 能化的多肽。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述鑒定步驟使用噬菌體展示，酵母展示，或mRNA展示進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明提供官能化的多肽，尤其是治療性多肽(例如，scFv)，其包括可通過添加一個(gè)或官能部分(例如，PEG)或結(jié)合特異性(例如，有特定結(jié)合特異性的氨基酸序列)來快速及特異性地官能化的接頭序列。所述官能化的多肽的優(yōu)點(diǎn)在于，它們相比非官能化的多肽具有改善的藥代動力學(xué)性質(zhì)(例如，改善的體內(nèi)半衰期，組織滲透及組織停留時(shí)間)。還提供了快速及可再現(xiàn)產(chǎn)生官能化的多肽的方法。
文檔編號C07K16/22GK102089431SQ200980124781
公開日2011年6月8日 申請日期2009年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月30日
發(fā)明者D·厄里什 申請人:艾斯巴技術(shù),愛爾康生物醫(yī)藥研究裝置有限責(zé)任公司