專利名稱：基于纖連蛋白的多價支架結(jié)構(gòu)域蛋白的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及供診斷、研究和治療應用中使用的多價的基于纖連蛋白的支架結(jié)構(gòu) 域。本發(fā)明進一步涉及包含此類蛋白質(zhì)的細胞、編碼此類蛋白質(zhì)或其片段的多核苷酸、及包 含編碼該創(chuàng)新蛋白質(zhì)的多核苷酸的載體。
背景技術：
基于纖連蛋白的支架是一個能夠演化而結(jié)合任何感興趣化合物的蛋白質(zhì)家族。這 些蛋白質(zhì)(一般利用自纖連蛋白III型0 或而3樣結(jié)構(gòu)域衍生的支架)以天然或工程 抗體(即多克隆、單克隆、或單鏈抗體)特征性的方式發(fā)揮功能，而且還具備結(jié)構(gòu)優(yōu)點。具 體而言，這些抗體模擬物的結(jié)構(gòu)被設計以實現(xiàn)最佳折疊、穩(wěn)定性、和溶解度，甚至在正常情 況下導致抗體結(jié)構(gòu)和功能丟失的條件下亦是如此?；诶w連蛋白的支架蛋白的一個例子是 Adnectins (Adnexus, 一家 Bristol-Myers Squibb 石if發(fā)公司)。纖連蛋白是一種在細胞外基質(zhì)的形成和細胞-細胞相互作用中發(fā)揮至關重要作 用的大型蛋白質(zhì)；它由三類(I型、II型、和III型)小型結(jié)構(gòu)域的許多重復組成(Baron et al.，1991)。Fn3自身是一個大型亞家族的范式，該亞家族包括細胞粘附分子、細胞表面 激素和細胞因子受體、伴侶蛋白(chaperoning)、和碳水化合物結(jié)合域的一部分。綜述參見 Bork&DooIittle,Proc Natl Acad Sci USA. 19920ct 1 ；89(19) :8990-4 ；Bork et al. ,J Mol Biol.1994 Sep 30 ；242 (4) :309-20 ；Campbell&Spitzfaden, Structure. 1994May 15; 2(5) :333-7 ；Harpez&Chothia, J Mol Biol. 1994May 13 ；238 (4) :528-39)。纖連蛋白III型0^3)結(jié)構(gòu)域包含(N端至C端的次序)β或β樣鏈Α、環(huán)ΑΒ、β 或β樣鏈B、環(huán)BC、β或β樣鏈C、環(huán)CD、β或β樣鏈D、環(huán)DE、β或β樣鏈Ε、環(huán)EF、β 或β樣鏈F、環(huán)TO、和β或β樣鏈G。任何或所有環(huán)AB、BC、CD、DE、EF和re可參與靶物 結(jié)合。BC、DE、和TO環(huán)在結(jié)構(gòu)和功能上都與來自免疫球蛋白的互補決定區(qū)(OTR)類似。美 國專利No. 7，115，396記載了這樣的而3結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)，其中通過對BC、DE、和TO環(huán)的改變 獲得了高親和力TNFa結(jié)合物。美國專利申請公開No. 2007/01481 記載了這樣的而3結(jié) 構(gòu)域蛋白質(zhì)，其中通過對BC、DEJP TO環(huán)的改變獲得了高親和力的VEGFR2結(jié)合物。為治療和診斷目的獲得改良的纖連蛋白結(jié)構(gòu)域支架蛋白會是有利的。本公開內(nèi)容 提供這樣的改良的蛋白質(zhì)。發(fā)明概述本申請的一個方面提供多價多肽，其包含N端結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域，該N端結(jié)構(gòu) 域包含以小于500nM的Kd結(jié)合第一靶物分子的第一纖連蛋白III型第10結(jié)構(gòu)域(kiFM)， 該C端結(jié)構(gòu)域包含以小于500nM的Kd結(jié)合第二靶物分子的第二 ’113。在一些實施方案中，第一和第二 1(1而3結(jié)構(gòu)域是藉由多肽接頭連接的，所述多肽接頭諸如例如具有1-100、1_50、 1-20、1-10、5-50、5-20、5-10、10-50、或10-20個氨基酸的多肽。在一些實施方案中，第一和 第二 1(1而3結(jié)構(gòu)域是藉由選自基于甘氨酸-絲氨酸的接頭，諸如SEQ ID N0:21和22的多 肽連接的。在一些實施方案中，第一和第二 1(1而3結(jié)構(gòu)域是藉由SEQ ID N0:20所示的多肽 連接的。在一些實施方案中，第一和第二 結(jié)構(gòu)域是藉由選自基于甘氨酸-脯氨酸的接 頭，諸如SEQ ID N0:32、33、和34的多肽連接的。在一些實施方案中，第一和第二 1(^n3結(jié) 構(gòu)域是藉由選自基于脯氨酸-丙氨酸的接頭，諸如SEQ ID N0:60、61和62的多肽連接的。每個"lFr^結(jié)構(gòu)域包含環(huán)AB、環(huán)BC、環(huán)CD、環(huán)DE、環(huán)EF、和環(huán)FG，而且每個°Fn3結(jié) 構(gòu)域獨立地在選自環(huán)BC、DE和TO中的至少一個環(huán)中具有相對于人呷113結(jié)構(gòu)域的相應環(huán)的 序列發(fā)生了改變的氨基酸序列。每個所述結(jié)構(gòu)域包含與SEQ ID NO :1所示的天然存 在人uiFr^結(jié)構(gòu)域至少50、60、70、或80%相同的氨基酸序列。在一些實施方案中，第一 ’113結(jié)構(gòu)域以小于IOOnM的Kd結(jié)合第一靶物分子，而且 第二 kiFM結(jié)構(gòu)域以小于IOOnM的Kd結(jié)合第二靶物分子。在一些實施方案中，第一靶物分 子和第二靶物分子是相同的。在一些實施方案中，第一靶物分子和第二靶物分子是不同的。 在一些實施方案中，第一靶物分子是IGF-IR，而且第二靶物分子是VEGFR2。在一些實施方 案中，第一靶物分子是VEGFR2，而且第二靶物分子是IGF-IR。在一些實施方案中，kiFM結(jié)構(gòu)域的至少兩個環(huán)發(fā)生了改變。在一些實施方案中， 環(huán)BC和環(huán)TO具有相對于人kiFi^結(jié)構(gòu)域的相應環(huán)的序列發(fā)生了改變的氨基酸序列。在一 些實施方案中，1(1而3結(jié)構(gòu)域的至少三個環(huán)發(fā)生了改變。在一些實施方案中，kiFM結(jié)構(gòu)域的 至少兩個環(huán)結(jié)合靶物分子。在一些實施方案中，kiFM結(jié)構(gòu)域的三個環(huán)結(jié)合靶物分子。在一些實施方案中，第一和/或第二 1(1而3結(jié)構(gòu)域在其C端連接至選自SEQID NO 17、18、19、50、51、52、71 或 72 或 E、EI、EID、ES、EC、EGS、或 EGC 的氨基酸序列。在一些實 施方案中，第一 uiFr^結(jié)構(gòu)域在其C端連接至氨基酸序列SEQ ID NO :19或50、或Ε、EI、或 EID0在一些實施方案中，第二 結(jié)構(gòu)域在其C端連接至氨基酸序列SEQ ID NO :17,18, 51、52、71 或 72。在一些實施方案中，提供包含與SEQ ID NO :8-15 J9-31和63-70中的任一序列至 少70、80、90、95、或100%相同的氨基酸序列的多價多肽。在一些實施方案中，多價多肽還包含一個或多個選自下述各項的藥動學(PK)模 塊聚氧化烯模塊、人血清白蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)、唾液酸、人血清白蛋白、運鐵蛋白、IgG、IgG 結(jié)合蛋白、和Fc片段。在一些實施方案中，Hi模塊是聚氧化烯模塊且所述聚氧化烯模塊是 聚乙二醇(PEG)。在一些實施方案中，PEG模塊經(jīng)Cys或Lys氨基酸共價連接于多價多肽。 在一些實施方案中，PEG介于約0. 5kDa和約IOOkDa之間。在一些實施方案中，1 模塊改善多肽的一項或多項藥動學特性，例如生物利用度、 血清半衰期、體內(nèi)穩(wěn)定性、和藥物分布。在一些實施方案中，相對于單獨的多價多肽，I3K模塊 將多價多肽的血清半衰期延長至少 20、30、40、50、70、90、100、120、150、200、400、600、800% 或更多。在一些實施方案中，所述進一步包含Hi模塊的多價多肽具有至少1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11、12、13、或14天的血清體內(nèi)半衰期。在一些實施方案中，1 模塊和1(1而3結(jié)構(gòu)域是藉由至少一個二硫鍵、肽鍵、多肽、聚 合糖(polymeric sugar)、或聚乙二醇模塊連接的。在一些實施方案中，I3K模塊和結(jié)
5構(gòu)域是藉由包含氨基酸序列SEQ ID NO :17，18，或20的多肽連接的。在一些實施方案中，多價多肽進一步包含結(jié)合模塊。在一些實施方案中，多價多 肽進一步包含抗體模塊。在一些實施方案中，抗體模塊小于50KDa。在一些實施方案中，抗 體模塊小于40KDa。在一些實施方案中，抗體模塊是單鏈Fv(ScFv)、Fab片段、Fab'片段、 F(ab' )2、二硫化物連接的Fv(SdFv)、Fv、雙抗體、或完整抗體。在一些實施方案中，抗體 模塊是單域抗體。在一些實施方案中，抗體模塊結(jié)合人蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，抗體 模塊結(jié)合 IGF-IR、FGFRU FGFR2、FGFR3、FGFR4、c_Kit、人 pl85 受體樣酪氨酸激酶、HER2、 HER3、c-Met、葉酸受體、PDGFR、VEGFRl、VEGFR2、VEGFR3、人血管內(nèi)皮生長因子(VEGF) A、 VEGF C, VEGF D、人 CD20、人 CD18、人 CDlla、人凋亡受體-2 (Apo_2)、人 α 4β 7 整聯(lián)蛋白、人 GPIIb-IIIa整聯(lián)蛋白、干細胞因子(SCF)、EGFR、或人CD3。在一些實施方案中，多價多肽進一步包含脂籠蛋白衍生物、四連蛋白衍生物、 avimer、或錨蛋白衍生物。在一些實施方案中，多價多肽結(jié)合人蛋白質(zhì)。在一些實施方案 中，多價多肽結(jié)合IGF-IR、FGFRl、FGFR2、FGFR3、FGFR4、c-Kit、Apl85受體樣酪氨酸激酶、 HER2、HER3、c-Met、葉酸受體、PDGFR、VEGFRl、VEGFR2、VEGFR3、人血管內(nèi)皮生長因子(VEGF) A、VEGF C, VEGF D、人 CD20、人 CD18、人 CDlla、人凋亡受體-2 (Apo_2)、人 α 4β 7 整聯(lián)蛋白、 人GPIIb-IIIa整聯(lián)蛋白、干細胞因子(SCF)、EGFR、或人CD3。在一些實施方案中，多價多肽進一步包含藉由至少一個二硫鍵、肽鍵、多肽、聚合 糖、或聚乙二醇模塊(PEG)連接的結(jié)合模塊。在一些實施方案中，PEG介于約0.5kDa和約 IOOkDa之間。在一些實施方案中，PEG是藉由Cys或Lys殘基綴合于多肽和結(jié)合模塊的。在一個方面，本申請?zhí)峁┙?jīng)過去免疫化(deimmunized)以消除一個或多個T細胞 表位的多價多肽。在一個方面，本申請?zhí)峁┙?jīng)過去免疫化以消除一個或多個B細胞表位的 多價多肽。在一個方面，本申請?zhí)峁┮环N多價多肽，其中1(1而3結(jié)構(gòu)域是通過包括下述步驟 的方法選擇的a)生成一群候選核酸分子，每個核酸分子包含與人而3結(jié)構(gòu)域編碼序列不 同的候選纖連蛋白III型(1(1而3)結(jié)構(gòu)域序列，所述核酸分子各自包含可操作連接至所述 候選wFM結(jié)構(gòu)域編碼序列的翻譯起始序列和起始密碼子且各自在3'末端可操作連接于 核酸-嘌呤霉素接頭；b)在體外翻譯所述候選kiFM結(jié)構(gòu)域編碼序列以生成一群候選核 酸」°Fn3融合物；c)使所述一群候選核酸」°Fn3融合物與靶物分子接觸；并d)選擇這樣的 核酸」°Fn3融合物，其蛋白質(zhì)部分對靶物分子的結(jié)合親和力或特異性相對于所述人1(1而3對 靶物分子的結(jié)合親和力或特異性有所改變。在一些實施方案中，對于所選擇的核酸」°Fn3 融合物通過下述方式加以進一步優(yōu)化改變一個或多個核酸殘基并再次用靶物分子篩選融 合物以選擇改良的結(jié)合物(improved binders) 0在一些實施方案中，候選核酸分子是RNA。 在一些實施方案中，候選核酸分子是DNA。在一個方面，本申請?zhí)峁┌鄡r多肽的藥學可接受組合物。在一些實施方案中， 組合物基本上不含內(nèi)毒素。在一些實施方案中，組合物基本上沒有微生物污染，使之適合于 體內(nèi)施用。組合物可配制成例如供IV、IP或皮下施用。在另一個方面，本申請?zhí)峁┚幋a本文所述多價多肽的核酸。還包括包含此類蛋白 質(zhì)的多核苷酸的載體。合適的載體包括例如表達載體。本申請的又一個方面提供包含編碼 多價多肽的多核苷酸、載體或表達載體的細胞。序列優(yōu)選經(jīng)過優(yōu)化以使在所使用的細胞類型中的表達最大化。優(yōu)選的是在大腸桿菌中表達。也可以在例如真核微生物(包括酵母，例 如畢赤氏酵母(Pichia)或釀酒酵母(cervaisea))或藍綠藻中表達多價多肽?？梢愿脑旖?母細胞以產(chǎn)生期望的糖基化。本發(fā)明的細胞可以是哺乳動物細胞。在一個方面，可以改造 哺乳動物細胞以產(chǎn)生期望的糖基化。在一個方面，細胞表達基于纖連蛋白的支架蛋白。在 一個方面，編碼基于纖連蛋白的支架蛋白的多核苷酸經(jīng)過密碼子優(yōu)化以便于在所選擇的細 胞類型中表達。還提供了用于生產(chǎn)本文所述多價多肽的方法，包括培養(yǎng)包含編碼多價多肽 的核酸、包含所述核酸的載體、或表達載體的宿主細胞并自培養(yǎng)物回收所表達的多價多肽。附圖簡述

圖1.各種HTPP純化的基于VAkiFI^的結(jié)合物展現(xiàn)相似的表達譜。如所示 的‘GS5' (SEQ ID NO 21)禾口' GSlO' (SEQ ID NO :22)。圖2. HTPP純化的構(gòu)建物385A08-Fn-V2B的SEC表現(xiàn)出主要是單體蛋白。圖3HTPP純化的構(gòu)建物V2B-Fn-385A08的SEC表現(xiàn)出單體和二聚體蛋白的混合 物。圖4某些基于V/I 10Fn3的結(jié)合物的通過LC-MS測量的分子量和DSC Tm測定。如 所示的‘GSlO' (SEQ ID N0:22)。圖5385A08-Fn-V2B-cys(PEG化，無his標簽)的SEC展現(xiàn)出此蛋白質(zhì)95. 1 %是單體。圖6385A08-Fn-V2B-cys (PEG化，無his標簽)DSC分析展現(xiàn)出該蛋白質(zhì)在56°C解 折疊一半，而且直到45°C沒有檢測到解折疊。圖7給藥40kD分支PEG化型或線性PEG化型構(gòu)建物385A08-Fn-V2B_Cys的小鼠 展現(xiàn)出半衰期為14. 6小時(分支的)和10. 5小時(線性的)。給數(shù)只小鼠給藥分支的或 線性的PEG化型構(gòu)建物，如圖中所指示的。圖8VEGFR2/IGF-IR串聯(lián)物(tandem)在細胞中與單獨的VEGFR2或IGF4R結(jié)合物 等效(equipotent)。用Biacore測定法測定構(gòu)建物對IGF-IR的結(jié)合，并用Ba/F3和詘41 測定法測定IC50(見實施例5和7)。實施例1中描述了所述的分子形式的序列。如所示 的‘GS5' (SEQ ID NO 21)禾口' GSlO' (SEQ IDNO 22)。圖9評估某些基于V/I 10Fn3的結(jié)合物對IGF4R和VEGFR2的動力學行為。如所 示的‘GSlO' (SEQ ID NO 22)。圖10評估有his標簽和無his標簽型的PEG化構(gòu)建物385A08-Fn-V2B_cys對 IGF4R和VEGFR2的動力學行為。圖 11 在細胞系四3 =KDR 上評估 Peg_V2BShort 和 385A08-Fn-V2B_cys (有 PEG 和 his標簽)與經(jīng)標記的Peg-V2BShort競爭細胞結(jié)合的VEGFR-2的相對能力。圖 12 在細胞系 R+ 上評估 AT580-PEG40 和 385A08-Fn-V2B_cys (有 PEG 和 his 標 簽)與經(jīng)標記AT580-PEG20-AT580競爭細胞結(jié)合的IGF-IR的相對能力。圖13。在基于細胞的測定法Μι41和HMVEC-L中評估基于V/I 10Fn3的結(jié)合物。如 所示的‘GS5' (SEQ ID NO 21)和'GSlO' (SEQ ID NO :22)。圖14。對選定的構(gòu)建物(包括有his標簽和無his標簽的PEG化構(gòu)建物 385A98-Fn-V2B-Cys)評估它們在基于細胞的測定法NCI_H^9和Ba/F3中的活性，與對照比 較。
圖15。HEK293/KDR和PAE/KDR細胞表達VEGFR2和IGF-IR，而且這兩種受體在它 們的關聯(lián)配體存在下活化。用VEGF、IGF1、或這兩種因子(VEGF/IGF1)刺激經(jīng)KDR(VEGFR2) 轉(zhuǎn)染的HEK293和PAE細胞。對細胞溶胞物的^festern印跡探查磷酸化VEGFR(p_Flk_l/ Tyr996)、磷酸化IGF-IR、磷酸化Akt、磷酸化MAPK、或總肌動蛋白。圖16?；诶w連蛋白的支架多聚體阻斷VEGFR2和IGF-IR配體誘導的磷酸化 且抑制HEK293/KDR細胞增殖。如實施例8中所述用VEGF和IGFl (“指示不刺激的 對照)及纖連蛋白支架結(jié)構(gòu)域蛋白處理細胞。對細胞溶胞物的Western印跡探查磷酸化 VEGFR(p-Flk-l/Tyr996)、總 VEGFR(Flk-I)、磷酸化 IGF-IR、總 IGF-IR、磷酸化 Akt、總 Akt、 磷酸化MAPK、總MAPK、或總肌動蛋白。暴露于各種構(gòu)建物后通過[3H]-胸苷摻入評估細胞增 殖，而且以 IC5tl 報告結(jié)果。如所示的‘GS5' (SEQ ID NO 21)和'GSlO' (SEQ ID NO 22)。圖17。基于纖連蛋白的支架多聚體阻斷VEGFR2和IGF-IR配體誘導的磷酸化 且抑制HEK293/KDR細胞增殖。如實施例8中所述用VEGF和IGFl及纖連蛋白支架結(jié)構(gòu) 域蛋白處理細胞。對細胞溶胞物的Western印跡探查磷酸化VEGFR(p Flk_l/Tyr996)、總 VEGFR(Flk-I)、磷酸化IGF-IR、總IGF-IR、磷酸化Akt、總Akt、磷酸化MAPK、總MAPK、或總肌 動蛋白。暴露于各種構(gòu)建物后通過[3H]-胸苷摻入評估細胞增殖，結(jié)果作為IC5tl報告。如 所示的‘GS5' (SEQ ID NO 21)和'GSlO' (SEQ ID NO :22)。圖18。細胞增殖測定法暴露72小時后HMVEC細胞中各種基于VAwFr^的結(jié)合 物的效果。圖19。Western印跡分析將HMVEC-L細胞暴露于漸增濃度的各種構(gòu)建物1小時， 接著用VEGF/IGF-1配體(二者終濃度均為50ng/ml)于37°C活化10分鐘，之后溶胞。通過 在相對于用作加載對照的GAPDH標準化之后比較未處理的對經(jīng)處理的樣品中磷酸信號的 比來測量對pIGF-lR、pAkt、和pMAPK活性的抑制。圖20。Western印跡分析將他41細胞暴露于漸增濃度的化合物1小時，接著用 IGF-I配體(50ng/ml)于37°C活化10分鐘，之后溶胞。通過在相對于用作加載對照的GAPDH 標準化之后比較未處理的對處理的樣品中磷酸信號的比來測量對PlGF-IR和pAkt活性的 抑制。圖21。暴露1小時后各種構(gòu)建物對HMVEC-L細胞中鈣釋放的影響。將細胞在EBM 培養(yǎng)基中血清饑餓過夜，然后在漸增量的各種構(gòu)建物存在下溫育1小時。用50ng/ml VEGF 配體刺激細胞。添加配體后60秒測量Ca2+通量。圖22。PEG化的、有his標簽的385A08-Fn-V2B_cys在RH-41腫瘤異種移植物模 型中在單劑量水平的抗腫瘤活性。Ajx周χ 3方案后的生長曲線。B.百分比生長抑制圖， 證明了在一個TVDT內(nèi)與溶媒處理組相比大于50%的TGI。(▼)指示的是給藥方案。圖23。PEG化的、有his標簽的385A08-Fn-V2B_cys在RH-41腫瘤異種移植物模 型中在多劑量水平的抗腫瘤活性。A、B、C、和D中列出每種藥劑的制定劑量水平。(▼)指示 給藥方案。圖M。PEG化的、有his標簽的385A08-Fn-V2B-cys在A549腫瘤異種移植物肺模 型中在多劑量水平的抗腫瘤活性。A和C中顯示指定劑量水平，B和D中顯示相應的％TGI。 (▼)指示給藥方案。
圖25。PEG化的、有his標簽的385A08-Fn-V2B_cys在GEO腫瘤異種移植物結(jié)腸 模型中在多劑量水平的抗腫瘤活性。A和C中顯示指定劑量水平，B和D中顯示相應的％ TGL· (▼)指示給藥方案。圖26。A673尤因肉瘤異種移植物腫瘤中由PEG化的、有his標簽的 385A08-Fn-V2B-cys 介導的腫瘤生長抑制與 mononectin PEG_V2B_short ( 一種 PEG 化的抗 VEGFR-2adnectin)可比較。圖 27。385A08-Fn-V2B_cys (有 his)的藥動學參數(shù)。圖 28。385A08-Fn-V2B-cys (有 his)和 mVEGF-A 對攜帶 A673 腫瘤的裸鼠 IP 施用 20和200mg/kg后的擬合的與觀察到的血漿濃度-時間圖譜的對照。圖四。385A08-Fn-V2B-cys (無his)和mVEGF-A對攜帶A673腫瘤的裸鼠IP施用 20和200mg/kg后的擬合的與觀察到的血漿濃度-時間圖譜的對照。圖 30。猴中 385A08-Fn-V2B_cys (有 his)的藥動學參數(shù)。圖 31。385A08-Fn-V2B-cys (有 his)和 hVEGF-A 對猴 IV 施用 3 和 30mg/kg 后的 擬合的與觀察到的血漿濃度-時間圖譜的對照。圖32。猴中385A08-Fn-V2B_cys (無his標簽)的藥動學參數(shù)。圖 33。385A08-Fn-V2B-cys (無 his)和 hVEGF-A 對猴 IV 施用 3mg/kg (第 1 劑) 后的擬合的與觀察到的血漿濃度-時間圖譜的對照。發(fā)明詳述定義“多肽”指兩個或更多個氨基酸的任何序列，無論長度、翻譯后修飾、或功能。“多 肽”、“肽”、和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用。多肽可包括天然氨基酸和非天然氨基酸，諸 如美國專利No. 6，559,1 (通過述及收入本文)中披露的那些。還可以以多種標準化學方 式中任一方式修飾多肽(例如可以用保護基團修飾氨基酸；可以將羧基末端氨基酸變成末 端酰胺基團；可以用基團修飾氨基末端殘基以例如增強親脂性；或者，可以化學糖基化或 以其它方式修飾多肽以提高穩(wěn)定性或延長體內(nèi)半衰期)。多肽修飾可包括將另一結(jié)構(gòu)(諸 如環(huán)狀化合物或其它分子)搭接到多肽上，而且還可包括包含一個或多個構(gòu)型發(fā)生了改變 的(例如R或S ；或者L或D)的氨基酸的多肽。術語“PK”與“藥動學”同義，涵蓋化合物包括例如下列在內(nèi)的特性受試者對 它的吸收、分布、代謝、和清除?！癏i調(diào)控蛋白”或“Hi模塊”指任何在與生物學活性分子 融合或一起施用時可影響生物學活性分子的藥動學特性的蛋白質(zhì)、肽、或模塊。1 調(diào)控 蛋白或Hi模塊的例子包括PEG、人血清白蛋白(HSA)結(jié)合物(如美國專利申請公開文本 No. 2005(^87153和20070003M9中所公開的)、人血清白蛋白、Fc或Fc片段、和糖(例如 唾液酸)?！肮δ苄訤c區(qū)”擁有天然序列Fc區(qū)的至少一項“效應器功能”。例示性的“效應器 功能”包括Clq結(jié)合、補體依賴性細胞毒性(CDC)、Fc受體結(jié)合、抗體依賴性細胞介導的細 胞毒性(ADCC)、吞噬、細胞表面受體(例如B細胞受體(BCR))的下調(diào)等。此類效應器功能 一般要求Fc區(qū)與結(jié)合域(例如抗體可變域)組合，而且可以使用本領域已知的用于評估此 類抗體效應器功能的各種測定法來加以評估。“天然序列Fc區(qū)”包含與在自然界中找到的Fc區(qū)的氨基酸序列同樣的氨基酸序
9列。“變異Fc區(qū)”包含由于至少一處氨基酸修飾而與天然序列Fc區(qū)的氨基酸序列不 同的氨基酸序列。優(yōu)選的是，變異Fc區(qū)與天然序列Fc區(qū)或親本多肽的!^c區(qū)相比具有至少 一處氨基酸替代，例如天然序列Fc區(qū)或區(qū)別多肽的Fc區(qū)中約1處至約10處氨基酸替代和 優(yōu)選約1處至約5處氨基酸替代。本文中的變異Fc區(qū)會優(yōu)選與天然序列Fc區(qū)和/或區(qū)別 多肽的Fc區(qū)具有至少約80%序列同一性和最優(yōu)選至少約90%序列同一性、更優(yōu)選至少約 95%序列同一性?！翱贵w依賴性細胞介導的細胞毒性”和“ADCC”是指一種細胞介導的反應，其中表達 Fc受體(FcR)的非特異性細胞毒性細胞(例如天然殺傷(NK)細胞、嗜中性細胞、和巨噬細 胞)識別靶細胞上所結(jié)合的抗體并隨后引起靶細胞的溶解。介導ADCC的主要細胞，即NK 細胞，只表達Fc γ RIII，而單核細胞表達Fc γ RI、Fc γ RII和Fc γ RIII。為了評估感興趣分 子的ADCC活性，可實施體外ADCC測定，諸如美國專利No. 5，500，362或5，821，337中所記 載的。對于此類測定法有用的效應細胞包括外周血單個核細胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細 胞?；蛘?另外，可在體內(nèi)評估感興趣分子的ADCC活性，例如在動物模型中，諸如Clynes 等，PNAS(USA)95 :652-656(1998)中所披露的?！鞍俜直?％ )氨基酸序列同一性”在本文中定義為比對序列并在必要時引入缺口 以實現(xiàn)最大百分比序列同一性后，且在不將任何保守替代視為序列同一性的一部分的條件 下，候選序列中與所選擇序列中的氨基酸殘基同樣的氨基酸的百分比。用于測定百分比氨 基酸序列同一性的比對可以以本領域技術范圍內(nèi)的多種方式來實現(xiàn)，例如使用公眾可獲得 的計算機軟件諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign (DNASTAR)軟件。本領域技 術人員可決定用于測量比對的適宜參數(shù)，包括在所比較序列的全長上實現(xiàn)最大比對所需要 的任何算法。然而，就本文而言，％氨基酸序列同一性值是如下文所描述的使用序列比較計 算機程序ALIGN-2獲得的。ALIGN-2序列比較計算機程序是由Genentech公司創(chuàng)作的，已經(jīng) 與用戶文檔一起提交給美國版權局(U. S. Copyright Office, Washington D. C.，20559)，登 記為美國版權注冊號TXU510087，而且公眾可通過Genentech公司(South San Francisco, Calif.)獲得。ALIGN-2程序應當編譯成在UNIX操作系統(tǒng)、優(yōu)選數(shù)字UNIX V4. OD上使用。 所有序列比較參數(shù)由ALIGN-2程序設定且不再變化。就本文而言，給定氨基酸序列A對(to)、與(with)、或針對(against)給定氨基酸 序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述為給定氨基酸序列A具有或包含對、與、或針對 給定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性)如下計算100乘以分數(shù)X/Y，其中X是序 列比對程序ALIGN-2在該程序的A和B比對中評分為相同匹配的氨基酸殘基數(shù)目，且其中Y 是B中的氨基酸殘基總數(shù)。應當理解的是，若氨基酸序列A的長度不等于氨基酸序列B的 長度，則A對B的％氨基酸序列同一性會不等于B對A的％氨基酸序列同一性?！胺蛛x的”多肽指已經(jīng)鑒定且與/自其天然環(huán)境的成分分開和/或回收的多肽。所 謂其天然環(huán)境的污染成分，是指會干擾該多肽的診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶、激素、 和其它蛋白質(zhì)性或非蛋白質(zhì)性的溶質(zhì)。在優(yōu)選的實施方案中，多肽會被純化(1)至超過 95% (以多肽的重量計，如通過Lowry法所測定的)和最優(yōu)選超過99% (以重量計)；(2) 至足以通過使用轉(zhuǎn)杯式測序儀獲得至少15個殘基的N-末端氨基酸序列或內(nèi)部氨基酸序列 的程度，或( 至通過還原性或非還原性條件下SDS-PAGE并使用考馬斯藍或優(yōu)選銀染色顯示均質(zhì)。分離的多肽包括重組細胞內(nèi)原位的多肽，這是因為其中不會存在多肽天然環(huán)境的 至少一種成分。然而，通常會通過至少一個純化步驟來制備分離的多肽。靶物還可以是所述靶物的片段。如此，靶物還是所述靶物的能夠引發(fā)免疫應答的 片段。靶物還是所述靶物的能夠結(jié)合針對全長靶物生成的單域抗體的片段。片段，在用于本文時，指序列的小于100% (例如99%、90%、80%、70%、60%、 50%,40%,30%,20%,10%^ )，但是包含 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、21、22、23、M、25或更多個氨基酸。片段的長度足以使感興趣的相互作用維持IxKTfiM或 更好的親和力。片段在用于本文時還指如下所述的一個或多個任選的氨基酸的插入、刪除和替 代，所述插入、刪除和替代基本上不改變該靶物與針對全長靶物生成的單域抗體結(jié)合的能 力。氨基酸插入、刪除或替代的數(shù)目優(yōu)選多至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、 42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、 67、68、69或70個氨基酸。術語“治療有效量”指在哺乳動物中有效治療疾病或病癥的藥物量。在癌癥的情 況中，藥物的治療有效量可減少癌細胞的數(shù)目；縮小腫瘤的尺寸；抑制(即在一定程度上減 緩，優(yōu)選阻止)癌細胞浸潤到周圍器官中；抑制(即在一定程度上減緩，優(yōu)選阻止)腫瘤轉(zhuǎn) 移；在一定程度上抑制腫瘤生長；和/或在一定程度上減輕一種或多種與病癥有關的癥狀。 以藥物可阻止生長和/或殺死現(xiàn)有癌細胞為限，藥物可以是細胞抑制性的和/或細胞毒性 的。對于癌癥治療，可通過例如評估疾病進展前時間(time to disease progression,TTP) 和/或測定響應率(response rate, RR)來測量體內(nèi)功效。氨基酸序列或化合物的半衰期可一般性地定義為多肽的血清濃度在體內(nèi)降低 50% (例如由于序列或化合物的的降解和/或天然機制對序列或化合物清除或隔離)所花 費的時間?？梢砸员旧硪阎娜魏畏绞絹頊y定半衰期，諸如通過藥動學分析。合適的技術對 于本領域技術人員會是清楚的，而且例如一般包括下述步驟對靈長類動物適當施用合適 劑量的要處理的氨基酸序列或化合物；以規(guī)則時間間隔自所述靈長類動物收集血液樣品或 其它樣品；測定本發(fā)明的氨基酸序列或化合物在所述血液樣品中的水平或濃度；并從如此 獲得的數(shù)據(jù)(圖)計算到本發(fā)明的氨基酸序列或化合物的水平或濃度與給藥后的初始水平 相比降低50%時的時間。參考例如標準手冊，諸如Kenneth，A等，Chemical Stability of Pharmaceuticals :A Handbook for Pharmacists^PetersPharmacokinete analysis A Practical Approach(1996)。還可參考"Pharmacokinetics" ,M Gibaldi 禾口D Perron, Marcel Dekker 出版，第二修訂版(1982)。半衰期可以使用諸如tl/2-α ,tl/2-β和曲線下面積(AUC)等參數(shù)來表述。在本 說明書中，“半衰期延長”指這些參數(shù)之任一項，如這些參數(shù)之任兩項，或?qū)嵸|(zhì)上所有這三項 參數(shù)的增大。“半衰期延長”尤其指tl/2-β的增大，同時有或無tl/2-α和/或AUC或二 者的增大。在用于本文時，術語“多價”指整合有兩個或更多個生物學活性區(qū)段的重組分子。 形成多價分子的蛋白質(zhì)片段任選可經(jīng)由多肽接頭連接，該多肽接頭搭接各組成部分并容許 各組成部分獨立發(fā)揮功能。
概覽本申請?zhí)峁┌瑑蓚€或更多個基于纖連蛋白的支架蛋白，諸如而3結(jié)構(gòu)域的多價 多肽。各而3結(jié)構(gòu)域可結(jié)合相同靶物(從而提高效價并因此提高靶物結(jié)合親合力)或不同 靶物(從而展現(xiàn)多種效應器功能)。美國專利No. 6，818，418記載了可共價或非共價連接的纖連蛋白支架多聚體。本 申請描述改良的多聚體，它們藉由多肽接頭共價鍵合，從而容許多價多肽作為單一構(gòu)建物 表達。本申請部分基于下述令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，即藉由多肽接頭連接的各而3結(jié)構(gòu)域彼此獨 立地正確折疊，保留高親和力結(jié)合，而且每個結(jié)構(gòu)域保留其功能特性?；诶w連蛋白的支架本申請的一個方面提供包含藉由多肽連接的至少兩個而3結(jié)構(gòu)域的多肽，其中每 個Fn3結(jié)構(gòu)域結(jié)合靶物分子。每個Fn3結(jié)構(gòu)域包含AB環(huán)、BC環(huán)、CD環(huán)、DE環(huán)、EF環(huán)、和FG 環(huán)。在一些實施方案中，而3結(jié)構(gòu)域是自人纖連蛋白衍生的而3結(jié)構(gòu)域，特別是纖連蛋 白的第十而3結(jié)構(gòu)域(1(lFn3)，如SEQ ID N0:1中所示。已經(jīng)報告了多種突變型1QFn3支架。 在一個方面，Asp 7, Glu 9、和Asp 23中的一個或多個被替換成另一種氨基酸，例如不帶負 電荷的氨基酸殘基(例如AsruLys、等)。已經(jīng)報告了這些突變具有與野生型相比促進突變 型1(^η3在中性pH的更大穩(wěn)定性的效果(參見PCT公開文本No. W002/04523)。已經(jīng)公開 了 1QFn3支架中其他多種有益或中性的改變。參見例如Batori等，Protein Eng. 2002Dec ； 15(12) :1015-20 ；Koide 等，Biochemistry 200IAug 28 ；40 (34) :10326_33。變體型和野生型wFM蛋白都具有相同的結(jié)構(gòu)特征，即七個β鏈結(jié)構(gòu)域序列(稱 作A-G)和連接前述七個β鏈結(jié)構(gòu)域序列的六個環(huán)區(qū)(AB環(huán)、BC環(huán)、CD環(huán)、DE環(huán)、EF環(huán)、和TO 環(huán))。位置與N-和C-末端最接近的β鏈在溶液中可采取β樣構(gòu)象。在SEQ ID Ν0:1中， AB環(huán)對應于殘基15-16，BC環(huán)對應于殘基21-30，CD環(huán)對應于殘基39-45，DE環(huán)對應于殘基 51-56，EF 環(huán)對應于殘基 60-66，而 FG 環(huán)對應于殘基 76-87 (Xu et al. , Chemistry&BioIogy 20029 =933-942)。BC、DE和TO環(huán)沿著分子的一個面排列，而AB、CD和EF環(huán)沿著分子相對 面排列。在SEQ ID N0:1中，β鏈A對應于殘基9-14，β鏈B對應于殘基17-20，β鏈C 對應于殘基31-38，β鏈D對應于殘基46-50，β鏈E對應于殘基57-59，β鏈F對應于殘 基67-75，而β鏈G對應于殘基88-94。各鏈經(jīng)由相應的環(huán)彼此連接，例如鏈A和B藉由環(huán) AB連接形成鏈Α、環(huán)ΑΒ、鏈B的排列，等等。涉及形成疏水性核心的殘基(“核心氨基酸殘 基”)包括與SEQ ID NO :1的下述氨基酸對應的氨基酸L8、V10、A13、L18、I20、W22、TO2、 134、Y36、F48、V50、A57、159、L62、Y68、170、V72、A74、188、190 和 Y92，其中核心氨基酸殘 基用單字母氨基酸代碼后加它們在SEQ ID NO :1內(nèi)的位置來表示。參見例如Dickinson et al.，J. Mol. Biol. 236 1079-1092 (1994)。在一些實施方案中，1°! 多肽可以與SEQ ID NO 1中所示人1QFn3結(jié)構(gòu)域至少 40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、或90%相同。大部分變異性一般會存在于 一個或多個環(huán)中。iciI7I^多肽的每個β或β樣鏈可以基本上由與SEQ ID NO 1的對應β 或β樣鏈的序列至少80^^85%,90^^95%或100%相同的氨基酸序列組成，只要這樣的 變異不破壞多肽在生理學條件中的穩(wěn)定性。在一些實施方案中，本公開內(nèi)容提供包含第十纖連蛋白III型(1(1而3)結(jié)構(gòu)域的多肽，其中"lFr^結(jié)構(gòu)域包含環(huán)AB、環(huán)BC、環(huán)CD、環(huán)DE、環(huán)EF、和環(huán)FG，且選自環(huán)BC、DE和FG中 的至少一個環(huán)具有相對于人kiFM結(jié)構(gòu)域的相應環(huán)的序列為改變的氨基酸序列。在一些實 施方案中，BC和re環(huán)是改變的。在一些實施方案中，BC、DEJP re環(huán)是改變的，即而3結(jié)構(gòu) 域包含非天然存在的環(huán)?！案淖兊摹敝敢惶幓蚨嗵幭鄬τ谀０逍蛄?對應的人纖連蛋白結(jié)構(gòu) 域)的氨基酸序列改變，包括氨基酸添加、刪除、和替代。氨基酸序列的改變可通過有意的、 盲目的、或自發(fā)的序列(一般是核酸編碼序列)變異來實現(xiàn)，而且可通過任何技術來實施， 例如PCR、易錯PCR、或化學DNA合成。在一些實施方案中，選自BC、DEjnre的一個或多個環(huán)的長度可以相對于相應的 人纖連蛋白環(huán)延長或縮短。在一些實施方案中，環(huán)的長度可以延長2-25個氨基酸。在一些 實施方案中，環(huán)的長度可以縮短1-11個氨基酸。具體而言，kiFM的re環(huán)長12個殘基，而 抗體重鏈中的相應環(huán)的范圍為4- 個殘基。因此，為了優(yōu)化抗原結(jié)合，1(1而3的re環(huán)的長 度優(yōu)選在長度以及序列方面改變以覆蓋4- 個殘基的CDR3范圍，以獲得最大可能的抗原 結(jié)合靈活性和親和力。在一些實施方案中，多肽包含如下的第一而3結(jié)構(gòu)域，其包含與SEQ IDNO 1的非 環(huán)區(qū)至少80，85，90，95，98，或100 %相同的氨基酸序列，其中至少一個選自BC，DE，和TO的 環(huán)是改變的。在一些實施方案中，多肽包含如下的第二而3結(jié)構(gòu)域，其包含與SEQ ID NO 1 的非環(huán)區(qū)至少80，85，90，95，98，或100%相同的氨基酸序列，其中至少一個選自BC, DE，和 re的環(huán)是改變的。在一些實施方案中，改變的BC環(huán)具有最多10處氨基酸替代、最多4處氨 基酸刪除、最多10處氨基酸插入、或其組合。在一些實施方案中，改變的DE環(huán)具有最多6 處氨基酸替代、最多4處氨基酸刪除、最多13處氨基酸插入或其組合。在一些實施方案中， re環(huán)具有最多12處氨基酸替代、最多11處氨基酸刪除、最多25處氨基酸插入或其組合。10Fn3結(jié)構(gòu)域一般以SEQ ID NO=I的氨基酸編號1開始。然而，本發(fā)明也涵蓋具有 氨基酸刪除的結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，SEQ ID NO :1的前8個氨基酸被刪除。N端或C 端也可添加額外的序列。例如，可以將額外的MG序列置于而3結(jié)構(gòu)域的N端，特別是第一 而3結(jié)構(gòu)域的N端。M通常會被切掉，留下G在N端。在一些實施方案中，序列可置于kiFM 結(jié)構(gòu)域的C端，例如SEQID N0:17，18，或19。在其它實施方案中，置于C端的序列可以是 SEQ ID NO: 17，18或19的C端截短片段，包括例如下述氨基酸序列之一(用單字母氨基酸 代碼表示):E, EI, EID, EIDKP (SEQ ID NO 50), EIDKPS (SEQ ID NO 51)，或 EIDKPC(SEQ ID NO 52)。在一些實施方案中，多肽包含如下的第一和/或第二 kiFM結(jié)構(gòu)域，其中BC環(huán)具 有氨基酸序列SEQ ID NO 2, DE環(huán)具有氨基酸序列SEQ ID NO :3，而TO環(huán)具有氨基酸序列 SEQ ID N0:4，其中而3結(jié)構(gòu)域結(jié)合IGF4R。在一些實施方案中，多肽包含如下的第一和/ 或第二 wFM結(jié)構(gòu)域，其中BC環(huán)具有氨基酸序列SEQ ID NO :5，DE環(huán)具有氨基酸序列SEQ ID NO :6，而TO環(huán)具有氨基酸序列SEQ ID NO :7，其中而3結(jié)構(gòu)域結(jié)合VEGFR2。在一些實施 方案中，多肽包含SEQ ID N0:8-15J9-31和63-70中的任一氨基酸序列。在一些實施方案 中，多肽包含與 SEQ ID NO :8-15,29-31 和 63-70 中任一序列至少 70，75，80，85，90，95，或 100%相同的氨基酸序列。纖連蛋白天然地借助其整聯(lián)蛋白結(jié)合基序“精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸”(RGD)結(jié) 合某些類型的整聯(lián)蛋白。在一些實施方案中，多肽包含缺少該(RGD)整聯(lián)蛋白結(jié)合基序的10Fn3結(jié)構(gòu)域。在一個實施方案中，多價多肽包含具有結(jié)構(gòu)A-B-C的多肽，其中A為包含結(jié)合 VEGFR2的結(jié)構(gòu)域、基本上由結(jié)合VEGFR2的結(jié)構(gòu)域組成、或由結(jié)合VEGFR2的1QFn3 結(jié)構(gòu)域組成的多肽，B為多肽接頭，而C為包含結(jié)合IGF-IR的1(1而3結(jié)構(gòu)域、基本上由IGF-IR 的kiFM結(jié)構(gòu)域組成、或由IGF-IR的1(1而3結(jié)構(gòu)域組成的多肽。在另一個實施方案中，多價 多肽包含具有結(jié)構(gòu)A-B-C的多肽，其中A為包含結(jié)合IGF4R的1(1而3結(jié)構(gòu)域、基本上由結(jié)合 IGF-IR的1(1而3結(jié)構(gòu)域組成、或由結(jié)合IGF4R的kiFM結(jié)構(gòu)域組成的多肽，B為多肽接頭，而 C為包含結(jié)合VEGFR2的1QFn3結(jié)構(gòu)域、基本上由結(jié)合VEGFR2的結(jié)構(gòu)域組成、或由結(jié)合 VEGFR2的1(1而3結(jié)構(gòu)域組成的多肽。具有結(jié)構(gòu)A-B-C的多價多肽的具體例子是包含下述各 項的多肽⑴具有SEQ ID NO :8-15,29-31和63-70任一所列氨基酸序列的多肽；或(ii) 包含與SEQ ID NO :8-15, 29-31和63-70任一所列氨基酸序列至少85%, 90%, 95%, 97%, 98%，或99%相同的氨基酸序列的多肽。在某些實施方案中，所述A區(qū)或C區(qū)是包含結(jié)合VEGFR2的1(1而3結(jié)構(gòu)域的多肽，其 中1(^η3結(jié)構(gòu)域具有如下的結(jié)構(gòu)(自N端至C端)β鏈Α、環(huán)ΑΒ、β鏈B、環(huán)BC、β鏈C、環(huán) ⑶、β鏈D、環(huán)DE、β鏈Ε、環(huán)EF、β鏈F、環(huán)TO、β鏈G，其中BC環(huán)具有氨基酸序列SEQ ID NO :5，DE環(huán)具有氨基酸序列SEQ IDNO :6，而TO環(huán)具有氨基酸序列SEQ ID N0:7，其中1QFn3 結(jié)構(gòu)域折疊成抗體重鏈可變區(qū)樣結(jié)構(gòu)，且其中多肽以小于IOOnM的Kd結(jié)合VEGFR2。結(jié)合 VEGFR2的1(1而3結(jié)構(gòu)域優(yōu)選折疊成如下的結(jié)構(gòu)，其中7條β鏈分布在兩個β片層之間，這 兩個β片層彼此相對擠壓，形成一個穩(wěn)定的核心，且其中各β鏈通過6個環(huán)連接，這些環(huán) 暴露于溶劑。在例示性的實施方案中，kiFM結(jié)構(gòu)域長度為80-150個氨基酸。在某些實施方案中，A區(qū)或C區(qū)是結(jié)合VEGFR2的1(^η3結(jié)構(gòu)域，其包含具有 氨基酸序列SEQ ID NO :5的BC環(huán)、具有氨基酸序列SEQ ID NO :6的DE環(huán)、和具有氨 基酸序列SEQ ID NO :7的TO環(huán)，其中該1Vr^結(jié)構(gòu)域以小于IOOnM的Kd結(jié)合VEGFR2。 一種例示性的VEGFR2結(jié)合物用下述序列表示=EWAATX…SLLIXd SWRHPHFPTR Xa2YYRITYGEXn2MFTVXa3 PLQPPT X.,ATIX^DYTITVYAVXa5 TDGRNGRLLSIP XjJSINYRT (SEQ ID NO :47)。在SEQ ID NO :47中，BC、DE和TO環(huán)具有以粗體顯示的固定序列，AB環(huán)用)(nl表示， CD環(huán)用‘表示，而EF環(huán)用Xn3表示，而β鏈A-G標有下劃線。X代表任意氨基酸，而X后面 的下標代表氨基酸數(shù)目的整數(shù)。具體而言，nl可以是1-15，2-15，1-10, 2-10,1-8, 2-8,1-5, 2-5，1-4，2-4，1-3，2-3,或1-2個任意數(shù)目基酸；而n2和n3可以各自獨立地是2-20, 2-15, 2-10，2-8，5-20，5-15，5-10，5-8，6-20，6-15，6-10，6-8，2-7，57，或 6-7 個氨基酸；而 al_a6 可以各自獨立地包含0-10，0-5，1-10，1-5，或2-5個氨基酸。在優(yōu)選的實施方案中，nl是2 個氨基酸，n2是7個氨基酸，n3是7個氨基酸，而al_a6是0個氨基酸。各β鏈的序列可 以在所有7個支架區(qū)間相對于SEQ ID NO :1所示相應氨基酸序列具有0-10，0-8，0-6，0-5， 0-4，0-3，0-2，或0-1處替代、刪除或添加。在一個例示性的實施方案中，β鏈的序列在所 有7個支架區(qū)內(nèi)可以相對于SEQ ID NO :1所示的相應氨基酸序列具有0-10，0-8，0-6，0-5， 0-4，0-3，0-2，或0-1處保守替代。在某些實施方案中，核心氨基酸殘基是固定的，且任意替 代、保守替代、刪除或添加發(fā)生于核心氨基酸殘基以外的殘基。在某些實施方案中，VEGFR2 結(jié)合物用下述氨基酸序列表示
EVVAATPTSLLI SWRHPHFPTR YYRITYGETGGNSPVQEFTV PLQPPT ATISGLKPGVDYTITVYAV TDGRNGRLLSIP ISINYRT (SEQ ID NO :40)。在SEQ ID NO :40中，BC、DE和TO環(huán)的序列具有以粗體顯示的固定序列(例如具有 氨基酸序列SEQ ID NO :5的BC環(huán)，具有氨基酸序列SEQ ID NO :6的DE環(huán)，和具有氨基酸序 列SEQ ID NO :7的TO環(huán))，而其余標有下劃線的序列(例如7條β鏈及ABjD和EF環(huán)的 序列)相對于SEQ ID NO :40所示相應氨基酸序列具有0-20，0-15，0-10，0-8，0-6，0-5，0-4， 0-3，0-2，或0-1處替代、保守替代、刪除或添加。在某些實施方案中，核心氨基酸殘基是固 定的，且任意替代、保守替代、刪除或添加發(fā)生于核心氨基酸殘基以外的殘基。結(jié)合VEGFR2 的10Fn3結(jié)構(gòu)域可以任選包含長度1-20，1-15，1-10,1-8,1-5,1-4,1-3,1-2，或1個氨基酸的 N端延伸。例示性的N端延伸包括(用單字母氨基酸代碼表示)M，MG, G，MGVSDVPRDL(SEQ ID NO 45) ,VSDVPRDL (SEQ ID NO :46)，和 GVSDVPRDL (SEQ ID NO :48)，或者 SEQ ID NO :45, 46或48任一的N端截短片段。其它合適的N端延伸包括例如XnSDVPRDL (SEQ ID NO :53)， XnDVPRDL(SEQ ID NO 54), XnVPRDL (SEQ ID NO 55), XnPRDL(SEQ IDNO 56)，XnRDL(SEQ ID NO 57)，XnDL (SEQ ID NO :58)，或 XnL，其中 η = 0，1 或 2 個氨基酸，其中當 η = 1 時，X 是 Met或Gly，而當η = 2時，X是Met-Gly。結(jié)合VEGFR2的’n3結(jié)構(gòu)域可以任選包含C端尾。 例示性的C端尾包括長度為1-20，1-15，1-10，1-8，1-5,1-4,1-3,1-2，或1個氨基酸的多肽。 C端尾的具體例子包括EIDKPSQ (SEQ ID NO 17), EIDKPCQ (SEQ ID NO 18)，和 EIDK (SEQ ID N0:19)。在其它實施方案中，合適的C端尾可以是SEQ ID NO 17，18或19的C端截短片 段，包括例如下述氨基酸序列之一(用單字母氨基酸代碼表示)E，EI，EID，EIDKP (SEQ ID NO 50), EIDKPS (SEQ ID NO :51)，或 EIDKPC (SEQ ID NO :52)。其它合適的 C 端尾包括例如 ES, EC, EGS, EGC, EGSGS (SEQ ID NO :71)，或 EGSGC (SEQ ID NO :72)。在某些實施方案中，結(jié) 合VEGFR2的1(1而3結(jié)構(gòu)域包含N端延伸和C端尾二者。在例示性的實施方案中，A區(qū)包含 以Gly或Met-Gly開始的N端延伸和不含半胱氨酸殘基的C端延伸，而B區(qū)包含不以Met開 始的N端延伸和包含半胱氨酸殘基的C端延伸。結(jié)合VEGFR2的結(jié)構(gòu)域的具體例子是 包含下述各項的多肽⑴具有SEQ IDNO :16,28和40-44任一所列氨基酸序列的多肽；或 (ii)包含與SEQ ID NO :16, 和40-44任一所列氨基酸序列至少85%，90%，95%，97%， 98 %，或99 %相同的氨基酸序列的多肽。在某些實施方案中，A或C區(qū)是包含結(jié)合IGF4R的wFM結(jié)構(gòu)域的多肽，其中wFM 結(jié)構(gòu)域具有如下的結(jié)構(gòu)(自N端至C端)鏈Α、環(huán)ΑΒ、β鏈B、環(huán)BC、β鏈C、環(huán)CD、β 鏈D、環(huán) Ε、β鏈Ε、環(huán)EF、0鏈F、環(huán)TO、β鏈G，其中BC環(huán)具有氨基酸序列SEQ ID NO :2， DE環(huán)具有氨基酸序列SEQ ID NO :3，而TO環(huán)具有氨基酸序列SEQ ID NO :4，其中uiFr^結(jié)構(gòu) 域折疊成抗體重鏈可變區(qū)樣結(jié)構(gòu)，且其中多肽以小于IOOnM的Kd結(jié)合IGF-IR。結(jié)合IGF-IR 的1(1而3結(jié)構(gòu)域優(yōu)選折疊成如下的結(jié)構(gòu)，其中7條β鏈分布在兩個β片層之間，這兩個β 片層彼此相對擠壓，形成一個穩(wěn)定的核心，且其中各β鏈通過6個暴露于溶劑的環(huán)連接。在 例示性的實施方案中，結(jié)構(gòu)域長度為80-150個氨基酸。在某些實施方案中，A或C區(qū)是結(jié)合IGF-IR的kiFM結(jié)構(gòu)域，其包含具有氨 基酸序列SEQ ID NO :2的BC環(huán)、具有氨基酸序列SEQ ID NO :3的DE環(huán)、和具有氨基 酸序列SEQ ID NO :4的FG環(huán)，其中wFM結(jié)構(gòu)域以小于IOOnM的Kd結(jié)合IGF-IR。一 種例示性的IGF-IR結(jié)合物用下述序列表示厘YMlXnlMMXal SWSARLKVAR
15X,,YYRITYGEXn,QEFTVX,, PKNVYT X^ATIXnJYTITVYAVX,. TRFRDYQP Xa6ISINYRT (SEQ ID NO 49)。在SEQ ID NO 49中，BC、DE和TO環(huán)具有以粗體顯示的固定序列，AB環(huán)用)(nl表 示，⑶環(huán)用‘表示，而EF環(huán)用Xn3表示，而β鏈A-G標有下劃線。X代表任意氨基酸，而 X后面的下標代表氨基酸數(shù)目的整數(shù)。具體而言，nl可以是1-15，2-15，1-10, 2-10,1-8, 2-8，1-5，2-5，1-4，2-4,1-3, 2-3,或 1-2 個氨基酸；n2 和 n3 可以各自獨立地是 2-20, 2-15, 2-10，2-8，5-20，5-15，5-10, 5-8，6-20，6-15，6-10，6-8，2-7, 5-7,或 6-7 個氨基酸；而 al_a6 可以各自獨立地包含0-10，0-5，1-10，1-5，或2-5個氨基酸。在優(yōu)選的實施方案中，nl是 2個氨基酸，n2是7個氨基酸，n3是7個氨基酸，而al_a6是0個氨基酸。各β鏈的序 列在所有7個支架區(qū)內(nèi)相對于SEQ ID Ν0:1所示的相應氨基酸序列可以具有0-10，0-8， 0-6，0-5，0-4，0-3，0-2，或0-1處替代、刪除或添加。在一個例示性的實施方案中，β鏈 的序列在所有7個支架區(qū)內(nèi)相對于SEQ ID NO :1所示的相應氨基酸序列可以具有0-10， 0-8，0-6，0-5，0-4，0-3，0-2，或0-1處保守替代。在某些實施方案中，核心氨基酸殘基是 固定的，且任意替代、保守替代、刪除或添加發(fā)生于核心氨基酸殘基以外的殘基。在某些 實施方案中，IGF-IR結(jié)合物用下述氨基酸序列表示=EVVAATPT SLLI SWSARLKVAR YYRITYGETGGNSPVQEFTV PKNVYT AT ISGLKPGVDYTITVYAV TRFRDYQP ISINYRT (SEQ ID NO 35)。在SEQ ID NO :35中，BC、DE和re環(huán)的序列具有以粗體顯示的固定序列(例如具有 氨基酸序列SEQ ID NO :2的BC環(huán)，具有氨基酸序列SEQ ID NO :3的DE環(huán)，和具有氨基酸序 列SEQ ID NO :4的TO環(huán))，而其余標有下劃線的序列(例如7條β鏈及ΑΒ、⑶和EF環(huán)的序 列)相對于SEQ ID NO :35所示的相應氨基酸序列具有0-20，0-15，0-10，0-8，0-6，0-5，0-4， 0-3，0-2，或0-1處替代、保守替代、刪除或添加。在某些實施方案中，核心氨基酸殘基是固 定的，且任意替代、保守替代、刪除或添加發(fā)生于核心氨基酸殘基以外的殘基。結(jié)合IGF-IR 的10Fn3結(jié)構(gòu)域可以任選包含長度1-20，1-15，1-10,1-8,1-5,1-4,1-3,1-2，或1個氨基酸的 N端延伸。例示性的N端延伸包括(用單字母氨基酸代碼表示)M，MG, G，MGVSDVPRDL(SEQ ID NO 45) ,VSDVPRDL (SEQ ID NO :46)，和 GVSDVPRDL (SEQ ID NO :48)，或者 SEQ ID NO :45, 46或48任一的N端截短片段。其它合適的N端延伸包括例如XnSDVPRDL (SEQ ID NO :53)， XnDVPRDL(SEQ ID NO 54), XnVPRDL (SEQ ID NO 55), XnPRDL(SEQ IDNO 56)，XnRDL(SEQ ID NO 57)，XnDL (SEQ ID NO :58)，或 XnL，其中 η = 0，1 或 2 個氨基酸，其中當 η = 1 時，X 是 Met或Gly，而當η = 2時，X是Met-Gly。結(jié)合IGF4R的結(jié)構(gòu)域可以任選包含C端尾。 例示性的C端尾包括長度為1-20，1-15，1-10，1-8，1-5,1-4,1-3,1-2，或1個氨基酸的多肽。 C端尾的具體例子包括EIDKPSQ (SEQ ID NO 17), EIDKPCQ (SEQ ID NO 18)，和 EIDK (SEQ ID Ν0:19)。在其它實施方案中，合適的C端尾可以是SEQ ID NO 17，18或19的C端截短片 段，包括例如下述氨基酸序列之一(用單字母氨基酸代碼表示)E，EI，EID，EIDKP (SEQ ID NO 50), EIDKPS (SEQ ID NO :51)，或 EIDKPC (SEQ ID NO :52)。其它合適的 C 端尾包括例如 ES, EC, EGS, EGC, EGSGS (SEQ ID NO :71)，或 EGSGC (SEQ ID NO :72)。在某些實施方案中，結(jié) 合IGF-IR的1(1而3結(jié)構(gòu)域包含N端延伸和C端尾二者。在例示性的實施方案中，A區(qū)包含 以Gly或Met-Gly開始的N端延伸和不含半胱氨酸殘基的C端延伸，而B區(qū)包含不以Met開 始的N端延伸和包含半胱氨酸殘基的C端延伸。結(jié)合IGF4R的結(jié)構(gòu)域的具體例子是包含下述各項的多肽⑴具有SEQ IDNO :26-27和35-39任一所列氨基酸序列的多肽；或 (ii)包含與SEQ ID NO J6-27和35-39任一所列氨基酸序列至少85%，90%，95%，97%， 98 %，或99 %相同的氨基酸序列的多肽。B區(qū)是多肽接頭。例示性的多肽接頭包括具有1-20，1-15，1-10，1-8，1-5，1-4， 1-3，或1-2個氨基酸的多肽。合適的多肽接頭的具體例子在本文中有進一步描述。在某些 實施方案中，接頭可以是本文所述的C端尾多肽、本文所述的N端延伸多肽、或其組合。在一個實施方案中，多價多肽包含具有結(jié)構(gòu)A-A-X2-B-X3-C-X4的多肽，其中&是 任選的N端延伸，A是結(jié)合VEGFR2的1(1而3結(jié)構(gòu)域，X2是任選的C端尾，B是多肽接頭，X3是 任選的N端延伸，C是結(jié)合IGF-IR的wFM結(jié)構(gòu)域，而\是任選的C端尾。在另一個實施方 案中，多價多肽包含具有結(jié)構(gòu)A-A-X2-B-X3-C-X4的多肽，其中\(zhòng)是任選的N端延伸，A是結(jié) 合IGF-IR的wFM結(jié)構(gòu)域，X2是任選的C端尾，B是多肽接頭，X3是任選的N端延伸，C是結(jié) 合VEGFR2的wFM結(jié)構(gòu)域，而&是任選的C端尾。上文描述了合適的N端延伸和C端尾的 具體例子。在某些實施方案中，X1、&、B、&或&中的一個或多個可以包含適合于PEG化的 氨基酸殘基，諸如半胱氨酸或賴氨酸殘基。在例示性的實施方案中，&包含至少一個適合于 PEG化的氨基酸殘基，諸如半胱氨酸或賴氨酸殘基。下文進一步描述了合適的多肽接頭的具 體例子。具有結(jié)構(gòu)A-A-X2-B-X3-C-X4的多價具體的具體例子是包含下述各項的多肽⑴ 具有SEQ ID N0:8-15J9-31和63-70任一所列氨基酸序列的多肽；或(ii)包含與SEQ ID NO :8-15,29-31 和 63-70 任一所列氨基酸序列至少 85%，90%，95%，97%，98%，或 99%相 同的氨基酸序列的多肽。在例示性的實施方案中，如本文中所定義的X是天然存在的氨基酸。多肽接頭本申請?zhí)峁┌逵啥嚯慕宇^連接的至少兩個而3結(jié)構(gòu)域的多價多肽。所述的多 肽包含N端結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域，該N端結(jié)構(gòu)域包含第一而3結(jié)構(gòu)域，該C端結(jié)構(gòu)域包含第 二而3結(jié)構(gòu)域。第一和第二而3結(jié)構(gòu)域可以直接連接或藉由多肽接頭間接連接。可以在 而3結(jié)構(gòu)域與多肽接頭之間在第一而3結(jié)構(gòu)域的C端引入另外的接頭或間隔物，例如SEQ ID NO 17,18，或19。可以在而3結(jié)構(gòu)域與多肽接頭之間在第二而3結(jié)構(gòu)域的N端引入另外的 接頭或間隔物。適合于連接而3結(jié)構(gòu)域的接頭是那些容許各別的結(jié)構(gòu)域彼此獨立地折疊，從而形 成容許高親和力結(jié)合靶物分子的三維結(jié)構(gòu)的接頭。本申請?zhí)峁┝藵M足這些要求的合適接 頭，包括基于甘氨酸-絲氨酸的接頭、基于甘氨酸-脯氨酸的接頭、基于脯氨酸-丙氨酸的 接頭以及接頭SEQ ID N0:20。本文所述實施例證明了藉由這些接頭連接的而3結(jié)構(gòu)域保 留它們的靶物結(jié)合功能。在一些實施方案中，接頭是基于甘氨酸-絲氨酸的接頭。這些接 頭包含甘氨酸和絲氨酸殘基，而且長度可以是8-50，10-30，和10-20個氨基酸。此類接頭的 例子包括SEQ ID N0:23，M，和25。在一些實施方案中，多肽接頭選自SEQID NO :21和22。 在一些實施方案中，接頭是基于甘氨酸-脯氨酸的接頭。這些接頭包含甘氨酸和脯氨酸，而 且長度可以是3-30，10-30，和3-20個氨基酸。此類接頭的例子包括SEQ ID N0:32，33，和 34。在一些實施方案中，接頭是基于脯氨酸-丙氨酸的接頭。這些接頭包含脯氨酸和丙氨 酸，而且長度可以是3-30，10-30，3-20和6-18個氨基酸。此類接頭的例子包括SEQ ID NO: 60，61和62。通過本領域公知的常規(guī)實驗可以確定最佳的接頭長度和氨基酸組成。在一些實施方案中，多肽接頭是SEQ ID NO: 20。藥動學模塊在一個方面，本申請?zhí)峁┻M一步包含藥動學(PK)模塊的多價多肽。改善的藥動學 可依照察覺到的治療需要來評估。往往希望提高生物利用度和/或延長給藥的時間間隔， 這可能通過延長服藥后蛋白質(zhì)在血清中保持可利用狀態(tài)的時間來實現(xiàn)。在有些情況下希望 改善蛋白質(zhì)的血清濃度隨時間的連貫性(例如縮小施藥后不久的蛋白質(zhì)血清濃度與下次 施藥前不久的蛋白質(zhì)血清濃度的差異)。可以將多肽連接于可使多肽在哺乳動物(例如小 鼠、大鼠、或人)中的清除速率相對于未修飾多肽降低超過3倍的模塊。改善的藥動學的其 它量度可包括血清半衰期，其常常分成α階段和β階段。兩個階段之一或二者可通過添 加適宜的模塊來顯著改善。有減緩蛋白質(zhì)從血液清除的傾向的模塊(在本文中稱作“Hi模塊”)包括聚氧化 烯模塊(例如聚乙二醇)、糖(例如唾液酸)、和耐受良好的蛋白質(zhì)模塊(例如Fc、Fc片段、 運鐵蛋白、或血清白蛋白)。多肽可以與白蛋白或白蛋白的片段(部分)或變體融合，如美 國專利申請公開文本No. 20070048282中所記載的。在一些實施方案中，Hi模塊是血清白蛋白結(jié)合蛋白，諸如美國專利申請公開文本 No. 2007/0178082 和 2007/0269422 中記載的那些。在一些實施方案中，PK模塊是血清免疫球蛋白結(jié)合蛋白，諸如美國專利申請公開 文本No. 2007/0178082中記載的那些。在一些實施方案中，多價多肽包含聚乙二醇(PEG)。可以將一個或多個PEG分子 連接于蛋白質(zhì)上的不同位置，這樣的連接可通過與胺、硫醇或其它合適的反應性基團的反 應來實現(xiàn)。胺模塊可以是例如存在于多肽N端的伯胺或存在于氨基酸(諸如賴氨酸或精氨 酸)中的胺基。在一些實施方案中，PEG模塊連接于多肽上選自下組的位置a)N末端；b)N 末端與最N端的β鏈或β樣鏈之間；c)位于多肽的與靶物結(jié)合位點相對的面上的環(huán)；d)C 末端與最C端的β鏈或β樣鏈之間；和e)C末端。PEG化可通過定點PEG化來實現(xiàn)，其中將合適的反應性基團引入蛋白質(zhì)中以創(chuàng)建 PEG化優(yōu)先發(fā)生的位點。在一些實施方案中，修飾蛋白質(zhì)以在期望的位置引入半胱氨酸殘 基，容許半胱氨酸上的定點PEG化。在一些實施方案中，多肽包含含有Cys的接頭，諸如SEQ ID NO :18，其容許定點PEG化。在一些實施方案中，在第二而3結(jié)構(gòu)域(即多肽中最C端的 結(jié)構(gòu)域)的3'端引入含Cys的接頭。PEG的分子量可以廣泛變化，而且可以是分支的或線 性的。在一些實施方案中，多價多肽包含而3結(jié)構(gòu)域和1 模塊。在一些實施方案中，而3 結(jié)構(gòu)域是kiFM結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，相對于單獨的而3結(jié)構(gòu)域，1 模塊將多肽的血清 半衰期延長超過 5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、200、400、600、800、1000%
或更多。在一些實施方案中，1 模塊是經(jīng)至少一個二硫鍵、肽鍵、多肽、聚合糖、或聚乙二醇 模塊連接于而3結(jié)構(gòu)域的。例示性多肽接頭包括PSTSTST (SEQID NO 20) ,EIDKPSQ(SEQ ID N0:17)、和GS接頭，諸如GSGSGSGSGS(SEQ ID NO 21)及其多聚體。在一些實施方案中，PK 模塊是人血清白蛋白。在一些實施方案中，PK模塊是運鐵蛋白。革巴物
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本申請?zhí)峁┌Y(jié)合第一靶物分子的第一而3結(jié)構(gòu)域和結(jié)合第二靶物分子的第 二而3結(jié)構(gòu)域的多價多肽。第一和第二靶物分子可以是相同的或不同的靶物分子。當?shù)谝?和第二靶物分子相同時，而3結(jié)構(gòu)域(即結(jié)合環(huán))可以是相同的或不同的。因此，第一和第 二而3結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合相同的靶物，但是表位不同。通過向環(huán)區(qū)，特別是環(huán)BC、DE、和TO中 引入序列變異，可生成結(jié)合幾乎任何靶物分子的而3結(jié)構(gòu)域?？梢栽u估結(jié)合靶物分子的多肽的平衡常數(shù)(例如解離Kd)及動力學常數(shù)(例如結(jié) 合速率常數(shù)k。n和解離速率常數(shù)k。ff)。而3結(jié)構(gòu)域一般會以小于500nM，IOOnM, InM, 500pM, IOOpM或更小的Kd結(jié)合靶物分子，盡管在k。ff足夠低或k。n足夠高的情況下可以容忍更高的 Kd值。在一些實施方案中，第一和/或第二而3結(jié)構(gòu)域結(jié)合選自下組的靶物IGF_IR， FGFR, FGFRl, FGFR2, FGFR3, FGFR4, FGFR5, c_Kit，人 pl85 受體樣激酶，EGFR, HER2, HER3, HER4, c-Met，葉酸受體，PDGFR, VEGFRl, VEGFR2, VEGFR3，人血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)-A, VEGF-C, VEGF-D,人 CD20,人 CD18，人 CDlla,人凋亡受體 _2 (Apo-2)，人 α 4 β 7 整聯(lián)蛋白， 人GPIIb-IIIa整聯(lián)蛋白，干細胞因子(SCF)，人CD3，IGF-IR，Angl, Ang2，成纖維細胞生長 因子，表皮生長因子，肝細胞生長因子，或Tie2. 3。在一些實施方案中，第一而3結(jié)構(gòu)域在N 端位置且結(jié)合IGF-IR，而第二而3結(jié)構(gòu)域結(jié)合VEGFR2。在一些實施方案中，第一而3結(jié)構(gòu) 域在N端位置且結(jié)合VEGFR2，而第二結(jié)構(gòu)域結(jié)合IGF-IR。在一些實施方案中，第一而3結(jié) 構(gòu)域在N端位置且結(jié)合IGF-1R，而第二結(jié)構(gòu)域結(jié)合VEGFR2。在某些實施方案中，多價多肽包含結(jié)合不同靶物的第一和第二而3結(jié)構(gòu)域。在此 類實施方案中，可能期望調(diào)節(jié)某一而3結(jié)合域相對于另一而3結(jié)合域的效力。例如，如果第 -Fn3結(jié)構(gòu)域的結(jié)合親和力顯著高于第二而3結(jié)構(gòu)域的結(jié)合親和力，那么第一 Fn3結(jié)構(gòu)域 的生物學效果會壓制第二而3結(jié)構(gòu)域的效果。因而，在某些實施方案中，可能期望多價多肽 的第一和第二而3結(jié)構(gòu)域的結(jié)合親和力彼此相似，例如結(jié)合親和力在彼此100倍，30倍，10 倍，3倍，1倍，0. 3倍或0. 1倍以內(nèi)，或結(jié)合親和力在彼此0. 1倍-10倍以內(nèi)，0. 3倍-10倍 以內(nèi)，0. 1倍-3倍以內(nèi)，0.3倍-3倍以內(nèi)，0. 1倍-1倍以內(nèi)，0.3倍-1倍以內(nèi)，1倍-10倍以 內(nèi)，3倍-10倍以內(nèi)，3倍-30倍以內(nèi)，或1倍-3倍以內(nèi)。多域?qū)嵤┓桨副旧暾埖囊粋€方面提供進一步包含結(jié)合模塊的多價多肽。在一些實施方案中，結(jié) 合模塊以小于IO-fiM，1(TM，10、，10_9M，或IO-9M的Kd結(jié)合人靶蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，結(jié)合模塊結(jié)合腫瘤相關靶物或抗原。在一些實施方案中，抗原 靶向會有助于多價多肽的定位(就組織分布或者提高在組織或期望細胞類型中的局部濃 度效應而言)。在一些實施方案中，結(jié)合模塊結(jié)合腫瘤相關靶物或抗原，例如碳酸酐酶IX、A3、對 于 A33 抗體特異性的抗原、BrE3 抗原、CDU CDla, CD3、CD5、CD15、CD16、CD19、CD20、CD21、 CD22、CD23、CD25、CD30、CD45、CD74、CD79a、CD80、HLA-DR、NCA 95、NCA90, HCG 及其亞基、 CEA (CEACAM-5)、CEACAM-6、CSAp, EGFR、EGP-1、EGP-2、Ep-CAM, Ba733、HER2/neu、低氧誘導 因子(HIF)、KC4 抗原、KS-I 抗原、KSl-4、Le-Y、巨噬細胞抑制因子(MIF)、MAGE、MUC1、MUC2、 MUC3、MUC4、PAM-4 抗原、PSA、PSMA, RS5、S100、TAG-72、p53、生腱蛋白、IL-6、IL-8、胰島素 生長因子-I (IGF-I)、胰島素生長因子-II (IGF-II)、Tn 抗原、Thomson-Friedenreich 抗原、腫瘤壞死抗原、胎盤生長因子(PlGF)、17-1A抗原、血管發(fā)生標志物(例如ED-B纖連蛋 白)、癌基因標志物、癌基因產(chǎn)物、和其它腫瘤相關抗原。最近關于腫瘤相關抗原的報告包 括 Mizukami 等 0005，Nature Med. 11 :992-97) ；Hatfield 等 0005，Curr. Cancer Drug Targets 5:229-48) ；Vallbohmer 等(2005, J. Clin. Oncol. 23 :3536-44)；及 Ren 等(2005, Ann. Surg. 242 :55-63)，通過述及將每一篇收入本文。在一些實施方案中，結(jié)合模塊選自抗體模塊。抗體模塊指免疫球蛋白分子和免疫 球蛋白分子的免疫學活性部分，即包含可免疫特異性地結(jié)合抗原的抗原結(jié)合位點的分子。 因此，“抗體模塊”這一術語不僅涵蓋完整抗體分子，而且還涵蓋抗體多聚體和抗體片段以 及抗體、抗體多聚體和抗體片段的變體(包括衍生物)。抗體模塊的例子包括但不限于單鏈 FV(SCFVS)、Fab片段、Fab'片段、F(ab' )2、二硫化物連接的Fv(sdFv)、和Fv。抗體模塊可 以是例如單克隆的、嵌合的、人源的、或人源化的。在一些實施方案中，抗體模塊選自⑴Fab片段，其具有VL、CL、VH和CHl結(jié)構(gòu)域；
(ii)Fab'片段，其是在CHl結(jié)構(gòu)域的C-末端具有一個或多個半胱氨酸殘基的Fab片段；
(iii)Fd片段，其具有Vh和CHl結(jié)構(gòu)域；(iv) Fd'片段，其具有Vh和CHl結(jié)構(gòu)域，并在CHl結(jié) 構(gòu)域C-末端具有一個或多個半胱氨酸殘基；(ν)Fv片段，其具有抗體單臂的結(jié)構(gòu)域； (vi)dAb 片段(Ward 等，Nature 341，544-546 (1989))，其由 Vh 結(jié)構(gòu)域組成；(vii)分離的 ⑶R區(qū)；(viii)F(ab' )2片段，一種包含通過鉸鏈區(qū)中的二硫橋相連的兩個Fab'片段的二 價片段；(ix)單鏈抗體分子(例如單鏈 Fv ；scFv) (Bird 等，Science 242 :423-426(1988)； 及Huston等，PNAS(USA)85 :5879-5883(1988)) ； (χ) “雙抗體”，其具有兩個抗原結(jié)合位 點，包含在同一條多肽鏈中相連的重鏈可變域(Vh)和輕鏈可變域(參見例如EP專 利公開文本 No. 404，097 ；WO 93/11161 ；及 Hollinger 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90 6444-6448(1993))；和(xi) “線性抗體”，其包含一對串聯(lián)的Fd區(qū)段(Vh-CHI-Vh-CHI)，這 些Fd區(qū)段與互補的輕鏈多肽一起形成一對抗原結(jié)合區(qū)(Zapata等，Protein Eng. 8 (10) 1057-1062 (1995)；及美國專利 No. 5，641，870)。在一些實施方案中，抗體模塊是單域抗體。例子包括但不限于重鏈抗體、天然不含 輕鏈的抗體、自常規(guī)的四鏈抗體衍生的單域抗體、工程化抗體和非衍生自抗體的單域支架 (single domain scaffolds) 0單域抗體可以衍生自任何物種，包括但不限于小鼠、人、駱 駝、美洲駝(llama)、山羊、家兔、牛。在一些實施方案中，單域抗體是天然存在的單域抗體，諸如Vra結(jié)構(gòu)域。Vhh是指從 天然不含輕鏈的免疫球蛋白，諸如那些源自駱駝科(Camelidae)(包括駱駝、單峰駝、美洲 駝、小羊駝(vicuna)、羊駝(alpaca)和大羊駝(guanaco))的免疫球蛋白，衍生的重鏈可變 域，如W094/04678中所記載的。Vra分子比IgG分子小約10倍。由于已知Vhh結(jié)合“非?！?表位，諸如腔(cavities)或溝(grooves)，因此這樣的Vra的親和力可能更適合于治療性處 理，PCT公開文本號W097/49805。在一些實施方案中，單域抗體是結(jié)合血清蛋白質(zhì)的Vhh,如美國專利申請公開文本 No. 20070178082中所記載的。血清蛋白質(zhì)可以是在受試者的血清中找到的任何合適蛋白 質(zhì)，或其片段。在一些實施方案中，血清蛋白質(zhì)是血清白蛋白、血清免疫球蛋白、甲狀腺素結(jié) 合蛋白、運鐵蛋白、或纖連蛋白。已經(jīng)開發(fā)了多種抗體片段生產(chǎn)技術，它們可用于制備本發(fā)明中所使用的抗體片段。傳統(tǒng)上，這些片段是通過對完整抗體的蛋白水解消化衍生的(參見例如Morimoto等， Journal of Biochemical and Biophysical Methods24 :107-117(1992)；及 Brerman 等， kience，229 :81 (1985))。然而，現(xiàn)在可以由重組宿主細胞直接生成這些片段。例如，可以 自上文所討論的抗體噬菌體文庫分離抗體片段?；蛘?，可以自大腸桿菌直接回收Fab' -SH 片段并化學偶聯(lián)以形成 F (ab' )2 片段(Carter 等，Bio/Technology 10:163-167(1992))。 依照另一種方法，可以自重組宿主細胞培養(yǎng)物直接分離F(ab' )2片段。用于抗體片段生產(chǎn) 的其它技術對于技術人員會是顯而易見的。在其它實施方案中，所選擇的抗體是單鏈Fv片 段(scFv)。參見 WO 93/16185 ；美國專利 No. 5，571，894 ；及美國專利 No. 5，587，458。抗體 片段也可以是“線性抗體”，舉例而言，如例如美國專利No. 5，641，870所述的。此類線性抗 體片段可以是單特異性的或雙特異性的。在一些實施方案中，結(jié)合模塊包含一種或多種avimer序列。avimer是通過 體外外顯子改組和噬菌體展示從人胞外受體域發(fā)展而來的(Silverman等，2005，Nat. Biotechnol. 23 :1493-94 ；SiIverman 等，2006，Nat. Biotechnol. 24 :220)。所得多域蛋白可 包含多個獨立的、與單表位結(jié)合蛋白相比可展現(xiàn)出改善的親和力(有些情況下是亞納摩爾 級)以及特異性的結(jié)合域。關于avimer的構(gòu)建和使用方法的更多細節(jié)披露于例如美國專 利公開文本 No. 20040175756，20050048512, 20050053973, 20050089932 和 20050221384,通 過述及將其完整收入本文。在一些實施方案中，結(jié)合模塊包含一種或多種脂籠蛋白相關序列，例如 anticalins或脂籠蛋白衍生物。anticalins或脂籠蛋白衍生物是一類對多種靶分子(包 括本文中所描述的那些)具有親和力和特異性的結(jié)合蛋白。此類蛋白質(zhì)在美國專利公開文 本No. 20060058510, 20060088908, 20050106660，和 PCT 公開文本No. W02006/056464 中有記載。在一些實施方案中，結(jié)合模塊包含一種或多種四連蛋白C型凝集素相關序列或三 連蛋白，例如四連蛋白C型凝集素或四連蛋白C型凝集素衍生物。四連蛋白C型凝集素或 四連蛋白C型凝集素衍生物是一類對多種靶分子(包括本文中所描述的那些)具有親和 力和特異性的結(jié)合蛋白。PCT 公開文本 W02006/053568，W02005/080418, W02004/094478, W02004/039841, W02004/005335, W02002/048189, W098/056906,和美國專利公開文本 No. 20050202043記載了不同的四連蛋白C型凝集素和相關蛋白。在一些實施方案中，結(jié)合模塊包含一種或多種天然錨蛋白重復蛋白，例如 DARPins(Molecular Partners)。在一些實施方案中，結(jié)合模塊包含一種或多種Affibodies 。Affibodies 衍生自 葡萄球菌蛋白A的IgG結(jié)合域?？赏ㄟ^改變位于蛋白A結(jié)構(gòu)域的結(jié)合表面附近的殘基來獲 得新的結(jié)合特性。在一些實施方案中，結(jié)合模塊包含一種或多種基于半胱氨酸結(jié)(cysteineknot) 的蛋白質(zhì)支架，即微體(Selecore/NascaCell)。在一些實施方案中，結(jié)合模塊包含一種或多種Trans-bodies 。Trans-bodies 基 于運鐵蛋白支架(BioResis/Pfizer)。在一些實施方案中，結(jié)合模塊包含基于伽馬晶體蛋白或遍在蛋白質(zhì)的結(jié)合蛋白。 這些所謂的AffilinTM(Scil Proteins)分子具有這樣的特征，即在蛋白質(zhì)的β片層結(jié)構(gòu)中從頭設計了結(jié)合區(qū)。Affilin 分子已經(jīng)在美國專利申請公開文本No. 20070248536中有描 述。綴合多價多肽和結(jié)合模塊可藉由至少一個二硫鍵、肽鍵、多肽、聚合糖、或PEG模塊連 接起來。在一些實施方案中，多價多肽和結(jié)合模塊是藉由多肽連接的。在一些實施方案中， 多肽接頭是SEQ ID NO 17，18，或20。在一些實施方案中，多價多肽和結(jié)合模塊是藉由具有血液或靶組織中的蛋白酶可 切割的蛋白酶位點的多肽接頭連接的?？衫么祟悓嵤┓桨羔尫艃煞N以上的治療性蛋白 質(zhì)，以實現(xiàn)與分別生成這些蛋白質(zhì)相比更好的投遞或或更高的產(chǎn)生效率。在一些實施方案中，多價多肽和結(jié)合模塊是藉由生物相容性聚合物(諸如聚合 糖)連接的。這樣的聚合糖可以包含能夠被血液或靶組織中的酶切割的酶切位點?？衫?此類實施方案釋放兩種以上的治療性蛋白質(zhì)，以實現(xiàn)與分別生成這些蛋白質(zhì)相比更好的投 遞或治療性質(zhì)或更高的產(chǎn)生效率。在一些實施方案中，多價多肽和結(jié)合模塊是藉由聚合物接頭連接的。可以利用聚 合物接頭來最合適地改變各蛋白質(zhì)模塊間的距離，以創(chuàng)建具有下述一項或多項特征的蛋白 質(zhì)1) 一個或多個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域在結(jié)合感興趣蛋白質(zhì)時的結(jié)合空間位阻降低或提高，2)蛋 白質(zhì)穩(wěn)定性或溶解度提高，而無需搜索別的氨基酸替代來提高穩(wěn)定性或溶解度(例如溶解 度為至少約20mg/ml，或至少約50mg/ml)，3)蛋白質(zhì)聚集降低，而無需搜索別的氨基酸替代 來降低穩(wěn)定性(例如如通過SEC所測量的)，及4)通過添加別的結(jié)合域而使蛋白質(zhì)的整體 親合力或親和力提高。在一些實施方案中，多價多肽包含第二 結(jié)構(gòu)域，其包含接頭SEQ IDNO :18。接 頭序列中的半胱氨酸模塊上綴合有PEG，PEG將多價多肽和結(jié)合模塊連接起來。PEG化的實施方案本申請的一個方面提供連接多價多肽與非蛋白質(zhì)性的聚合物。在一些實施方 案中，聚合物是聚乙二醇(“PEG”)、聚丙二醇、或聚氧化烯，如美國專利No. 4，640，835 ； 4，496，689 ；4, 301，144 ；4, 670，417 ；4, 791，192 或 4，179，337 中所記載的。在一些實施方案 中，多價多肽包含而3結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，聚合物是PEG模塊。另外，本申請?zhí)峁┡c 抗體模塊(例如駱駝抗體及其衍生物，以及單鏈和單域抗體；特別是那些由微生物表達的) 和抗體樣模塊(例如脂籠蛋白、錨蛋白、多重Cys-Cys結(jié)構(gòu)域以及四連蛋白的衍生物；特別 是那些由微生物表達的)的N或C端PEG綴合。PEG是眾所周知的水溶性聚合物，其可通過商業(yè)途徑獲得或者可依照本領域眾所 周知的方法通過乙二醇的開環(huán)聚合來制備(Sandler和Karo，PolymerSynthesis，Academic Press, New York，卷3，頁138-161)。術語“PEG”廣泛用于涵蓋任何聚乙二醇分子，無論 大小或PEG末端的修飾，而且可以由下式來表示X-O (CH2CH2O) ^1CH2CH2OH (1)，其中η為 20-2300，X為H或末端修飾，例如CV4烴基。在一個實施方案中，本發(fā)明的PEG的一端以氫或 甲氧基終止，即X是H或CH3 (“甲氧基PEG”)。PEG可進一步包含的結(jié)合反應所必需的化學 基團；其源自分子的化學合成；或者其是為獲得分子各部分間的最佳距離的間隔物。另外， 這樣的PEG可以由一個或多個連接到一起的PEG側(cè)鏈組成。具有超過一條PEG鏈的PEG稱作多臂的或分支的PEG。分支的PEG可通過例如聚環(huán)氧乙烷加成至各種多元醇(包括甘油、 季戊四醇、和山梨醇)來制備。例如，可以自季戊四醇和環(huán)氧乙烷制備四臂分支PEG。分支 PEG記載于例如歐洲申請公布No. 473084A和美國專利No. 5，932，462。一種形式的PEG包 括兩條經(jīng)某個賴氨酸的伯氨基相連接的PEG側(cè)鏈(PEG》(Monfardini，C.等，Bioconjugate Chem. 6(1995)62-69)。PEG對肽或蛋白質(zhì)的綴合一般包括活化PEG，將活化后的PEG-中間體直接偶聯(lián)至 目標蛋白質(zhì)/肽或接頭，隨后將該接頭活化并偶聯(lián)至目標蛋白質(zhì)/肽(參見Abuchowski， A.等，J.Biol. Chem.，252，3571 (1977)和 J. Biol. Chem.，252，3582 (1977)，Zalipsky 等， 禾口 Harris 等，-f' ((Poly (ethylene glycol) Chemistry :Biotechnical and Biomedical Applications)) ； (J. M. Harris 編)Plenum Press :New York, 1992 ；第 21 和 22 章)。注意， 包含PEG分子的結(jié)合多肽也稱作綴合蛋白質(zhì)，而沒有連接PEG分子的蛋白質(zhì)可稱作未綴合 的。所利用的PEG的大小取決于數(shù)項因素，包括多價多肽的預期用途。為了延長在身 體、血液、非血液胞外流體和組織中的半衰期，優(yōu)選較大的PEG。對于體內(nèi)細胞活性，優(yōu)選約 10-60kDa范圍的PEG，以及小于約lOOkDa、更優(yōu)選小于約60kDa的PEG，但也可使用大于約 IOOkDa的大小。對于體內(nèi)成像應用，可使用較小的PEG，一般小于約20kDa，它們增加半衰期 沒有大PEG那么多，從而容許更快地分布和更短的半衰期。為了綴合至本發(fā)明的結(jié)合多肽， 可以選擇多種分子量形式的PEG，例如約1，000道爾頓(Da)至100，OOODa (η為20-2300)。 PEG中重復單元的數(shù)目“η”是根據(jù)以道爾頓描述的分子量而估算的。優(yōu)選的是，活化后的 接頭上的PEG的分子量的總和適合于藥用。如此，在一個實施方案中，PEG分子的分子量 不超過100，000Da。例如，如果三個PEG分子連接于接頭，其中每個PEG分子具有相同的分 子量12，OOODa(每個的η為約270)，那么接頭上的PEG的總分子量為約36，OOODa(總η為 約820)。連接于接頭的PEG的分子量也可以是不同的，例如，在接頭上的三個分子中，兩個 PEG分子可以是每個5，OOODa (每個η為約110)，而另一個PEG分子可以是12，OOODa (η為 約270)。在一些實施方案中，將一個PEG模塊綴合于多價多肽。在一些實施方案中，PEG模 塊是約20、30、40、50、60、70、80、或90KDa。在一些實施方案中，PEG模塊是約40KDa。在一些實施方案中，PEG化多價多肽含有一個、兩個或更多個PEG模塊。在一個實 施方案中，PEG模塊結(jié)合于這樣的氨基酸殘基其位于蛋白質(zhì)表面上和/或遠離與靶物配 體接觸的表面。在一個實施方案中，PEG-結(jié)合多肽中PEG的聯(lián)合分子量或總分子量為約 3，OOODa至60，OOODa,或約10，OOODa至36，OOODa0在一個實施方案中，PEG化結(jié)合多肽中 的PEG是基本上線性的直鏈PEG。本領域技術人員能為PEG選擇合適的分子量，例如根據(jù)PEG化的結(jié)合多肽會如何 用于治療、期望的劑量、循環(huán)時間、對蛋白水解的抗性、免疫原性、和其它考慮。關于PEG及 其用于增強蛋白質(zhì)性能的用途的討論參見N. V. Katre，Advanced Drug Delivery Reviews 10 :91-114(1993)。在一些實施方案中，多價多肽與符合下式的一個聚乙二醇基團共價連 接-C0-(CH2)x-(0CH2CH2)m-0R，其中聚乙二醇基團的-C0(即羰基)與結(jié)合多肽的一個氨基 形成酰胺鍵；R是低級烴基；χ是2或3 ;m是約450至約950 ；并且選擇η和m使得綴合物減 去結(jié)合多肽的分子量為約10_40kDa。在一個實施方案中，結(jié)合多肽的賴氨酸氨基是可利用的(游離的)氨基。在一個具體的實施方案中，使用PEG的碳酸酯來形成PEG-結(jié)合多肽綴合物?？梢?在與PEG的反應中使用N，N’ - 二琥珀酰亞氨基碳酸酯(DSC)來形成有活性的混合PEG-琥 珀酰亞氨基碳酸酯，其隨后可以與接頭的親核基團或結(jié)合多肽的氨基起反應(參見美國專 利No. 5，281，698和美國專利No. 5，932，462)。在一種類似類型的反應中，可以使1，1，_(二 苯并三唑基)碳酸酯和二-(2-吡啶基)碳酸酯與PEG起反應以分別形成PEG-苯并三唑基 和PEG-吡啶基混合碳酸酯(美國專利No. 5，382，657)。多價多肽的PEG化可依照本領域已知方法來實施，例如通過結(jié)合多肽與親電子活 性 PEG 的反應(供應商Shearwater Corp.，USA, WWW. shearwatercorp. com)。本發(fā)明的 優(yōu)選PEG試劑是例如N-羥基琥珀酰亞氨基丙酸酯(PEG-SPA)、丁酸酯(PEG-SBA)、PEG-琥 珀酰亞氨基丙酸酯或分支的N-羥基琥珀酰亞胺諸如mPEG2-NHS (Monfardini，C.，等， BioconjugateChem. 6 (1995) 62-69)。此類方法可用于對結(jié)合多肽賴氨酸的ε -氨基或結(jié)合 多肽N末端氨基的PEG化。在另一個實施方案中，PEG分子可以被偶聯(lián)于結(jié)合多肽上的硫氫基(sulfhydryl) (Sartore, L.,等，Appl. Biochem. Biotechnol. , 27,45 (1991) ；Morpurgo 等，Biocon. Chem., 7,363-368(1996) ；Goodson 等，Bio/Technology (1990) 8，343 ；美國專利 No. 5，766，897)。 美國專利No. 6，610，281和5，766，897記載了例示性的可偶聯(lián)于硫氫基的反應性PEG種類。在一些實施方案中，PEG化多價多肽是通過定點PEG化，特別是通過將PEG綴合至 N或C末端處的半胱氨酸模塊而生成的。在一些實施方案中，多價多肽是共價結(jié)合于PEG模 塊的而3結(jié)構(gòu)域，其中所述而3結(jié)構(gòu)域的至少一個環(huán)參與靶物結(jié)合。PEG模塊可通過定點 PEG化連接至而3多肽，諸如通過連接至Cys殘基，其中Cys殘基可以位于而3多肽的N末 端、或位于N末端和最靠N端的β或β樣鏈之間、或位于而3多肽的C末端、或位于C末 端和最靠C端的β或β樣鏈之間。Cys殘基也可以位于其它位置，特別是任何不參與靶物 結(jié)合的環(huán)。PEG模塊也可以通過其它化學來連接，包括通過綴合至胺。在某些PEG分子被綴合至結(jié)合多肽上的半胱氨酸殘基的實施方案中，半胱氨酸殘 基對于結(jié)合多肽而言是天然的，而在其它實施方案中，一個或多個半胱氨酸殘基是通過工 程改造引入結(jié)合多肽的。可以在結(jié)合多肽編碼序列中引入突變以產(chǎn)生半胱氨酸殘基。這可 以通過，例如，將一個或多個氨基酸殘基突變成半胱氨酸來實現(xiàn)。用于突變成半胱氨酸殘基 的優(yōu)選氨基酸包括絲氨酸、蘇氨酸、丙氨酸和其它親水性殘基。優(yōu)選的是，待突變成半胱氨 酸的殘基是表面暴露的殘基。根據(jù)蛋白質(zhì)一級序列預測殘基的表面可及性的算法在本領域 是眾所周知的?；蛘撸捎诮Y(jié)合多肽的設計和改進的基礎框架的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)得以解析并 且由此鑒定了表面暴露的殘基，可以通過比較結(jié)合多肽的氨基酸序列來預測表面殘基(參 見 Himanen 等，Nature. (2001)20-27 ；414 (6866) :933-8)。在一個實施方案中，將半胱氨酸 殘基引入結(jié)合多肽中的N和/或C末端或其附近，或者環(huán)區(qū)內(nèi)。半胱氨酸殘基的PEG化可 以使用例如PEG-馬來酰亞胺、PEG-乙烯基砜、PEG-碘乙酰胺、或PEG-正吡啶基二硫化物。在有些實施方案中，PEG化的結(jié)合多肽包含共價連接至N末端氨基酸的α氨基的 PEG分子。位點特異性N末端還原性氨化記載于P印insky等OOOl) JPET，297,1059和美 國專利No. 5，824，784。利用其它可獲得的親核氨基用PEG-醛進行蛋白質(zhì)還原性氨化的用 途記載于美國專利 No. 4，002, 531 ；Wieder 等(1979) J. Biol. Chem. 254，12579 ；和 Chamow 等(1994)Bioconjugate Chem. 5,133。在另一個實施方案中，PEG化的結(jié)合多肽包含一個或多個共價連接至接頭的PEG 分子，而該接頭連接于結(jié)合多肽N末端氨基酸殘基的α氨基。這樣的方法披露于美國專利 申請公開文本No. 2002/0044921和PCT公開文本No. W094/01451。在一個實施方案中，結(jié)合多肽的C末端被PEG化。在一個具體的實施方案中， 通過引入C末端疊氮-甲硫氨酸，隨后借助Maudinger反應來綴合甲基-PEG-三芳基 膦，將蛋白質(zhì)的C末端PEG化。這種C末端綴合方法記載于Cazalis等，C-Terminal Site-Specific PEGylation of a Truncated Thrombomodulin Mutant with Retention of Full Bioactivity, Bioconjug Chem. 2004 ； 15 (5) :1005_1009?？梢允褂帽绢I域已知的常規(guī)分離和純化技術來純化PEG化結(jié)合多肽，諸如大小排 阻(例如凝膠過濾)和離子交換層析。也可以使用SDS-PAGE來分離產(chǎn)物?？梢苑蛛x的產(chǎn) 物包括單PEG化、二 PEG化、三PEG化、多PEG化和未PEG化的結(jié)合多肽，以及游離PEG?？?以通過合并洗脫峰周圍的較寬的級分(broader fractions)，提高組合物中單PEG的百分 比，來控制單PEG綴合物的比例。單PEG綴合物占約90 %則代表了產(chǎn)量和活性的優(yōu)良平衡。 如下所述的組合物可能是理想的其中例如至少92%或至少96%的綴合物是單PEG種類。 在本發(fā)明的一個實施方案中，單PEG綴合物的百分比為約90%至96%。在本發(fā)明的一個實施方案中，PEG化多價多肽中的PEG在羥胺測定(例如450mM 羥胺pH6. 5，室溫，8-16小時)中不會從PEG化氨基酸殘基水解，因此是穩(wěn)定的。在一個實 施方案中，組合物的超過80%、更優(yōu)選至少90%、最優(yōu)選至少95%是穩(wěn)定的單PEG-結(jié)合多 肽。在另一個實施方案中，PEG化多肽優(yōu)選將保留與未修飾蛋白質(zhì)相關的生物學活性 的至少約25%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%。在一個實施方案中，生物 學活性指其結(jié)合靶物分子的能力，以&、1^或1^。 來評估。在一個具體的實施方案中，相對 于未PEG化的結(jié)合多肽，PEG化結(jié)合多肽蛋白顯示出升高的對靶物分子的結(jié)合。相對于未修飾的結(jié)合多肽的血清清除速率，PEG修飾多肽的清除速率可以降低約 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、或甚至90%。相對于未修飾蛋白質(zhì)的半衰 期，PEG修飾多肽的半衰期(t1/2)可以延長。PEG-結(jié)合多肽的半衰期可以相對于未修飾的 結(jié)合多肽的半衰期延長至少 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、 125%、150%、175%、200%、250%、300%、400%或 500%、或甚至 1000% 在有些實施方案 中，蛋白質(zhì)半衰期是在體外測定的，諸如在緩沖鹽水溶液中或在血清中。在其它實施方案 中，蛋白質(zhì)半衰期是體內(nèi)半衰期，諸如蛋白質(zhì)在動物的血清或其它體液中的半衰期。多價多肽的去免疫在一個方面，本申請?zhí)峁┤ッ庖?deimmunized)的多價多肽。在一些實施方案中， 多價多肽的序列經(jīng)過改變以消除一個或多個B或T細胞表位。多價多肽可以去免疫以使得它對于給定物種無免疫原性或免疫原性降低。去免疫 可以藉由對多肽的結(jié)構(gòu)改變來實現(xiàn)?？刹捎帽绢I域技術人員知道的任何去免疫技術。例如， WO 00/34317記載了一種合適的用于蛋白質(zhì)去免疫的技術，將其公開內(nèi)容完整收入本文?？?的來說，其中所述一般方法內(nèi)的典型方案包括下述步驟。1.測定多肽的氨基酸序列；
2.通過任何方法來鑒定多肽的氨基酸序列內(nèi)的潛在T細胞表位，包括測定肽對 MHC分子的結(jié)合，測定肽HLA復合物對來自要接受治療性蛋白質(zhì)的物種的T細胞受體的結(jié) 合，使用具有要接受治療性蛋白質(zhì)的物種的HLA分子的轉(zhuǎn)基因動物來測試多肽或其部分， 或測試用來自要接受治療性蛋白質(zhì)的物種的免疫系統(tǒng)細胞重建的此類轉(zhuǎn)基因動物；及3.通過遺傳工程或其它生成修飾多肽的方法來改變多肽以消除一個或多個潛在 T細胞表位，并生成這樣的改變多肽供測試用。在一個實施方案中，可以分析多肽的序列以確定MHC II類結(jié)合基序的存在。例 如，可以與MHC結(jié)合基序的數(shù)據(jù)庫進行比較，例如通過搜索萬維網(wǎng)上sitewehil. wehi. edu. au的“基序”數(shù)據(jù)庫?；蛘?，可以使用計算穿線法(computational threading method) 來鑒定MHC II類結(jié)合肽，諸如由Altuvia等(J. Mol. Biol. 249244-250 (1995))設計的穿 線法，測試來自多肽的連續(xù)重疊肽對MHC II類蛋白質(zhì)的結(jié)合能。預測結(jié)合的計算機算法 (computational bindingprediction algorithms)包括 iTope 、Tepitope、SYFPEITHI、 EpiMatrix(EpiVax)、和MHCpred。為了幫助鑒定MHC II類結(jié)合肽，可搜索諸如兩親性和 Rothbard基序等與被成功呈遞的肽關聯(lián)的有關序列特征，及組織蛋白酶B和其它加工酶的 切割位點。鑒定出潛在的(例如人)T細胞表位后，通過改變一個或多個氨基酸(視消除T細 胞表位的需要)來消除這些表位。通常，這會涉及T細胞表位自身內(nèi)的一個或多個氨基酸 的改變。這可能涉及改變這樣的氨基酸，其在蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)上鄰近于所述表位，或者在 分子的一級結(jié)構(gòu)上不鄰近但在二級結(jié)構(gòu)中鄰近于所述表位。所考慮的通常的改變是氨基酸 替代，但是在某些情況下有可能氨基酸添加或刪除是適宜的。所有改變均可通過重組DNA 技術來實現(xiàn)，這樣最終的分子可通過重組宿主表達來制備，例如借助已確立的方法，但是也 可使用蛋白質(zhì)化學或任何其它改變分子的手段。將鑒定出的T細胞表位去除之后，可以對去免疫的序列再次進行分析以確保沒有 產(chǎn)生新的T細胞表位，如果有新的T細胞表位，那么可刪除該表位。并非所有通過計算鑒定出的T細胞表位都需要消除。本領域技術人員會理解特定 表位的“強度”(或者更恰當?shù)恼f是潛在免疫原性)的重要性。各種計算方法可為潛在表位 打分。本領域技術人員會理解，只有得分高的表位才可能需要消除。本領域技術人員還會 認識到，消除多肽的潛在表位與維持結(jié)合親和力之間有一種權衡。因此，一種策略是向多肽 中依次地引入替代，然后測試抗原結(jié)合和免疫原性。在一個方面，去免疫的多肽在人受試者中的免疫原性比原始多肽要低(或者更恰 當?shù)恼f，引發(fā)更低的HAMA應答)。用于測定免疫原性的測定法完全在熟練技術人員的知識 范圍內(nèi)。可實施本領域公認的測定免疫應答的方法來監(jiān)測特定受試者中的或臨床試驗中的 HAMA應答。對施用了去免疫的多肽的受試者可在施用所述療法開始時和整個期間給予免疫 原性評估。HAMA應答可以例如通過使用本領域技術人員知道的方法，包括表面等離振子共 振技術(BIAC0RE)和/或固相ELISA分析等，測定來自受試者的血清樣品中針對去免疫多 肽的抗體來加以測量?；蛘?，設計用于測量T細胞活化事件的體外測定法也能指示免疫原 性。其他修飾在一些實施方案中，多價多肽是糖基化的。Fn3結(jié)構(gòu)域在正常情況下不含有糖基化
26位點，然而，可以將此類糖基化通過工程化改造引入蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的糖基化通常是N-連接或是0-連接的。N-連接指碳水化合物模塊連接于 天冬酰胺殘基的側(cè)鏈。三肽序列天冬酰胺-χ-絲氨酸和天冬酰胺-χ-蘇氨酸(其中X是除 脯氨酸外的任何氨基酸)是將碳水化合物模塊酶促連接于天冬酰胺側(cè)鏈的識別序列?？梢?將這些序列通過工程化改造引入本發(fā)明的蛋白質(zhì)，特別是基于纖連蛋白的支架蛋白及其相 應的多核苷酸中。如此，這兩種三肽序列中的任一種在多肽中的存在可產(chǎn)生潛在的糖基化 位點。0-連接的糖基化是指將N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖等糖類之一連接于羥基氨基 酸，最常見的是絲氨酸或蘇氨酸，但也可使用5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸。向蛋白質(zhì)中添加糖基化位點是通過改變氨基酸序列使其包含一個或多個上述三 肽序列(用于N-連接的糖基化位點)而便利地完成的。也可通過向原始抗體的序列中添 加或替換入一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基(用于0-連接的糖基化位點)來進行改變。在一些實施方案中，修飾多價多肽以增強抗原依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC) 和/或補體依賴性細胞毒性(⑶C)。在一些實施方案中，多價多肽是進一步包含F(xiàn)c區(qū)的而3 結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，F(xiàn)c區(qū)是增強ADCC或⑶C的變體。Fc區(qū)變體可包含在一個或 多個氨基酸位置處包含氨基酸修飾(例如替代)的人Fc區(qū)序列(例如人IgGl、IgG2、IgG3 或 IgG4Fc 區(qū))。在一個實施方案中，變異的Fc區(qū)可以比天然序列Fc區(qū)更有效地在人效應細胞 存在下介導抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)，或以更好的親和力結(jié)合Fc伽馬受體 (Fe y R)。此類 Fc 區(qū)變體可以在 Fc 區(qū)的第 256、290、298、312、326、330、333、334、360、378 或430位中的一個或多個處包含氨基酸修飾，其中Fc區(qū)中殘基的編號方式是如Kabat中的 EU索引的。核酸-蛋白質(zhì)融合技術在一個方面，本申請?zhí)峁┒鄡r多肽，其包含結(jié)合人靶物例如EGFR、VEGFR2、IGF-IR 或其它蛋白質(zhì)的纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域。一種快速產(chǎn)生并測試具有特定結(jié)合特性的而3 結(jié)構(gòu)域的方式是Adnexus (—家Bristol-MyersSquilA研發(fā)公司)的核酸-蛋白質(zhì)融合物 技術。本公開內(nèi)容描述此類體外表達和標記技術的使用，該技術稱作PROfusion ，利用核 酸-蛋白質(zhì)融合物(RNA-蛋白質(zhì)融合物和DNA-蛋白質(zhì)融合物)來鑒定對于結(jié)合蛋白質(zhì)重 要的新型多肽和氨基酸基序。核酸-蛋白質(zhì)融合物技術是一種共價偶聯(lián)蛋白質(zhì)與其編碼 遺傳信息的技術。關于RNA-蛋白質(zhì)融合技術和基于纖連蛋白的支架蛋白文庫篩選方法的 詳細描述參見 Szostak 等，美國專利 No. :6，258，558 ；6，261，804 ；6，214，553 ；6，281，344 ； 6，207，446 ；6，518，018 ；PCT 公開文本號 W000/34784；W001/64942 ；W002/032925；及 Roberts 和 Szostak，Proc Natl. Acad. Sci. 94 12297-12302，1997，通過述及收入本文。關 于核酸-蛋白質(zhì)融合技術的進一步討論可見于本申請的實施例及材料和方法部分。載體和多核苷酸實施方案編碼本文中所公開的各種蛋白質(zhì)或多肽之任一的核酸可以化學合成?？梢赃x擇密 碼子用法以改善在細胞中的表達。此類密碼子用法會取決于所選擇的細胞類型。已經(jīng)開 發(fā)了用于大腸桿菌和其它細菌以及哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞和昆蟲細胞專門的 密碼子用法。參見例如Mayfield 等，Proc Natl Acad Sci U S A. 2003Jan 21 ； 100 (2) 438-42 ；Sinclair 等，Protein Expr Purif.2002 Oct ；26(1) :96-105 ；Conne11 ND.，Curr
27Opin Biotechnol. 20010ct ； 12(5) :446-9 ；Makrides 等，Microbiol Rev. 1996S?。?0(3) 512-38 ；及 Sharp 等，Yeast. 19910ct ；7 (7) :657_78。通用核酸操作技術記載于例如Sambrook等，Molecular Cloning =A Laboratory Manual, ^ 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press,第 2 1989, 或 F. Ausubel 等，Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing and Wiley-Interscience =New York, 1987)和定期更新，通過述及收入本文。編碼多肽的DNA與 合適的源自哺乳動物、病毒、或昆蟲基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)節(jié)元件可操作連接。這樣的調(diào)節(jié)元 件包括轉(zhuǎn)錄啟動子、任選的操縱基因序列(用以控制轉(zhuǎn)錄)、編碼合適的mRNA核糖體結(jié)合位 點的序列、和控制轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列。還加入在宿主中復制的能力(通常由復制起點 賦予)和選擇基因(用以幫助轉(zhuǎn)化子的識別)。本文所述蛋白質(zhì)可以重組生產(chǎn)，不僅是直接的重組生產(chǎn)，還可以作為與異源多肽 的融合蛋白，所述異源多肽優(yōu)選是信號序列或其它位于成熟蛋白或多肽的N末端、具有特 異性切割位點的多肽。所選擇的異源信號序列優(yōu)選是受到宿主細胞識別和加工(即被信 號肽酶切割)的異源信號序列。對于不識別和加工天然信號序列的原核宿主細胞，用原核 信號序列替換信號序列，原核信號序列選自例如堿性磷酸酶、青霉素酶、lpp、或熱穩(wěn)定腸毒 素II前導序列。對于酵母分泌，可以用例如下述序列替換天然信號序列酵母轉(zhuǎn)化酶前導 序列、α因子前導序列(包括酵母屬(Saccharomyces)和克魯維酵母屬(Kluyveromyces) α -因子前導序列)、或酸性磷酸酶前導序列、白色假絲酵母(C. albicans)葡糖淀粉酶前導 序列、或PCT公開文本NO.W090/13646中記載的信號。在哺乳動物細胞表達中，有哺乳動物 信號序列以及病毒分泌前導序列(例如單純皰疹gD信號)可供使用?？梢詫⑦@樣的前體 區(qū)域的DNA與編碼蛋白質(zhì)的DNA以符合讀碼框的方式相連接。表達載體和克隆載體都包含使載體能夠在選定的一種或多種宿主細胞中復制的 核酸序列。通常，在克隆載體中，這種序列使載體能夠不依賴于宿主染色體DNA而復制，這 種序列包括復制起點或自主復制序列。多種細菌、酵母和病毒的此類序列是公知的。來自 質(zhì)粒PBR322的復制起點適合于大多數(shù)革蘭氏陰性細菌，2微米質(zhì)粒起點適合于酵母，而各 種病毒起點(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用于哺乳動物細胞中的克隆載體。通 常，哺乳動物表達載體不需要復制起點構(gòu)件(SV40起點的使用通常可能只是因為它包含早 期啟動子)。表達和克隆載體可包含選擇基因，也稱為選擇標志。典型的選擇基因編碼如下 蛋白質(zhì)(a)賦予對抗生素或其它毒素，例如氨芐青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四環(huán)素，的抗 性；(b)補足營養(yǎng)缺陷型的缺陷；或(c)提供不能由復合培養(yǎng)基獲得的必需營養(yǎng)物，例如用 于芽孢桿菌的編碼D-丙氨酸消旋酶的基因。適用于酵母的選擇基因是存在于酵母質(zhì)粒YRp7中的trpl基因(Minchcomb等， Nature 282 :39(1979))。trpl基因為缺乏在色氨酸中生長能力的酵母突變株(例如ATCC No. 44076 或 PEP4-1)提供了選擇標志。Jones,Genetics 85:12(1977)。于是，酵母宿主細 胞基因組中trpl損傷的存在提供了有效的環(huán)境用于通過在缺乏色氨酸時的生長來檢測轉(zhuǎn) 化。類似的，Leu2缺陷型酵母菌株(ATCC 20，622或38，626)被攜帶Leu2基因的已知質(zhì)粒 所補足。表達載體和克隆載體通常包含被宿主生物體識別的、與編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)(例如基于纖連蛋白的支架蛋白)的核酸可操作連接的啟動子。適用于原核宿主的啟動子包括 PhoA啟動子、β -內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動子系統(tǒng)、堿性磷酸酶、色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)、和雜 合啟動子(諸如tac啟動子)。然而，其它已知的細菌啟動子也是合適的。用于細菌系統(tǒng)的 啟動子還將包含與編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA可操作連接的Siine-Dalgarno (S. D.)序列。真核細胞的啟動子序列是已知的。幾乎所有真核基因在位于起始轉(zhuǎn)錄的位點上游 大約25至30個堿基處都具有富AT區(qū)。在許多基因的轉(zhuǎn)錄起點上游70至80個堿基處還 可找到另一種序列，即CNCAAT區(qū)，其中N可以是任何核苷酸。在大多數(shù)真核基因的3'端是 AATAAA序列，它可能是向編碼序列的3'端添加polyA尾的信號。所有這些序列合適的插 入真核表達載體。適用于酵母宿主的啟動序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的啟 動子，諸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄 糖-6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、磷酸葡萄糖異構(gòu) 酶和葡糖激酶。其它酵母啟動子(它們是誘導型啟動子，具有通過生長條件控制轉(zhuǎn)錄的額外優(yōu) 點)有醇脫氫酶2、異細胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝有關的降解酶、金屬硫蛋白、甘油 醛-3-磷酸脫氫酶、及負責麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動子區(qū)。適用于酵母表達的載體 和啟動子進一步記載于EP專利公開文本No. 73，657。酵母增強子也可以有利地與酵母啟動 子一起使用。對于哺乳動物宿主細胞中載體的轉(zhuǎn)錄，可通過例如從病毒(諸如多瘤病毒、禽痘 病毒、腺病毒(諸如腺病毒幻、牛乳頭瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細胞病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙肝 病毒和更優(yōu)選的猿猴病毒40 (SV40))基因組、異源哺乳動物啟動子(例如肌動蛋白啟動子 或免疫球蛋白啟動子)、及熱休克啟動子獲得的啟動子來控制，條件是這樣的啟動子應與宿 主細胞系統(tǒng)相容。方便地以SV40限制性片段的形式獲得SV40病毒的早期和晚期啟動子，該片段還 包含SV40病毒復制起點。方便地以HindIIIE限制性片段的形式獲得人巨細胞病毒的立即 早期啟動子。美國專利No. 4，419，446中披露了使用牛乳頭瘤病毒作為載體在哺乳動物宿 主中表達DNA的系統(tǒng)。美國專利No. 4，601，978中記載了該系統(tǒng)的一種改良。關于在小鼠 細胞中在來自單純皰疹病毒的胸苷激酶啟動子的控制下表達人β-干擾素cDNA還可參見 Reyes等，Nature 297:598-601(1982)?；蛘撸梢允褂脛谑先饬霾《鹃L末端重復序列作為 啟動子。常常通過在載體中插入增強子序列來增加高等真核細胞對編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的 DNA的轉(zhuǎn)錄?，F(xiàn)在知道許多來自哺乳動物基因(球蛋白、彈性蛋白酶、清蛋白、甲胎蛋白和 胰島素)的增強子序列。然而，典型的是使用來自真核細胞病毒的增強子。例子包括SV40 復制起點晚期一側(cè)的增強子(bpl00-270)、巨細胞病毒早期啟動子增強子、多瘤病毒復制起 點晚期一側(cè)的增強子、和腺病毒增強子。關于激活真核啟動子的增強元件還可參見Yaniv， Nature 297:17-18(1982)。可以將增強子剪接到載體中多價抗體編碼序列的5'或3'方 向的位置，但是優(yōu)選位于啟動子的5'方向的位置上。用于真核宿主細胞(例如酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人或來自其它多細胞生物 體的有核細胞)的表達載體還將包含終止轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定mRNA所必需的序列。此類序列通?？梢詮恼婧嘶虿《綝NA或cDNA非翻譯區(qū)的5'端和(偶爾可從3'端)獲得。這些區(qū)域包 含這樣核苷酸區(qū)段，其被轉(zhuǎn)錄為編碼多價抗體的mRNA的非翻譯部分中的聚腺苷酸化片段。 一種有用的轉(zhuǎn)錄終止構(gòu)件是牛生長激素聚腺苷酸化區(qū)。參見WO 94/110 及其中披露的表 達載體。重組DNA還可包含任何類型的可能對蛋白質(zhì)純化有用的蛋白質(zhì)標簽序列。蛋白 質(zhì)標簽的例子包括但不限于組氨酸標簽、FLAG標簽、myc標簽、HA標簽、或GST標簽。與 細菌、真菌、酵母、和哺乳動物細胞宿主一起使用的適宜的克隆和表達載體可見于Cloning Vectors :A Laboratory Manual, (Elsevier, New York，1985)，以此通過述及收入其相關公 開內(nèi)容。使用對宿主細胞適宜的方法將表達構(gòu)建物導入宿主細胞中，這對本領域技術人員 而言是顯而易見的。本領域已知多種用于將核酸導入宿主細胞中的方法，包括但不限于電 穿孔；采用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-右旋糖酐、或其它物質(zhì)的轉(zhuǎn)染；微粒轟擊；脂轉(zhuǎn) 染；和感染(其中載體是傳染劑)。合適的宿主細胞包括原核生物、酵母、哺乳動物細胞、或細菌細胞。合適的細菌包 括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如大腸埃希氏菌或大腸桿菌(E. coli)或芽孢桿菌 屬(Bacilli spp)。酵母(優(yōu)選來自酵母屬物種，諸如釀酒酵母(S. cerevisiae))也可用 于生產(chǎn)多肽。也可采用各種哺乳動物或昆蟲細胞培養(yǎng)系統(tǒng)來表達重組蛋白。關于在昆蟲細 胞中生產(chǎn)異源蛋白的桿狀病毒系統(tǒng)的綜述見Luckow和Summers，(Bio/Technology, 6 :47， 1988)。合適的哺乳動物宿主細胞系的例子包括內(nèi)皮細胞、C0S-7猴腎細胞、CV-U L細胞、 C127、3T3、中國倉鼠卵巢(CH0)、人胚腎細胞、HeLa、293、293T、和BHK細胞系。為了制備純 化的多肽，培養(yǎng)合適的宿主/載體系統(tǒng)以表達重組蛋白。對于許多應用，本文中所公開的許 多多肽的小尺寸會使得大腸桿菌表達成為優(yōu)選的表達方法。然后從培養(yǎng)液或細胞提取物純 化蛋白質(zhì)。適于表達本發(fā)明的糖基化蛋白質(zhì)的宿主細胞衍生自多細胞生物體。無脊椎動 物細胞的例子包括植物和昆蟲細胞。已經(jīng)鑒定了許多桿狀病毒株和變體及相應的允許 昆蟲宿主細胞，它們來自諸如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛蟲)、埃及伊蚊 (Aedes aegypti)(蚊子)、白紋伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)(果蠅)和家蠶(Bombyx mori)等宿主。有多種轉(zhuǎn)染用病毒株是公眾可獲得 的，例如苜蓿尺蠖(Autographa californica)NPV的L-I變體和家蠶NPV的& -5株，而且 此類病毒可依照本發(fā)明用作本文中的病毒，特別是用于轉(zhuǎn)染草地夜蛾細胞。在有些情況下會希望在脊椎動物細胞生產(chǎn)蛋白質(zhì)，諸如為了糖基化，而且培 養(yǎng)(組織培養(yǎng))中脊椎動物細胞的繁殖已經(jīng)成為常規(guī)流程。有用的哺乳動物宿主細胞 系的例子是用SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CVl系(COS-7，ATCC CRL1651)；人胚腎系093或為了 在懸浮培養(yǎng)中生長而亞克隆的293細胞，Graham等，J. Gen Virol. 36 :59 (1977))；幼 倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR (CHO，Urlaub等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA77 :4216(1980))；小鼠塞托利(Sertoli)細胞(TM4, Mather, Biol. R印rod. 23 :243-251(1980))；猴腎細胞(CVl, ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VER0-76， ATCC CRL-1587)；人宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；牛鼠 (buffalo rat)肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL1442)；人肺細胞(Wl38,ATCC CCL 75)；人肝細胞
30(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳瘤(MMT 060562, ATCC CCL 51) ；TRI 細胞(Mather 等，AnnalsN. Y. Acad. Sci. 383 :44-68(1982) ；MRC5細胞；FS4細胞；人肝瘤系(Hep G2)；和骨髓瘤或淋巴 瘤細胞(例如Y0、J558L、P3和NSO細胞)(參見美國專利No. 5，807，715)。還可利用棉花、 玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、番茄和煙草的植物細胞培養(yǎng)物作為宿主。蛋白質(zhì)生產(chǎn)用本文所述用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的表達或克隆載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，并在為了誘導啟動 子、選擇轉(zhuǎn)化子或擴增編碼期望序列的基因而適當更改的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。在 本文所示實施例中，用于高通量蛋白質(zhì)生產(chǎn)(HTPP)和中等規(guī)模生產(chǎn)的宿主細胞是HMS174 細菌株。可以在多種培養(yǎng)基中培養(yǎng)用于生產(chǎn)本發(fā)明蛋白質(zhì)的宿主細胞。商品化培養(yǎng)基諸 如 Ham 氏 FlO(Sigma)、極限必需培養(yǎng)基(MEM, Sigma)、RPMI-1640 (Sigma)、禾口 Dulbecco 氏 改良的fegle氏培養(yǎng)基(DMEM，Sigma)適于培養(yǎng)宿主細胞。另外，可以使用下列文獻中記 載的任何培養(yǎng)基作為宿主細胞的培養(yǎng)基Ham等，Meth. Enz. 58 :44(1979) ；Barnes等，Anal. Biochem. 102 :255(1980)；美國專利 No. 4，767，704 ；4，657，866 ；4，927，762 ；4，560，655 ；或 5，122，469 ；W090/03430 ；WO 87/00195 ；或美國專利No. Re. 30, 985。任何這些培養(yǎng)基可以根 據(jù)需要補充激素和/或其它生長因子(諸如胰島素、運鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(諸如 氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩沖劑(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷和胸苷)、抗生素(諸如 GENTAMYCIN 藥物)、痕量元素(定義為通常以微摩爾范圍的終濃度存在的無機化合物)、和 葡萄糖或等效能源。還可以以適宜濃度包含本領域技術人員知道的任何其它必需補充物。 培養(yǎng)條件(諸如溫度、PH等)為先前表達選用的宿主細胞所用的培養(yǎng)條件，這對于普通技 術人員而言是顯而易見的。本文中所公開的蛋白質(zhì)也可以使用無細胞翻譯系統(tǒng)來生產(chǎn)。為了該目的，必須修 飾編碼多肽的核酸以容許體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生mRNA，并容許mRNA在所利用的特定無細胞系統(tǒng)(真 核型如哺乳動物或酵母無細胞翻譯系統(tǒng)；或原核型如細菌無細胞翻譯系統(tǒng))中進行無細胞 翻譯。本發(fā)明的蛋白質(zhì)也可以通過化學合成來生產(chǎn)(例如使用Solid PhasePeptide Synthesis，第 2 版，1984，The Pierce Chemical Co.，Rockford, IL 中記載的方法)。對蛋 白質(zhì)的修飾也可以通過化學合成來產(chǎn)生。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以通過蛋白質(zhì)化學領域普遍知道的蛋白質(zhì)分離/純化方法來 純化。非限制性的例子包括抽提、再結(jié)晶、鹽析(例如用硫酸銨或硫酸鈉)、離心、透析、超 濾、吸附層析、離子交換層析、疏水層析、正相層析、反相層析、凝膠過濾、凝膠滲透層析、親 和層析、電泳、逆流分配或這些手段的任意組合。純化后，可以通過本領域已知的多種技術 (包括但不限于過濾和透析)將多肽更換到不同的緩沖液中和/或濃縮。純化后的多肽優(yōu)選是至少85%純、更優(yōu)選至少95%純、最優(yōu)選至少98%純。無論 純度的確切數(shù)值如何，多肽對于用作藥品是足夠純的。成像、診斷和其它應用在一個方面，本申請?zhí)峁┯每蓹z測模塊標記的多價多肽。該多肽可用于各種診斷 應用?？蓹z測模塊可以是任何能夠直接或間接產(chǎn)生可檢測信號的模塊。例如，可檢測模塊 可以是放射性同位素，諸如H3、C14或13、P32、S35、或1131 ；熒光或化學發(fā)光化合物，諸如異硫氰酸熒光素、羅丹明、或螢光素；或酶，諸如堿性磷酸酶、β -半乳糖苷酶或辣根過氧化 物酶。任何本領域已知的將蛋白質(zhì)綴合至可檢測模塊的方法均可以采用，這樣的方法包 括 Hunter 等，Nature 144:945(1962) ；David 等，Biochemistry 13:1014(1974) ；Pain 等， J. Immunol. Meth. 40 :219 (1981)；及 Nygren, J.Histochem. andCytochem. 30 :407 (1982)所 記載的方法。體外方法包括本領域眾所周知的綴合化學，包括與蛋白質(zhì)相容的化學，諸如對 特定氨基酸(諸如Cys和Lys)的化學。為了將模塊(諸如PEG)連接至本發(fā)明的蛋白質(zhì)， 使用連接基團或反應性基團。合適的連接基團是本領域眾所周知的，包括二硫化物基團、硫 醚基團、酸不穩(wěn)定基團、光不穩(wěn)定基團、肽酶不穩(wěn)定基團和酯酶不穩(wěn)定基團。取決于應用，優(yōu) 選的連接基團是二硫化物基團和硫醚基團。對于不含Cys半胱氨酸的多肽，可以通過工程 化在某個位置引入Cys，以便在創(chuàng)建綴合位置的同時容許蛋白質(zhì)的活性存在。連有可檢測模塊的多價結(jié)合多肽也可用于體內(nèi)成像。可將多肽與不透射線 (radio-opaque)的藥劑或放射性同位素連接，施用給受試者(優(yōu)選進入血流)，然后測定經(jīng) 標記的蛋白質(zhì)在受試者中的存在和位置。這種成像技術在惡性腫瘤的分期和治療中是有用 的。蛋白質(zhì)可以用任何在受試者中可檢測(通過核磁共振、放射學、或本領域已知的其它檢 測手段)的模塊來標記。多價多肽也可以用作親和純化劑。在這種方法中，使用本領域眾所周知的方法將 多肽固定化在合適的支持物上，諸如kphadex樹脂或濾紙。多價多肽可用于任何已知的測定法中，諸如競爭性結(jié)合測定、直接和間接夾心 測定、禾口 免疫沉淀測定(Zola, Monoclonal Antibodies :A Manual of Techniques,頁 147-158(CRC Press, Inc.，1987))。在某些方面，本公開內(nèi)容提供了用于檢測樣品中的靶物分子的方法。該方法可包 括使樣品接觸本文中所描述的多價多肽，其中所述接觸在容許多肽-靶物復合物形成的條 件下進行，并檢測所述復合物，由此檢測所述樣品中的所述靶物。檢測可使用本領域已知的 任何技術來進行，如放射線照相術、免疫學測定法、熒光檢測、質(zhì)譜、或表面等離子共振。樣 品常常會是生物學樣品，諸如活檢，特別是腫瘤、疑似腫瘤的活檢。樣品可以來自人或其它 哺乳類動物。多價多肽可以用標記模塊，諸如放射性模塊、熒光模塊、生色模塊、化學發(fā)光模 塊、或半抗原模塊來標記。多價多肽可以固定化在固體支持物上。治療/體內(nèi)用途在一個方面，本申請?zhí)峁┰诓“Y的治療中有用的多價多肽。本申請還提供用于對 受試者施用多價多肽的方法。在一些實施方案中，受試者是人。在一些實施方案中，多價多 肽對于哺乳動物，特別是人而言是藥學可接受的?！八帉W可接受的”多肽指對動物施用時沒 有顯著的不利醫(yī)學后果的多肽。藥學可接受的多價多肽的例子包括缺少整聯(lián)蛋白結(jié)合域 (RGD)的結(jié)構(gòu)域和基本上不含內(nèi)毒素或具有很低的內(nèi)毒素水平的wFM結(jié)構(gòu)域。多價多肽在病癥，諸如癌癥中特別有用。在一個例示性實施方案中，多價多肽包含 結(jié)合兩種不同靶物的而3結(jié)構(gòu)域。兩種靶物可以在同一信號傳導途徑內(nèi)或在兩種分開的信 號傳導途徑內(nèi)。靶物分子之一可“募集”多價多肽至特定位點，諸如癌細胞，而與第二靶物 分子結(jié)合可影響特定信號傳導途徑。本申請的一個方面提供靶向一種或多種涉及腫瘤生物學的蛋白質(zhì)諸如例如VEGFR2、IGF-IR、和EGFR的多價多肽。在一些實施方案中，施用多價多肽在體內(nèi)抑制腫瘤 細胞生長。腫瘤細胞可衍生自任何細胞類型，包括但不限于表皮、上皮、內(nèi)皮、白血病、肉瘤、 多發(fā)性骨髓瘤、或中胚層細胞。異種移植物腫瘤研究中使用的常用腫瘤細胞系的例子包括 A549(非小細胞肺癌)細胞、DU-145(前列腺)細胞、MCF_7(乳腺)細胞、Colo 205 (結(jié)腸) 細胞、3T3/]GF-IR(小鼠成纖維細胞)細胞、NCI H441細胞、HEP G2 (肝癌)細胞、MDA MB 231 (乳腺)細胞、HT-29 (結(jié)腸)細胞、MDA-MB-435s (乳腺)細胞、U266細胞、SH-SY5Y細 胞、Sk-Mel-2細胞、NCI-H929、RPM18226jPA431細胞。在一些實施方案中，相對于未處理 動物中腫瘤的生長，多肽抑制腫瘤細胞生長。在一些實施方案中，相對于未處理動物中腫瘤 的生長，多肽將腫瘤細胞生長抑制50、60、70、80%或更多。在一些實施方案中，對腫瘤細胞 生長的抑制是在開始用多肽處理動物后至少7天或至少14天測量的。在一些實施方案中， 與多肽一起給動物施用另一種抗腫瘤劑。在某些方面，本公開內(nèi)容提供施用多價多肽以治療和/或預防腫瘤和/或腫瘤轉(zhuǎn) 移的方法，其中腫瘤特別優(yōu)選選自下組腦瘤、泌尿生殖道腫瘤、淋巴系統(tǒng)腫瘤、胃腫瘤、喉 腫瘤、單核細胞白血病、肺腺癌、小細胞肺癌、胰腺癌、成膠質(zhì)細胞瘤和乳腺癌，不限于這些。在某些方 面，本公開內(nèi)容提供施用多價多肽以治療選自下組癌性疾病的疾病的方 法鱗狀細胞癌、膀胱癌、胃癌、肝癌、腎癌、結(jié)腸直腸癌、乳腺癌、頭癌、頸癌、食管癌、婦科癌 癥、甲狀腺癌、淋巴瘤、慢性白血病和急性白血病。可以與本發(fā)明的適宜實施方案一起使用的其他藥劑本發(fā)明的一個方面提供與細胞毒劑相連的多價多肽。此類實施方案可視情況通過 體外或體內(nèi)方法來制備。體外方法包括本領域眾所周知的綴合方法，包括與蛋白質(zhì)相容的 化學，諸如對特定氨基酸(諸如Cys和Lys)的化學。為了將細胞毒劑與多肽相連，使用連接 基團或反應性基團。合適的連接基團是本領域眾所周知的，包括二硫化物基團、硫醚基團、 酸不穩(wěn)定基團、光不穩(wěn)定基團、肽酶不穩(wěn)定基團和酯酶不穩(wěn)定基團。優(yōu)選的連接基團是二硫 化物基團和硫醚基團。例如，可以使用二硫化物交換反應或通過在抗體和細胞毒劑之間形 成硫醚鍵來構(gòu)建綴合物。優(yōu)選的細胞毒劑是美登木素生物堿、紫杉烷和CC-1065類似物。在一些實施方案中，將多價多肽與細菌毒素、植物毒素、蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋 白、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、蛋白酶、葡萄球菌腸毒素-A、商陸(pokeweed)抗病毒蛋 白、白樹毒素、白喉毒素、假單胞菌外毒素、假單胞菌內(nèi)毒素、Ranpimase(Rap)、Rap (N69Q)、 酶、或熒光蛋白相連。在一些實施方案中，將多價多肽與美登木素生物堿或美登木素生物堿類似物相 連。合適的美登木素生物堿的例子包括美登醇和美登醇類似物。合適的美登木素生物堿披 露于美國專利 No. 4，424，219 ；4，256，746 ；4，294，757 ；4，307，016 ；4，313，946 ；4，315，929 ； 4，331，598 ；4，361，650 ；4，362，663 ；4，364，866 ；4，450，254 ；4，322，348 ；4，371，533 ； 6，333，410 ；5，475，092 ；5，585，499 ；和 5，846，545。在一些實施方案中，將多價多肽與紫杉烷相連。美國專利No. 6，372，738和 6，340，701披露了適合用于本發(fā)明的紫杉烷。在一些實施方案中，將多價多肽與CC-1065或其類似物相連。美國專利 No. 6，372，738 ；6，340, 701 ；5，846，545 和 5，585，499 披露了 CC-1065 及其類似物。用于制備此類細胞毒性綴合物的一種令人感興趣的候選物是CC-1065，其是一種從澤耳鏈霉菌(Str印tomyces zelensis)培養(yǎng)液中分離得到的強有力的抗腫瘤抗生 素。CC-1065在體外比常用的抗癌藥(諸如多柔比星、甲氨蝶呤和長春新堿)強約1000倍 (B. K. Bhuyan 等，Cancer Res.，42，3532-3537 (1982))。細胞毒性藥物(諸如甲氨蝶呤、柔紅霉素、多柔比星、長春新堿、長春堿、美法侖、 絲裂霉素C、苯丁酸氮芥、和加利車霉素)也適合于制備本發(fā)明的綴合物，而且，也可以通過 中間載體分子(諸如血清白蛋白)將藥物分子與多價多肽連接。 在其它治療性處理或組合物中，將多價多肽與一種或多種其他的治療劑共同施用 或順序施用。合適的治療劑包括但不限于靶向治療劑、其它靶向生物制品、和細胞毒性或細 胞抑制性藥劑。在有些情況下，優(yōu)選從同一個或各別的、裝有液體配制劑的治療可接受管形 瓶、注射器或其它施用裝置中施用藥劑。癌癥治療劑指那些旨在殺死癌細胞或限制癌細胞生長同時對患者具有最低限度 影響的藥劑。如此，此類藥劑可利用與癌細胞的性質(zhì)(例如代謝、血管化或表面抗原呈遞) 與健康宿主細胞相比的任何差異。腫瘤形態(tài)學差異是潛在的干預位點例如，第二治療劑可 以是抗體，如可以用來阻礙實體瘤內(nèi)部血管化由此減緩其生長速率的抗VEGF。其它治療劑 包括但不限于輔助劑諸如鹽酸格拉司瓊(granisetron HCl)、雄激素抑制劑諸如醋酸亮丙 瑞林(leuprolide acetate)、抗生素諸如多柔比星、抗雌激素諸如他莫昔芬、抗代謝物諸如 干擾素α _2a、細胞毒劑諸如紫杉醇、酶抑制劑諸如ras法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑、免疫調(diào)控劑 諸如阿地白介素(aldesleukin)、和氮芥衍生物諸如鹽酸美法侖、諸如此類。可以與多價多肽組合以改善抗癌效果的治療劑包括腫瘤學實踐中所使用的多種 藥劑(參考文獻Cancer, Principles&Practice of Oncology, DeVita, V. Τ. , HelIman, S.，Rosenberg, S. Α.,第 6 版，Lippincott-Raven, Philadelphia，2001)，諸如多西他塞、 帕利他塞、多柔比星、表柔比星、環(huán)磷酰胺、曲妥單抗、卡培他濱、他莫昔芬、托瑞米芬、來曲 唑、阿那曲唑、氟維司群、依西美坦、戈舍瑞林、奧沙利鉬、卡鉬、順鉬、地塞米松、安肽、貝伐 單抗、5-氟尿嘧啶、亞葉酸、左旋咪唑、伊立替康、依托泊苷、托泊替康、吉西他濱、長春瑞 濱、雌莫司汀、米托蒽醌、阿巴瑞克、唑來膦酸鹽、鏈佐星、利妥昔單抗、伊達比星、白消安、苯 丁酸氮芥、氟達拉濱、伊馬替尼、阿糖胞苷、替伊莫單抗(ibritumomab)、托西莫單抗、干擾 素a_2b、美法侖、硼替佐米(bortezomib)、六甲蜜胺、天冬酰胺酶、吉非替尼、埃羅替尼、 抗EGF受體抗體(例如西妥昔單抗或panitumab)、伊沙匹隆(ixabepilone)、埃博霉素 (epothilones)或其衍生物、和細胞毒性藥物與針對細胞表面受體的抗體的綴合物。優(yōu)選 的治療劑是鉬劑(諸如卡鉬、奧沙利鉬、順鉬)、紫杉烷(諸如帕利他塞、多西他塞)、吉西他 濱、和喜樹堿?？梢栽谑┯枚鄡r多肽之前、同時、或之后施用一種或多種其他的治療劑。熟練技 術人員會理解，對于每種治療劑，可能有特定的有利的施用次序。類似地，熟練技術人員會 理解，對于每種治療劑，施用藥劑與本發(fā)明的抗體、抗體片段或綴合物之間的時間長度會變 化。配制和施用本申請進一步提供包含本文所述多價多肽的藥學可接受組合物，其中所述組合 物基本上不含內(nèi)毒素。通過將具有期望純度的所述蛋白質(zhì)與任選的生理學可接受的載 體、賦形劑或穩(wěn)定劑(Remington ‘ s Pharmaceutical Sciences,第 16 版，Osol, Α·編(1980))混合，以水溶液、凍干或其它干燥配制劑的形式制備包含多價多肽的治療用配制 齊U?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所采用的劑量和濃度對接受者是無毒的，包括緩 沖劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑 (諸如氯化十八燒基二甲基節(jié)基銨(octadecyidimethylbenzyl ammonium chloride)；氯 化己燒雙胺(hexamethonium chloride)；苯扎氯銨(benzalkonium chloride)、苯索氯銨 (benzethonium chloride)；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯(alkylparabens)， 諸如對羥基苯甲酸甲酯或丙酯；鄰苯二酚(catechol)；間苯二酚；環(huán)己醇；3_戊醇；和間 甲酚)；低分子量(少于約10個殘基)多肽；蛋白質(zhì)，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋 白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨 酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或右旋糖酐；螯合 齊U，諸如EDTA ；糖類，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽反荷離子(salt-forming counter-ions)，諸如鈉；金屬復合物(例如Zn-蛋白質(zhì)復合物)；和/或非離子表面活性劑， 諸如 TTOEN 、PLURONICS 或聚乙二醇(PEG)。本文中的配制劑還可含有多于一種治療具體適應癥所必需的活性化合物，優(yōu)選活 性互補且彼此沒有不利影響的化合物。本文中提供了活性化合物組合的例子。這樣的分子 以對預定目的有效的量合適的組合存在?；钚猿煞诌€可包載于例如通過凝聚技術或通過界面聚合制備的微膠囊中(例如 分別是羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)，在膠狀藥物投遞系統(tǒng) 中(例如脂質(zhì)體、白蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和納米膠囊)，或在粗滴乳狀液中。此類 技術披露于例如 Remington' sPharmaceutical Sciences，第 16 版，Osol，Α·編(1980)。

用于體內(nèi)施用的配制劑必須是無菌的。這可容易地通過使用無菌濾膜過濾來實 現(xiàn)?？芍苽涑掷m(xù)釋放制劑。持續(xù)釋放制劑的合適例子包括含有本發(fā)明蛋白質(zhì)的固體疏 水性聚合物半透性基質(zhì)，該基質(zhì)是定型產(chǎn)品的形式，例如薄膜或微膠囊。持續(xù)釋放基質(zhì)的例 子包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基_甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國 專利No. 3，773，919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸、乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、 可降解的乳酸_乙醇酸共聚物諸如LUPRON DEPOT (由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞 林構(gòu)成的可注射微球體)及聚-D-(_)-3-羥基丁酸。雖然諸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙 醇酸等聚合物能夠釋放分子達100天以上，但是某些水凝膠釋放蛋白質(zhì)的時間較短。當膠 囊化抗體或免疫偶聯(lián)物在體內(nèi)長時間維持時，它們可能因為暴露于37°C的潮濕環(huán)境而變性 或聚集，導致生物學活性的損失和可能的免疫原性改變?？梢愿鶕?jù)相關的機理來設計合理 的穩(wěn)定化策略。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集機理是經(jīng)由硫醇_ 二硫化物互換的分子間S-S鍵形成， 那么可通過修飾巰基殘基、由酸性溶液凍干、控制濕度、采用適宜添加劑和開發(fā)特定聚合物 基質(zhì)組合物來實現(xiàn)穩(wěn)定化。雖然熟練技術人員會理解每種治療劑的劑量會取決于藥劑本身，但是優(yōu)選的劑量 范圍可以是約IOmg/平方米至約2000mg/平方米、更優(yōu)選約50mg/平方米至約IOOOmg/平 方米。為了治療性應用，以藥學可接受劑量形式將多價多肽施用于受試者。它們可以靜 脈內(nèi)(作為推注或持續(xù)一段時間的連續(xù)輸注)、肌肉內(nèi)、皮下、關節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、鞘內(nèi)、口服、表面、或吸入路徑施用。蛋白質(zhì)也可以通過腫瘤內(nèi)、腫瘤周圍、病變內(nèi)、或病變周圍路徑施 用，以發(fā)揮全部以及全身治療效果。合適的藥學可接受載體、稀釋劑、和賦形劑是眾所周知 的，而且可以由本領域技術人員根據(jù)臨床情況來決定。合適的載體、稀釋劑和/或賦形劑的 例子包括(I)Dulbecco氏磷酸鹽緩沖鹽水，pH約7. 4，含有約lmg/ml至25mg/ml人血清白 蛋白；(2)0.9%鹽水(0.9% w/v NaCl)；和(3)5% (w/v)右旋糖。本發(fā)明的方法可以在體 夕卜、在體內(nèi)、或回體實施。以治療應用為目的，可以如上所述地進行多價多肽與一種或多種其他治療劑的施 用(無論是共同施用或者是順序施用)。熟練技術人員會了解，適合于共同施用的藥學可接 受載體、稀釋劑和賦形劑取決于共同施用的具體治療劑本身。在以水性劑型而非凍干劑型存在時，蛋白質(zhì)通常配制成約0. lmg/ml至100mg/ml 的濃度，但也容許在這些范圍以外廣泛變化。就疾病治療而言，多價多肽的適宜劑量將取決 于待治療疾病的類型(如上文所定義的)、疾病的嚴重程度和進程、施用抗體是出于預防目 的還是治療目的、先前療法的過程、患者的臨床史和對抗體的響應、及主治醫(yī)師的判斷等。 合適地以一次性處理或一系列處理的方式施用蛋白質(zhì)。其他專利參考文獻以下別的專利申請和專利中所記載的方法和組合物也包括在本公開內(nèi)容中 美國專利申請公開文本 No. 20050186203 ；20050084906 ；20050008642 ；20040202655 ； 20040132028 ；20030211078 ；20060083683 ；20060099205 ；20060228355 ；20040081648 ； 20040081647 ；20050074865 ；20040259155 ；20050038229 ；20050255548 ；20060246059 ； 和美國專利No. 5，707, 632 ；6, 818，418 ；和7，115，396 ；及PCT國際申請公開文本 No. W02005/085430 ；W02004/019878 ；W02004/029224 ；W02005/056764 ；W02001/064942 ；和 W02002/032925。通過提述的引證本文以提述方式將所記載的所有文件和參考文獻(包括專利文件和網(wǎng)站)個別地 引證到本文件中，如同它們完整地或部分地書面記載在本文件中一樣。序列表具有BC、DEJP FG 環(huán)(標有下劃線)的 10Fn3 (SEQ ID NO 1)VSDVPRDLEVVAATPTSLLI SWDAPAVTVR YYRITYGETGGNSPVQEFTV PGSKST AT ISGLKPGVDYTITVYAV TGRGD SPAS SKP ISINYRT385A08BC 環(huán)(SEQ ID NO 2)SffSARLKVAR385A08DE 環(huán)(SEQ ID NO 3)PKNVYT385A08FG 環(huán)(SEQ ID NO 4)TRFRDYQPV2B BC 環(huán)(SEQ ID NO 5)SffRHPHFPTRV2B DE 環(huán)(SEQ ID NO 6) PLQPPT
V2B FG 環(huán)(SEQ ID NO 7)TDGRNGRLLSIP385A08-Fn-V2B(Ser 尾)(SEQ ID NO 8)MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVD YTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKPSTSTSTVSDVPRDLEVVAATPTSLLISffRHPHFPTRYYRITYGETG GNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPSQ385A08-Fn-V2B(Cys尾)(SEQ ID NO 9)MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVD YTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKPSTSTSTVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNS PVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPCQ385A08-GS5(SEQ ID NO :21)-V2B(Ser 尾)(SEQ ID NO 10)MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVD YTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKGSGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETG GNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPSQ385A08-GS10(SEQ ID NO :22)-V2B (Ser 尾)(SEQ ID NO 11)MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVD YTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKGSGSGSGSGSGSGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTR YYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPSQV2B-Fn-385A08(Ser 尾)(SEQ ID NO 12)MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVD YTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPSTSTSTVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGET GGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKPSQ(SEQ ID NO 2)V2B-Fn-385A08(Cys尾)(SEQ ID NO 13)MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVD YTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPSTSTSTVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGET GGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKPCQV2B-GS5 (SEQ ID NO :21)-385A08 (Ser 尾)(SEQ ID NO 14)MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVD YTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKGSGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISffSARLKVARYYRITY GETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKPSQV2B-GS10(SEQ ID NO :22)-385A08 (Ser 尾)(SEQ ID NO :15)MGVSDVPRDLEVVAATPT SLLISffRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYR TEIDKGSGSGSGSGSGSGSGSGSGSVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPK NVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKPSQV2B (Ser 尾)(SEQ ID NO 16)MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVD YTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPSQ Ser 尾(SEQ ID NO : 17)EIDKPSQ
Cys 尾(SEQ ID NO :18)EIDKPCQ短尾(SEQID NO 19)EIDK 基于Fn 的接頭(SEQ ID NO 20)PSTSTSTGS5 接頭(SEQ ID NO 21)GSGSGSGSGSGS10 接頭(SEQ ID NO 22)GSGSGSGSGSGSGSGSGSGS(GGGGS) 3 (SEQ ID NO 23)GGGGS GGGGS GGGGS(GGGGS)5 (SEQ ID NO 24)GGGGS GGGGS GGGGS GGGGS GGGGSG4SG4SG3SG (SEQ ID NO 25)GGGGSGGGGSGGGSGAT577(SEQ ID NO 26)MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVD YTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKPSQAT580(SEQ ID NO 27)MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVD YTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEIDKPCQV2BShort(SEQ ID NO 28)GEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVT DGRNGRLLSIPISINYRTEIDKPCQ385A08-GPG(SEQ ID NO :32)-V2B(SEQ ID NO 29)MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISffSAR LKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTGPGVSDVPRDLE VVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSI PISINYRT385A08-GPGPGPG(SEQ ID NO :33)-V2B(SEQ ID NO 30)MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVD YTITVYAVTRFRDYQPISINYRTGPGPGPGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISffRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQE FTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRT385A08-GPGPGPGPGPG(SEQ ID NO :34)-V2B(SEQ ID NO 31)MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVD YTITVYAVTRFRDYQPISINYRTGPGPGPGPGPGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISffRHPHFPTRYYRITYGETGGNS PVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTGPG (SEQ ID NO : 32)GPGPGPG (SEQ ID NO 33)
GPGPGPGPGPG(SEQ ID NO 34)385A08 核心(SEQ ID NO 35)EVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTR FRDYQPISINYRT具有完整N端延伸(標有下劃線)的385A08核心(SEQ ID NO 36)MGVSDVPRDL EVVAATPTSLLI Sff SARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISG LKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRT具有完整N端延伸(標有下劃線)和短尾(標有下劃線)的385A08核心(SEQID NO 37) MGVSDVPRDL EVVAATPTSLLI SWSARLKVARYYRI TYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTAT ISG LKPGVDYT I TVYAVTRFRDYQP ISINYRT EIDK具有N端延伸(標有下劃線)和Ser尾(標有下劃線)的385A08核心(SEQ IDNO
38)VSD VPRDL EVVAATPTSLLI SWSARLKVARYYRI TYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTAT ISGLKP GVDYTI TVYAVTRFRDYQP ISINYRT EIDKPSQ具有N端延伸(標有下劃線)和Cys尾(標有下劃線)的385A08核心(SEQ IDNO
39)VSD VPRDL EVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRI TYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTAT ISGLKP GVDYTI TVYAVTRFRDYQP ISINYRT EIDKPCQV2B 核心(SEQ ID NO 40)EVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTD GRNGRLLSIPISINYRT具有N端延伸(標有下劃線)的V2B核心(SEQ ID NO 41)VSD VPRDL EVVAATPTSLL ISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKP GVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRT具有N端延伸(標有下劃線)和短尾(標有下劃線)的V2B核心(SEQ ID NO 42)
MGVSDVPRDL EVVAATPTSLLISffRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISG LKPGVDYT I TVYAVTDGRNGRLLS IPISINYRT EIDK具有完整N端延伸(標有下劃線)和Ser尾(標有下劃線)的V2B核心(SEQ IDNO
43)VSD VPRDL EVVAATPTSLL ISWRHPHFPTRYY RI TYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTAT ISGLKP GVDYTI TVYAVTDGRNGRLLS IPISINYRT EIDKPSQ具有完整N端延伸(標有下劃線)和Cys尾(標有下劃線)的V2B核心(SEQ IDNO
44)VSD VPRDL EVVAATPTSLL ISWRHPHFPTRYYRI TYGETGGNSPVQEFTVPLQPPTAT ISGLKP GVDYTI TVYAVTDGRNGRLLS IPISINYRT EIDKPCQ完整N 端延伸(SEQ ID NO 45)MGVSDVPRDLN 端延伸(SEQ ID NO 46)
VSDVPRDLN 端延伸(SEQ ID NO 48)GVSDVPRDLPA3 接頭(SEQ ID NO 60)PAPAPAPA6 接頭(SEQ ID NO 61)PAPAPAPAPAPAPA9 接頭(SEQ ID NO 62) PAPAPAPAPAPAPAPAPA385A08-Fn-V2B (改良 Ser 尾)(SEQ ID NO 63)MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVD YTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEPSTSTSTVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQ EFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEGSGS385A08-Fn-V2B (改良 Cys 尾)(SEQ ID NO 64)MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVD YTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEPSTSTSTVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQ EFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEGSGC385A08-PA3 (SEQ ID NO :60)_V2B (改良 Ser 尾)(SEQ ID NO 65)MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVD YTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEPAPAPAVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQE FTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEGSGS385A08-PA3 (SEQ ID NO :60)-V2B (改良 Cys 尾)(SEQ ID NO 66)MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVD YTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEPAPAPAVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGGNSPVQE FTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEGSGC385A08-PA6 (SEQ ID NO :61)_V2B (改良 Ser 尾)(SEQ ID NO 67)MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVD YTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEPAPAPAPAPAPAVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGG NSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEGSGS385A08-PA6 (SEQ ID NO :61)-V2B (改良 Cys 尾)(SEQ ID NO 68)MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVD YTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEPAPAPAPAPAPAVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRITYGETGG NSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEGSGC385A08-PA9 (SEQ ID NO :62)_V2B (改良 Ser 尾)(SEQ ID NO 69)MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVD YTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEPAPAPAPAPAPAPAPAPAVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRIT YGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEGSGS385A08-PA9 (SEQ ID NO :62)-V2B (改良 Cys 尾)(SEQ ID NO 70)MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSARLKVARYYRITYGETGGNSPVQEFTVPKNVYTATISGLKPGVDYTITVYAVTRFRDYQPISINYRTEPAPAPAPAPAPAPAPAPAVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWRHPHFPTRYYRIT YGETGGNSPVQEFTVPLQPPTATISGLKPGVDYTITVYAVTDGRNGRLLSIPISINYRTEGSGC改良Ser 尾(SEQ ID NO 71)EGSGS改良Cys 尾(SEQ ID NO 72)EGSGC
實施例 現(xiàn)在參考以下實施例來描述本發(fā)明，實施例只是例示性的，并非意圖限制本發(fā)明。 雖然上文中已經(jīng)結(jié)合具體實施方案詳細地描述了本發(fā)明，但對本領域技術人員顯然能夠想 到可以進行各種變化和修飾而不背離本發(fā)明的精神和范圍。實施例1 多價纖連蛋白支架結(jié)構(gòu)域蛋白，包括數(shù)個基于VAkiFM的結(jié)合物。生成了多價纖連蛋白支架結(jié)構(gòu)域蛋白的多種構(gòu)建物。下表給出的是本文所述的構(gòu) 建物及其SEQ ID NO。
權利要求
1.一種多肽，包含(a)N端結(jié)構(gòu)域，其包含第一纖連蛋白III型第10結(jié)構(gòu)域(kiFM)，其中所述1(1而3結(jié)構(gòu) 域(i)包含環(huán)AB、環(huán)BC、環(huán)⑶、環(huán)DE、環(huán)EF、和環(huán)FG ;(ii)選自環(huán)BC、DE和FG中的至少一 個環(huán)相對于人1Vr^結(jié)構(gòu)域的相應環(huán)的序列具有改變的氨基酸序列；(iii)包含與SEQ ID NO 1至少60%相同的氨基酸序列；且(iv)以小于500nM的Kd結(jié)合第一靶物分子；(b)C端結(jié)構(gòu)域，其包含第二纖連蛋白III型第10結(jié)構(gòu)域(kiFM)，其中所述1(1而3結(jié)構(gòu) 域(i)包含環(huán)AB、環(huán)BC、環(huán)⑶、環(huán)DE、環(huán)EF、和環(huán)FG ;(ii)選自環(huán)BC、DE和FG中的至少一 個環(huán)相對于人lc^n3結(jié)構(gòu)域的相應環(huán)的序列具有改變的氨基酸序列；(iii)包含與氨基酸序 列SEQ ID NO 1至少60%相同的氨基酸序列；且(iv)以小于500nM的Kd結(jié)合第二靶物分 子；其中所述第一和第二 1(1而3結(jié)構(gòu)域是藉由選自下列的多肽連接的基于甘氨酸-絲氨酸 的接頭，基于甘氨酸-脯氨酸的接頭，或氨基酸序列SEQ ID N0:20。
2.權利要求1的多肽，其中所述第一kiFM結(jié)構(gòu)域以小于IOOmM的Kd結(jié)合第一靶物分 子，且所述第二 kiFM結(jié)構(gòu)域以小于IOOmM的Kd結(jié)合第二靶物分子。
3.權利要求1或2的多肽，其中所述第一和第二1(1而3結(jié)構(gòu)域的環(huán)BC和環(huán)TO相對于 人wFM結(jié)構(gòu)域的相應環(huán)的序列具有改變的氨基酸序列。
4.權利要求1-3中任一項的多肽，其中所述第一結(jié)構(gòu)域在其C端連接于氨基酸 序列 SEQ ID NO :19ο
5.權利要求1-4中任一項的多肽，其中所述第二結(jié)構(gòu)域在其C端連接于氨基酸 序列 SEQ ID NO 17 或 18。
6.權利要求1的多肽，其選自⑴包含SEQ ID NO 8-15和29-31中任一氨基酸序列的多肽；和(ii)包含與SEQ ID NO :8_15和四_31中任一氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列 的多肽。
7.權利要求1-6中任一項的多肽，進一步包含一個或多個選自下列的藥動學(PK)模 塊聚氧化烯模塊、人血清白蛋白結(jié)合蛋白、唾液酸、人血清白蛋白、IgG、IgG結(jié)合蛋白、運 鐵蛋白、和Fc片段。
8.權利要求7的多肽，其中所述1 模塊是聚氧化烯模塊，且所述聚氧化烯模塊是聚乙
9.權利要求7的多肽，其中所述1 模塊和所述多肽是藉由至少一個二硫鍵、肽鍵、多 肽、聚合糖、或聚乙二醇模塊連接的。
10.權利要求1-5或7-9中任一項的多肽，其中所述第一和第二靶物分子是相同的。
11.權利要求1-9中任一項的多肽，其中所述第一和第二靶物分子是不同的。
12.權利要求1-9或11任一項的多肽，其中所述第一靶物分子是IGF-IR，且所述第二 靶物分子是VEGFR2。
13.權利要求1-9或11任一項的多肽，其中所述第一靶物分子是VEGFR2，且所述第二 靶物分子是IGF-IR。
14.權利要求1-13中任一項的多肽，其中所述多肽已經(jīng)過去免疫而消除了一個或多個 T細胞表位。
15.權利要求1-14中任一項的多肽，其中所述第一和第二1(1而3結(jié)構(gòu)域是藉由基于甘 氨酸-絲氨酸的接頭連接的。
16.權利要求15的多肽，其中所述基于甘氨酸-絲氨酸的接頭選自氨基酸序列SEQID NO 21 禾口 22。
17.權利要求1-16任一項的多肽，其中所述第一和第二1(1而3結(jié)構(gòu)域是通過包括下述步 驟的方法選擇的a)生成一群候選RNA分子，它們各自包含與人1(ι ^3結(jié)構(gòu)域編碼序列不同 的候選1(^n3結(jié)構(gòu)域序列，所述RNA分子各自包含可操作連接于所述候選wFM結(jié)構(gòu)域編碼 序列的翻譯起始序列和起始密碼子且各自可操作連接于3'末端的核酸-嘌呤霉素接頭； b)在體外翻譯所述候選結(jié)構(gòu)域編碼序列以生成一群候選RNA-1(^n3融合物；c)使所 述一群候選RNA-1(^n3融合物與靶物分子接觸；并d)選擇這樣的RNA-wFM融合物，其蛋白 質(zhì)部分對所述靶物分子的結(jié)合親和力或特異性相對于所述人1Vr^對所述靶物分子的結(jié)合 親和力或特異性有所改變。
18.—種包含權利要求1-17中任一項的多肽的藥學可接受組合物，其中所述組合物基 本上不含內(nèi)毒素。
19.權利要求1-14任一項的多肽，其中所述第一和第二1(1而3結(jié)構(gòu)域是藉由基于甘氨 酸-脯氨酸的接頭連接的。
20.權利要求19的多肽，其中所述基于甘氨酸-脯氨酸的接頭選自氨基酸序列SEQID NO :32，33，和 34。
21.一種多肽，包含(a)N端結(jié)構(gòu)域，其包含第一纖連蛋白III型第10結(jié)構(gòu)域(kiFM)，其中所述1(1而3結(jié)構(gòu) 域(i)包含環(huán)AB、環(huán)BC、環(huán)⑶、環(huán)DE、環(huán)EF、和環(huán)FG ;(ii)選自環(huán)BC、DE和FG中的至少一 個環(huán)相對于人1Vr^結(jié)構(gòu)域的相應環(huán)的序列具有改變的氨基酸序列；(iii)包含與SEQ ID NO 1至少60%相同的氨基酸序列；且(iv)以小于500nM的Kd結(jié)合第一靶物分子；(b)C端結(jié)構(gòu)域，其包含第二纖連蛋白III型第10結(jié)構(gòu)域(kiFM)，其中所述1(1而3結(jié)構(gòu) 域(i)包含環(huán)AB、環(huán)BC、環(huán)⑶、環(huán)DE、環(huán)EF、和環(huán)FG ;(ii)選自環(huán)BC、DE和FG中的至少一 個環(huán)相對于人lc^n3結(jié)構(gòu)域的相應環(huán)的序列具有改變的氨基酸序列；(iii)包含與氨基酸序 列SEQ ID NO 1至少60%相同的氨基酸序列；且(iv)以小于500nM的Kd結(jié)合第二靶物分 子；其中所述第一和第二 1(^n3結(jié)構(gòu)域是藉由基于脯氨酸-丙氨酸的多肽接頭連接的。
22.權利要求20的多肽，選自⑴包含SEQ ID NO 63-70中任一氨基酸序列的多肽；和(ii)包含與SEQ ID NO :63-70中任一氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列的多肽。
23.權利要求21的多肽，其中所述第一靶物分子是IGF-IR且所述第二靶物分子是 VEGFR2。
24.權利要求21的多肽，其中所述第一靶物分子是VEGFR2且所述第二靶物分子是 IGF-IR0
全文摘要
本發(fā)明涉及包含至少兩個藉由多肽接頭連接的纖連蛋白支架結(jié)構(gòu)域的多價多肽。本發(fā)明還涉及供診斷、研究和治療應用中使用的多價多肽。本發(fā)明進一步涉及包含此類蛋白質(zhì)的細胞、編碼此類蛋白質(zhì)或其片段的多核苷酸、及包含編碼該新蛋白質(zhì)的多核苷酸的載體。
文檔編號C07K14/78GK102099373SQ200980127966
公開日2011年6月15日 申請日期2009年5月21日 優(yōu)先權日2008年5月22日
發(fā)明者H.N.馬什, 埃里克.普法恩, 歐維思.M.卡瓦杰爾, 理卡多.M.阿塔, 瓊.卡博尼, 雷.坎普豪森, 馬科.M.戈塔迪斯 申請人:百時美施貴寶公司