專利名稱：重組纖維蛋白原的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及重組纖維蛋白原，涉及在哺乳動物細胞中以高水平產生重組纖維蛋白 原的方法，還涉及它的應用。
背景技術：
纖維蛋白原是可溶性血漿糖蛋白，主要是通過肝臟的肝實質細胞在人體內合成。 它是由兩對標記為A α、Ββ和γ的三條多肽鏈組成的二聚體分子，所述三條多肽鏈由二硫 橋鍵連接。三條多肽鏈由三個獨立的基因編碼。野生型A α鏈合成為含625個氨基酸的前 體，并作為含610個氨基酸的蛋白質存在于血漿中，Ββ含461個氨基酸，γ鏈含411個氨 基酸。三種多肽分別由3種mRNA合成。三條組成鏈(Αα、Ββ和Y)組裝成最終形式的六 鏈二聚體(Αα、Ββ、Y )2發(fā)生于內質網(ER)腔內。纖維蛋白原以高濃度(l_2g/L)循環(huán)于血液中，并顯示出高度的異質性。通過基 因多態(tài)性、糖基化和磷酸化的差異、A α鏈的端羧基部分的(部分)蛋白水解以及選擇性剪 接產生變體(請參閱 De Maat 和 VerschuuH2005) Curr. Opin. Hemato 1. 12，377 ；Laurens 等(2006)J. Thromb Haemost. 4，932 ；Henschen-Edman(2001)Ann. N. Y. Acad. Sci. USA 936， 580)。據估計，在每個個體中，約有一百萬個不同的纖維蛋白原分子循環(huán)。大部分的這些 變體在功能和結構上都不同，所述的這些變體只占纖維蛋白原總數的一小部分(在大多數 情況下不超過幾個百分比)。Aa鏈的端羧基部分的蛋白水解導致具有明顯不同分子量 的纖維蛋白原的三種主要循環(huán)形式。纖維蛋白原以高分子量的形式合成(HMW ；分子量為 340kDa;循環(huán)中的Aa鏈的主要形式含610個氨基酸)。A α鏈之一的降解產生低分子量形 式(LMW ;MW = 305kDa) ；LMW形式Q70kDa)是其中兩個A α鏈都在端羧基部分地降解的變 體。在正常血液中，50-70%的纖維蛋白原是HMW，20-50%是具有一個或兩個降解Aa鏈的 纖維蛋白原(de Maat 和 VerschuuH2005) Curr. Opin. Hematol. 12，377)。HMW 和 LMW 變體 在凝血時間和纖維蛋白聚合體結構方面顯示出明顯的差異(Hasegawa N5Sasaki S. (1990) Thromb. Res. 57,183。由選擇性剪接產生的眾所周知的變體是所謂的Y，變體和Fib420變體。γ丨變體占γ鏈總數的約8%。對于豐度最高的Y鏈來說，它由427個而不是 411個氨基酸組成；四個末端C氨基酸(AGDV)被含2個硫酸化酪氨酸的20個氨基酸取代。 纖維蛋白原 ’鏈不能與對調節(jié)血小板凝聚至關重要的血小板纖維蛋白原受體nb0 3結合。分子量為420kDa的Fib420變體占循環(huán)纖維蛋白原總數的1_3 % (de Maat和 Verschuur (2005) Curr. Opin. Hematol. 12，377)。通過選擇性剪接，使額外的開放讀碼框包 括于Aa鏈的C-末端，從而用237個氨基酸將其擴展。附加的氨基酸形成結節(jié)結構。血源性纖維蛋白原是市售纖維蛋白封閉劑的一個重要組分，所述纖維蛋白封閉劑 臨床應用于外科手術中，用以止血和減少血液及體液的流失。此外，其用于通過利用纖維蛋 白的凝集性能促進組織粘連和用于改善傷口的愈合。纖維蛋白原臨床上也用于補充遺傳性纖維蛋白原缺乏癥患者和后天性纖維蛋白原缺乏癥患者的纖維蛋白原缺乏。已證實高劑量 纖維蛋白原(3-10克)的靜脈注射能在不同的臨床情況下使血液凝固正?；⒆柚够蝾A防 嚴重的出血。人纖維蛋白原的重組生產，無論是野生型(HMW)形式或作為變體(如Fib420)，比 使用血源性材料有很多優(yōu)點。這些優(yōu)點包括其優(yōu)選的安全特性、以純粹的方式產生變體的 可能性和無限制供應。然而，為了以經濟上可行的方式進行生產，需要完整、功能性纖維蛋 白原的高表達水平。此外，針對具體的應用(如使用纖維蛋白原作為靜脈注射(IV)止血 劑)，需要正確的翻譯后修飾(如糖基化)。由于翻譯后修飾的原因，哺乳動物系統(tǒng)中的表達是優(yōu)選的。因此，生物活性重組 纖維蛋白原已經在各種細胞中被表達，如幼倉鼠腎(BHK)(如Roy等，(1991)Biochemistry 30,9414)、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞(如 Lord, (US6037457)，Binnie 等，(1993) Biochemistry 32，107)或非洲綠猴源性 COS 細胞(如 Roy 等，(1991) J. Biol. Chem. 266, 4758)。然而，表達水平只有大約l_15yg/ml，被認為不足以取代臨床實踐中所需的大量血 漿纖維蛋白原。此外，人纖維蛋白原在酵母P. pastor is中的表達水平為8 μ g/ml，這對于商 業(yè)生產來說也是不夠的CTojo等，(2008) Prot. Expr.和Purif. 59，289)。在EP 1 661 989中，據報道，對于商業(yè)上可行的生產來說，需要的產量為至少 100mg/L。在這種應用中，報告稱在轉瓶中，CHO細胞的表達水平可高達631. 5mg/L。然而， 為了達到這種水平，細胞必須共同表達桿狀病毒P35抗凋亡蛋白質，且必須使用甲氨蝶呤 (抗代謝物)擴增載體。與工業(yè)上的標準相比(例如mirm(Nature Biotechnol. (2004)22， 1393)報告了 3-4天的傳代培養(yǎng)中的常規(guī)細胞密度為2 X 106細胞/ml)，細胞密度相對較低 (在轉瓶中，15天內最高為9. 4X105細胞/ml)。重組纖維蛋白原的成功生產的最重要問題是如何制備高純度的足夠完整、正確組 裝的生物活性產物。
具體實施例方式本發(fā)明涉及編碼纖維蛋白原α、β或Y鏈的核苷酸序列，所述核苷酸序列是針對 在真核細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的表達優(yōu)化的。根據本發(fā)明的優(yōu)化核苷酸序列可實現在真核細胞培 養(yǎng)系統(tǒng)中以完整的形式高效表達重組纖維蛋白原。由優(yōu)化核苷酸序列編碼的蛋白質序列與 由相應的非優(yōu)化核苷酸序列編碼的蛋白質序列相同。在本發(fā)明中，術語‘纖維蛋白原’可以 指任何形式的纖維蛋白原，包括通過基因多態(tài)性、糖基化和磷酸化的差異、Aa鏈的端羧基 部分的(部分)蛋白水解和選擇性剪接產生的變體。在本發(fā)明中，術語‘α鏈’和‘Αα鏈’ 可互換使用。它們可以指α鏈的野生型和變體兩者，包括含信號序列(SEQ ID No. 8)的 644個氨基酸的纖維蛋白原α鏈、無信號序列(SEQ ID Ν0. 8的氨基酸20至644)的625個 氨基酸的前體纖維蛋白原α鏈、見于循環(huán)中的610個氨基酸(SEQ ID Ν0. 8的氨基酸20至 629)的截短纖維蛋白原α鏈和含信號序列(SEQ ID Ν0. 11)或無信號序列(SEQ ID NO. 11 的氨基酸20-866)的866個氨基酸的Fib420變體α鏈。在本發(fā)明中，術語‘β鏈，和‘Ββ 鏈’可互換使用。它們可以指β鏈的野生型和變體兩者，包括含信號序列(SEQ ID No. 9) 的491個氨基酸的纖維蛋白原β鏈和無信號序列(SEQ ID Ν0. 9的氨基酸31至491)的 461個氨基酸的纖維蛋白原β鏈。
在本發(fā)明中，術語‘伽瑪鏈’和‘ Y鏈’可互換使用。它們可以指Y鏈的野生型和 變體兩者，包括含信號序列(SEQ ID No. 10)的437個氨基酸的纖維蛋白原、鏈、無信號序 列(SEQ ID NO. 10的氨基酸27至437)的411個氨基酸的纖維蛋白原Y鏈、453個氨基酸 的纖維蛋白原、鏈(帶有信號序列(SEQ ID NO. 13)的Y ’鏈)和427個氨基酸的纖維蛋 白原Y鏈(無信號序列(SEQ ID NO. 13的氨基酸27至453)的Y ’鏈)。在本發(fā)明中，當氨基酸序列含由核苷酸序列編碼的所有氨基酸，任選不含在正常 細胞(分泌)處理過程中被移除的氨基酸時，纖維蛋白原或纖維蛋白原鏈是‘完整形式的’。 因此，具有644、625或610個氨基酸的α鏈是完整形式的α鏈的例子。根據本發(fā)明的優(yōu)化核苷酸序列的GC含量為至少55 %，優(yōu)選為至少58 %，更優(yōu)選為 至少60或65 %。在一個實施例中，根據本發(fā)明的優(yōu)化核苷酸序列的GC含量在約55 %至 70 %范圍內。在另一實施例中，根據本發(fā)明的優(yōu)化核苷酸序列的GC含量在約60 %至65 % 范圍內。編碼纖維蛋白原α、β或Y鏈的本分明的優(yōu)化核苷酸序列是針對在真核細胞培 養(yǎng)系統(tǒng)中的表達優(yōu)化的。優(yōu)選地，它們是針對在哺乳動物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的表達優(yōu)化的，如 針對在COS細胞、BHK細胞、NSO細胞、Sp2/0細胞、CHO細胞、PER. C6細胞、HEK293細胞或昆 蟲細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的表達。更優(yōu)選地，核苷酸序列是針對在人體細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的表達優(yōu) 化的，如針對PER. C6細胞或HEK293細胞培養(yǎng)系統(tǒng)。根據本發(fā)明的優(yōu)化的密碼子適應指數為至少0. 90，優(yōu)選為至少0. 95，更優(yōu)選為至 少0. 97。在一個實施例中，根據本發(fā)明的核苷酸序列通過適應CHO細胞的密碼子使用被優(yōu) 化，其中密碼子適應指數為至少0. 95。根據本發(fā)明的核苷酸序列可以是編碼任何類型的纖維蛋白原鏈的。優(yōu)選地，它們 編碼哺乳動物纖維蛋白原鏈，更優(yōu)選地，它們編碼靈長類動物纖維蛋白原鏈，最優(yōu)選地，它 們編碼人纖維蛋白原鏈。鏈的組合也是可能的，例如一個或兩個哺乳動物纖維蛋白原鏈與 兩個或一個嚙齒類動物纖維蛋白原鏈組合。優(yōu)化核苷酸序列可以是DNA或RNA。優(yōu)選是 cDNA。編碼纖維蛋白原α、β或Y鏈的本發(fā)明的優(yōu)化核苷酸序列顯示出與其相應的非 優(yōu)化對應物至少70%的一致性。在一個實施例中，編碼纖維蛋白原α、β和Y鏈的本發(fā)明 的優(yōu)化核苷酸序列顯示出與其相應的非優(yōu)化序列70-80%的一致性。優(yōu)選地，編碼纖維蛋白 原α、β或Υ鏈的本發(fā)明的優(yōu)化核苷酸序列不包含順式作用位點，如剪接位點和poly(A)信號。編碼纖維蛋白原α鏈的本發(fā)明的優(yōu)化核苷酸序列不包含通常存在于編碼人纖維 蛋白原的α鏈的基因中的39個堿基對直接重復序列。在編碼α鏈的本發(fā)明的優(yōu)化核苷 酸序列中，不用改變編碼的蛋白質序列即可改變重復序列。在一個優(yōu)選的實施例中，編碼α鏈的本發(fā)明的優(yōu)化核苷酸序列包含根據SEQ ID No. 4或7的序列。編碼纖維蛋白原α鏈且包含部分的這些序列的核苷酸序列也涵蓋在本發(fā) 明中。在一個實施例中，根據本發(fā)明的優(yōu)化核苷酸序列包含SEQ ID NO. 4的核苷酸60-1932。 在另一實施例中，根據本發(fā)明的優(yōu)化核苷酸序列包含SEQ ID N0. 4的核苷酸60-1887。在 又一實施例中，根據本發(fā)明的優(yōu)化核苷酸序列包含SEQ ID N0. 7的核苷酸60-2598。這樣 的核苷酸序列也涵蓋在本發(fā)明中，該核苷酸序列包含與SEQ iD N0. 4或7有至少85%、至少87 %或至少90 %、更優(yōu)選至少92 %、至少94 %、96 %、最優(yōu)選至少98 %或至少99 %的一 致性的序列，并且編碼纖維蛋白原α鏈，例如帶有根據SEQ ID NO. 8或11的序列或部分的 這些序列的纖維蛋白原α鏈，如上文所例示。在優(yōu)選的實施例中，編碼β鏈的本發(fā)明的優(yōu) 化核苷酸序列包含根據SEQ ID No. 5的序列。編碼纖維蛋白原β鏈且包含部分此序列的核苷酸序列也涵蓋在本發(fā)明中。在一 個實施例中，根據本發(fā)明的優(yōu)化核苷酸序列包含SEQ ID NO. 5的核苷酸93-1473。這樣的 核苷酸序列也涵蓋在本發(fā)明中，該核苷酸序列包含與SEQ ID No. 5有至少85%、至少87% 或至少90%、更優(yōu)選至少92%、至少94%、96%、最優(yōu)選至少98%或至少99%的一致性的 序列，并且編碼纖維蛋白原β鏈，例如帶有根據SEQ ID NO. 9的序列或部分此序列(例如 SEQ ID NO. 9的氨基酸31至491)的纖維蛋白原β鏈。在優(yōu)選的實施例中，編碼纖維蛋白 原、鏈的本發(fā)明的優(yōu)化核苷酸序列包含根據SEQ ID NO. 6的序列。編碼纖維蛋白原、鏈 且包含部分此序列的核苷酸序列也涵蓋在本發(fā)明中。在一個實施例中，編碼纖維蛋白原Y 鏈的本發(fā)明的優(yōu)化核苷酸序列包含SEQ ID N0. 6的核苷酸81-1311。這樣的核苷酸序列也 涵蓋在本發(fā)明中，該核苷酸序列包含與SEQ ID No. 6有至少85%、至少87%或至少90%、更 優(yōu)選至少92%、至少94%、96%、最優(yōu)選至少98%或至少99%的一致性的序列，并且編碼纖 維蛋白原Y鏈，例如帶有根據SEQ ID NO. 10的序列或部分此序列(例如SEQ ID NO. 10的 氨基酸27至437)的纖維蛋白原、鏈。在另一優(yōu)選的實施例中，編碼纖維蛋白原Y鏈的本發(fā)明的優(yōu)化核苷酸序列包含 根據SEQ ID N0. 12的序列。編碼纖維蛋白原Y鏈且包含部分此序列的核苷酸序列也涵蓋 在本發(fā)明中。在一個實施例中，編碼纖維蛋白原Y鏈的本發(fā)明的優(yōu)化核苷酸序列包含SEQ ID N0. 12的核苷酸81-1359。這樣的核苷酸序列也涵蓋在本發(fā)明中，該核苷酸序列包含與 SEQ ID No. 12有至少85%、至少87%或至少90%、更優(yōu)選至少92%、至少94%、96%、最優(yōu) 選至少98%或至少99%的一致性的序列，并且編碼纖維蛋白原γ鏈，例如帶有根據SEQ ID N0. 13的序列或部分此序列(例如SEQ ID N0. 13的氨基酸27至453)的纖維蛋白原Y鏈。在另一方面，本發(fā)明涉及核苷酸構建體，所述核苷酸構建體包含編碼纖維蛋白原 α、β或Y鏈的本發(fā)明的優(yōu)化核苷酸序列。核苷酸構建體可包含影響纖維蛋白原鏈的表 達的調節(jié)序列，包括啟動子、終止子和增強子。在一個實施例中，核苷酸構建體是載體，例如 克隆載體或表達載體。核苷酸構建體可包含選擇標記。在另一方面，本發(fā)明涉及包含編碼纖維蛋白原α、β或Y鏈的本發(fā)明的優(yōu)化核 苷酸序列的細胞。在所述細胞中，根據本發(fā)明的核苷酸可以本身或者在構建體中的形式存 在，如在表達載體或克隆載體中。所述細胞通常是用于產生纖維蛋白原的宿主細胞。包含 根據本發(fā)明的核苷酸序列的細胞優(yōu)選為哺乳動物細胞。哺乳動物細胞的合適例子包括昆蟲 細胞、COS細胞、BHK細胞、NSO細胞、Sp2/0細胞、CHO細胞、PER. C6細胞和HEK293細胞。根據本發(fā)明的細胞產生大量的完整生物活性纖維蛋白原。所述細胞通常是細胞 系的一部分。在本發(fā)明中，短語‘產生大量完整纖維蛋白原的細胞或細胞系’是指產生超過 85 %、優(yōu)選超過90 %、95 %或99 %的完整產物的細胞或細胞系。優(yōu)選地，這是在群體倍增為 10,20或30的時期、更優(yōu)選為40或50的時期測量的。在本發(fā)明中，‘生物活性’纖維蛋白 原是指在凝血酶的存在下聚合成纖維蛋白的纖維蛋白原。這種細胞或細胞系也涵蓋在本發(fā) 明中。在優(yōu)選的實施例中，根據本發(fā)明的細胞系產生完整重組纖維蛋白原的水平為每天每個細胞至少3微微克，更優(yōu)選為每天每個細胞至少4或5微微克，甚至更優(yōu)選為每天每個細 胞至少7或10微微克。在細胞密度為30 X 106個細胞/ml的反應器中，每天每個細胞3微 微克相當于每天每升反應器體積產生90mg纖維蛋白原，每天每個細胞5微微克相當于每天 每升產生150mg纖維蛋白原，每天每個細胞7微微克相當于每天每升產生210mg纖維蛋白 原。優(yōu)選地，細胞群的至少50%、更優(yōu)選細胞群的至少60%、70%或80%、最優(yōu)選細胞群的 至少90^^95%或99%每天每個細胞產生至少3微微克，更優(yōu)選每天每個細胞產生至少5 微微克，甚至更優(yōu)選每天每個細胞產生至少7微微克。產生大量完整纖維蛋白原的細胞或細胞系的選擇優(yōu)選在沒有蛋白酶抑制劑的表 達的情況下進行。在一個實施例中，使用抗體進行選擇，優(yōu)選的是與α鏈的完整N-末端 和α鏈的完整C-末端結合的單克隆抗體。市售的這種抗體的合適例子包括由Koppert 等((1985)Blood 66,503)所描述的 Y18 抗體和由 Hoegee-de Nobel 等((1988)Thromb. Haemost. 60(3)415)所描述的G8抗體。優(yōu)選在無血清的環(huán)境中進行這種選擇。選擇產生完 整纖維蛋白原的細胞系的方法也是本發(fā)明的一部分。另一方面，本發(fā)明涉及在真核細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中產生纖維蛋白原的方法。所述方法 包括根據本發(fā)明在產生纖維蛋白原的條件下培養(yǎng)宿主細胞或細胞系?？扇芜x回收產生的纖 維蛋白原?？梢越M合優(yōu)化和非優(yōu)化的鏈。可以通過基因工程或者通過合成方法獲得非優(yōu)化 鏈，并且它們的來源可以與優(yōu)化鏈不同。在一個實施例中，每個纖維蛋白原分子中只有一個 鏈是通過根據本發(fā)明的密碼子優(yōu)化核苷酸序列編碼的，而兩個其它鏈是通過兩個沒有優(yōu)化 的核苷酸序列編碼的。在另一實施例中，每個纖維蛋白原分子的三個纖維蛋白原鏈中的兩 個是通過根據本發(fā)明的密碼子優(yōu)化核苷酸序列編碼的。在優(yōu)選的實施例中，所有三個纖維 蛋白原鏈都是通過優(yōu)化的核苷酸序列編碼的。與血源性纖維蛋白原相比，因為產生了特定 的纖維蛋白原鏈，所以由此方法產生的纖維蛋白原制劑相當均勻。所述方法能夠產生纖維 蛋白原制劑，其 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%以上、優(yōu)選95%、98% 或99 %以上是僅少量存在于血漿中的變體。另一方面，本發(fā)明涉及根據本發(fā)明的核苷酸序列在制備若干醫(yī)療應用的纖維蛋白 原中的用途。在一個應用中，根據本發(fā)明的核苷酸序列用于制備用在纖維蛋白封閉劑中的 纖維蛋白原，所述纖維蛋白封閉劑臨床應用于外科手術中，用以止血和減少血液及體液的 流失。在另一應用中，根據本發(fā)明的核苷酸序列可用于制備纖維蛋白原，從而通過利用纖維 蛋白的凝集性能促進組織粘連和改善傷口的愈合。在又一應用中，根據本發(fā)明的核苷酸序 列可用于制備纖維蛋白原，所述纖維蛋白原臨床上用于通過靜脈注射纖維蛋白原治療先天 性或后天性(如通過在創(chuàng)傷后或在手術過程中出血)纖維蛋白原缺乏癥患者的急性出血發(fā) 作。市場上銷售的血源性纖維蛋白原制劑有Riastap (CSL Behring LLC ；在美國市場銷售) 和Haemocomplettan (CSL Behring AG;在歐洲市場銷售)。與血源性制劑相比，重組纖維蛋 白原制劑有若干優(yōu)點，包括優(yōu)選的安全特性、無限制供應和以純粹的方式針對此特定適應 證生產具有優(yōu)選活性特性的纖維蛋白原變體的可能性。


圖1在CHO細胞用野生型和編碼A α、Ββ和γ鏈的密碼子優(yōu)化構建體轉染后的第 1、2、3和6天時重組人纖維蛋白原的表達水平。實驗重復進行兩次，(opt)優(yōu)化序列；(wt)野生型序列。圖2在CHO細胞用編碼A α、B β和γ鏈的密碼子優(yōu)化構建體和帶有A α -擴展 的、B β和γ鏈(標記為A α-ext. (opt)+B β (opt)+ γ (opt))的密碼子優(yōu)化構建體(標記 為Aa (opt)+B β (opt)+ y (opt))轉染后的第1、2、3和6天時重組人纖維蛋白原的表達水
平。實驗重復進行兩次。圖3來自表達重組人纖維蛋白原的克隆體M21、M25和M57的批處理運行的培養(yǎng) 上清液的蛋白質印跡分析。對照泳道(contr)含血源性野生型纖維蛋白原(FIB3，Enzyme Research Laboratories)。箭頭指示A α鏈的分解產物。圖4來自表達具有擴展A α鏈的變體人纖維蛋白原(Fib420)的克隆體P40的批 處理運行的培養(yǎng)上清液的蛋白質印跡分析。泳道1是含血源性野生型纖維蛋白原(FIB3， Enzyme Research Laboratories)的對照泳道。泳道2和3含克隆體P40A α擴展的培養(yǎng)上 清液，分別取自比處理運行的第4天和第7天。圖5用含Y’的人纖維蛋白原瞬時轉染的PER. C6細胞的培養(yǎng)上清液的蛋白質 印跡分析(詳見實例9中所述)。泳道1含表達重組Y’纖維蛋白原的PER. C6細胞的 培養(yǎng)上清液。泳道2是對照泳道，含血源性野生型纖維蛋白原(FIB3，Enzyme Research Laboratories)。圖6通過PNGase F處理的N-糖基化的纖維蛋白原分析，接下來的SDS-PAGE分析。泳道加載如下MW 分子量標準(基準，hvitrogen)ERL FIB3 血源性纖維蛋白原(ERL)，用PNGase F處理(+)或不用PNGase F處理 ㈠。PER. C6 fdg :PER. C6源性纖維蛋白原，用PNGase F處理(+)或不用PNGase F處理㈠。每條泳道加載2 μ g纖維蛋白原；使用考馬斯藍(Coomassie Blue)完成染色。使用還原的10% BisTris 凝膠(Nul^age，Invitrogen)進行分析。圖7R0TEM分析凝血時間。通過ROTEM分析確定凝血時間。200 μ 1合并的正常(檸檬酸鹽)血漿或100 μ 1 合并的正常(檸檬酸鹽)血漿以1 1的比例與Haemocomplettan (CSL Behring GmbH, Marburg, Germany)或PER. C6纖維蛋白原(均為在TBS中ang/ml)混合。添加CaC12至最終 濃度為17mM。為了開始凝血，加入α-凝血酶至最終濃度為lU/ml。總反應體積是240μ 1。 圖中顯示與纖維蛋白原以1 1混合的血漿的凝血時間(秒)1.血源性纖維蛋白原(CSL Behring, Marburg, Germany)2. PER. C6源性纖維蛋白原所有的測量均重復兩次。圖8R0TEM分析血凝塊硬度。通過ROTEM分析確定血凝塊硬度。圖中表示的是 AlO值(mm)，該值是在血漿與纖維蛋白原以1 1混合10分鐘時血凝塊的硬度。實驗細節(jié) 與圖7的圖例中所述相同。1.血源性纖維蛋白原(CSL Behring, Marburg, Germany)2. PER. C6源性纖維蛋白原
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所有的測量均重復兩次。圖9R0TEM分析血凝塊形成時間。用或不用林格氏(Ringer's)乳酸鹽(Baxter， Utrecht, The Netherlands)稀釋來自健康個體的檸檬酸鹽血。隨后給林格氏乳酸鹽稀釋 的血液補充或不補充(對照)血源性或重組的纖維蛋白原。圖中顯示如下1. 300 μ 1 血液2. 150 μ 1 血液、100 μ 1 林格氏乳酸鹽(RL)、50 μ 1 TBS3. 150 μ 1 血液、100 μ 1 RL、50 μ 1 Haemocomplettan 6. 5mg/ml (最終濃度1. lmg/ ml)4. 150 μ 1 血液、100 μ 1 RL,50 μ 1 重組 hFbg 6. 5mg/ml (最終濃度:1. lmg/ml)在任何情況下均使用20 μ 1 star-TEM 和 20 μ 1 ex-TEM 試劑(Pentapharm GmbH, Munich, Germany)開始凝血。正常范圍(35-160秒)是見于健康個體的值。160-220秒的CFT值見于止血功能正常未受損但儲血減少的患者。圖10 ROTEM分析血凝塊硬度。用或不用林格氏乳酸鹽(Baxter，Utrecht, The Netherlands)稀釋來自健康個體 的檸檬酸鹽血。隨后給林格氏乳酸鹽稀釋的血液補充或不補充(對照)血源性或重組的纖 維蛋白原。測量條件如下1. 300 μ 1 血液2. 150 μ 1 血液、100 μ 1 林格氏乳酸鹽(RL)、50 μ 1 TBS3. 150 μ 1 血液、100 μ 1 RL、50 μ 1 Haemocomplettan 6. 5mg/ml (最終濃度1. lmg/ ml)4. 150 μ 1 血液、100 μ 1 RL、50 μ 1 重組 hFbg 6. 5mg/ml (最終濃度1. lmg/ml)在任何情況下均使用20 μ 1 star-TEM 和 20 μ 1 ex-TEM 試劑(Pentapharm GmbH, Munich, Germany)開始凝血。正常范圍(53-72mm)是見于無凝血功能障礙的健康患者的值。45_40mm的MCF值 見于有出血危險指征的患者。實例實例1優(yōu)化的cDNA構建體的制備在野生型(此例中指非優(yōu)化形式)和由GeneArt (RegensburgjGermany)密碼子優(yōu) 化的形式兩者中合成編碼人纖維蛋白原多肽鏈Αα、Ββ、γ、Αα-擴展(Fib420)和Y’的 cDNA (i)移除順式作用位點(剪接位點，poly(A)信號)；(ii)修飾Aa鏈的重復序列；±曾 加GC含量以延長mRNA的半衰期；(iv)使密碼子使用適應CHO (密碼子適應指數-CAI- > 0.95)。使用的野生型參照物，對于α鏈是ΝΜ_021871，對于β鏈是ΝΜ_005141，對于γ鏈 是 ΝΜ_000509。將編碼野生型形式中的Aa (SEQ ID NO. 1)、Ββ (SEQ ID NO. 2)和 y (SEQ ID NO. 3)鏈的00嫩與編碼優(yōu)化的八0 (SEQ ID Ν0·4)、Ββ (SEQ ID NO. 5)禾口 y (SEQ ID NO. 6) 的cDNA進行比較，結果示于表1。優(yōu)化的Aa-擴展(Fib420) (SEQ ID NO. 7)和γ，序列(SEQ ID NO. 12)也示于表 1。野生型α (SEQ ID No. 1)、β (SEQ ID NO. 2)禾口 γ (SEQ ID NO. 3)鏈 cDNA 及優(yōu)化 的 α (SEQ ID No. 4)、β (SEQ ID NO. 5)禾口 γ (SEQ ID NO. 6)鏈 cDNA 在 pcDNA3. 1 衍生物 (deriviate)中被亞克隆。野生型和優(yōu)化的_A α -鏈及A α擴展(Fib420)均在pcDNA3. 1(+) neo 中，Ββ 鏈均在 pcDNA3. 1 (+)hygro 中，γ 鏈均在 pcDNA3. 1(-)hygro (Invitrogen, Carlsbad, USA)中。優(yōu)化的Y'鏈在pcDNA3. 1 (+) hygro中被亞克隆。表 權利要求
1.一種編碼纖維蛋白原α、β或Y鏈的核苷酸序列，所述核苷酸序列是針對在哺乳 動物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的表達優(yōu)化的。
2.根據權利要求1所述的核苷酸序列，所述核苷酸序列是針對在COS細胞、BHK細胞、 NSO細胞、CHO細胞、Sp2/0或人細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的表達優(yōu)化的。
3.根據權利要求1或2所述的核苷酸序列，所述核苷酸序列是針對在PER.C6細胞或 HEK293細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的表達優(yōu)化的。
4.根據權利要求1-3所述的核苷酸序列，所述核苷酸序列通過適應CHO細胞的密碼子 使用被優(yōu)化，優(yōu)選密碼子適應指數為至少0. 95。
5.根據權利要求1-4所述的核苷酸序列，所述核苷酸序列的GC含量為至少55%。
6.根據權利要求1-5所述的核苷酸序列，所述核苷酸序列顯示出與其相應的非優(yōu)化對 應物至少70%的一致性。
7.根據權利要求1-6所述的核苷酸序列，其中所述密碼子優(yōu)化的纖維蛋白原鏈不包含 順式作用位點。
8.根據權利要求1-7所述的核苷酸序列，所述核苷酸序列具有根據SEQID No. 4或7 的核苷酸序列或其一部分，或者具有包含與SEQ ID NO. 4或7有至少85%的一致性且編碼 纖維蛋白原α鏈的序列的核苷酸序列。
9.根據權利要求1-7所述的核苷酸序列，所述核苷酸序列具有根據SEQID No. 5的核 苷酸序列或其一部分，或者具有包含與SEQ ID NO. 5有至少85%的一致性且編碼纖維蛋白 原β鏈的序列的核苷酸序列。
10.根據權利要求1-7所述的核苷酸序列，所述核苷酸序列具有根據SEQID No. 6或 12的核苷酸序列或其一部分，或者具有包含與SEQ ID NO. 6或12有至少85%的一致性且 編碼纖維蛋白原Y鏈的序列的核苷酸序列。。
11.包含根據權利要求1-10所述的核苷酸序列的核苷酸構建體。
12.包含根據權利要求1-10所述的核苷酸序列或權利要求11所述的核苷酸構建體的 細胞。
13.一種細胞或細胞系，所述細胞或細胞系以每天每個細胞至少3微微克的水平產生 完整的重組纖維蛋白原。
14.一種在真核細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中產生纖維蛋白原的方法，所述方法包括在產生纖維蛋 白原的條件下培養(yǎng)根據權利要求12或13所述的細胞或根據權利要求13所述的細胞系，可 任選回收所產生的纖維蛋白原。
15.通過權利要求14所述的方法制備的纖維蛋白原制劑。
16.一種纖維蛋白原制劑，其中超過10%的α、β或Y鏈是變體型。
17.根據權利要求16所述的纖維蛋白原制劑，其中所述變體型是Y’鏈或α擴展鏈。
18.根據權利要求14-17所述的纖維蛋白原制劑，用作藥劑、組織封閉劑或用于促進組 織粘連。
19.根據權利要求14-18所述的纖維蛋白原制劑在制備用于治療或預防纖維蛋白原缺 乏癥的藥劑方面的用途。
20.一種通過重組技術產生的纖維蛋白原制劑，其中超過85%的纖維蛋白原是完整形 式的。
21. 一種選擇產生完整重組纖維蛋白原的細胞或細胞系的方法，所述方法包括使用兩 種抗體，其中一種抗體選擇性地與α鏈的完整N-末端結合，另一種抗體選擇性地與α鏈 的完整C-末端結合。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼纖維蛋白原α、β或γ鏈的核苷酸序列。所述序列是針對在真核細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的表達優(yōu)化的。這種優(yōu)化的核苷酸序列可實現在真核細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中以完整的形式高效表達重組纖維蛋白原及其變體。
文檔編號C07K14/75GK102089322SQ200980126952
公開日2011年6月8日 申請日期2009年7月9日 優(yōu)先權日2008年7月9日
發(fā)明者A·伯特, J·庫普曼, J·格林伯格 申請人:普羅菲布瑞克斯公司