專利名稱：免疫誘導劑及癌的檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種作為癌的治療及/或預防劑等有用的新型免疫誘導劑。另外，本 發(fā)明涉及一種新型的癌的檢測方法。
背景技術：
癌癥是占據所有死亡原因第一位的疾病，目前進行的治療以手術療法為主，組合 使用放射療法和化學療法。近年來，盡管開發(fā)了新的手術方法并發(fā)現(xiàn)了新的抗癌劑，但現(xiàn)狀 是除了部分癌癥之外，癌的治療效果仍未見提高。近年來，由于分子生物學和癌免疫學的進 步，逐漸能夠鑒定出被與癌反應的細胞毒性T細胞所識別的癌抗原類、及編碼癌抗原的基 因類等，對抗原特異性免疫療法的期待日漸高漲(非專利文獻1)。在免疫療法中，為了減輕副作用，作為其抗原被識別的肽、多肽或蛋白必須在正常 細胞中幾乎不存在，而特異性地存在于癌細胞中。1991年，比利時Ludwig研究所的Boon等 人通過使用自身癌細胞株與癌反應性T細胞的cDNA表達克隆法，分離出CD8陽性T細胞識 別的人黑色素瘤抗原MAGEl (非專利文獻2)。之后，報導了采用基因表達克隆的方法鑒別 在癌癥患者體內與自身的癌反應產生的抗體所識別的腫瘤抗原，即SEREX法(serological identifications of antigens by recombinant expression cloning)(與一專禾ll文獻3 ；專 利文獻1)，通過該方法，分離出一些癌抗原(非專利文獻4 9)。進而，正在開始進行以其 一部分作為靶的癌癥免疫療法的臨床試驗。另一方面，已知犬和貓與人相同，有乳腺癌、白血病、淋巴瘤等多種腫瘤，并在犬和 貓的疾病統(tǒng)計中排名較高。然而，目前針對犬和貓尚無有效的治療藥物及預防藥物。大部 分犬和貓的腫瘤，幾乎都是在腫瘤進行性擴大后，方為飼主察覺，入院之后，即使通過外科 手術切除并給與人類藥物(抗癌劑等)，多數(shù)情況下為時已晚，在處理后不久即死亡。在上 述現(xiàn)狀下，如有可能獲得對犬和貓有效的癌癥治療藥物及預防藥物，則可以期望開拓其針 對犬的癌癥的用途。另外，如果能在早期發(fā)現(xiàn)癌癥，則治療效果較好，因此尋求一種對癌癥患者沒有體 力、經濟負擔的可以使用血清或尿等簡便地進行檢查的癌癥的檢測方法。作為使用血液或 尿的癌檢測法，最近開始普及測定腫瘤標記物等腫瘤產物的方法。所謂腫瘤產物，是指與腫 瘤相關的抗原、酶、特定的蛋白質、代謝產物、腫瘤基因、腫瘤基因產物及腫瘤抑制基因等， 在一部分癌癥中，癌胚抗原CEA、糖蛋白CA19-9、CA125、前列腺特異抗原PSA、由甲狀腺產生 的肽類激素即降鈣素等作為腫瘤標記物有效運用于癌癥檢測中(非專利文獻10)。但是，在 大多癌癥種類中，不存在對癌癥檢測有用的腫瘤標記物。另外，目前已知的大部分腫瘤標記 物在體液中僅存在極微量(pg/mL級程度)，因此，為了檢測上述腫瘤標記物，需要高靈敏度 的測定法及特殊的技術。在上述現(xiàn)狀中，如果能提供可以用簡便的操作高靈敏度地檢測出 各種癌癥的新型癌癥檢測方法，可以期待開發(fā)其針對各種癌癥的診斷用途。已知⑶179b是免疫球蛋白的替代輕鏈的一部分，且在B細胞的前體細胞(前B細 胞及原B細胞)的膜表面表達。伴隨B細胞的分化而消失，在成熟的B細胞中不表達。然而，已知CD179b在前B細胞癌化的白血病(前B細胞性白血病)細胞中表達(非專利文獻 10、11)。另外，已知⑶179b在前B細胞癌變的淋巴瘤(前B細胞性淋巴瘤)細胞中也表 達，且可以作為前B細胞性淋巴瘤的診斷標記物使用(非專利文獻12)。然而，沒有報道其 在前B細胞性白血病細胞以外的白血病細胞、前B細胞性淋巴瘤以外的淋巴瘤及乳癌細胞 等中特異性地表達。另外，沒有報道暗示增強針對⑶179b的免疫對癌的治療及/或預防有 用。專利文獻1 美國專利第5698396號非專利文獻1 秋吉毅，“癌與化學療法”，1997年，第M卷，P551-519非專利文獻2 =Bruggen P. et al.，Science, 254 :1643-1647(1991)非專利文獻3 :Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92 :11810-11813(1995)非專利文獻4 :Int. J. Cancer, 72 :965-971(1997)非專利文獻5 =Cancer Res.，58 1034-1041 (1998)非專利文獻6 Int. J. Cancer, 29 :652-658 (1998)非專利文獻7 :Int. J. Oncol.，14 :703-708 (1999)非專利文獻8 =Cancer Res.，56 :4766-4772 (1996)非專利文獻9 :Hum. Mol. Genet 6:33-39(1997)非專利文獻10 :Adv. Immunol.，63 1-41 (1996)非專利文獻11 :Blood,92 :4317-4324(1998)非專利文獻12 =Modern Pathology, 17 :423-429(2004)

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于發(fā)現(xiàn)一種作為癌的治療及/或預防劑等有用的新型多肽，并提 供該多肽作為免疫誘導劑的應用。進而，本發(fā)明的目的在于提供一種對癌的診斷有用的癌 的檢測方法。本發(fā)明人等經過深入研究，結果通過使用來自犬乳癌組織的cDNA文庫及同一罹 癌犬血清的SEREX法，獲得cDNA，所述cDNA編碼與來自罹癌生物體的血清中存在的抗體相 結合的蛋白質，并以此cDNA為基礎，制作具有序列表的序列號5 93中奇數(shù)序列號(即， 序列號5、7、9、11、13、15、...91或93)表示的氨基酸序列的犬⑶179b多肽。另外，以獲得 基因的人同源性基因為基礎，制作具有序列號3表示的氨基酸序列的人CD179b多肽，同樣 地以牛同源性基因為基礎，制作具有序列號95表示的氨基酸序列的牛CD179b多肽。發(fā)現(xiàn) 上述⑶179b多肽在乳癌、白血病及淋巴瘤細胞中特異性表達。進而，發(fā)現(xiàn)通過向生物體給 與上述⑶179b，可以在生物體內誘導針對⑶179b的免疫細胞，及可以使表達⑶179b的生 物體內的腫瘤萎縮。進而，發(fā)現(xiàn)重組載體在生物體內誘導對于表達⑶179b的癌的抗腫瘤效 果，所述重組載體含有能夠表達編碼⑶179b多肽或其片段的多核苷酸。進而，發(fā)現(xiàn)CD179b蛋白中的部分多肽被抗原呈遞細胞呈遞，具有活化及增殖對該 肽特異性的細胞毒性T細胞的能力(免疫誘導活性)，因此，該肽對癌的治療及/或預防有 用，另外，與該肽接觸的抗原呈遞細胞、和與該抗原呈遞細胞接觸的T細胞對癌的治療及/ 或預防有用。進而，發(fā)現(xiàn)以上述CD179b蛋白的氨基酸序列為基礎制作的重組多肽，只特異 性地與罹癌生物體中的血清反應，因此可以檢測出癌。根據以上結果，完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明具有以下特征。(1) 一種免疫誘導劑，所述免疫誘導劑含有多肽或重組載體作為有效成分，所述多 肽為選自以下(a) (c)的多肽類、且具有免疫誘導活性的至少一個多肽，所述重組載體含 有編碼該多肽的多核苷酸、且能夠在生物體內表達該多肽。(a)多肽，由序列表的序列號3 95中奇數(shù)序列號表示的氨基酸序列中連續(xù)7個 以上的氨基酸組成，(b)多肽，與上述(a)的多肽具有90%以上的序列同源性、且由7個以上的氨基酸 組成，(c)多肽，包含上述(a)或(b)的多肽作為部分序列。(2)如上述(1)的免疫誘導劑，其中，上述(b)的多肽為與上述(a)的多肽具有 95%以上的序列同源性的多肽。(3)如上述(1)的免疫誘導劑，其中，上述具有免疫誘導活性的多肽為由序列表的 序列號3 95中奇數(shù)序列號表示的氨基酸序列中連續(xù)7個以上的氨基酸組成的多肽、或包 含該多肽作為部分序列的多肽。(4)如上述(3)的免疫誘導劑，其中，上述具有免疫誘導活性的多肽為具有序列表 的序列號3 95中奇數(shù)序列號表示的氨基酸序列的多肽。(5)如上述(3)的免疫誘導劑，其中，上述具有免疫誘導活性的多肽為由序列表的 序列號3 95中奇數(shù)序列號表示的氨基酸序列中的aal-34或aa52_75的區(qū)域內連續(xù)7個 以上氨基酸序列組成的多肽、或包含該多肽作為部分序列的多肽。(6)如上述(5)的免疫誘導劑，其中，上述具有免疫誘導活性的多肽為由序列表的 序列號108、序列號109、序列號110、序列號111、序列號112、序列號113、序列號114、序列 號115、序列號116或序列號117組成的多肽，或包含序列表的序列號108、序列號109、序列 號110、序列號111、序列號112、序列號113、序列號114、序列號115、序列號116或序列號 117表示的氨基酸序列作為部分序列，且氨基酸殘基數(shù)為8 12的多肽。(7)如上述⑴ (6)中任一項的免疫誘導劑，所述免疫誘導劑含有1個或多個上 述多肽作為有效成分。(8)如上述(7)的免疫誘導劑，其中，上述多肽為抗原呈遞細胞的處理劑。(9)如上述⑴ ⑶中任一項的免疫誘導劑，所述免疫誘導劑用于動物的癌的治
療及/或預防。(10)如上述(9)的免疫誘導劑，其中，上述癌為表達⑶179b基因的癌。(11)如上述(10)的免疫誘導劑，其中，上述癌為乳癌、白血病或淋巴瘤。(12)如上述(1) (11)中任一項的免疫誘導劑，所述免疫誘導劑還含有免疫增強 劑。(13) 一種分離抗原呈遞細胞，所述分離抗原呈遞細胞含有上述具有免疫誘導活性 的多肽和HLA分子的復合物。(14) 一種分離T細胞，所述分離T細胞與上述具有免疫誘導活性的多肽和HLA分 子的復合物選擇性結合。(15) 一種免疫誘導方法，包括給與個體多肽或重組載體，所述多肽為選自下述 (a) (c)的多肽類、且具有免疫誘導活性的至少1個多肽，所述重組載體含有編碼該多肽的多核苷酸、且能夠在生物體內表達該多肽。(a)多肽，由序列表的序列號3 95中奇數(shù)序列號表示的氨基酸序列中連續(xù)7個 以上氨基酸組成。(b)多肽，與上述(a)的多肽具有90%以上的序列同源性、且由7個以上的氨基酸 組成。(c)多肽，包含上述(a)或(b)的多肽作為部分序列。(16) 一種癌的檢測方法，為針對從生物體分離的試樣進行的方法，包括測定以下 (a) (c)中至少任一多肽的表達。(a)多肽，由序列表的序列號3 95中奇數(shù)序列號表示的氨基酸序列中連續(xù)7個 以上的氨基酸組成，(b)多肽，與上述(a)的多肽具有90%以上的序列同源性、且由7個以上氨基酸組 成，(c)多肽，包含上述(a)或(b)的多肽作為部分序列。(17)如上述(16)所述的方法，其中，上述多肽的表達的測定通過免疫測定抗體來 進行，所述抗體可以包含在上述試樣中、針對應測定的上述多肽在上述生物體內被誘導。(18) 一種癌的檢測方法，為針對從生物體分離的試樣進行的方法，包括分析具有 編碼區(qū)的CD179b基因的表達，將其與來自健康人的試樣中該基因的表達量進行比較，所述 編碼區(qū)具有來自癌患者的試樣中序列表的序列號1或序列號4 94中偶數(shù)序列號表示的 堿基序列。(19) 一種癌檢測用試劑，含有與針對以下(a) (c)中任一多肽、與在生物體內被 誘導的抗體發(fā)生抗原抗體反應的多肽。(a)多肽，由序列表的序列號3 95中奇數(shù)序列號表示的氨基酸序列中連續(xù)7個 以上氨基酸組成，(b)多肽，與上述(a)的多肽具有90%以上的序列同源性、且由7個以上氨基酸組 成，(c)多肽，包含上述(a)或(b)的多肽作為部分序列。通過本發(fā)明，提供了一種作為癌的治療及/或預防等有用的新型免疫誘導劑。如 下述實施例中具體說明所示，向罹癌犬給與本發(fā)明中使用的多肽時，可以在該罹癌動物體 內誘導免疫細胞，進而能夠使已經生成的癌縮小或萎縮。另外，根據本發(fā)明，提供了一種新型的癌的檢測方法。根據本發(fā)明的方法測定試樣 中的上述多肽的表達時，也可以檢測出肉眼看不見的較小尺寸的癌和體內深處的癌，因此 對健康診斷等中的癌的早期發(fā)現(xiàn)也有用。另外，如在癌治療后的患者的跟進觀察中利用本 發(fā)明的方法，則也可以在早期檢測出復發(fā)的癌。進而，根據本發(fā)明的方法，也可以診斷癌的 進展程度，包括腫瘤的增大、向周邊組織的侵入、癌向淋巴結及遠處器官的轉移。


[圖1]為表示編碼CD179b蛋白的基因在正常組織及腫瘤細胞株中的表達譜的 圖。標號1 編碼⑶179b蛋白的基因的表達譜；標號2 表示GAPDH基因的表達譜。需要 說明的是，圖1中，縱軸的標號1表示上述鑒定的基因表達譜，標號2表示作為比較對照的GAPDH基因的表達譜。[圖2]圖2中，橫軸的標號3、4、5、6、7、8、9、10，分別表示由于來自T2細胞的刺激 而引起的HLA-A0201陽性CD8陽性T細胞產生IFN- γ的能力，所述Τ2細胞用序列號108、
109、110、113、114、115、116、117的肽進行脈沖。標號11表示關于序列號118陰性對照的肽 (作為本發(fā)明的范圍外的序列的肽)的結果。[圖3]圖3中，橫軸的標號12、13、14、15、16、17、18、19，分別表示^^40201陽性 的⑶8陽性T細胞對Namalwa細胞的細胞毒性，所述T細胞使用序列號108、109、110、113、 114、115、116、117刺激。標號20表示使用陰性對照的肽(序列號118)誘導的⑶8陽性T 細胞的細胞毒性。[圖4]圖4中，橫軸的標號21、22、23、對、25，分別表示由于來自JTK-LCL細胞的 刺激而引起HLA-AM陽性⑶8陽性T細胞產生IFN- γ的能力，所述JTK-LCL細胞用序列號
110、111、112、115、116的肽進行脈沖。標號沈表示關于序列號118的陰性對照的肽的結果。[圖5]圖5中，橫軸的標號27、觀、29、30、31，分別表示HLA-A24陽性的CD8陽性T 細胞對JTK-LCL細胞的細胞毒性，所述T細胞使用序列號110、111、112、115、116的肽刺激。 標號32表示使用陰性對照的肽(序列號118)誘導的CD8陽性T細胞的細胞毒性。
具體實施例方式〈多肽〉作為本發(fā)明免疫誘導劑中作為有效成分所含的多肽，可以舉出選自以下(a)、(b) 及(c)的多肽類中的1個或多個多肽。(a)由具有序列表的序列號3 95中奇數(shù)序列號(S卩，序列號3、5、7、9、11、13、 15、. . . 93或95)表示的氨基酸序列的多肽中的連續(xù)7個以上氨基酸組成的、具有免疫誘導 活性的多肽，(b)與上述(a)的多肽具有90%以上的序列同源性、且由7個以上氨基酸組成的、 具有免疫誘導活性的多肽，(c)含有上述(a)或(b)的多肽作為部分序列、具有免疫誘導活性的多肽。本發(fā)明中使用的所謂“多肽”，是指多個氨基酸通過肽鍵形成的分子，不僅包括構 成的氨基酸數(shù)量多的多肽分子，也包括氨基酸數(shù)量少的低分子量的分子(寡肽)和全長分 子，在本發(fā)明中，還包括由序列號3、5、7、9、11、13、15、. . . 93或95的全長組成的蛋白質。在本說明書中使用的所謂“具有氨基酸序列”，是指氨基酸殘基按照特定的順序排 列。因此，例如所謂“具有序列號3表示的氨基酸序列的多肽”，是指具有序列號3表示的 Leu Leu Arg Pro...(省略)...Ala Glu Cys Ser的氨基酸序列，大小為176個氨基酸殘基 的多肽。另外，例如有時將“具有序列號3表示的氨基酸序列的多肽”簡稱為“序列號3的 多肽”?！熬哂袎A基序列”之類的表達也相同。本說明書中使用的所謂“免疫誘導活性”，是指在生物內對分泌干擾素等細胞因子 的免疫細胞加以誘導的能力。上述多肽是否具有免疫誘導活性可以通過例如公知的ELISP0T法等確認。具體 而言，例如如下述實施例所述，從給與應評價免疫誘導活性的多肽的生物體中，獲得末梢血單核細胞等細胞，將該細胞與該多肽共同培養(yǎng)，通過使用特異性抗體測定來自該細胞的 IFN-γ、白細胞介素(IL)等細胞因子及/或趨化因子的生成量，可以測定該細胞中免疫細 胞的數(shù)量，從而可以評價免疫誘導活性?；蛘撸缦率鰧嵤├?，向罹 癌動物給與基于序列號3、5、7、9、11、13、15、... 93 或95的氨基酸序列制成的重組多肽時，也可以通過其免疫誘導活性使腫瘤縮小或萎縮。因 此，上述免疫誘導活性，也可以作為抑制表達序列號3、5、7、9、11、13、15、... 93或95的多肽 的癌細胞的增殖或使癌組織(腫瘤)縮小或消失的能力(以下稱作“抗腫瘤活性”)進行評 價。多肽的抗腫瘤活性，例如如下述實施例中具體所述，實際上可以在向罹癌動物給與該多 肽后，通過分析是否使腫瘤縮小或萎縮來進行確認?；蛘?，通過分析由上述多肽所刺激的T細胞(即，與呈遞該多肽的抗原呈遞細胞相 接觸的T細胞)是否在生物體外顯示出對腫瘤細胞的細胞毒性，也可評價多肽的抗腫瘤活 性。T細胞與抗原呈遞細胞的接觸，如下所述，可以通過在液體培養(yǎng)基中將兩者共同培養(yǎng)來 進行。細胞毒性的測定，可以通過例如Int. J. Cancer, 58 :p317，1994中記載的被稱作51Cr 釋放法的公知方法來進行。將上述多肽用于癌的治療及/或預防用途時，沒有特別限定，但優(yōu)選以抗腫瘤活 性作為指標對免疫誘導活性進行評價。本發(fā)明公開的序列表中序列號3、5、7、9、11、13、15、... 93或95分別表示的氨基酸 序列，是通過使用來自犬乳腺癌的cDNA文庫與同一患病犬的血清的SEREX法，以與特異性 存在于來自罹癌犬血清中的抗體相結合的多肽、及該多肽的人同源因子(同源物)的形式 被分離出的、CD179b的氨基酸序列(參照下述實施例1)。上述(a)的多肽是由具有序列號 3、5、7、9、11、13、15、... 93或95表示的氨基酸序列的多肽中連續(xù)7個以上、優(yōu)選連續(xù)8、9或 10個以上的氨基酸組成，且具有免疫誘導活性多肽。需要說明的是，如該領域中公知的，如 果是約7個氨基酸殘基以上的多肽，則可以發(fā)揮抗原性及免疫原性。因此，只要為序列號3、 5、7、9、11、13、15、... 93或95的氨基酸序列中連續(xù)7個氨基酸殘基以上的多肽，即能夠具 有免疫誘導活性，因此可以用于本發(fā)明的免疫誘導劑的制備。作為通過給與癌抗原多肽進行免疫誘導的原理，已知為多肽被抗原呈遞細胞吞 噬，其后在該細胞內被肽酶分解為更小的片段，呈遞于該細胞的表面上，細胞毒性T細胞等 將其識別，選擇性地殺滅呈遞該抗原的細胞。呈遞到抗原呈遞細胞表面上的多肽的尺寸較 小，氨基酸數(shù)為7 30個左右。因此，從使其呈遞到抗原呈遞細胞表面上的觀點來看，作為 上述(a)的多肽，優(yōu)選方案之一為序列號3、5、7、9、11、13、15、...93或95表示的氨基酸序 列中連續(xù)的7 30個左右，較優(yōu)選由8 30個或9 30個左右的氨基酸組成的多肽。這 些較小尺寸的多肽有時也直接呈遞于抗原呈遞細胞表面，不被抗原呈遞細胞所吞噬。另外，被抗原呈遞細胞所吞噬的多肽在隨機位置被該細胞內的肽酶切斷，產生各 種多肽片段，上述多肽片段呈遞于抗原呈遞細胞表面上，因此，若給與如序列號3、5、7、9、 11、13、15、. . . 93或95的全長序列所示的大尺寸的多肽，則通過抗原呈遞細胞內的分解，必 然會產生對抗原呈遞細胞介導的免疫誘導有效的多肽片段。因此，即使對于抗原呈遞細胞 介導的免疫誘導，也可以使用尺寸大的多肽，氨基酸數(shù)為30以上，更優(yōu)選為100以上，進一 步優(yōu)選為200以上，也可以進一步優(yōu)選序列號3、5、7、9、11、13、15、. . . 93或95的全長序列 的多肽。
進而，本發(fā)明的多肽，通過可以檢索表位肽的檢查方法，例如Biolnfomatics & Moleccular Analysis Selection(BIMAS)的HLA Peptide Binding Predictions (http:// bimas. dcrt. nih. gov/molbio/hla_bind/index. html)進行檢查，可以篩選能成為表位肽的 肽，所述表位肽具有HLA的各種類型的結合基序、由8 12個、優(yōu)選9 10個氨基酸組成。 具體而言，優(yōu)選由序列號3、5、7、9、11、13、15、. . . 93或95表示的氨基酸序列中的aal_34或 aa52-75區(qū)域內的連續(xù)7個以上的氨基酸組成的多肽，進而在序列號3的多肽中，較優(yōu)選序 列號108 117表示的多肽。上述(b)的多肽，是上述(a)的多肽中少數(shù)氨基酸殘基被取代及/或缺失及/或添 加及/或插入得到的多肽，是具有與原序列的序列同源性為80%以上、優(yōu)選為90%以上、較 優(yōu)選為95%以上、更優(yōu)選為98%以上、99%以上、或99. 5%以上、且具有免疫誘導活性的多 肽。一般情況下，即使在蛋白質抗原中將該蛋白質的氨基酸序列中的少數(shù)氨基酸殘基進行 取代、缺失、添加或插入的情況下，有時也具有與原蛋白質幾乎相同的抗原性或免疫原性， 這一點是本領域技術人員所公知的。因此，上述(b)的多肽也可發(fā)揮免疫誘導活性，故可用 于制備本發(fā)明的免疫誘導劑。另外，上述(b)的多肽，也優(yōu)選為將序列號3、5、7、9、11、13、 15、. . . 93或95表示的氨基酸序列中的1個 數(shù)個氨基酸殘基進行取代、缺失、添加及/或 插入得到的多肽。本說明書中，所謂與氨基酸序列或堿基序列相關的“序列同源性”，是將需要比較 的2個氨基酸序列(或堿基序列)的氨基酸殘基(或堿基)盡可能相一致地整齊排列，以 一致的氨基酸殘基數(shù)(或一致的堿基數(shù))兩氨基酸序列(或堿基序列)除以全部氨基酸殘 基數(shù)(或全堿基數(shù))后所得的以百分比(％ )表示的數(shù)值。在進行上述整齊排列時，根據需 要，在加以比較的兩個序列的一者或兩者中插入適當?shù)拈g隔。上述序列的整齊排列，可以使 用例如 BLAST、FASTA、CLUSTAL W等公知的程序進行(Karlin及Altschul，Proc. Natl. Acad. Sci.U. S. Α. ,87 :2264-2268,1993 ；Altschul 等·，Nucleic Acids Res.，25 :3389-3402, 1997)。當有間隔插入時，上述全部氨基酸殘基數(shù)(或總堿基數(shù))，為以1個間隔作為1個氨 基酸殘基(或堿基)計算得到的殘基數(shù)(或堿基數(shù))。用這樣的方法計算出的全部氨基酸 殘基數(shù)(或總堿基數(shù))在加以比較的2個序列間不同時，同源性(％)是將一致的氨基酸殘 基數(shù)(或堿基數(shù))除以較長序列的全部氨基酸殘基數(shù)(或總堿基數(shù))算出的。在氨基酸殘基的取代中，優(yōu)選的取代為保守的氨基酸取代。已知構成天然蛋白 質的20種氨基酸可以根據具有類似的性質分為以下幾組具有低極性側鏈的中性氨基酸 (Gly、lie、Val、Leu、Ala、Met、Pro)，具有親水性側鏈的中性氨基酸(Asn、Gin、Thr, Ser, Tyr、Cys)，酸性氨基酸(Asp、Glu)，堿基性氨基酸(Arg、Lys、His)，芳香族氨基酸(W^Tyr、 Trp，His)，在它們間發(fā)生取代，即保守的取代，多數(shù)情況下不會導致性質的變化。因此，取代 本發(fā)明的上述(a)的多肽中的氨基酸殘基時，通過在上述各組間進行取代，能夠維持免疫 誘導活性的可能性提高。上述(c)的多肽是含有上述(a)或(b)的多肽作為部分序列，且具有免疫誘導活 性的多肽。即，為在上述(a)或(b)的多肽的一端或兩端添加其他氨基酸或多肽、且具有免 疫誘導活性的多肽。上述多肽也可以用于本發(fā)明的免疫誘導劑的制備。上述多肽可以按照例如Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等化 學合成法合成。另外，也可以利用各種市售的肽合成儀器通過常規(guī)方法合成。另外，還可以使用公知的基因工程學方法，制備編碼上述多肽的多核苷酸，將該多核苷酸參入到表達載 體上，導入宿主細胞，在該宿主細胞中使多肽生成，由此獲得目標多肽。編碼上述多肽的多核苷酸可以通過公知的基因工程學方法或使用市售的核酸合 成儀的常規(guī)方法簡單地制備。例如，具有序列號4的堿基序列的DNA可以如下制備使用犬 染色體DNA或cDNA文庫為模板，將一對引物設計成能夠擴增序列號4所示的堿基序列，使 用上述引物進行PCR法，由此制備。若為具有序列號1的堿基序列的DNA，則可以通過使用 人染色體DNA或cDNA文庫作為上述模板同樣地制備。PCR的反應條件可以適當?shù)卦O定，例 如可以舉出如下的條件等將由94°C下30秒(變性)、55°C下30秒 1分鐘(退火退火)、 72°C下2分鐘(延伸)構成的反應過程作為1個循環(huán)，例如進行30個循環(huán)后，在72°C下使 其反應7分鐘，但反應條件并不限定于此。關于PCR的方法、條件等例如記載在Ausubel 等，Short Protocols in Molecular Biology，第 3 片反，A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995)，John Wiley & Sons (特別是第 15 章) 中。另外，基于本說明書的序列表中序列號1 95表示的堿基序列及氨基酸序列的信息， 制備適當?shù)奶结樆蛞?，并用其篩選人、犬或牛等的cDNA文庫，由此能夠分離出所期望的 DNA。cDNA文庫，優(yōu)選由表達序列號3、5、7、9、11、13、15、. . . 93或95的蛋白質的細胞、器官 或組織制成。上述探針或引物的制備、cDNA文庫的構筑、cDNA文庫的篩選、以及靶基因的 克隆等操作是本領域技術人員所公知的，例如可以按照Sambrook等，Molecular Cloning, 第 2 版，Current Protocols in Molecular Biology (1989)，Ausubel 等(上述)等記載的 方法進行。由上述方法獲得的DNA可以獲得編碼上述(a)的多肽的DNA。另外，由于已知 編碼各氨基酸的密碼子，所以可以容易地特定編碼特定的氨基酸序列的多核苷酸的堿基序 列。因此，也能夠容易地特定編碼上述(b)的多肽和(c)的多肽的多核苷酸的堿基序列，故 上述多核苷酸也可以使用市售的核酸合成儀按照常規(guī)方法容易地合成。作為上述宿主細胞，只要是能夠表達上述多肽的細胞即可，作為原核細胞的例子 可以舉出大腸桿菌等，作為真核細胞的例子可以猴腎臟細胞C0S1、中國倉鼠卵巢細胞CH0、 人胚腎細胞HEK293、小鼠胚胎皮膚細胞株OTH3T3等哺乳動物培養(yǎng)細胞，芽殖酵母，裂殖酵 母，蠶細胞、非洲爪蟾卵細胞等，但并不限定于這些。使用原核細胞作為宿主細胞時，作為表達載體使用具有可以在原核細胞中復制起 點、啟動子、核糖體結合部位、多克隆部位、終止子、抗藥基因、營養(yǎng)補充基因等的表達載體。 作為大腸桿菌用表達載體，可以舉出pUC系列、pBlueScriptII、pET表達系統(tǒng)、pGEX表達系 統(tǒng)等。將編碼上述多肽的DNA參入到上述表達載體中，使用該載體轉化原核宿主細胞后，培 養(yǎng)所得的轉化體時，可以在原核宿主細胞中表達上述DNA編碼的多肽。在此情況下，也可使 該多肽以與其他蛋白質(例如，綠色熒光蛋白質(GFP)、谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)等)的 融合蛋白質的形式進行表達。使用真核細胞作為宿主細胞時，作為表達載體使用具有啟動子、剪接區(qū)域、poly-A 附加部位等的真核細胞用表達載體。作為上述表達載體，可以舉出pKAl、pCDM8、pSVK3、 pMSG、pSVL、pBK-CMV、pBK-RSV、EBV 載體、pRS、pcDNA3、pMSG、pYES2 等。與上述同樣地， 將編碼上述多肽的DNA參入到上述表達載體中，用該載體轉化真核宿主細胞后，培養(yǎng)所得 的轉化體時，可以使上述DNA編碼的多肽在真核宿主細胞中表達。當使用pIND/V5-His、 pFLAG-CMV-2、pEGFP-Nl、pEGFP-Cl等作為表達載體時，能夠以附加有Hi s標簽(例如(His)6 (His)ltl)、FLAG標簽、myc標簽、HA標簽、GFP等各種標簽的融合蛋白質的形式，表 達上述多肽。將表達載體導入宿主細胞，可以使用電穿孔法、磷酸鈣法、脂質體法、DEAE葡聚糖 法、顯微注射法等眾所周知的方法。為了從宿主細胞中分離純化目標多肽，可以組合使用公知的分離操作。例如可以 舉出使用尿素等改性劑或表面活性劑進行的處理、超聲波處理、酶消化、鹽析或溶劑分步沉 淀法、透析、離心分離、超濾、凝膠過濾、SDS-PAGE、等電聚焦電泳、離子交換色譜法、疏水色 譜法、親和色譜法、反相色譜法等，但并不限定于此。使用以上方法所得的多肽中，如上所述也可以以與其他任意蛋白質的融含蛋白質 的形式存在。例如可以舉出與谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)或His標簽的融合蛋白質等。上 述以融合蛋白質的形式存在的多肽也作為(c)的多肽包含在本發(fā)明的范圍內。進而，由轉 化細胞表達的多肽在翻譯之后，有時在細胞內進行各種修飾。上述翻譯后經修飾的多肽只 要具有免疫誘導活性，則也包含在本發(fā)明的范圍內。作為上述的翻譯修飾，可以舉出N末端 移除蛋氨酸、N末端乙?；?、附加糖鏈、由細胞內蛋白酶導致的限制分解、肉豆蔻?；?、異戊 二烯化、磷酸化等。<免疫誘導劑>如下述實施例具體所述，對罹癌動物給與上述具有免疫誘導活性的多肽時，可以 使已經產生的腫瘤縮小或萎縮。因此，本發(fā)明的免疫誘導劑可以用作癌的治療及/或預防。本說明書中使用的所謂“腫瘤”及“癌”的術語，是指惡性新生物，可以互換使用。此時，作為對象的癌，為表達⑶179b基因的癌，例如為表達編碼序列號3、5、7、9、 11、13、15、... 93或95表示多肽的基因的癌，優(yōu)選乳癌、白血病及淋巴瘤。上述特定的癌中， 例如包括乳癌(乳腺癌、復合型乳腺癌、乳腺惡性混合腫瘤、乳管內乳頭狀腺癌等)、白血病 (慢性淋巴細胞性白血病等)、淋巴瘤(消化管淋巴瘤、消化器官淋巴瘤、小 中細胞型淋巴 瘤等)等，但并不限定于此。上述多肽、或含有編碼該多肽的多核苷酸、且在生物體內可以表達該多肽的重組 載體，可以用作免疫誘導的治療方法。另外，也可以用作以動物的癌的治療及/或預防為目 的的治療方法，也可以用作還含有免疫增強劑的治療方法。另外，作為對象動物，為哺乳動物，例如包括靈長類、寵物、家畜類、競技用動物等 哺乳動物，優(yōu)選人、犬及貓。本發(fā)明的免疫誘導劑向生物體的給藥途徑，可以口服給與也可以非口服給與，但 優(yōu)選肌肉內投與、皮下給與、靜脈內給與、動脈內給與等非口服給與。以治療癌為目的使用 該免疫誘導劑時，為了提高抗癌作用，如下述實施例所述，可以向為治療對象的腫瘤附近的 所屬淋巴結給與。給與量只要是對免疫誘導有效的量即可，例如當用于癌的治療及/或預 防時，為對癌的治療及/或預防有效的量即可，另外，可根據動物的體重、性別(雄或雌)、癥 狀等變化。對癌的治療及/或預防有效的量，應根據腫瘤的大小或癥狀等適當選擇，但通常 情況下，對于對象動物而言，每1日的有效量為0. 0001 μ g 1000 μ g，優(yōu)選為0. 001 μ g lOOOyg，可分1次或多次給與。優(yōu)選分數(shù)次、數(shù)日 數(shù)月給與。如下述實施例具體所示，本發(fā)明的免疫誘導劑，可以使已經形成的腫瘤縮小或萎 縮。因此，對發(fā)生早期的少數(shù)的癌細胞也能發(fā)揮抗癌作用，從而用于癌癥發(fā)病前或癌癥治療后時，可以防止癌的發(fā)病和復發(fā)，即，本發(fā)明的免疫誘導劑對癌的治療和預防兩方面都有用。本發(fā)明的免疫誘導劑，既可僅由多肽組成，也可與適用于各給藥方式的、藥理學上 允許的填充劑、稀釋劑、賦形劑等添加劑適當混合制成制劑。制劑方法及可使用的添加劑， 在醫(yī)藥制劑的領域眾所周知，可以使用其中任何方法或添加劑。作為添加劑的具體例，可以 舉出生理緩沖液之類的稀釋劑；如砂糖、乳糖、玉米淀粉、磷酸鈣、山梨醇、甘氨酸等賦形劑； 糖漿、明膠、阿拉伯膠、山梨醇、聚氯乙烯、黃芪膠等粘合劑；硬脂酸鎂、聚乙二醇、滑石粉、二 氧化硅等潤滑劑等，但并不限定于此。作為制劑形態(tài)，可以舉出片劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、 糖漿劑等口服劑、吸入劑、注射劑、栓劑、液劑等非口服劑等。上述制劑可通過一般所知的制 法制得。本發(fā)明的免疫誘導劑，可與能夠在生物體內增強免疫應答的免疫增強劑組合使 用。免疫增強劑既可包含在本發(fā)明的免疫誘導劑中，也可作為其他組合物與本發(fā)明的免疫 誘導劑一并給與患者。此處，患者為動物、特別是哺乳動物，優(yōu)選人、犬及貓。作為上述免疫增強劑，例如可以舉出佐劑。佐劑為提供抗原的儲存場所(細胞外 或巨噬細胞內)，活化巨噬細胞、并且刺激特定組的淋巴細胞，由此可以提高免疫應答，從而 可以提高抗癌作用。因此，特別是當將本發(fā)明的免疫誘導劑用于癌的治療及/或預防時，免 疫誘導劑除了包含上述多肽作為有效成分外，優(yōu)選還包含佐劑。在本技術領域多種佐劑眾 所周知，可以使用任一種佐劑。作為佐劑的具體例，可以舉出MPL(SmithKline Beecham), 沙門氏菌屬Mlmonella Minnesota Re 595脂多糖類純化及酸水解后得到的同源物質； QS21 (SmithKline Beecham)、從 Quillja saponaria 提取物中純化所得的 QA-21 皂苷；PCR 申請 W096/33739 (SmithKline Beecham)中記載的 DQS21 ；QS-7、QS-17、QS-18 及 QS-L1 (So 等，Molecules and Cells，1997年，第7卷，pl78_186)；弗氏不完全佐劑；弗氏完全佐劑；維 生素 E ;Montanide ；明礬；CpG 寡核苷酸(例如，Kreig 等，Nature，第 374 卷，p546_549)；多 聚IC(Poly IC)及其衍生物(如多聚ICLC等)以及鯊烯及/或生育酚之類由可生物降解油 制成的各種油包水乳劑等。其中，優(yōu)選弗氏不完全佐劑、Montanide、多聚IC及其衍生物以 及CpG寡核苷酸。上述佐劑和多肽的混合比典型約為1 10 10 1，優(yōu)選約為1 5 5 1，更優(yōu)選約為1 1。不過，佐劑并不限定于上述例子，本領域公知的上述以外的佐 劑在給與本發(fā)明的免疫誘導劑時也可以使用(例如，Goding著，Monoclonal Antibodies Principles and Practice，第2版，1986年)。多肽與佐劑的混合物或乳劑的制備方法，對 于預防接種領域的技術人員來說是眾所周知的。另外，作為上述免疫增強劑，除上述佐劑之外，還可以使用刺激對象免疫應答的因 子。例如，可以將具有刺激淋巴細胞和抗原呈遞細胞的特性的各種細胞因子作為免疫增 強劑，與本發(fā)明的免疫誘導劑組合使用。上述可增強免疫應答的細胞因子多數(shù)為本領域 技術人員所公知，作為其例，可以舉出顯示增強疫苗防御作用的白細胞介素-12(IL-12)、 GM-CSF、1L-18、干擾素α、干擾素β、干擾素ω、干擾素Υ及Flt3配體，但并不限定于此。 這些因子也可用作上述免疫增強劑，可以包含在本發(fā)明的免疫誘導劑中或作為其他組合物 與本發(fā)明的免疫誘導劑并用給與患者?！纯乖蔬f細胞〉
如下述實施例中具體所述，通過使本發(fā)明中使用的上述多肽與抗原呈遞細胞在在 體外接觸，可使抗原呈遞細胞呈遞該多肽。即，上述(a) (G)的多肽可以用作抗原呈遞細 胞的處理劑。此處，作為抗原呈遞細胞，可以舉出用樹狀細胞、B細胞及巨噬細胞，可以優(yōu)選 使用帶有MHC類I分子的樹狀細胞或B細胞。另外，所謂處理劑，是指脈沖抗原呈遞細胞的 藥劑，被脈沖的抗原呈遞細胞可以具有刺激末梢血淋巴細胞的能力，因此可作為疫苗使用。多種MHC類I分子已被鑒定，并周知。人類的MHC分子稱為HLA。作為HLA類I分 子,可以舉出 HLA-A、HLA-B, HLA-C，更具體而言，可以舉出 HLA-Al、HLA-A0201、HLA-A0204、 HLA-A0205、HLA-A0206、HLA-A0207、HLA-Al 1、HLA-A24、HLA-A31、HLA-A6801、HLA-B7、 HLA-B8、HLA-B2705、HLA-B37、HLA-Cw040U HLA-Cw0602 等。帶有MHC類I分子的樹狀細胞或B細胞，可以使用眾所周知的方法由末梢血制 得。例如，從骨髓、臍帶血或患者末梢血中，使用粒細胞巨噬細胞集落激活因子(GM-CSF)與 IL-3(或IL-4)誘導樹狀細胞，并在該培養(yǎng)系中加入腫瘤相關肽，由此可以誘導腫瘤特異性 的樹狀細胞。通過給與有效量的該樹狀細胞，可以誘導出癌癥治療所期望的應答。作為使用的 細胞，可以使用健康者提供的骨髓活臍帶血、患者本人的骨髓或末梢血等，但使用患者本來 的自身細胞時安全性較高，也可以期待避免嚴重的副作用。末梢血或骨髓可以為新鮮試 樣、低溫保存試樣及冷凍保存試樣，均可。末梢血可以培養(yǎng)全血，也可以只分離出白細胞成 分加以培養(yǎng)，但從效率方面考慮，優(yōu)選后者。進而，即使在白細胞成分中也可以分離單核細 胞。另外，以骨髓或臍帶血作為來源時，可以培養(yǎng)構成骨髓的所有細胞，也可以從中分離出 單核細胞加以培養(yǎng)。在末植血或其白細胞成分、骨髓細胞中，包含為樹狀細胞起源的單核細 胞、造血干細胞或未成熟樹狀細胞或CD4陽性細胞等。使用的細胞因子，只要是確認具有 安全性和生理活性特性的物質時，則無論天然型或基因重組型等其生產方法皆可，但優(yōu)選 以必要最低量使用確保能夠用于醫(yī)療的質量的標準品。添加的細胞因子的濃度，只要是可 誘導樹狀細胞的濃度即可，沒有特別的限定，通常細胞因子的總濃度優(yōu)選為10 IOOOng/ ml左右，更優(yōu)選為20 500ng/ml左右。可以使用通常用于白細胞的培養(yǎng)中的眾所周知的 培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度只要可使白細胞增殖即可，沒有特殊限定，但最優(yōu)選人體溫度 的37°C左右。另外，培養(yǎng)中的氣體環(huán)境只要可使白細胞增殖即可，沒有特殊限定，但優(yōu)選通 氣5% C02。進而，培養(yǎng)時間只要是可誘導出必要數(shù)量細胞的時間即可，沒有特殊的限定，但 通常為3天 2周。用于細胞的分離和培養(yǎng)的儀器，可以使用適當?shù)膬x器，但優(yōu)選確認醫(yī)療 用安全性、且操作穩(wěn)定簡單。特別是，對于細胞培養(yǎng)裝置，并不限定于培養(yǎng)皿、燒瓶、燒杯等 一般的容器，也可以使用層合型容器或多段式容器、滾瓶(Roller Bottle)、轉瓶(Spinner Bottle)、袋式培養(yǎng)器、中空纖維柱等。在體外使上述多肽與抗原呈遞細胞接觸的方法本身，可使用眾所周知的方法進 行。例如，可以通過在含有上述多肽的培養(yǎng)液中培養(yǎng)抗原呈遞細胞進行。培養(yǎng)基中的肽濃 度沒有特別限定，但通常為ι μ g/ml 100 μ g/ml左右，優(yōu)選為5 μ g/ml 20 μ g/ml左右。 培養(yǎng)時的細胞密度沒有特別限定，但通常為IO3個細胞/ml IO7個細胞/ml左右，優(yōu)選為 5X IO4個細胞/ml 5X IO6個細胞左右。優(yōu)選根據常規(guī)方法，在5% (X)2氛圍氣中進行培 養(yǎng)。需要說明的是，在抗原呈遞細胞表面上可呈遞的肽的長度，通常最大為30個氨基酸殘 基左右。因此沒有特別限定，但在體外使抗原呈遞細胞與多肽接觸時，也可以將該多肽制成長度大約30個氨基酸殘基以下。通過在上述多肽共存下培養(yǎng)抗原呈遞細胞，該肽被抗原呈遞細胞的MHC分子捕 獲，使其呈遞在抗原呈遞細胞的表面。因此，使用上述多肽，可以制備含有該多肽與MHC分 子的復合物的分離抗原呈遞細胞。上述抗原呈遞細胞在生物體內或體外，針對T細胞呈遞 該多肽，從而誘導該多肽特異性的細胞毒性T細胞，并使其增殖。通過使如上所述制備的含有上述多肽與MHC分子的復合物的抗原呈遞細胞在體 外與T細胞接觸，可以誘導對該多肽特異性的細胞毒性T細胞并使其增殖。其可以通過將 上述抗原呈遞細胞和T細胞在液體培養(yǎng)基中共存培養(yǎng)來進行。例如，可將抗原呈遞細胞懸 浮在液體培養(yǎng)基中，移入微孔板的孔等的容器中，并向其中添加T細胞進行培養(yǎng)，由此進 行。共存培養(yǎng)時的抗原呈遞細胞與T細胞的混合比例，沒有特別限定，但通常細胞數(shù)的比例 為1 1 1 100左右，優(yōu)選為1 5 1 20左右。另外，在液體培養(yǎng)基中懸浮的抗 原呈遞細胞的密度沒有特別限定，但通常為100 1000萬細胞/ml左右、優(yōu)選為10000 100萬細胞/ml左右。共存培養(yǎng)優(yōu)選按照常規(guī)方法，在37°C、5%C02氣氛中進行。培養(yǎng)時間 沒有特別限定，但通常為2天 3周，優(yōu)選為4天 2周左右。另外，共存培養(yǎng)優(yōu)選在例如 IL-2、IL-6、IL-7及IL-12之類的白細胞介素的1種或多種存在下進行。這種情況下，IL-2 及IL-7的濃度通常為5U/ml 20U/ml左右，IL-6的濃度通常為500U/ml 2000U/ml左 右，IL-12的濃度通常為5ng/ml 20ng/ml左右，但均不限于上述范圍。此處，“U”表示活 性單位。上述共存培養(yǎng)，可以追加新鮮的抗原呈遞細胞一次至多次重復進行。例如，舍棄共 存培養(yǎng)后的培養(yǎng)上清液，添加新鮮的抗原呈遞細胞的懸浮液，進一步進行共存培養(yǎng)，上述操 作可以重復1次至數(shù)次。各共存培養(yǎng)的條件可以與上述相同。通過上述的共存培養(yǎng)，可以誘導對該多肽特異性的細胞毒性τ細胞，使其增殖。因 此，使用上述多肽，可以制備選擇性結合該多肽與MHC分子的復合物的分離T細胞。如下述實施例所示，編碼序列號3、5、7、9、11、13、15、. . . 93或95的多肽的基因， 在乳癌細胞、白血病細胞及淋巴瘤細胞中特異性表達。因此，一般認為序列號3、5、7、9、11、 13、15、...93或95的多肽與正常細胞相比顯著多地存在于上述癌細胞中。癌細胞內存在 的多肽的一部分呈遞于癌細胞表面上的MHC分子上，將如上所述制備的細胞毒性T細胞給 與生物體內時，這些細胞毒性T細胞可以以上述被呈遞的多肽為目標毒殺癌細胞。另外，由 于呈遞上述多肽的抗原呈遞細胞在生物體內也可誘導和增殖對該多肽特異性的細胞毒性T 細胞，所以即使通過向生物體內給與該抗原呈遞細胞，也可毒殺癌細胞。即，使用上述多肽 制得的上述細胞毒性T細胞與上述抗原呈遞細胞也與本發(fā)明的免疫誘導劑同樣地作為癌 的治療及/或預防劑有用。在將上述分離抗原呈遞細胞或分離T細胞給與生物體時，為了避免生物體內免疫 應答將這些細胞作為異物加以攻擊，優(yōu)選如上所述使用上述(a) (c)的多肽制備從接受 治療的患者采集的抗原呈遞細胞或T細胞。含有抗原呈遞細胞或分離T細胞作為有效成分的癌的治療及/或預防劑，其給與 途徑優(yōu)選為靜脈內給與及動脈內給與上述的非口服給與。另外，給與量應根據癥狀及給與 目的等適當?shù)剡x擇，但通常為1個 10兆個，優(yōu)選為100萬個 10億個，優(yōu)選數(shù)日至數(shù)月 給與1次上述細胞。制劑例如可以為將細胞懸浮于生理緩沖鹽水中的制劑等，也可以與其 他抗癌劑及細胞因子等并用。另外，也可以添加制劑領域中眾所周知的1種或2種以上的添加劑?！椿蛞呙纭盗硗?，通過在對象動物體內表達編碼上述(a) (C)的多肽的多核苷酸，可以在該 生物體內產生抗體并誘導細胞毒性T細胞，獲得與給與該多肽同等的效果。即，本發(fā)明的免 疫誘導劑，可以含有編碼上述(a)、(b)及(c)的多肽的多核苷酸，含有可以在生物體內表達 該多肽的重組載體作為有效成分。上述可以表達抗原多肽的重組載體，也可被稱為基因疫
田ο用于制備基因疫苗的載體，只要是能夠在對象動物細胞內(優(yōu)選哺乳動物細胞 內)表達的載體即可，沒有特別限定，質粒載體或病毒載體皆可，也可以使用在基因疫苗領 域公知的任何載體。需要說明的是，編碼上述多肽的DNA或RNA等多核苷酸，如上所述可以 使用常規(guī)方法容易地制備。另外，可用本領域技術人員眾所周知的方法將該多核苷酸參入 到載體中。基因疫苗的給與途徑，優(yōu)選肌肉內給與、皮下給與、靜脈內給與、動脈內給與等非 口服給與途徑，其給與量可以根據抗原種類等適當?shù)剡x擇，但通常每Ikg體重以基因疫苗 的重量計為0. 1 μ g IOOmg左右，優(yōu)選為Iyg IOmg左右。作為利用病毒載體的方法，例如可以舉出將編碼上述多肽的多核苷酸參入到逆轉 錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒、疫苗病毒病毒、痘病毒(pox virus)、脊髓灰質炎病 毒、辛德畢斯病毒(Sindbis virus)等RNA病毒或DNA病毒中，并用其感染對象動物的方法。 其中，特別優(yōu)選使用逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、疫苗病毒等的方法。作為其他方法，可以舉出將表達質粒直接給與肌肉內的方法(DNA疫苗法)、脂質 體法、Lipofectin法、顯微注射法、磷酸鈣法、電穿孔法等，特別優(yōu)選DNA疫苗法、脂質體法。為使本發(fā)明使用的編碼上述多肽的基因可實際上作為藥物作用，有將基因直接導 入體內的體內方法、以及從對象動物采集某種細胞，在體外將基因導入該細胞中，然后將該 細胞放回體內的ex vivo方法(日經科學，1994年4月，p. 20-45 ；月刊藥事，1994年，第36 卷，第1號，p. 23-48;實驗醫(yī)學增刊，1994年，第12卷，第15號；及其引用文獻等)。較優(yōu) 選體內方法。通過體內方法給與藥物時，可以按照與治療目標的疾病、癥狀等相應的適當?shù)慕o 與途徑給與。例如，可以通過靜脈、動脈、皮下、肌肉內等途徑給與，或也可以直接給與到腫 瘤存在的患病部位。通過體內方法給與時，例如可以采取液體制劑等制劑形式，但一般而 言，制成含有本發(fā)明中編碼上述多肽的DNA的注射劑等，可以根據需要，添加常用的填充 劑。另外，在含有該DNA的脂質體或膜融合脂質體(仙臺病毒(HVJ)-脂質體等)時，可以 制成懸濁劑、凍結劑、離心分離濃縮凍結劑等的脂質體制劑形式。需要說明的是，在本發(fā)明中，當提及“序列號1表示的堿基序列”時，除序列號1實 際表示的堿基序列外，還包含其互補序列。因此，當提及“具有序列號1表示的堿基序列的 多核苷酸”時，包含具有序列號1實際所示的堿基序列的單鏈多核苷酸、具有其互補堿基序 列的單鏈多核苷酸、及由上述兩者組成的雙鏈多核苷酸。在制備本發(fā)明中使用的編碼多肽 的多核苷酸時，適當選擇任一堿基序列，對于本領域技術人員來說可以容易地選擇?！窗┑臋z測〉作為本發(fā)明的癌的檢測方法，使用從生物體分離的試樣，測定本發(fā)明中使用的多肽的表達。作為使用上述試樣測定多肽表達的方法，可以舉出對針對試樣中所含該多肽的 抗體進行免疫測定方法(第1方法)、對試驗中所含該多肽本身進行免疫測定的方法(第2 方法)、及測定編碼試樣中所含該多肽的mRNA的方法(第3方法)。在本發(fā)明的方法中，可 以用上述任一種方法測定多肽的表達。需要說明的是，在本發(fā)明中，所謂“測定”的用語，也 包括檢測、定量及半定量的任一種。此處，⑶179b可以通過使用來自犬乳癌的cDNA文庫和同一患病犬的血清的SEREX 法，作為與特異性存在于來自罹癌犬的血清中的抗體(癌特異性抗體)相結合的多肽被鑒 定(參見實施例1)。即，在罹癌犬生物體內特異性誘導針對0D179b的抗體。因此，通過測定 針對罹癌生物體內的G9179b的抗體，也可以檢測表達⑶179b的癌癥(參見實施例7)。另 外，通過采用上述第2方法測定作為抗原的CD179b，也可以檢測犬的癌癥。另外，如下述實 施例所述，由于編碼該抗原多肽的mRNA與正常組織相比較顯著地表達于癌、特別是乳癌及 白血病細胞中(參見實施例1)，所以通過測定mRNA，也可以檢測犬的癌癥。需要說明的是， 如上所述，已知CD179b在B細胞的前體細胞(前B細胞)的膜表面表達，因此，報道了在前 B細胞癌變的白血病(前B細胞性白血病)細胞中表達，但是，在本發(fā)明中首次發(fā)現(xiàn)在除前 B細胞性白血病細胞之外的白血病細胞及乳癌細胞中表達的事實。由此，通過分析CD179b 的表達，可以檢測除前B細胞性白血病細胞之外的白血病、淋巴瘤及乳癌。在上述第1方法中，可存在于試樣中的上述癌特異性抗體的測定，可以通過使用 與該抗體發(fā)生抗原抗體反應的抗原物質的免疫測定法簡便地進行。如下述詳述，免疫測定 法本身為眾所周知的常規(guī)方法。作為免疫測定的抗原物質，可以使用上述(a) (c)的多 肽。另外，抗體存在交叉反應性，實際上即使為除作為免疫原的抗原物質之外的分子，分子 上存在與免疫原的表位類似的結構時，其分子通過與針對免疫原被誘導的抗體進行抗原抗 體反應可以結合。例如，在氨基酸序列的同源性高的多肽之間，大多數(shù)情況下表位的結構也 類似，在此種情況下，兩者可以顯示相同的抗原性。如下述實施例中具體所述，序列號3的 來自人多肽，與罹癌犬體內與被誘導的上述抗體發(fā)生抗原抗體反應。因此，在本發(fā)明的第1 方法中，作為免疫測定的抗原，也可以使用來自任一哺乳動物的同源因子。通常，在如蛋白質等具有復雜結構的分子量大的抗原物質的情況下，在分子上存 在結構不同的多個部位。因此，在生物體內，針對上述抗原物質，可以產生分別識別、結合多 個部位的多種抗體。即，在生物體內針對蛋白質等抗原物質所產生的抗體，為作為多種抗體 混合物的多克隆抗體。需要說明的是，本發(fā)明中所謂“多克隆抗體”的情況，是指存在于來 自體內含有抗原物質的生物體的血清中的抗體，針對該抗原物質在該生物體內被誘導的抗 體。試樣中抗體的測定可以通過使用上述多肽作為抗原的免疫測定簡便地進行。免 疫測定本身在本技術領域中眾所周知，按反應方式分類時，包括夾層法、競爭法、凝集法、蛋 白質印跡法等。另外，按標記分類時，包括放射免疫測定、熒光免疫測定、酶免疫測定、生物 素免疫測定等，可以使用任一種方法進行上述抗體的免疫測定。沒有特別限定，但由于夾 層ELISA或凝集法的操作簡便且不需要繁瑣的裝置等，可以優(yōu)選作為本發(fā)明的方法中的上 述抗體的免疫測定方法使用。使用酶作為抗體的標記時，作為酶，只要是滿足轉化數(shù)大、即 使與抗體結合也穩(wěn)定、且使基質特異性地染色等的條件的酶即可，沒有特別的限制，也可以 使用通常的酶免疫測定法中使用的酶，例如過氧化物酶、β -半乳糖苷酶、堿性磷酸酯酶、葡糖氧化酶、乙酰膽堿酯酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶等。另外，也可以使用酶抑 制物質或輔酶等。上述酶與抗體的結合，可以通過使用馬來酰亞胺化合物等交聯(lián)劑的公知 的方法進行。作為基質，可以根據所使用的酶的種類，使用公知的物質。例如，使用過氧化 物酶作為酶時，可以使用3，3’、5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺，另外使用堿性磷酸酯酶作為酶時，可 以使用對硝基酚等。作為放射性同位素，可以使用1251或;3H等常用的放射免疫測定法中 使用的物質。作為熒光色素，可以使用異硫氰酸熒光素(FITC)或四甲基羅丹明異硫氰酸鹽 (TRITC)等常用的熒光抗體法中使用的物質。需要說明的是，上述免疫測定法本身眾所周知，在本說明書中沒有說明的必要，但 簡單記載時，例如，在夾層法中，將作為抗原使用的上述多肽固定在固相上，使其與血清等 試樣反應，清洗后，與適當?shù)亩壙贵w反應，清洗后，測定與固相結合的二級抗體。通過將抗 原多肽固定在固相上，可以容易地除去未結合的二級抗體，因此，優(yōu)選作為本發(fā)明中癌的檢 測方法的方案。作為二級抗體，例如如果試樣來自犬，則可以使用抗犬IgG抗體。通過用上 述列舉的標記物質標記二級抗體，可以測定與固相結合的二級抗體。這樣測定的二級抗體 量相當于血清試樣中的上述抗體量。使用酶作為標記物質時，加入因酶作用而分解、顯色的 基質，用光學方法測定基質的分解量，由此可以測定抗體量。使用放射性同位素作為標記物 質時，使用閃爍計數(shù)器等可以測定放射性同位素發(fā)出的放射線量。本發(fā)明的第2方法中，測定序列號3、5、7、9、11、13、15、...93或95表示的多肽，所 述多肽可以包含在從生物體獲得的試樣中。如上所述，在癌患者中，與序列號3、5、7、9、11、 13、15、... 93或95表示的多肽或其同源因子發(fā)生抗原抗體反應的癌特異性抗體的量顯著 增加，這表明在癌患者體內，作為該癌特異性抗體的抗原的上述多肽或其同源因子的生成 量顯著增多。因此，即使通過測定序列號3、5、7、9、11、13、15、... 93或95表示的多肽或其 同源因子，也可以與上述第1方法同樣地檢測出生物體內的癌。試樣中的多肽的測定，可以通過眾所周知的免疫測定法簡便地進行。具體而言，例 如制作與由序列號3 95中奇數(shù)序列號表示的序列組成的多肽或其同源因子發(fā)生抗原抗 體反應的抗體或其抗原結合性片段，使用抗體或其抗原結合性片段進行免疫測定，由此可 以測定可存在于試樣中的由序列號3 95中奇數(shù)序列號表示的序列組成的多肽或其同源 因子。免疫測定方法本身如上所述為眾所周知的常規(guī)方法。此處，所謂“抗原結合性片段”，是指包含在抗體分子中的Fab片段或F(ab’)2片 段之類具有與抗原的結合能力的抗體片段?？贵w可以為多克隆抗體也可以為單克隆抗體， 但為了免疫測定等，優(yōu)選重現(xiàn)性高的單克隆抗體。以多肽為免疫原的多克隆抗體及單克隆 抗體的制備方法眾所周知，可以按照常規(guī)方法簡便地進行。例如，使多肽與匙孔血藍蛋白 (KLH)或酪蛋白等載體蛋白質結合，用其作為免疫原與佐劑一同對動物免疫，由此可以誘導 針對該多肽的抗體。使從經免疫的動物采集的脾細胞或淋巴細胞之類的抗體產生細胞與骨 髓瘤細胞融合，制作雜交瘤，選擇生成與序列號3、5、7、9、11、13、15、...93或95表示的多肽 或其同源因子相結合的抗體的雜交瘤，使其增殖，可以從培養(yǎng)上清得到以上述蛋白質為對 應抗原的單克隆抗體。需要說明的是，上述方法為眾所周知的常規(guī)方法。在本發(fā)明第3方法中，測定了可包含在從生物體獲得的試樣中、且編碼⑶179b的 mRNA。如下述實施例中具體所示，編碼CD179b的mRNA在癌、特別是乳癌及白血病細胞中顯 著地高表達。因此，即使通過測定試樣中的該mRNA，也可以檢測生物體內的癌。本發(fā)明的檢測方法中，基于如上所述測定得到的多肽的表達量，判斷對象生物體是否患癌等。癌的檢測 也可以只測定對象生物體中多肽的表達，但從提高檢測精度的觀點考慮，優(yōu)選考察1個至 多個健康人試樣中多肽的表達量(抗體量、多肽量或mRNA量)，取得健康人基準值，比較對 象生物體的測定值與該健康人基準值。欲進一步提高檢測精度時，也可以針對從已知罹患 癌癥的多個患者得到的試樣，考察多肽的表達量，取得癌患者基準值，比較對象生物體的測 定值與健康人基準值及癌患者基準值兩方面。上述基準值例如可以如下確定可以將各試 樣中多肽表達量數(shù)值化，算出其平均值。需要說明的是，可以事先考察多個健康人及癌患者 的多肽表達量來確定健康人基準值與癌患者基準值。因此，用本發(fā)明的方法進行與基準值 的比較時，也可以使用預先確定的基準值。在本發(fā)明的檢測方法中，也可以組合使用利用其他癌抗原和癌標記物的檢測。由 此，可以進一步提高癌的檢測精度。根據本發(fā)明的檢測方法，可以檢測生物體內的癌。根據本發(fā)明的方法，也可以檢測 出肉眼看不見的較小尺寸的腫瘤和體內深處的腫瘤，因此對癌的早期發(fā)現(xiàn)有用。另外，如在 對癌的治療后跟進觀察中的患者應用本發(fā)明的檢測方法，則存在癌的復發(fā)時可以在早期檢 測該癌。另外，在罹癌生物體內，如果表達本發(fā)明中作為測定對象的上述規(guī)定的多肽的癌細 胞的數(shù)量增加，則該生物體內的該多肽及其mRNA的蓄積量增大，血清中生成更多針對上述 多肽的抗體。另一方面，如果癌細胞的數(shù)量減少，則生物體內該多肽及其mRNA的蓄積量減 少，血清中針對上述多肽的抗體減少。因此，上述規(guī)定多肽的表達量多時，可以判斷發(fā)生了 腫瘤的增大或癌的轉移，即癌的進展程度在發(fā)展。另外，如下述實施例所示，在同一種類的腫瘤中，在惡性型中的上述抗體量明顯多 于良性型的上述抗體量。因此，上述規(guī)定多肽的表達量多時，可以判斷癌的惡性程度較高。 即，根據本發(fā)明的方法，也可以檢測癌的惡性程度。進而，以上述規(guī)定多肽的表達量的增減為指標，也可以監(jiān)測癌的治療效果。因此， 對于癌的治療中或治療后的個體，通過觀察上述多肽的表達量，可迅速獲得下述線索抗癌 劑的治療效果、腫瘤摘除后是否有殘存腫瘤、進而跟進觀察中的轉移·復發(fā)?？梢赃M行適 當治療時，多肽的表達量比治療前的罹癌狀態(tài)低，因此可以判斷針對上述生物體已進行的 (正在進行的)治療的效果良好。多肽表達量上升或維持時、或一旦下降后可進一步觀察到 上升時，可以判斷治療效果不充分，改變?yōu)槠渌委煼椒ɑ蚋淖兛拱﹦┙o與量等為對治療 方法選擇的有用的判斷材料。作為本發(fā)明的癌的檢測方法的對象癌，是表達CD179b的癌(但是不包括前B細胞 性的癌)，可以舉出乳腺癌、復合型乳腺癌、乳癌惡性混合腫瘤、乳管內乳頭狀腺癌、白血病 (優(yōu)選慢性淋巴細胞性白血病，但不包括前B細胞性的癌)淋巴瘤(優(yōu)選消化管淋巴瘤、消 化器官淋巴瘤、小 中細胞型淋巴瘤、中細胞型淋巴瘤或多中心型淋巴瘤，但不包括前B細 胞性的癌)等，但不并限定于此。另外，作為本發(fā)明方法的對象的生物體為哺乳動物，優(yōu)選 人或犬、貓。作為用于本發(fā)明的方法的試樣，可以舉出血液、血清、血漿、腹水、胸水等體液，組 織、細胞。特別是在上述第1方法及第2方法中，可以優(yōu)選使用血清、血漿、腹水及胸水，另 外，在測定mRNA的上述第3方法中，優(yōu)選組織試樣及細胞試樣。在第1方法中作為免疫測定的抗原使用的上述多肽，可以作為癌檢測試劑提供。該試劑可以只由上述多肽組成，另外，也可以含有對該多肽的穩(wěn)定等有用的各種添加劑等。 另外，該試劑也可以以固定在板或膜等固相上的狀態(tài)進行提供。在第2方法中對序列號3、5、7、9、11、13、15、. .. 93或95表示的多肽或其同源因子 進行免疫測定時使用的、與該多肽或其同源因子發(fā)生抗原抗體反應的抗體或其抗原結合性 片段，也可以作為癌檢測試劑提供。上述情況下，癌檢測試劑可以只由上述抗體或抗原結合 性片段組成，另外，也可以含有對該抗體或抗原結合性片段的穩(wěn)定等有用的各種添加劑等。 另外，該抗體或抗原結合性片段可以與錳或鐵等金屬結合。向體內給與上述金屬結合抗體 或抗原結合性片段時，在抗原蛋白質較多存在的部位，該抗體或抗原結合性片段較多蓄積， 因此利用MRI等測定金屬時，可以檢測產生抗原蛋白質的癌細胞的存在。進而，在第3方法中，mRNA的測定中使用的上述癌檢測用多核苷酸，也可以作為癌 檢測試劑提供。在上述情況下，癌檢測用試劑可以只由該多核苷酸組成，另外，也可以含有 對該多核苷酸的穩(wěn)定等有用的各種添加劑等。該試劑中所包含的該癌檢測用多核苷酸優(yōu)選 引物或探針。實施例以下，基于實施例更具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明的范圍并不限定于以下的具體 例。實施例1 通過SEREX法制取新型癌抗原蛋白(1)構建 cDNA 文庫使用酸-胍-酚-氯仿法(Acid guanidium-Phenol-Chloroform法)從通過手術 摘除的犬乳腺癌組織中提取總RNA，用01igotex-dT30mRNA purification Kit (寶酒造公司 制)，按照該試劑盒所附操作說明書純化多聚A RNA。使用由此所得的mRNA(5 μ g)合成來自犬乳腺癌的cDNA噬菌體文庫。在構 建 cDNA 噬菌體文庫時，使用 cDNA Synthesis Kit、ZAP-cDNA Synthesis Kit、ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit (STRATAGENE公司制)按照試劑盒所附的操作說明書構建 文庫。構建的cDNA噬菌體文庫的大小為2. 99X 105pfu/mlo(2)利用血清篩選cDNA文庫用上述構建的來自犬乳腺癌的cDNA噬菌體文庫進行免疫篩選。具體而言，在 Φ90Χ 15mm的NZY瓊脂糖平板中，感染宿主大腸桿菌(XLl-Blue MRF，)，使其為2340 克隆，在42°C下培養(yǎng)3 4小時，形成溶菌斑(plaque)，在37 °C下，用浸透了 IPTG (異 丙基-β-D-硫代半乳糖苷)的硝酸纖維素濾膜(Hybond C Extra =GE Healthecare Biolcience公司制)覆蓋培養(yǎng)板4小時，由此誘導 表達蛋白質，并使蛋白質轉印到膜上。 之后，回收膜，將其浸泡在含0.5%脫脂奶粉的TBSdOmM Tris-HCl, 150mM NaCl ρΗ7· 5)中， 在4°C下振蕩一晚，由此抑制非特異性反應。在室溫下使此過濾膜與稀釋了 500倍的患病犬 血清反應2 3小時。作為上述患病犬血清，分別使用從摘除了上述乳腺癌的同一患病犬及其他乳腺癌 患病犬收集的共3個血清樣本。上述血清在_80°C下保存，在即將使用前進行前處理。血 清前處理的方法采用如下方法。即，用未插入外來基因的λ ZAP Express噬菌體感染宿主 大腸桿菌(XLl-Blue MRF’)后，在37°C下，在NZY平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)一晚。接著，向培養(yǎng)板 中添加含有0. 5M NaCl的0. 2M NaHCO3 pH8. 3的緩沖液，在4°C下靜置15小時后，回收上清作為大腸桿菌/噬菌體提取液。接著，將回收的大腸桿菌/噬菌體提取液通過NHS-柱(GE Healthecare Bio-Science公司制)，固定化來自大腸桿菌 噬菌體的蛋白質。在此蛋白質 固定化柱中使患病犬血清通過·反應，從血清中除去吸附在大腸桿菌和噬菌體上的抗體。用 含有0.5%脫脂奶粉的TBS將只是僅僅通過柱子的血清餾分稀釋500倍，將其作為免疫篩選 的材料。將經上述處理血清與上述融合蛋白質印跡的膜用TBS-T(0. 05% Tween20/TBS) 清洗4次后，將用含有0.5%脫脂奶粉的TBS稀釋5000倍的山羊抗犬IgG(Goat anti Dog IgG-h+I HRP conjugated =BETHYL Laboratories公司制)作為二級抗體，在室溫下使其反 應1小時，使用NBT/BCIP反應液(Roche公司制)通過酶顯色反應檢測，從Φ90X 15mm的 NZY瓊脂糖平板上采集與顯色反應陽性部位相一致的菌落，使其溶解在500 μ 1 SM緩沖液 (IOOmM NaCl, IOmM MgClSO4, 50mMTris_HCl，0. 01 % 明膠 ρΗ7. 5)中。采用與上述同樣的方 法將顯色反應呈陽性的菌落反復篩選兩次、三次，直至菌落單一化，篩選出與血清中IgG反 應的擬820個噬菌體克隆，分離出45個陽性克隆。(3)分離抗原基因的同源性檢索為了將用上述方法分離所得的45個陽性克隆用于堿基序列解析，進行操作從噬 菌體載體轉化為質粒載體。具體而言，將宿主大腸桿菌(XLl-Blue M RF')制成吸光度0D_ 為1.0的溶液，將上述溶液200 μ 1與250 μ 1經純化的噬菌體溶液以及1μ 1 ExAssist helper phage (STRATAGENE公司制)混合后，在37°C下反應15分鐘，然后，添加3ml LB培 養(yǎng)基，在37°C下進行培養(yǎng)2. 5 3小時，立即在70°C水浴中保持溫度20分鐘后，在4°C下 以IOOOXg離心15分鐘，回收上清作為噬菌粒溶液。接著，將噬粒宿主大腸桿菌(SOLR)制 成吸光度0D_為1. 0的溶液，將上述溶液200 μ 1與10 μ 1經純化的噬菌體溶液混合后，在 37°C下反應15分鐘，取50μ1接種于含有氨芐西林(終濃度50yg/ml)的LB瓊脂培養(yǎng)基 中，在37°C下培養(yǎng)一晚。采集經轉化的SOLR單菌落，在37°C下，用含有氨芐西林(終濃度 50 μ g/ml)的 LB 培養(yǎng)基培養(yǎng)后，使用 QIAGEN plasmid Miniprep Kit (QIAGEN 公司制)，純 化含有目標插入片段的質粒DNA。純化的質粒，可以使用序列號96所記載的T3引物與序列號97所記載的T7引物， 通過引物步移法(primer-walking)來解析插入片段的全長序列。通過該序列解析獲得序 列號4 92的偶數(shù)號所記載的基因序列。使用該基因的堿基序列及氨基酸序列(序列號 5 93的奇數(shù)號)，進行同源性檢索程序BLAST 搜索(http //www. ncbi. nlm. nih. gov/ BLAST/)，進行與已知基因的同源性檢索，結果表明所得的45個基因均為編碼CD179b的基 因。45個基因間的同源性為堿基序列94 99%、氨基酸序列96 99%。該基因與編碼人 同源因子的基因的同源性，在被翻譯為蛋白質的區(qū)域，為堿基序列62 82%、氨基酸序列 69 80%。人同源因子的堿基序列如序列號1所示，氨基酸序列如序列號2及3所示。另 外，該基因與編碼牛同源因子的基因的同源性，在被翻譯為蛋白質的區(qū)域為堿基序列68 82%、氨基酸序列56-77%。牛同源因子的堿基序列如序列號94所示，氨基酸序列如序列 號95所示。需要說明的是，編碼人同源因子的基因與編碼牛同源因子的基因的同源性，在 被翻譯為蛋白質的區(qū)域，為堿基序列62%、氨基酸序列72%。(4)在各組織中的表達解析對于通過上述方法所得的基因，利用RT-PCR(Reverse Transcription-PCR)分析其在犬及人的正常組織及各種細胞株中的表達。逆轉錄反應以下進行。即，使用TRIZOL 試劑(invitrogen公司制)按照所附說明書從50 IOOmg各組織及5 IOXlO6個各 細胞株的細胞中提取總 RNA。通過 Superscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR(invitrogen公司制)，按照所附說明書用上述總RNA合成cDNA。人正常組織(腦、 海馬、睪丸、結腸、胎盤)的 cDNA，使用 Gene Pool cDNA (invitrogen 公司制)、QUICK_Clone cDNA (CL0NETECH 公司制)及 Large-Insert cDNA Library (CL0NETECH 公司制)。PCR 反應 使用對獲得的犬基因具有特異性的引物(序列號98及99所示)及對其人同源基因具有 特異性的引物(序列號100及101所示)如下進行。即，加入各試劑和附加緩沖液使總量 為25 μ 1，其中使通過逆轉錄反應制得的試樣為0. 25μ 1，上述引物各為2μ 1Μ，各dNTP為 0.2mM，ExTaq聚合酶為0.65U(寶酒造公司制)，使用Thermal Cycler (BIO RAD公司制)， 以94°C 30秒、60°C 30秒、72°C 30秒為1循環(huán)，將該循環(huán)重復進行30次。需要說明 的是，對具有上述序列號98及99所示的堿基序列的基因具有特異性的引物，是擴增下述區(qū) 域的引物，所述區(qū)域是序列號4的堿基序列中的32號 341號，及序列號4 92的偶數(shù)號 所示的全部犬CD179b基因中共同的區(qū)域。另外，對具有序列號100及101所示的堿基序列 的基因具有特異性的引物，是擴增序列號1的堿基序列中的216號 738號堿基的區(qū)域的 引物。為了比較對照，同時也使用GAPDH特異性的引物(序列號102及103所示)。其結果 如圖1所示，發(fā)現(xiàn)獲得的犬基因在健康的犬組織中幾乎完全表達，另一方面，在犬乳癌組織 中有強表達。人同源因子的表達中，可以確認到在人正常組織中表達的只有骨髓，在人癌細 胞中檢測到于白血病細胞株及乳癌細胞株中表達，確認到CD179b在白血病細胞株與乳癌 細胞株中特異性表達。需要說明的是，圖1中，縱軸的標號1表示上述鑒定的基因的表達譜，標號2表示 作為比較對照的GAPDH基因的表達譜。實施例2 犬及人新型癌抗原蛋白的制備(1)重組蛋白質的制備基于實施例1取得的序列號4的基因，用以下方法制備重組蛋白質。PCR如下進行 加入各試劑和附加緩沖液使總量為50μ 1，其中，使由實施例1中所得的噬粒溶液制備的用 于序列解析的載體為ι μ 1、使含有NdeI及KpnI限制性酶剪切序列的2種引物(如序列號 104及105所示)各為0. 4 μ M、dNTP為0. 2mM、PrimeSTAR HS聚合酶(寶酒造公司制)為 1.25U。使用 Thermal Cycler (BIO RAD 公司制)，以 98°C 10 秒、68°C 40 秒為 1 循環(huán)，將 該循環(huán)重復進行30次。需要說明的是，上述2種引物是擴增下述區(qū)域的引物，所述區(qū)域是 編碼序列號5的氨基酸序列5號 120號氨基酸的區(qū)域。PCR之后，用2%瓊脂糖凝膠對經 擴增的DNA進行電泳，用QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN公司制)純化出約350bp 的DNA片段。將經純化的DNA片段與克隆載體pCR-Blunt (invitrogen公司制)連接。將其轉 化至大腸桿菌后回收質粒，通過測序列確認經擴增的基因片段與目標序列一致。用NdeI及 KpnI限制性酶處理與目標序列一致的質粒，用QIAquick Gel Extraction Kit純化后，將 目標基因序列插入到經Ndel、KpnI限制性酶處理的大腸桿菌用表達載體pET30b (Novagen 公司制)中。通過使用該載體可生成His標簽融合型的重組蛋白質。將該質粒轉化至表達 用大腸桿菌BL21 (DE3)，通過利用ImMIPTG的表達誘導，能夠使目標蛋白質在大腸桿菌內表達。另外，基于序列號1的基因，用以下方法制備人同源基因的重組蛋白質。PCR如下 進行加入各試劑和附加緩沖液使總量為50 μ 1，其中，使實施例1中制備的各種組織 細胞 cDNA中已經確認通過RT-PCR法表達的cDNA為1 μ 1、使含有EcoRI及Mil限制性酶剪切 序列的2種弓丨物(序列號106及107所記載)各為0. 4 μ M、dNTP為0. 2mM、PrimeSTAR HS 聚合酶(寶酒造公司制)為1. 25U，使用Thermal Cycler (BIO RAD公司制)，以98°C 10 秒、68°C 40秒為1循環(huán)，將該循環(huán)重復進行30次。需要說明的是，上述兩種引物是擴增 下述區(qū)域的引物，所述區(qū)域是編碼序列號3的氨基酸序列全長的區(qū)域。PCR之后，用2%瓊 脂糖凝膠對經擴增的DNA進行電泳，用QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN公司制)純 化約MObp的DNA片段。將經純化的DNA片段與克隆載體pCR-Blunt (invitroge公司制)連接。將其轉化 至大腸桿菌中后回收質粒，通過測序確認經擴增的基因片段與目標序列相一致。用EcoRI 及Mil限制性酶處理與目標序列一致的質粒，用QIAquick Gel Extraction Kit純化后，將 目標基因序列插入到經EcoRI、MlI限制性酶處理的大腸桿菌用表達載體pET30a(NOVagen 公司制)中。通過使用該載體可生成His標簽融合型的重組蛋白質。將該質粒轉化為表達 用大腸桿菌BL21(DE3)，通過利用ImM IPTG進行表達誘導，使目標蛋白質在大腸桿菌內表 達。(2)重組蛋白質的純化將由上述方法得到的、表達序列號1及序列號4的各個重組大腸桿菌在含有 30 μ g/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中在37°C下進行培養(yǎng)直至600nm處吸光度為0. 7左右，然 后，添加異丙基-β-D-l-硫代半乳糖苷至終濃度為ImM，在30°C下培養(yǎng)20小時。之后以 4800rpm離心10分鐘集菌。將此菌體球狀物懸浮在磷酸緩沖生理鹽水中，進而以4800rpm 離心10分鐘，清洗菌體。將上述菌體懸浮在磷酸緩沖生理鹽水中，在冰上進行超聲粉碎聲裂解。將大腸桿 菌超聲裂解液以7000rpm離心分離20分鐘，所得的上清為可溶餾分，沉淀物為不溶餾分。用4% Triton-XlOO溶液懸浮不溶餾分，以7000rpm離心分離20分鐘。重復該操 作2次，進行除蛋白酶的操作。將該殘渣懸浮于含有6M胍鹽酸鹽的20mM磷酸鹽緩沖液(pH8. 0)中，在4°C下靜置 20小時，使蛋白質變性。該變性操作后，以7000rpm離心20分鐘，將所得的可溶餾分加入到 按照常規(guī)方法制備的鎳螯合柱(載體=Chelateing kpharose (商標)Fast Flow (GE Health Care公司)、柱容量5mL、平衡緩沖液含有6M胍鹽酸鹽的20mM磷酸鹽緩沖液(pH8. 0))中。 將未吸附餾分用柱容量10倍量的含有6M胍鹽酸的20mM磷酸鹽緩沖液(pH8. 0)與20mM含 有IOmM咪唑的磷酸鹽緩沖液(pH8. 0)清洗后，立即用分為4個階段的50mM-500mM咪唑階 段性濃度梯度進行洗脫，形成純化餾分，以后將該純化餾分作為給與試驗用的材料。向 Iml 反應用緩沖液(20mM Tris_HCl、50mM NaCl、2mM CaCl2pH7. 4)中分注 200 μ 1 由上述方法所得的純化標準品后，添加2μ 1腸激酶(Novagen公司制)，之后在室溫下靜 置 反應一晚，切斷His標簽，使用 Enterokinase Cleavage Capture Kit (Novagen 公司制) 按照所附說明書進行純化。接著，使用超濾NAN0SEP 10K OMEGA (PALL公司制)將1.2ml用 上述方法所得的純化標準品進行生理用磷酸緩沖液(日水制藥公司制)置換后，用0. 22ymHT Tuffryn Acrodisc (PALL公司制)進行無菌過濾，用于以下的實驗。實施例3 對罹癌犬給與重組蛋白質的試驗(1)抗腫瘤評價評價上述純化的重組蛋白對表皮患有腫瘤的罹癌患病犬(乳癌)的抗腫瘤效果。在100 μ g(0. 5ml)如上述純化的重組多肽中混合等量的弗氏不完全佐劑(和光純 藥公司制)，制備癌癥治療劑。向膀胱附近的所述淋巴結給與該癌癥治療劑共3次，給與時 間分別為初次給與、3日后以及7日后。結果，在給與癌治療劑時大小約為55mm3的腫瘤，在 初次給與癌治療劑10日后縮小至30mm3，20日后縮小至16mm3、30日后縮小至10mm3。另外，在100 μ g(0. 5ml)上述來自犬的多肽中混合0. 5ml弗氏不完全佐劑，將所得 混合物與上述同樣地給與其他乳腺癌的患病犬共3次。另外同時，每次皮下給與IOOyg犬 白細胞介素12。結果，在給與癌癥治療劑時，大小約為155mm3的腫瘤，在初次給與癌治療劑 24日后完全萎縮。(2)免疫誘導能力的評價在給與癌治療劑前以及初次給與10日后及30日后的各時間點，采集上述(1)的 給與試驗中已取得抗腫瘤效果的患病犬的血液，按照常規(guī)方法分離末梢血單核細胞，根據 使用其的IFNy酶聯(lián)免疫斑點法(EliSpot Assay)，對給與的各重組蛋白進行免疫誘導能 力的評價。將70 %乙醇以100 μ L/孔分別添力Π到Millipore公司制的96孔板 (MultiScreen-IP, MAIPS4510)上，靜置5分鐘，吸取并棄去后，用滅菌水清洗，以300 μ L/ 孔添加200mM碳酸氫鈉(pH8. 2)，靜置5分鐘后，吸取并棄去，清洗培養(yǎng)板。然后，將添加在 200mM碳酸氫鈉中的抗犬干擾素γ單克隆抗體(R&D公司制造，clonel42529、MAB781)以 0.5 μ g/孔分別添加在培養(yǎng)板中，在37°C下溫育一晚，使一級抗體固相化。吸取并棄去一級 抗體后，將封閉溶液(1% BSA-5%蔗糖_200mM碳酸氫鈉(pH8. 2))以300 μ L/孔分別添加 到培養(yǎng)板中，在4°C下溫育一晚，封閉培養(yǎng)板。吸取并棄去封閉溶液后，以300 μ L/孔分別添 加含有10%胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基anvitrogen公司制)，靜置5分鐘，吸取并棄去培養(yǎng) 基。之后，將懸浮在含有10%胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基中的各個犬末梢血單核細胞分別以 5 X IO5細胞/孔添加到培養(yǎng)板中，向其中以10 μ L/孔分別添加在每次給藥中使用的來自犬 的多肽或來自人的多肽，在37°C、5% CO2的條件下培養(yǎng)M小時，由此使可存在于末梢血單 核細胞中的免疫細胞產生干擾素Y。培養(yǎng)后，棄去培養(yǎng)基，用清洗液(0. l%Tween20-200mM 碳酸氫鈉(PH8.2))清洗孔6次。將用上述封閉溶液稀釋1000倍的兔抗犬多克隆抗體以 100 μ L/孔分別添加到各個孔中，在4°C下溫育一晚。用上述清洗液清洗孔3次后，將用上 述封閉溶液稀釋1000倍的HRP標記抗兔抗體以100μ L/孔分別添加到各個孔中，在37°C下 反應2小時。用上述清洗液清洗孔3次后，用Konica免疫染色劑(Konica公司制)使其顯 色，用水清洗孔使反應停止，反應停止后，將膜干燥，用KS Elispot (Carl Zeiss公司制)計 算出現(xiàn)的斑點數(shù)。結果，在給與多肽前的末梢血單核細胞中沒有檢測到斑點，另一方面，給 與多肽后的患病犬中，在給與10天后及30天后的末梢血單核細胞中分別檢測出18個、87 個斑點。由以上結果可以確認，在給藥的患病犬中，確認可以誘導免疫細胞，所述免疫細胞 與給與的重組蛋白特異性反應、產生干擾素Y，一般認為通過上述免疫細胞為中心的免疫反應，能夠發(fā)揮上述(1)所述的抗腫瘤效果。實施例4 來自⑶179b的肽表位反應性⑶8陽性T細胞的誘導(1)HLA-A0201與HLA-AM結合的肽基序的預測從GenBank獲得了人CD179b蛋白質的氨基酸序列的信息。為了預測HLA-A0201 與HLA-A24的結合基序，利用使用公知的BIMAS軟件(在http //bimas. dcrt. nih. gov/ m0lbi0/hla_bind/中可以利用)的計算機預測程序，解析人CD 179b蛋白質的氨基酸序列， 選擇了下述肽預計能夠與HLA-A0201分子結合的從序列號108至至序列號110以及從序 列號113至序列號117所示的8種肽、預計能夠與HLA-AM分子結合的從序列號110至序 列號112、序列號115、以及序列號116所示的5種肽。(2)肽表位反應性⑶8陽性T細胞的誘導從HLA-A0201陽性的健康人分離末梢血，重疊在Lymphocyte separation medium(OrganonpTeknika, Durham, NC)上，以500rpm在室溫下離心分離20分鐘?；厥蘸?有PBMC的餾分，在冷磷酸鹽緩沖液中清洗3次(或更多次)，得到末梢血單核細胞(PBMC)。 將所得 PBMC 懸浮在 20ml AIM-V 培養(yǎng)基(Life Technololgies 公司制)中，在 37°C、5% CO2 的條件下使其附著在培養(yǎng)燒瓶(Falcon公司制)中2小時。非附著細胞用于制備T細胞， 附著細胞用于制備樹狀細胞。在AIM-V培養(yǎng)基中、IL-4(1000U/ml)及GM-CSF(1000U/ml)的存在下培養(yǎng)附著細 胞。6 天后，將培養(yǎng)基替換為添加有 IL-4(1000U/ml)、GM-CSF(1000U/ml)、IL-6 (1000U/ml, Genzyme, Cambridge, MA)、IL-I β (lOng/ml, Genzyme, Cambridge, MA)及 TNF-α (lOng/ml, Genzyme, Cambridge,MA)的AIM-V培養(yǎng)基，進一步培養(yǎng)2天后，將所得的非附著細胞集團用 作樹狀細胞。在AIM-V培養(yǎng)基中以IX IO6細胞/ml的細胞密度懸浮制備得到的樹狀細胞，將 上述(1)中選擇的、預計能夠與HLA-A0201分子結合的從序列號108至序列號110、從序列 號113至序列號117所示的肽以10yg/ml的濃度添加到上述懸浮液中，使用96孔板，在 37°C,5% CO2的條件下培養(yǎng)4小時。培養(yǎng)后，用X射線照射(3000rad)，用AIM-V培養(yǎng)基清 洗，在含有 10%人 AB 血清(Nabi，Miami，F(xiàn)L)、IL-6(1000U/ml)及 IL-12 (10ng/ml、Genzyme， Cambridge, ΜΑ)的AIM-V培養(yǎng)基中懸浮，以1 X IO5細胞/孔分別添加到24孔板的每1個 孔中。進而將制備得到的T細胞集團以IX IO6細胞/孔分別添加到各孔中，在37°C、5% CO2的條件下培養(yǎng)。7天后，棄去各個培養(yǎng)上清，與上述同樣地，用得到的各肽處理后，將X射 線照射的樹狀細胞懸浮在含有10%人AB血清(Nabi，Miami, FL)、IL-7 (10U/ml，Genzyme, Cambridge, MA)及 IL-2 (10U/ml、Genzyme，Cambridge, MA)的 AIM-V 培養(yǎng)基中(細胞密度 1 χ IO5細胞/ml)，以1 X IO5細胞/孔分別添加到M孔板的每1個孔中，進一步培養(yǎng)。每隔 7天重復同樣的操作4 6次后，回收刺激的T細胞，利用流式細胞術確認CD8陽性T細胞 的誘導。對于預計能夠與HLA-AM分子結合的序列號110、111、112、115、116所示的肽，使 用HLA-AM陽性的來自健康人末梢血的經誘導的樹狀細胞和T細胞集團，按照與上述同樣 的方法，嘗試肽表位反應性CD8陽性T細胞的誘導。需要說明的是，作為陰性對照，使用作為本發(fā)明范圍之外的序列的肽(序列號 118)。
實施例5 刺激HLA-A0201陽性⑶8陽性T細胞的來自⑶179b的細胞毒性T細胞 抗原表位的確定(1)產生IFN-γ的能力為了分析各個T細胞對肽表位的特異性，所述T細胞在上述誘導的T細胞內可觀 察到增殖，向5X104個使用各肽進行脈沖的、表達HLA-A0201分子的T2細胞(Salter RD et al.，Immunogenetics，21 :2；35_246 (1985)，購自 ATCC)(以 10 μ g/ml 的濃度向 AIM-V 培養(yǎng)基 中添加各肽，在37°C、5% CO2的條件下培養(yǎng)4小時)中添加5X IO3個T細胞，在含有10% 人AB血清的AIM-V培養(yǎng)基中、于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)M小時。取培養(yǎng)后的上清，根據ELISA 法測定IFN-Y的產生量。結果，與使用沒有脈沖肽的T2細胞的孔的培養(yǎng)上清相比，確認了 在使用脈沖了從序列號108至序列號110或從序列號113至序列號117的肽的T2細胞的 孔的培養(yǎng)上清中產生IFN-Y (圖幻。由該結果表明，上述肽特異性地增殖刺激HLA-A0201 陽性⑶8陽性T細胞，為具有誘導IFN- γ產生的能力的T細胞表位肽。需要說明的是，圖2中，橫軸的標號3、4、5、6、7、8、9、10，分別表示由于來自T2細胞 的刺激而產生的HLA-A0201陽性⑶8陽性T細胞產生IFN- γ的能力，所述Τ2細胞用序列 號108、109、110、113、114、115、116、117的肽進行脈沖。標號11表示關于序列號118的陰 性對照的肽的結果。(2)細胞毒性評價接著，分析本發(fā)明中使用的從序列號108至序列號110以及從序列號113至序列 號117的肽是否呈遞在HLA-A0201陽性、且表達⑶179b的腫瘤細胞上的HLA-A0201分子 上，或被此肽刺激的⑶8陽性T細胞是否能夠損傷HLA-A0201陽性、且表達⑶179b的腫瘤 細胞。將IO6個確認了⑶179b表達的B細胞白血病細胞株、Namalwa細胞(購自ATCC)收 集到50ml容量的離心管中，加入100 μ Ci鉻51，在37°C下溫育2小時。之后用含有10% 胎牛血清(Gibco公司制)的RPMI培養(yǎng)基(Gibco公司制)清洗3次，添加到96孔V底板 上，使每孔為IO3個，進一步向每個孔中分別加入5X IO4個⑶8陽性T細胞，所述⑶8陽性 T細胞懸浮在含有10%胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基中、且具有被各肽刺激的HLA-A0201陽性的 肽表位反應性，在37°C、5% CO2的條件下培養(yǎng)4小時。培養(yǎng)后，測定從受到損傷的腫瘤細胞 中釋放的培養(yǎng)上清中的鉻51的量，由此算出被各肽刺激的CD8陽性T細胞的細胞毒性。其 結果表明，被此肽刺激的HLA-A0201陽性的CD8陽性T細胞具有對Namalwa細胞的細胞毒 性(圖3)。用陰性對照的肽(片列號118)誘導的CD8陽性T細胞不顯示細胞毒性。因此， 本發(fā)明中使用的各肽(從序列號108至序列號110以及從序列號113至序列號117)為呈 遞到HLA-A0201陽性、且表達⑶179b的腫瘤細胞上的HLA-A0201分子上的肽，進一步表明， 該肽具有誘導能夠損傷上述腫瘤細胞的CD8陽性細胞毒性T細胞的能力。需要說明的是，如上所述，細胞毒性為下述結構混合IO5個由本發(fā)明中使用的各 肽刺激誘導的⑶8陽性T細胞與IO3個參入了鉻51的B細胞白血病株Namalwa，培養(yǎng)4小 時，培養(yǎng)后測定釋放到培養(yǎng)基中的鉻51的量，以下表示根據計算式*算出的CD8陽性T細 胞針對Namalwa細胞的細胞毒性的結果。*式細胞毒性(％ )=由加入了 CD8陽性T細胞時的Namalwa細胞釋放的鉻51 游離量+由加入了 IN鹽酸的靶細胞釋放的鉻51游離量X 100。需要說明的是，圖3中，橫軸的標號12、13、14、15、16、17、18、19，分別表示 HLA-A0201陽性的⑶8陽性T細胞對Namalwa細胞的細胞毒性，所述T細胞使用序列號108、109、110、113、114、115、116、117刺激。標號20表示使用陰性對照的肽(序列號118)誘導 的⑶8陽性T細胞的細胞毒性。實施例6 刺激HLA-AM陽性⑶8陽性T細胞的來自⑶179b的細胞毒性T細胞抗 原表位的確定(1)生成IFN-γ的能力與實施例5(1)同樣地，為了分析實施例3(2)中誘導的肽表位反應性CD8陽性T 細胞對肽表位的特異性，向5X IO4個使用序列號110、111、112、115、116的肽脈沖的、表達 HLA-A24分子的JTK-LCL細胞(購自理化學研究所)(以10 μ g/ml的濃度向AIM-V培養(yǎng) 基中添加各肽，在37°C、5% CO2的條件下培養(yǎng)4小時)中添加5X IO3個上述T細胞，在含 有10%人AB血清的AIM-V培養(yǎng)基中、于96孔板中培養(yǎng)M小時。取出培養(yǎng)后的上清，根據 ELISA法測定IFN-γ的產生量。結果，與使用沒有脈沖肽的JTK-LCL細胞的孔的培養(yǎng)上清 相比，確認了在使用脈沖了序列號110、111、112、115、116的肽的JTK-LCL細胞的孔的培養(yǎng) 上清中產生IFN-Y (圖4)。由該結果表明，上述肽為特異性地增殖刺激HLA-AM陽性⑶8 陽性T細胞，為具有誘導IFN-Y產生的能力的T細胞表位肽。需要說明的是，圖4中，橫軸的標號21、22、23、對、25，分別表示由于來自JTK-LCL 細胞的刺激而產生的HLA-AM陽性⑶8陽性T細胞產生IFN- γ的能力，所述JTK-LCL細胞 用序列號110、111、112、115、116的肽進行脈沖。標號沈表示關于序列號118的陰性對照 的肽的結果。(2)細胞毒性評價接著，采用與實施例(5)同樣的方法，分析本發(fā)明中使用的序列號110、111、112、 115、116的肽是否呈遞在HLA-AM陽性、且表達⑶179b的細胞上的HLA-AM分子上，或被 該肽刺激的⑶8陽性T細胞是否能夠損傷HLA-AM陽性、且表達⑶179b的細胞。將IO6個 HLA-A24陽性、且表達CD179b的JTK-LCL細胞收集到50ml容量的離心管中，加入100 μ Ci 的鉻51，在37°C下溫育2小時。之后用含有10%胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基清洗3次，添加到 96孔V底板上，使每1個孔為IO3個，進一步向各個孔中分別添加5X IO4個⑶8陽性T細 胞，所述CD8陽性T細胞懸浮在含有10%胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基中、且具有被各肽刺激的 HLA-A24陽性的肽表位反應性，在37°C、5% CO2的條件下培養(yǎng)4小時。培養(yǎng)后，測定從受到 損傷的細胞中釋放的培養(yǎng)上清中的鉻51的量，由此算出被各肽刺激的CD8陽性T細胞的細 胞毒性。其結果表明，被該肽刺激的HLA-AM陽性的CD8陽性T細胞具有對JTK-LCL細胞 的細胞毒性(圖5)。因此，本實施例中使用的各肽(序列號110、111、112、115、116)為呈遞 到HLA-AM陽性、且表達⑶179b的細胞上的HLA-AM分子上的肽，進而表明，該肽具有誘導 能夠損傷上述細胞的CD8陽性細胞毒性T細胞的能力。用陰性對照的肽(序列號118)誘 導的⑶8陽性T細胞不顯示細胞毒性。需要說明的是，圖5中，橫軸的標號27、沘、29、30、31，分別表示HLA-A24陽性的 ⑶8陽性T細胞對JTK-LCL細胞的細胞毒性，所述T細胞使用序列號110、111、112、115、116 的肽刺激。標號32表示用陰性對照的肽(序列號118)誘導的CD8陽性T細胞的細胞毒性。實施例7 使用重組蛋白質的癌檢測(1)犬的癌檢測采集153確認到惡性腫瘤的患病犬和264只健康犬的血液，分離血清。使用實施 例2中制備的來自犬的癌抗原蛋白(序列號5的氨基酸序列中5號 120號)和抗犬IgG抗體，用ELISA法測定與該多肽特異性反應的血清中的IgG抗體效價。制備的多肽的固定化如下進行將用磷酸鹽緩沖生理鹽水稀釋到100 μ g/mL的重 組蛋白質溶液以100 μ L/孔添加到96孔固定化氨基培養(yǎng)板(Immobilizer Amino plate) (Nunc公司制)中，在4°C下靜置一晚。封閉如下進行，即，以IOOyL/孔加入下述溶液，所 述溶液是將4g Block Ace粉末(DS Pharma Biomedical株式會社制)溶解在IOOrnl精制 水中，將所得的溶液用精制水稀釋4倍得到的溶液(以下，封閉溶液)，在室溫下振蕩1小 時。以100 μ L/孔添加使用稀釋時中使用的封閉溶液的稀釋1000倍的血清，在室溫下振蕩 3小時使其反應。用含有0. 05% Tween20(和光純藥工業(yè)公司制)的磷酸鹽緩沖生理鹽水 (以下PBS-T)清洗3次，以100 μ L/孔加入用封閉溶液稀釋了 3000倍的HRP修飾犬IgG抗 體(Goat anti Dog IgG-h+I HRP conjugated =BETHYL Laboratories 公司制)，在室溫下 振蕩1小時使其反應。用PBS-T清洗3次，以100 μ 1/孔添加HRP基質TMB (1-Step Turbo TMB(四甲基聯(lián)苯胺)，PIERCE公司)，在室溫下進行30分鐘酶基質反應。之后，以100 μ 1/ 孔加入0. 5Μ硫酸溶液(Sigma-Aldrich Japan公司制)停止反應后，用酶標儀(Microplate reader)測定450nm處的吸光度。作為對照，將沒有固定化制備的重組蛋白質的、使罹癌犬 血清不反應的情況與上述同樣地進行并比較。作為使用上述癌檢測的癌癥種類，使用通過病理診斷確診為惡性的112個乳癌試 樣、31個淋巴瘤試樣及10個白血病試樣。上述來自罹癌犬生物體的血清顯示出顯著高的針對重組蛋白質的抗體效價。表 明利用本檢測法判斷為惡性是健康犬平均值的2倍以上時，可以判斷乳癌中61個試樣 ( %)、淋巴瘤中21個試樣(71%)、白血病中7個試樣(70%)分別為惡性。另外，使用 通過病理診斷確診為良性的30只乳腺腫瘤患病犬的血清，同樣地進行檢查，結果檢測出健 康犬平均值2倍以上值的試樣數(shù)為0。同樣地，使用實施例2中制備的來自人的癌抗原蛋白(序列號3的氨基酸序列)與 抗犬IgG抗體，用ELISA法測定與上述各罹癌犬血清試樣中的該多肽特異性反應的IgG抗 體效價，結果表明，可以判斷乳癌中56個試樣(50%)、淋巴瘤中18個試樣(58%)、白血病 中5個試樣(50%)分別為惡性。另外，使用從末期癌癥患病犬收集的胸水、腹水，進行與上述同樣的檢測，結果可 以檢測出與通過使用血清的該檢測法的結果同樣的值，能夠診斷為癌。(2)人的癌檢測使用上述使用的來自人的癌抗原蛋白(序列號3的氨基酸序列)與抗人IgG抗體， 與上述同樣地測定與該多肽特異性反應的健康人血清中的IgG抗體效價。用封閉溶液將 HRP jftrp^iA IgG (HRP-Goat Anti-Human IgG (H+L) Conj ugate =Zymed Laboratories 公司制)稀釋10000倍，用作2次抗體。作為陽性對照，使用蛋清白蛋白抗原，所述蛋清白 蛋白抗原用磷酸鹽緩沖生理鹽水配制為50μ g/mL且被固定化。結果，在450m處的吸光度， 對于蛋清白蛋白抗原，7個健康人顯示了較高的平均值，為0.45。另一方面，對于上述多肽， 完全檢測不到，為0。進而，與上述同樣地，對于17個來自患有惡性乳癌的患者的血清的試樣(購自 ftOmeddx公司)，與上述同樣地測定與來自人的癌抗原蛋白(序列號3的氨基酸序列)特 異性反應的血清中的IgG抗體效價。結果，在450nm處的吸光度，對于上述多肽，17個乳癌患者顯示了較高的平均值，為0.觀。因此，表明在人中也可以通過該方法檢測癌癥。產業(yè)上的可利用性本發(fā)明提供了含有發(fā)揮針對乳癌、白血病、淋巴瘤等癌(腫瘤)的抗腫瘤活性的多 肽的免疫誘導劑，因此對癌的治療有用。另外，本發(fā)明提供了新型的癌的檢測方法，因此對 癌的診斷有用。
權利要求
1.一種免疫誘導劑，所述免疫誘導劑含有多肽或重組載體作為有效成分，所述多肽為 選自以下(a) (c)的多肽類、且具有免疫誘導活性的至少一個多肽，所述重組載體含有編 碼所述多肽的多核苷酸、且能夠在生物體內表達所述多肽，(a)多肽，由序列表的序列號3 95中奇數(shù)序列號表示的氨基酸序列中連續(xù)7個以上 的氨基酸組成，(b)多肽，與所述(a)的多肽具有90%以上的序列同源性、且由7個以上的氨基酸組成，(c)多肽，包含所述(a)或(b)的多肽作為部分序列。
2.如權利要求1所述的免疫誘導劑，其中，所述(b)的多肽為與所述(a)的多肽具有 95%以上序列同源性的多肽。
3.如權利要求1所述的免疫誘導劑，其中，所述具有免疫誘導活性的多肽為由序列表 的序列號3 95中奇數(shù)序列號表示的氨基酸序列中連續(xù)7個以上氨基酸組成的多肽，或包 含所述多肽作為部分序列的多肽。
4.如權利要求3所述的免疫誘導劑，其中，所述具有免疫誘導活性的多肽為具有序列 表的序列號3 95中奇數(shù)序列號表示的氨基酸序列的多肽。
5.如權利要求3所述的免疫誘導劑，其中，所述具有免疫誘導活性的多肽為由序列表 的序列號3 95中奇數(shù)序列號表示的氨基酸序列中的aal-34或aa52_75的區(qū)域內連續(xù)7 個以上氨基酸序列組成的多肽，或包含所述多肽作為部分序列的多肽。
6.如權利要求5所述的免疫誘導劑，其中，所述具有免疫誘導活性的多肽為由序列表 的序列號108、序列號109、序列號110、序列號111、序列號112、序列號113、序列號114、序 列號115、序列號116或序列號117表示的氨基酸序列組成的多肽，或包含序列表的序列號 108、序列號109、序列號110、序列號111、序列號112、序列號113、序列號114、序列號115、 序列號116或序列號117表示的氨基酸序列作為部分序列，且氨基酸殘基數(shù)為8 12的多 肽。
7.如權利要求1 6中任一項所述的免疫誘導劑，所述免疫誘導劑含有1個或多個所 述多肽作為有效成分。
8.如權利要求7所述的免疫誘導劑，其中，所述多肽為抗原呈遞細胞的處理劑。
9.如權利要求1 8中任一項所述的免疫誘導劑，所述免疫誘導劑用于動物的癌的治療及/或預防。
10.如權利要求9所述的免疫誘導劑，其中，所述癌為表達CD179b基因的癌。
11.如權利要求10所述的免疫誘導劑，其中，所述癌為乳癌、白血病或淋巴瘤。
12.如權利要求1 11中任一項所述的免疫誘導劑，所述免疫誘導劑還含有免疫增強劑。
13.一種分離抗原呈遞細胞，所述分離抗原呈遞細胞含有所述具有免疫誘導活性的多 肽與HLA分子的復合物。
14.一種分離T細胞，所述分離T細胞與所述具有免疫誘導活性的多肽與HLA分子的復 合物選擇性結合。
15.一種免疫誘導方法，包括給與個體多肽或重組載體，所述多肽為選自下述(a) (c)的多肽類、且具有免疫誘導活性的至少1個多肽，所述重組載體含有編碼所述多肽的多核苷酸、且能夠在生物體內表達所述多肽，(a)多肽，由序列表的序列號3 95中奇數(shù)序列號表示的氨基酸序列中連續(xù)7個以上 氨基酸組成，(b)多肽，與所述(a)的多肽具有90%以上的序列同源性、且由7個以上氨基酸組成，(c)多肽，包含所述(a)或(b)的多肽作為部分序列。
16.一種癌的檢測方法，為針對從生物體分離的試樣進行的方法，包括測定以下(a) (c)中至少任一多肽的表達，(a)多肽，具有通過抗原抗體反應與抗體結合的反應性、且在生物體內產生，所述抗體 針對由序列表的序列號3 95中奇數(shù)序列號表示的氨基酸序列中連續(xù)7個以上氨基酸組 成的多肽，(b)多肽，具有通過抗原抗體反應而與抗體結合的反應性、且在生物體內產生，所述抗 體是針對與所述(a)的多肽具有90%以上的序列同源性、且由7個以上氨基酸組成的多肽 的抗體，(c)多肽，具有通過抗原抗體反應而與抗體結合的反應性、且在生物體內產生，所述抗 體是針對包含所述(a)或(b)的多肽作為部分序列的多肽的抗體。
17.如權利要求16所述的方法，其中，所述多肽的表達的測定通過免疫測定抗體來進 行，所述抗體能包含在所述試樣中、針對應測定的所述多肽在所述生物體內被誘導。
18.一種癌的檢測方法，為針對從生物體分離的試樣進行的方法，包括分析具有編碼區(qū) 的CD179b基因的表達，將其與來自健康人的試樣中所述基因的表達量進行比較，所述編碼 區(qū)具有來自癌癥患者的試樣中序列表的序列號1或序列號4 94中偶數(shù)序列號表示的堿 基序列。
19.一種癌檢測用試劑，含有針對以下(a) (c)中任一多肽、與在生物體內被誘導的 抗體發(fā)生抗原抗體反應的多肽，(a)多肽，由序列表的序列號3 95中奇數(shù)序列號表示的氨基酸序列中連續(xù)7個以上 氨基酸組成，(b)多肽，與所述(a)的多肽具有90%以上序列同源性、且由7個以上氨基酸組成，(c)多肽，包含所述(a)或(b)的多肽作為部分序列。
全文摘要
本發(fā)明提供一種含有多肽或重組載體作為有效成分的免疫誘導劑，所述免疫誘導劑用于癌的治療及/或預防，所述多肽為選自以下(a)～(c)的多肽類、且具有免疫誘導活性的至少一個多肽，所述重組載體含有編碼該多肽的多核苷酸，且能夠在生物體內表達該多肽，(a)多肽，由序列表的序列號3～95中奇數(shù)序列號表示的氨基酸序列中連續(xù)7個以上的氨基酸組成；(b)多肽，與上述(a)的多肽具有90％以上的序列同源性、且由7個以上的氨基酸組成；及(c)多肽，包含上述(a)或(b)的多肽作為部分序列。另外，由于上述多肽與特異性存在于癌癥患者的血清中的抗體反應，所以如果測定試樣中的該抗體，則可以檢測生物體內的癌。
文檔編號C07K14/47GK102089001SQ20098012658
公開日2011年6月8日 申請日期2009年7月10日 優(yōu)先權日2008年7月10日
發(fā)明者岡野文義, 齋藤孝則, 清水正樹 申請人:東麗株式會社