專利名稱：用于治療內(nèi)毒素介導的促炎反應的整聯(lián)蛋白肽、抗-CD18 βA抗體及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開涉及用于治療內(nèi)毒素介導的促炎反應的方法和組合物，更具體地涉及急性腹膜炎和膿毒病病狀的治療。公開了人工單鏈抗-⑶18 β A抗體(抗-⑶18 β A)和新型整聯(lián)蛋白肽在治療內(nèi)毒素介導的促炎反應中的用途。
背景技術(shù)：
患有急性膿毒病的病?；颊哂兴劳龅闹苯语L險。對這些患者的當前處理方法依賴于使用皮質(zhì)類固醇、抗生素、流體復蘇(fluidresuscitation)和對衰竭器官的支持性護理。然而，這些介入對于實現(xiàn)100%保護患者免于器官衰竭和死亡不夠有效。重度膿毒病患者的死亡率為約50%，并且如果發(fā)生膿毒性休克則可達到90%。細菌脂多糖(LPS)為細菌細胞壁細胞外膜的結(jié)構(gòu)組分。一旦被釋放到循環(huán)中，游離且具有生物活性的LPS分子刺激單核細胞釋放促炎細胞因子。這些細胞因子的控釋和局部釋放有助于宿主免疫系統(tǒng)引發(fā)促炎反應以清除入侵的病原菌。然而，在對難以抵御的嚴重細菌感染的應答中，不受限制地廣泛釋放促炎細胞因子可導致凝血系統(tǒng)和白細胞介導的反應的有害活化，這最終導致多器官衰竭，甚至死亡。凝血的過度活化導致血栓形成、組織缺氧和壞死。同時，還刺激炎性白細胞的外滲和組織浸潤。浸潤的白細胞通過許多不同細胞機理如產(chǎn)生損傷質(zhì)膜的活性氧物質(zhì)引起組織損傷。根據(jù)當前對膿毒病發(fā)病機理的認識，能通過阻斷初始LPS對宿主免疫系統(tǒng)的刺激和/或白細胞浸潤至組織中而減少促炎細胞因子的釋放的治療劑，可能有利于急性膿毒病患者的存活。因此，在急救室中存在對用于治療患有急性腹膜炎和膿毒病的病?；颊叩钠渌煼ǖ男枨蟆０l(fā)明概述本發(fā)明涉及治療內(nèi)毒素介導的促炎反應的方法，以及新型治療劑和這些藥劑在例如治療炎癥的不利作用中的用途，所述炎癥不利作用包括可在膿毒病患者中出現(xiàn)的嚴重組織損傷。白細胞β 2整聯(lián)蛋白被認為充當介導促炎反應的LPS的受體。白細胞β 2整聯(lián)蛋白為異二聚體，其中β亞基(⑶18)與至少四個不同α亞基(⑶11a、⑶lib、⑶Ilc和⑶lid) 配對。本文公開了新型整聯(lián)蛋白肽和抗-⑶18 β A SCFv抗體，其可用作對抗與由內(nèi)毒素包括LPS引起的炎癥有關(guān)的不利作用包括死亡的治療劑。 在具體實施方案中，本發(fā)明涉及整聯(lián)蛋白肽和/或抗-CD18 β AscFv在針對急性膿毒病保護動物包括人中的用途。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供靶向⑶18βΑ域的單鏈抗體(抗-βΑ域 ScFv)。與常規(guī)治療性抗體相比，本發(fā)明的kFv分子為包含用柔性接頭連接在一起的輕鏈和重鏈的可變區(qū)但沒有恒定區(qū)(Fe)的抗體。不存在恒定區(qū)允許較好的組織滲透性、較小的免疫原性和較高的特異性。在另一個實施方案中，整聯(lián)蛋白肽能消減內(nèi)毒素在循環(huán)中的生物活性。此外，單獨給予或以聯(lián)合方案給予整聯(lián)蛋白肽和抗-CD18 β AscFv，可用于阻抑促炎細胞因子釋放、粘附分子表達和白細胞浸潤至組織中。本發(fā)明的另一個實施方案為用于篩選可抑制或改善內(nèi)毒素介導的促炎反應的化合物的方法，其包括評估候選化合物結(jié)合CD18 β A域的親合力。在相關(guān)方法中，通過使用競爭性結(jié)合測定法并評估候選化合物對結(jié)合至CD18 β A域的抗-CD18 β AscFv或其保守變體或片段的置換作用進行評估。在其它相關(guān)方法中，CD18 β A域為βΑ266_318。優(yōu)選的候選物將被觀察到具有與本發(fā)明的抗-⑶18 β AscFv相等或更優(yōu)的對⑶18 β A域的結(jié)合特異性。本發(fā)明的又一個方面為在體外或體內(nèi)抑制LPS結(jié)合至⑶18 β A域。在相關(guān)方法中， 通過給予整聯(lián)蛋白肽、抗-⑶18 β A或兩者的組合實現(xiàn)抑制。本發(fā)明的其它實施方案包括編碼整聯(lián)蛋白肽、抗-⑶18 β A和其片段的分離多核苷酸，所述片段足以保持具有SEQ ID NO. 1和SEQ IDN0. 3序列的肽抑制LPS結(jié)合至⑶18 β A 的特性。這種片段容易并常規(guī)地通過例如使用用于從起始多核苷酸的末端進行控時限制性消化的Bal31核酸外切酶產(chǎn)生。附圖簡述圖IA顯示本發(fā)明實施方案的整聯(lián)蛋白肽的氨基酸序列(SEQ IDN0. 1)。圖IB為多肽序列(SEQ ID NO. 1)和整聯(lián)蛋白肽的計算機模擬(insilico)模型的圖示。整聯(lián)蛋白肽的螺旋排列通過所示的螺旋輪圖描述。該螺旋表明兩親性螺旋的特征。圖2為選自scFv cDNA文庫的抗-CD18 β A scFv多肽序列(SEQ IDN0. 3)的圖示， 所述文庫通過本發(fā)明實施方案的噬菌體展示。加下劃線的為根據(jù)KcAat氏算法預測的抗體的互補決定區(qū)(CDR)。免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域，分別命名為Vh和八，其通過接頭連接成抗-⑶18 β A scFv.接頭由三個(Gly)4Ser重復單元組成。在抗-⑶18 β A scFv (SEQ ID NO. 3)的C末端，連接著13個氨基酸-肽E標記。圖3為用㈧整聯(lián)蛋白肽、⑶抗-⑶18 β A scFv和(C)聯(lián)合方案治療的施以CLP 小鼠的存活分析結(jié)果的圖示。圖4為在循環(huán)中整聯(lián)蛋白肽對內(nèi)毒素生物活性的影響的血清學分析結(jié)果的圖示， 該分析使用鱟變形細胞溶解物(LAL)顯色測定進行。圖5為整聯(lián)蛋白肽、抗-⑶18β A scFv和聯(lián)合方案對施以CLP小鼠的(A)TNF_a 和(B) IL-6血清水平的影響的血清學分析結(jié)果的圖示。圖6為整聯(lián)蛋白肽、抗-⑶18 β A scFv和聯(lián)合方案對白細胞浸潤至施以CLP小鼠的㈧肺和⑶肝中的影響的CD3mRNA實時PCR結(jié)果的圖示。圖7為整聯(lián)蛋白肽、抗-⑶18βΑ scFv和聯(lián)合方案對細胞間粘附分子(ICAM)-I在施以CLP小鼠的肝中表達的影響的表達分析結(jié)果的圖示。
圖8為整聯(lián)蛋白肽對VCAM和E-選擇蛋白在施以CLP小鼠的肺中表達的影響的免疫組織化學分析結(jié)果的圖示。圖9為整聯(lián)蛋白肽對壞死性小腸結(jié)腸炎模型大鼠的㈧TNF- α和⑶IL_6血清水平的影響的血清學分析的圖示。

圖10為整聯(lián)蛋白肽對壞死性小腸結(jié)腸炎大鼠的⑶14、TLR4和MD_2的mRNA表達的影響的實時PCR分析的圖示。序列簡述SEQ ID NOSEQ ID NOSEQ ID NOSEQ ID NOSEQ ID NOSEQ ID NOSEQ ID NOSEQ ID NOSEQ ID NOSEQ ID NOSEQ ID NOSEQ ID NO發(fā)明詳述本發(fā)明涉及新型治療劑以及這些藥劑在例如治療炎癥的不利作用包括可在膿毒病患者中出現(xiàn)的嚴重組織損傷中的用途。術(shù)語“處理”和“治療”在本文中可交換地使用，并且如本文中所用的包括預防性和響應性治療兩方面，可為急性短期或慢性長期，并且表示抑制或改善患者中的炎性反應或免疫應答?！盎颊摺卑▌游铮ú溉閯游锖腿祟?。“改善”或“改進”表示減輕接受治療的患者中的炎性反應或免疫應答病癥的有害作用。術(shù)語“治療有效的”意指所使用的治療劑(整聯(lián)蛋白肽、抗_CD18i3A scFv或其組合)的量為足以抑制或改善炎性反應或免疫應答的癥狀的量。本發(fā)明的某些實施方案涉及具有對⑶18 β A域抗原的親和力的單鏈抗體(抗-β A 域^^力。與常規(guī)治療性抗體相比，^Fv抗體的實施方案包含在單條多肽序列中而不是在兩條獨立多肽序列的組成部分中用柔性接頭連接在一起的輕鏈和重鏈的可變區(qū)，沒有恒定區(qū)(Fe)。不存在恒定區(qū)允許較好的組織滲透性、較低的免疫原性和較高的特異性。在一個實施方案中，整聯(lián)蛋白肽能消減內(nèi)毒素在血液和其它體液循環(huán)中的生物活性。另外，如下文所論述的，單獨給予或與整聯(lián)蛋白肽聯(lián)合給予抗-CD18 β A scFv，可用于阻抑促炎細胞因子釋放、粘附分子表達和白細胞浸潤至組織中。本發(fā)明的另一個實施方案為用于篩選可抑制或改善內(nèi)毒素介導的促炎反應的化合物的方法，其包括評估候選化合物結(jié)合CD18 β A域的親合力。在相關(guān)方法中，通過使用競爭性結(jié)合測定法并評估候選化合物對結(jié)合至CD18 β A域的抗-CD18 β AscFv或其保守變體或片段的置換作用進行評估。
.1為整聯(lián)蛋白肽的多肽序列。 .2為編碼整聯(lián)蛋白肽的多核苷酸序列。 .3為抗-CD18 β A scFv的多肽序列。 .4為抗-CD18 β A scFv的核苷酸序列。 .5為抗-⑶18 β A scFv的Vh-衍生區(qū)的多肽序列。 .6為抗-⑶18 β A scFv的衍生區(qū)的多肽序列。 .7為抗CD18 β A scFv的CDR的多肽序列。 .8為抗CD18 β A scFv的CDR的多肽序列。 .9為抗CD18 β A scFv的CDR的多肽序列。 .10為抗CD18 β A scFv的CDR的多肽序列。 .11為抗CD18 β A scFv的CDR的多肽序列。 .12為抗CD18 β A scFv的CDR的多肽序列。
在其它相關(guān)方法中，CD18 β A域至少由人CD18 β A域的殘基266-318 ( β Α266-318) (SEQ ID NO. 7)組成。優(yōu)選的候選物將被觀察到具有與本發(fā)明的抗-⑶18 β A scFv相等或更優(yōu)的對⑶18 β A域的結(jié)合特異性。本發(fā)明的又一個方面為在體外或體內(nèi)抑制LPS結(jié)合至⑶18 β A域。在相關(guān)方法中， 通過給予整聯(lián)蛋白肽、抗-⑶18 β A scFv或兩者的組合實現(xiàn)抑制。本發(fā)明的其它實施方案包括編碼整聯(lián)蛋白肽、抗-⑶18 β A和其片段的分離多核苷酸，所述片段足以保持具有SEQ ID NO. 1和SEQ IDN0. 2序列的肽抑制LPS結(jié)合至⑶18 β A 的特性。這種片段容易且常規(guī)地通過例如使用用于從起始多核苷酸的末端進行控時限制性消化的Bal31核酸外切酶產(chǎn)生。本發(fā)明的某些實施方案涉及整聯(lián)蛋白肽，其可重組制備，其氨基酸序列來源于 ⑶18 β A域上的LPS結(jié)合位點中的一個。換言之，整聯(lián)蛋白肽來源于⑶18 β A受體蛋白區(qū)， 該受體蛋白已鑒定為具有對LPS的親和力。整聯(lián)蛋白肽容易結(jié)合LPS，并且在體外拮抗LPS 作用?？?⑶18βΑ scFv為可變片段，其可重組制備，其表位位于⑶18βΑ域中。 抗-⑶18 β A scFv識別呈靜息構(gòu)象和活性構(gòu)象的哺乳動物整聯(lián)蛋白。本發(fā)明治療劑的給藥劑量范圍足夠大以至于產(chǎn)生所需效果，其中內(nèi)毒素介導病癥的癥狀得以治愈。劑量不應太大以致于引起不利的副作用，例如不合乎需要的交叉反應、過敏性反應等。一般而言，劑量隨著年齡、狀況、性別和患者中癥狀的程度而變化，并可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。劑量可由個別醫(yī)師在發(fā)生任何禁忌癥(counter indication)的情況下作調(diào)整。劑量取決于被治療的特定內(nèi)毒素介導的病癥，并可由具有治療這些病癥的普通技術(shù)的醫(yī)師使用已知劑量調(diào)整技術(shù)容易地確定。劑量通常在對治療性化合物已建立的治療窗之內(nèi)，這在使另外的發(fā)病率和死亡率最小化的同時提供療效。通常，治療性化合物以每劑 0. OOlmg/kg-約100mg/kg，優(yōu)選0. l_20mg/kg的劑量范圍給予。約0. 5_5mg/kg的優(yōu)選劑量尤其可用于含本文公開的治療劑的化合物，以每天給予一劑或多劑，持續(xù)一天或數(shù)天。本文所述的任何組合物可配制用于藥理學上或治療性給予哺乳動物或更優(yōu)選給予人。因此，組合物可包含在藥學上可接受的載體中。肽活性劑的優(yōu)選給藥模式為通過靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下注射。給藥的其它途徑也是可能的，也包括在本公開內(nèi)容的范圍之內(nèi)。組合物可經(jīng)胃腸外給予或腹膜內(nèi)給予。作為游離堿或藥理可接受鹽的活性化合物的溶液劑可在水中與表面活性劑例如羥基丙基纖維素適當混合而制備。分散劑 (dispersion)也可在甘油、液態(tài)聚乙二醇和其混合物中以及油類中制備。在普通條件下儲存和使用時，這些制劑包含防腐劑以防止微生物的生長。定義術(shù)語“變體”多肽或多核苷酸在本文中是指由于在親本序列中的一個或多個氨基酸殘基的插入、缺失和/或置換而與“親本”多肽或多核苷酸序列在氨基酸或核苷酸序列上不同的分子。變體多肽或多核苷酸具有與親本多肽或多核苷酸類似或相同的功能。變體多肽具有與親本多肽類似的氨基酸序列，并符合以下中的至少一種具有同一性為至少約 40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%和至少約98 %中的一種或多種和/或被保守取代的氨基酸序列的多肽。變體多核苷酸具有與親本多核苷酸類似的氨基酸序列，并符合以下中的至少一種(i)變體核苷酸序列編碼的多肽與親本多肽具有至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%和至少約98%中的一種或多種的同一性；或(ii)變體多核苷酸序列在如本文中定義的嚴格條件下與親本多核苷酸序列雜交?！胺蛛x的”核酸分子為與所述核酸分子的天然來源中存在的其它核酸分子分離的核酸分子。此外，“分離的”核酸分子，例如cDNA分子，可基本不含其它胞內(nèi)物質(zhì)或培養(yǎng)基 (當通過重組技術(shù)制備時)，或者基本不含化學前體或其它化學物質(zhì)(當化學合成時)，但不包括存在于重組DNA文庫中的核酸分子。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，編碼本發(fā)明的多肽 /蛋白的核酸分子為分離的或純化的。術(shù)語“在嚴格條件下”是指雜交和洗滌條件，在該條件下相互具有同源性的核酸序列保持相互雜交。這種雜交條件描述于例如但不限于Current Protocols in Molecular Biology (分子生物學中的現(xiàn)有方案)，John Wiley 和 Sons, N. Y. (1989),6. 3. 1-6.3.6 ； Basic Methods inMolecular Biology(分子生物學中的基本方法)，Elsevier SciencePublishing Co.，Inc.，N. Y. (1986)，第 75-78 頁和 84-87 頁；以及 Molecular Cloning (分子克隆)，Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. (1982)，第 387-389 頁，并且為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。嚴格雜交條件的非限制性優(yōu)選實例為在約68°C下于6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)，0. 5% SDS中雜交，接著在室溫下于2XSSC，0.5% SDS中洗滌一次或多次。嚴格雜交條件的另一個非限制性優(yōu)選實例為在約45°C下于6 X SSC中雜交，接著在約 50-65°C下于0.2XSSC，0. 1% SDS中洗滌一次或多次。氨基酸殘基的“保守性取代”或“保守取代”是指用具有類似化學性質(zhì)和/或物理性質(zhì)的氨基酸殘基取代親本多肽中的氨基酸殘基以形成變體多肽。氨基酸殘基可屬于以下10個化學組別中的任一個，其中用來自同一個化學組別的另一種氨基酸殘基取代任何氨基酸殘基為保守取代(1)酸性(帶負電荷的) 氨基酸例如天冬氨酸和谷氨酸；( 堿性(帶正電荷的)氨基酸例如精氨酸、組氨酸和賴氨酸；C3)中性極性氨基酸例如甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)中性非極性(疏水)氨基酸例如丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；( 具有脂族側(cè)鏈的氨基酸例如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；(6)具有脂族羥基側(cè)鏈的氨基酸例如絲氨酸和蘇氨酸；(7)具有含酰胺側(cè)鏈的氨基酸例如天冬酰胺和谷氨酰胺；(8)具有芳族側(cè)鏈的氨基酸例如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(9)具有堿性側(cè)鏈的氨基酸例如賴氨酸、精氨酸和組氨酸；(10)具有含硫側(cè)鏈的氨基酸例如半胱氨酸和甲硫氨酸。本文所用“藥學上可接受的載體”包括任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和延緩吸收劑等。這種介質(zhì)和制劑在藥物活性物質(zhì)中的應用為本領(lǐng)域所熟知。除非任何常規(guī)介質(zhì)或制劑與活性成分不相容，否則預期了其在治療性組合物中的用途。附加的活性成分也可加入到組合物中。本發(fā)明的實施方案本文公開的抗-⑶18 β A scFv抗體和整聯(lián)蛋白肽都是以下多肽其可作為本文中公開的特定序列或本文公開序列的變體的形式。多肽可以中性或鹽的形式配制成組合物。 藥學上可接受的鹽包括酸加成鹽(與游離氨基形成的鹽)，其用無機酸例如鹽酸或磷酸形成，或用有機酸例如乙酸、草酸、酒石酸、苦杏仁酸等形成。與游離羧基形成的鹽還可衍生自無機堿，例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵，以及有機堿，例如異丙胺、三甲胺、組氨酸、普魯卡因等。用于胃腸外給藥的制劑包括無菌水性或非水性溶液劑、混懸劑和乳劑。非水性溶劑的實例為丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄欖油以及注射用有機酯例如油酸乙酯。水性載體包括水、醇/水溶液劑、乳劑或混懸劑，包括鹽水和緩沖介質(zhì)。胃腸外載體包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉、乳酸林格氏液或不揮發(fā)性油。靜脈內(nèi)載體包括液體和營養(yǎng)補充劑、電解質(zhì)補充劑(例如基于林格氏葡萄糖的補充劑)等。還可存在防腐劑和其它添加劑，例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體等。本發(fā)明還涉及用于制備包含本發(fā)明的治療劑的藥物或藥物組合物的方法，所述藥物組合物用于治療內(nèi)毒素介導的促炎反應和所產(chǎn)生的病癥。這兩種新型藥劑抗-⑶18 β A scFv和整聯(lián)蛋白肽的治療效果已在熟知的鼠盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)模型中評估。發(fā)現(xiàn)整聯(lián)蛋白肽能消減內(nèi)毒素在循環(huán)中的生物活性。研究表明整聯(lián)蛋白肽、抗-⑶18 β A scFv以及整聯(lián)蛋白肽和抗-⑶18 β A scFv的聯(lián)合方案能阻抑腹膜炎誘導的促炎細胞因子釋放和ICAM-I在肝中的表達。整聯(lián)蛋白肽還能阻抑VCAM和E-選擇蛋白在施以CLP小鼠的肺中的表達。還發(fā)現(xiàn)用這些新型治療法的治療減少了白細胞在肺和肝中的浸潤。整聯(lián)蛋白肽的治療效果除在CLP模型中之外，還已在良好建立的壞死性小腸結(jié)腸炎(NEC)的大鼠模型中檢驗。在大鼠NEC模型中，由灌輸至大鼠空腸的細菌LPS誘導超炎性反應(super-inflammatoryresponse)。整聯(lián)蛋白肽能阻抑NEC誘導的促炎細胞因子釋放和先天免疫組分(包括TLR4、⑶H和MD-2)的表達。在某些實施方案中，本發(fā)明涉及新型治療劑，其具有提高有急性膿毒病風險或患有急性膿毒病的人患者的存活率的能力。A.整聯(lián)蛋白肽LPS結(jié)合至其細胞受體引發(fā)促炎信號級聯(lián)放大。病原體相關(guān)性分子圖式(PAMP)， 包括LPS，由稱為toll樣受體(TLR)的受體家族識別。TLR4識別LPS，而LPS結(jié)合至TLR4 導致由各種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子介導的信號傳導途徑的活化。核因子- κ B為眾多重要的調(diào)控因子之一，其從細胞質(zhì)易位至細胞核中可導致許多促炎細胞因子包括TNF-α的轉(zhuǎn)錄。為了減少或中斷促炎細胞因子的產(chǎn)生，已制備出企圖阻斷LPS結(jié)合到TLR4上的實驗藥劑。已通過對實驗動物和膿毒病患者的許多研究來評估其保護效能。然而，很少實驗藥劑產(chǎn)生令人滿意的保護作用。成功例子有限的潛在原因尚未明確認識。盡管如此，非人類來源的這些抗體和拮抗劑的免疫原性可能引起免疫反應，這可能導致不良的臨床表現(xiàn)如過敏反應。從實踐的角度來看，使用來源于人蛋白的制品為有利的，因為其防止副作用，例如由免疫應答引起的過敏反應。因此，本發(fā)明提出整聯(lián)蛋白肽，其具有來源于人白細胞整聯(lián)蛋白的⑶18βΑ域上的LPS結(jié)合位點的序列。白細胞整聯(lián)蛋白(⑶11/⑶18)，稱為β 2整聯(lián)蛋白，為細菌LPS的受體。我們最近在CD18抗原上的表位分析揭示了兩個LPS結(jié)合位點，其位于殘基216-248和266-318。因而，將這兩個結(jié)合位點稱為β Α216_248和β Α266_318。參見 Wong等(2007), FASEB J.，第21卷，3231-3239，其通過引用結(jié)合于本文中。隨后制備了這兩個結(jié)合位點的多肽序列的兩種重組肽，而且發(fā)現(xiàn)來源于β A266_3W的重組肽(整聯(lián)蛋白肽)在體外有效抑制LPS對人淋巴母細胞細胞系(Jurkat細胞)的作用。在一個實施方案中，整聯(lián)蛋白肽包含SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 1的變體。在一個實施方案中，SEQ ID NO. 1的變體具有與SEQ ID NO. 1的約70%或更多的同一性和/或保守取代。在另一個實施方案中，SEQID NO. 1的變體具有與SEQ ID NO. 1的約80%或更多的同一性和/或保守取代。在又一個實施方案中，SEQ ID NO. 1的變體具有與SEQ IDN0. 1 的約90%或更多的同一性和/或保守取代。在再一個實施方案中，SEQ ID NO. 1的變體具有與SEQ ID NO. 1的約95%或更多的同一性和/或保守取代。B.抗-CD18PA scFv白細胞整聯(lián)蛋白，其中共同的⑶18抗原與至少4個不同的⑶11抗原配對，促進炎性白細胞的滲出和遷移至組織中。為促進移動，整聯(lián)蛋白與不同的細胞粘附分子相互作用。 白細胞整聯(lián)蛋白的主要結(jié)合配體為細胞間粘附分子(ICAM)。據(jù)此，破壞整聯(lián)蛋白與ICAM之間的相互作用的任何拮抗劑很可能減少浸潤過程，從而導致在膿毒病期間組織損傷較少。在本文之中，通過常規(guī)雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生特異性靶向白細胞整聯(lián)蛋白的CDll或 CD18抗原的單克隆抗體，并初次嘗試阻斷整聯(lián)蛋白與ICAM相互作用。盡管據(jù)報道在實驗動物和患者中降低膿毒病的嚴重程度，但這些單克隆抗體的藥代動力學確實受到恒定區(qū)(Fe) 的存在所限制。存在Fc使得抗體具有約150kDa的分子量，該高分子量足以阻礙抗體的有效組織滲透。此外，F(xiàn)c與其全身分布的相應受體之間的相互作用可導致治療性抗體不理想的生物分布(biodistribution)。更為重要的是，F(xiàn)c對患者可為免疫原性的，引起不良臨床后果。為了減少炎性白細胞浸潤至組織中以及防止出現(xiàn)使用常規(guī)治療性抗體時遇到的普遍問題，本發(fā)明開發(fā)了靶向⑶18βΑ域的單鏈抗體(scFy)的應用。所述scFv包含由接頭連接的重鏈和輕鏈的抗原結(jié)合位點(\和VJ，并且不存在Fc部分。scFv相對低的分子量使得其有效滲透至組織中。免疫原性和不理想的生物分布的問題也解決了。本發(fā)明制備的scFv靶向白細胞CD18i3A域。許多功能性研究和位點定向誘變研究已表明，CD18 β A域在配體識別方面對整聯(lián)蛋白與粘附分子之間的相互作用為重要的。據(jù)此，已產(chǎn)生以高親合力結(jié)合至⑶18 β A域的scFv。構(gòu)建了由編碼scFv的cDNA片段群體組成的噬菌體展示文庫。在三輪淘選(panning)之后，最終選出高親合力的克隆?？筥CD18i3A scFv的結(jié)合特性通過免疫沉淀反應證實，而且對抗-⑶18 β A scFv與不同的人淋巴母細胞系結(jié)合的FASC分析表明，抗-⑶18 β AscFv能結(jié)合呈靜息構(gòu)象和活性構(gòu)象的整聯(lián)蛋白。抗-⑶18 β A scFv抗體的結(jié)構(gòu)作為單條多肽鏈示于圖2中?？?⑶18 β A scFv抗體包含存在至少以下三種氨基酸序列的多肽鏈i)來源于Vh結(jié)構(gòu)域的序列(SEQ ID N0. 5)； )柔性接頭序列；以及iii)來源于\結(jié)構(gòu)域的序列(SEQ ID N0. 6)。來源于Vh結(jié)構(gòu)域的序列相對于來源于\結(jié)構(gòu)域的序列位于抗-CD18 β A scFv抗體的N端，其中柔性接頭序列介于Vh結(jié)構(gòu)域序列與八結(jié)構(gòu)域序列之間。認為柔性接頭序列的確切身份(identity)不是關(guān)鍵的。在一個實施方案中，接頭序列具有約60%或更多的甘氨酸殘基。在另一個實施方案中，接頭序列具有約75%或更多的甘氨酸殘基。在一個實施方案中，接頭序列為兩個或更多個Gly-Gly-Gly-Gly-Ser重復單元。在一個實施方案中，接頭序列長度為約8-約25個殘基。抗-CD18 0A scFv抗體包含SEQ ID N0. 5或SEQ ID N0. 5的變體，其中術(shù)語“變體In上文所定義。在一個實施方案中，SEQ ID NO. 5的變體具有與SEQ ID NO. 5的約70% 或更多的同一性和/或保守取代。在另一個實施方案，SEQ ID NO. 5的變體具有與SEQ ID NO. 5的約80%或更多的同一性和/或保守取代。在又一個實施方案中，SEQID NO. 5的變體具有與SEQ ID NO. 5的約90%或更多的同一性和/或保守取代。在再一個實施方案中， SEQ ID NO. 5的變體具有與SEQ IDN0. 5的約95%或更多的同一性和/或保守取代。此外，抗-CD18 0A scFv抗體包含SEQ ID N0. 6或SEQ ID N0. 6的變體，其中術(shù)語“變體”如上文所定義。在一個實施方案中，SEQ IDN0. 6的變體具有與SEQ ID N0. 6的約70%或更多的同一性和/或保守取代。在另一個實施方案中，SEQ ID N0. 6的變體具有與SEQ ID W). 6的約80%或更多的同一性和/或保守取代。在又一個實施方案中，SEQID N0. 6的變體具有與SEQ ID N0. 6的約90%或更多的同一性和/或保守取代。在再一個實施方案中，SEQ ID N0. 6的變體具有與SEQ IDN0. 6的約95%或更多的同一性和/或保守取代。在一個實施方案中，抗-CD18 β A scFv抗體包含SEQ ID N0. 3或SEQ ID N0. 3的變體。在一個實施方案中，SEQ ID N0. 3的變體具有與SEQ ID N0. 3的約70%或更多的同一性和/或保守取代。在另一個實施方案中，SEQ ID N0. 3的變體具有與SEQ ID N0. 3的約80%或更多的同一性和/或保守取代。在又一個實施方案中，SEQ ID N0. 5的變體具有與SEQ ID W). 3的約90%或更多的同一性和/或保守取代。在再一個實施方案中，SEQ ID N0. 3的變體具有與SEQ ID N0. 3的約95%或更多的同一性和/或保守取代。SEQ ID N0. 5和SEQ ID N0. 6包含互補決定區(qū)(OTR)，其被認為涉及對⑶18 β A表位的識別。⑶R在圖2中加下劃線顯示。在一個實施方案中，SEQ ID Ν0. 5或SEQ ID N0. 5 的變體包含序列SYDID (SEQ ID N0. 12)。在另一個實施方案中，SEQ ID N0. 5或SEQ ID N0. 5 的變體包含SEQ ID N0. 7或具有70%或更多同一性的SEQ ID N0. 7變體。在又一個實施方案中，SEQ ID N0. 5或SEQ ID N0. 5的變體包含SEQ ID N0. 7或具有70%或更多同一性的 SEQ ID N0. 8 變體。在一個實施方案中，SEQ ID N0. 6或SEQ ID N0. 6的變體包含SEQ ID N0. 9或具有70%或更多同一性的SEQ ID N0. 9變體。在另一個實施方案中，SEQ ID N0. 6或SEQ ID N0. 6的變體包含SEQ IDN0. 10或具有70%或更多同一性的SEQ ID NO. 10變體。在又一個實施方案中，SEQ ID N0. 6或SEQ ID N0. 6的變體包含SEQ ID NO. 11或具有70%或更多同一性的SEQ ID NO. 11變體。在急性腹膜炎的動物模型中的效能研究整聯(lián)蛋白肽和抗-⑶18 β A scFv在保護動物免受急性腹膜炎中的效能已在使用稱為盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)的熟知鼠模型的實驗中評估。CLP為人膿毒病的嚴格模型。在該模型中，將小鼠的盲腸非阻塞地結(jié)扎并用19規(guī)針穿孔兩次。腸內(nèi)菌群隨后傳染腹膜腔，并引發(fā)免疫反應，這類似于人膿毒病的膿毒性反應。結(jié)果表明單獨地或在聯(lián)合方案中用整聯(lián)蛋白肽和抗_CD18i3A scFv治療施以CLP的小鼠，導致如較低的促炎細胞因子釋放和白細胞浸潤至組織中所示的促炎反應減少。還在用新型療法治療的小鼠中發(fā)現(xiàn)48小時的存活率顯著增加。整聯(lián)蛋白肽在保護動物免受內(nèi)毒素介導的超炎性反應方面的治療效能也已在壞死性小腸結(jié)腸炎大鼠模型中評估。在該模型中，用細菌LPS使大鼠空腸腫脹，而該腫脹誘導超炎性反應，如循環(huán)促炎細胞因子增加所反映。先天免疫組分的表達隨之上升。結(jié)果表明用整聯(lián)蛋白肽治療NEC大鼠減少了針對細菌LPS的炎性反應。總起來說，本說明書公開了抑制內(nèi)毒素介導的促炎反應的方法，本文通過改善膿毒病和壞死性小腸結(jié)腸炎的超炎性反應來例示。還公開了制備整聯(lián)蛋白肽和抗-CD18 β A scFv的方法。特別地，本文還教導了使用這兩種治療法治療動物包括人的方法。我們的結(jié)果表明整聯(lián)蛋白肽和抗-⑶18 β A scFv為前沿分子(lead molecule)，其在治療急性膿毒病以及其它內(nèi)毒素介導的促炎反應中可用作新型介入劑(intervention)。本發(fā)明的整聯(lián)蛋白肽可為重組制備的肽，其包含來源于新發(fā)現(xiàn)的沿著白細胞 ⑶18 β A域抗原的LPS結(jié)合位點(即殘基沈6-318)的以下氨基酸序列GRCHLEDNLYXRSN EFDYPSVGQLAHKLAENNIQPIFAVTSRMVKTYEKLTEIIPKSAVPKSAVGELSEDSSNVVHLIKNAYNKL(SEQ IDNO. 1) (Wong KF 等，2007)。在本文中，抗-⑶18 β A scFv為以下抗體(優(yōu)選重組制備的)其靶向⑶18 β A域， 并且最初選自噬菌體展示的cDNA文庫。
實施例本發(fā)明的實施方面在以下實施例中闡述。實施例1闡述使用原核細菌表達系統(tǒng)重組地制備整聯(lián)蛋白肽和抗-⑶18 β A scFv的方法。實施例2使用稱為盲腸結(jié)扎穿孔模型的熟知的鼠模型，闡述由整聯(lián)蛋白肽和抗-CD18 β A scFv提供的保護小鼠免受內(nèi)毒素介導的組織損傷和致死的體內(nèi)研究。實施例3使用鱟變形細胞(LAL)測定法，表示整聯(lián)蛋白肽對內(nèi)毒素在循環(huán)中的生物活性的影響的血清學分析。實施例4表示整聯(lián)蛋白肽和抗-CD18 β A scFv對施以CLP小鼠的TNF- α和IL-6血清水平的影響的血清學分析。實施例5表示關(guān)于白細胞浸潤至肺和肝的⑶3表達分析。實施例6表示整聯(lián)蛋白肽和抗-⑶18 β A scFv對施以CLP小鼠的肝中的ICAM-I轉(zhuǎn)錄水平的影響的分析。該實施例還表示整聯(lián)蛋白肽對VCAM 和E-選擇蛋白在肺中表達的影響的免疫組織化學分析。實施例7表示整聯(lián)蛋白肽對NEC 大鼠模型的促炎細胞因子釋放和先天免疫的影響。實施例8表示篩選結(jié)合CD18 β A的候選化合物的測定法。實施例9表示設計衍生物結(jié)構(gòu)(derivative structure)的標準技術(shù)，所述衍生物結(jié)構(gòu)可用于制備經(jīng)測試抑制能力增強的候選物。以下為闡述實施本發(fā)明的方法的實施例。這些實施例不應理解為限制性的。除非另外指出，否則所有百分比為重量百分百，而所有溶劑混合比例為體積比。根據(jù)本公開內(nèi)容，本領(lǐng)域的技術(shù)個員應認識到可對所公開的具體實施方案作出很多改變，但依然獲得同樣或類似的結(jié)果，而不會背離本發(fā)明的精神和范圍。實施例1A.整聯(lián)蛋白肽的制備整聯(lián)蛋白肽為重組地制備并純化自原核表達系統(tǒng)的多肽。整聯(lián)蛋白肽的制備方法按照(Wong KF等，2007)描述的方法進行。簡言之，將編碼肽的cDNA，5’ -ACCCCCAACGACGG CCGCTGTCACCTGGAGGACAACTTGTACAAGAGGAGCAACGAATTCGACTACCCATCGGTGGGCCAGCTGGCGCACA AGCTGGCTGAAAACAACATCCAGCCCATCTTCGCGGTGACCAGTAGGATGGTGAAGACCTACGAGAAACTCACCGAG ATCATCCCCAAGTCAGCCGTGGGGGAGCTGTCTGAGGACTCCAGCAATGTGGTCCATCTCATTAAGAATGCTTACAA TAAACTC-3，(SEQID NO. 2)使用AmpliTaq Gold DNA聚合酶通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增。用于PCR的DNA模板為人CD18 cDNA構(gòu)建體，其由Lloyd B. Klickstein博士(Harvard Medical School, Boston, MA, USA)惠贈。PCR條件按照制造商的說明書在94°C變性1分鐘，在55°C退火30秒，然后在72°C延伸1分鐘，25個循環(huán)。將所得DNA片度純化并通過兩個限制性位點JacI和HindIII克隆至稱為pET43. I-B的表達載體中。然后將經(jīng)驗證序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株BL21 (DE3)。通過加入異丙基-D-硫代半乳糖吡喃糖苷至終濃度0. 5mM誘導蛋白產(chǎn)生。過夜溫育后，通過在3，OOOg離心10分鐘收獲細菌細胞，然后使之在裂解緩沖液(50mM Tris-HCl，pH 8. 0,0. 3mM NaCl，20mM咪唑)中超聲處理。重組整聯(lián)蛋白肽在其C端包含聚組氨酸標簽，并使用用Ni-NTA柱的固定化親和層析法從細菌提取物中將其純化。用200mM咪唑?qū)⒔Y(jié)合的重組蛋白從柱中洗脫。B.抗-CD18PA scFv 的制備抗-⑶18 β A scFv為重組制備并且靶向白細胞整聯(lián)蛋白的⑶18 β A域的抗體。對于其制備，將BALB/c小鼠用純化的重組⑶18 β A域初免，其中如(Wong KF等，2007)所述制備和純化重組⑶18βΑ域。如上所述進行PCR擴增、克隆、蛋白制備和純化。免疫接種后， 經(jīng)手術(shù)將脾摘除用于提取總RNA。在反轉(zhuǎn)錄之后，將免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的可變基因通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增。將簡并寡核苷酸用于PCR中，因為未完全認識基因靶標的序列。將所得PCR產(chǎn)物純化并連接以產(chǎn)生單鏈抗體cDNA片段。這些scFv cDNA片段編碼一系列親合力的抗體。構(gòu)建了這些cDNA克隆的文庫。為選出顯示對⑶18 β A域有顯著親合力的克隆，用噬菌體感染文庫，并使之經(jīng)過數(shù)輪淘選。在實行3輪篩選之后，選出其scFv 產(chǎn)物在40個克隆中顯示最高親合力的cDNA克隆。隨后對該scFv克隆的DNA序列進行測序。通過原核表達系統(tǒng)制備足量的抗-⑶18 β A ScFv0重組抗-⑶18 β A scFv的表達和純化隨后按照制備整聯(lián)蛋白肽的方法進行。圖2顯示了多肽序列(SEQ ID N0. 3)，其中下劃線區(qū)域的那些序列為抗體的互補決定區(qū)(⑶R)。還預測了抗-⑶18βΑ scFv的分子結(jié)構(gòu)，其中Vh和八結(jié)構(gòu)域通過接頭連接。 代表性克隆的核苷酸序列為SEQ ID N0. 4。實施例2盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)膿毒病模型使用盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)模型評估本療法提供的保護患者對抗急性腹膜炎的治療作用。CLP模型為許多模擬人類患者中的膿毒性反應的嚴格模型之一。為了使可由手術(shù)產(chǎn)生的潛在變化最小化，所有手術(shù)方法如Echtenacher B等所述由一名有公認資格 (board-qualified)的外科獸醫(yī)進行。在手術(shù)前，腹膜內(nèi)注射60mg/kg在0. 3ml無菌無熱原鹽水中的戊巴比妥鈉 (Nembutal, Rhone Merieux, Pinkenba, QLD, Australia) ) 酉卒 ICR/]、!！。15mm 的腹前中線切口暴露，并將其遠端無阻塞地結(jié)扎。隨后將結(jié)扎的盲腸用19規(guī)針穿孔兩次。 將經(jīng)穿孔的盲腸放回腹腔，并用小夾使切口閉合。假手術(shù)對照組的小鼠僅接受剖腹術(shù)而沒有任何盲腸結(jié)扎和穿孔。手術(shù)2小時后，通過腹膜內(nèi)注射給予小鼠治療。用⑴無菌鹽水、(ii)整聯(lián)蛋白肽 (0. 8mg/kg)、(iii)抗-0)18βΑ scFv (0. 8mg/kg)和(iv)整聯(lián)蛋白肽和抗-CD18 β A scFv 的聯(lián)合方案(每種制劑0. 8mg/kg)注射小鼠。術(shù)后12和M小時，通過頸脫位法處死接受不同治療的小鼠。然后立即從內(nèi)腔靜脈抽出血液，并儲存在-20°C直至其分別用于測定內(nèi)毒
12素活性和促炎細胞因子水平的LAL測定和ELISA。還采集冷凍并石蠟固定的肝樣品，分別用于實時PCR和免疫組織化學。施以CLP小鼠的存活公析還研究了用整聯(lián)蛋白肽和抗-⑶18 β A scFv的療法所提供的CLP小鼠免于致死的保護作用。在手術(shù)后對鹽水、整聯(lián)蛋白肽、抗-⑶18 β AscFv和聯(lián)合方案治療的小鼠連續(xù)監(jiān)測48小時。存活超過48小時的小鼠確定為存活者。進行了兩組獨立的實驗，并用GraphPad Pr ism (GraphPad Software, Inc.，La Jolla, CA)分析了數(shù)據(jù)。存活分析的結(jié)果示于圖3A-C中。在本研究中，用鹽水治療的施予CLP的小鼠在手術(shù)后無一存活超過36小時。用整聯(lián)蛋白肽和抗-⑶18 β A scFv治療的施以CLP小鼠的 48小時存活率分別為37. 5%和37. 5%。聯(lián)合方案進一步使施以CLP小鼠的存活率增加至 50%。從整聯(lián)蛋白肽和抗-⑶18 β A scFv的治療性給藥中所得到的存活益處與用無菌鹽水處理的那些相比都是統(tǒng)計學顯著的。實施例3整聯(lián)蛋白肽對內(nèi)毒素在循環(huán)中的生物活性的影響通過使用LALpyrochrome試劑盒(Associates of Cape Cod, Falmouth, MA)的 LAL 測定法如先前所述(Ho DW 等，Asian J. Surg. (2002)，第25卷，73-39)進行測定。用于LAL測定法的所有緩沖液按照制造商的說明書用無內(nèi)毒素的水制備。使用微量滴定板讀數(shù)器(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)在 MOnm的光密度下監(jiān)測信號發(fā)展。將樣品分析三次，然后根據(jù)以0-0. 623內(nèi)毒素單位(EU)/ ml的動態(tài)范圍建立的標準曲線計算內(nèi)毒素水平。腸內(nèi)細菌感染腹腔導致循環(huán)中內(nèi)毒素水平(0.266士0. 106EU/ml)在手術(shù)后12 小時迅速增加，這反映了感染的全身散布(圖4)。用鹽水處理的小鼠中的血清內(nèi)毒素水平在手術(shù)后M小時期間持續(xù)升高(0. 143士0.006EU/ml)。在腹膜內(nèi)注射整聯(lián)蛋白肽治療的那些小鼠中，血清內(nèi)毒素水平顯著低于在鹽水處理的小鼠中測到的水平在手術(shù)后 12 小時 0. 143 士 0. 03EU/ml 對比 0. 266 士 0. 106EU/ml (P < 0. 05)；在手術(shù)后 24 小時 0. 076士0. 001EU/ml對比0. 143士0. 006EU/ml (P < 0. 001)。這些結(jié)果為以下提供明確的證據(jù)如施以CLP的小鼠所例示的，用整聯(lián)蛋白肽的治療可降低患者中的循環(huán)內(nèi)毒素水平實施例4在用整聯(lián)蛋白肽、抗-⑶18βΑ scFv和聯(lián)合治療之后，施以CLP小鼠中的血清 TNF- α和IL-6水平的變化通過ELISA測定，結(jié)果闡述于圖5中。在手術(shù)后12小時，鹽水處理的施以CLP小鼠的血清TNF-α水平為約 1081 士 132pg/ml，接近于假手術(shù)對照小鼠Q89士90pg/ml)的5倍的值。單獨或者聯(lián)合使用治療劑治療施以CLP的小鼠導致血清TNF-α水平幾乎減少50% (PSP12 :5 士43pg/ml ； 整聯(lián)蛋白肽627士98pg/ml ；抗-ΟΗ8βΑ scFv :6 士50pg/ml ；以及聯(lián)合方案462士43pg/ ml)。施以CLP小鼠的血清IL-6水平在單獨或聯(lián)合使用治療劑治療后于手術(shù)后12小時也降低(假手術(shù)對照:95士 19pg/ml ；鹽水:550士83pg/ml ；PSP12 :256士60pg/mi ；整聯(lián)蛋白肽 212士49pg/ml ；抗 _0)18βΑ scFv :182士24pg/ml ；以及聯(lián)合方案242士38pg/ml)。在鹽水處理的CLP小鼠中的兩種細胞因子的血清水平在手術(shù)后M小時保持升高， 并接近假手術(shù)對照小鼠的6倍。CLP小鼠在手術(shù)后M小時對各種治療的反應類似于在手術(shù)后12小時的CLP小鼠中觀察到的反應TNF-a和IL-6血清水平與用鹽水治療的小鼠相比降低50%。實施例5整聯(lián)蛋白肽和抗-⑶18 β A scFv對白細胞浸潤至施以CLP小鼠的肺和肝中的調(diào)節(jié)作用通過測量在兩種組織中的CD3mRNA含量來進行研究。CD3為炎性淋巴細胞的標志。為此，在處死小鼠后，立即將肺和肝在液氮中速凍。首先從肺和肝中提取和純化總RNA，隨后用于合成第一條cDNA鏈。隨后在ABI PRISM 7700序列檢測器系統(tǒng)(Applied Biosystems Inc.，F(xiàn)orest Hill, CA, USA)中進行從第一條cDNA鏈擴增⑶3，以及對擴增的⑶3的實時測量。施以CLP小鼠的肺和肝中的⑶3水平闡述于圖6中。結(jié)果表明在CLP后12小時和M小時，⑶3mRNA在肺和肝兩者中的含量升高，這表明炎性白細胞嚴重浸潤至這些器官中。用整聯(lián)蛋白肽、抗-⑶18 β A scFv和聯(lián)合方案治療施以CLP的小鼠降低了⑶3 mRNA在肺和肝中的含量。這些結(jié)果表明整聯(lián)蛋白肽和抗-CD18 β A scFv兩者都能終止炎性白細胞浸潤至患者的主要器官中。實施例6實時PCR測量給予不同治療的小鼠肝中的ICAM-I轉(zhuǎn)錄水平。ICAM-I轉(zhuǎn)錄物在 Power SYBR Green PCR Master Mix(AppliedBiosystems)中使用 ABI PRISM 7700 序列檢測器系統(tǒng)(AppliedBiosystems)擴增。計算并比較結(jié)果，然后表示為圖7中的倍數(shù)變化。急性腹膜炎導致ICAM-I轉(zhuǎn)錄的顯著增量調(diào)節(jié)，如鹽水處理的施以CLP的小鼠所反映的，所述小鼠中ICAM-I轉(zhuǎn)錄物為假手術(shù)對照小鼠的14-16倍。接受不同治療的施以 CLP的小鼠總體顯示較低的ICAM-I轉(zhuǎn)錄。具體而言，與鹽水處理的小鼠的ICAM-I轉(zhuǎn)錄水平相比，用整聯(lián)蛋白肽的治療導致ICAM-I轉(zhuǎn)錄水平在手術(shù)后的兩個時間點上都顯著降低 (P <0.05)。單獨或聯(lián)合的抗-⑶18 β A scFv也阻抑CLP誘導的ICAM-I轉(zhuǎn)錄。然而，發(fā)現(xiàn)抗-CD18i3A scFv的調(diào)節(jié)作用小于整聯(lián)蛋白肽。因此，這就表明本發(fā)明的治療劑單獨或在聯(lián)合方案中對下調(diào)腹膜炎誘導的ICAM-I在患者肝中表達有效。整聯(lián)蛋白肽對VCAM和E-選擇蛋白在肺中的表達的調(diào)節(jié)作用通過免疫組織化學來研究(圖8)。VCAM和E-選擇蛋白為在內(nèi)皮上的除ICAM-I外的兩種粘附分子，其促進白細胞浸潤至組織中。結(jié)果表明CLP手術(shù)誘導VCAM和E-選擇蛋白在肺中表達。將整聯(lián)蛋白肽給予施以CLP的小鼠阻抑這些粘附分子在肺中表達，如在肺部分中對VCAM和E-選擇蛋白的反應性減低所顯示的。實施例7除盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)模型之外，整聯(lián)蛋白肽的療效還在壞死性小腸結(jié)腸炎大鼠模型中得以證實。在該模型中，用細菌LPS使大鼠空腸腫脹誘導致死的全身性炎性反應，這由循環(huán)TNF- α和IL-6水平的急劇上升以及TLR4免疫組分mRNA的增量調(diào)節(jié)表達所揭示。 這些組分包括TLR4、MD-2和CD14。TNF-α和IL_6的循環(huán)水平通過細胞因子ELISA來研究(圖9)。根據(jù)顯示，用細菌內(nèi)毒素使大鼠空腸腫脹以極為顯著的方式使TNF-α和IL-6兩者的循環(huán)水平升高(紅柱)。為了檢測整聯(lián)蛋白肽是否可降低循環(huán)中的這種細胞因子水平，將0. 8mg/kg整聯(lián)蛋白肽直接注入大鼠空腸中。對采集的血液樣品的測定表明所給予的整聯(lián)蛋白肽(藍柱)善細菌LPS誘導的炎性反應。內(nèi)毒素介導的炎性反應還增加先天免疫組分(TLR4、MD-2和CD14)的mRNA，其通過如上所論述的實時PCR測定(圖10)。如所顯示的(紅柱)，用細菌內(nèi)毒素使空腸腫脹激發(fā)TLR4、MD-2和⑶14mRNA的表達。輸注整聯(lián)蛋白肽以顯著的方式阻抑這些內(nèi)毒素介導的表達(藍柱):TLR4 (P = 0. 00127) ；MD-2 (P = 0. 0187)；以及 CD14 (P = 0. 00498)。在開發(fā)新型療法中的基本問題之一是確定藥物靶標和制備針對這些靶標的藥劑。 本公開內(nèi)容教導了用于在治療膿毒病中使用的分子靶標。本發(fā)明的治療劑的保守變體包括將氨基酸換成例如具有類似電荷、大小或親水性的另一種氨基酸。本發(fā)明的保守變體可為特定序列的變更使得功能上等價的氨基酸取代肽序列中的一個或多個氨基酸，從而產(chǎn)生沉默變化(silent change) 0例如，序列內(nèi)的一個或多個氨基酸殘基可用在功能上起等價作用的具有類似極性的另一種氨基酸取代。用于序列內(nèi)的氨基酸的取代物可選自所述氨基酸所屬分類中的其它成員。例如，非極性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。帶正電荷 (堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶負電(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸?！白凅w”多肽或抗體在本文中是指由于在親本序列中的一個或多個氨基酸殘基的插入、缺失和/或取代而與“親本”多肽或抗體氨基酸序列在氨基酸序列上不同的分子。在優(yōu)選實施方案中，變體抗體包含在親本抗體的一個或多個超變區(qū)中的一個或多個氨基酸的取代。例如，變體可包含在親本抗體的一個或多個超變區(qū)的至少1個取代物，例如約1個至約10個取代物，優(yōu)選約2個至約5個取代物。通常，變體的氨基酸序列與親本抗體重鏈或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列具有至少75%的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少 85%，更優(yōu)選至少90%以及最優(yōu)選至少95%同一性。關(guān)于該序列的同一性或同源性在本文中定義為在比對序列和引入空位(如果需要的話)以獲得最大百分比序列同一性之后，候選序列中與親本抗體殘基相同的氨基酸殘基的百分比。在N端、C端或內(nèi)部的抗體序列中的延伸、缺失或插入都不應理解為影響序列的同一性或同源性。變體保留結(jié)合受體的能力， 并優(yōu)選具有優(yōu)于親本抗體的結(jié)合能力的性質(zhì)。有可能通過測定被測試的抗體是否能防止抗-⑶18 β A scFv結(jié)合至特定抗原 (例如抗-⑶18 β A scFv通常與之反應的⑶18 β A受體)而無需過度的實驗就能評估抗體，以確定其是否具有與本發(fā)明的抗-CD18 β A scFv相同的特異性。如果被測試的抗體與抗-⑶18 β A 8沖￥競爭，如抗-^18 0 4 scFv的結(jié)合減少所示，那么很可能這兩種抗體結(jié)合相同的表位。確定抗體是否具有抗-⑶18 β A scFv的特異性的另一種方法為將抗-⑶18 β A scFv與其通常與之反應的抗原(例如CD18i3A受體)預保溫，并測定被測試的抗體在其結(jié)合抗原的能力方面是否受抑制。如果被測試的抗體受抑制，那么很可能其具有與本發(fā)明的抗-⑶18 β A scFv相同的表位特異性。實施例8篩選測定候選化合物與CD18 β A結(jié)合的能力通過競爭性結(jié)合測定法評估。候選化合物可為
15肽類化合物或非肽類化合物。與⑶18 β A的結(jié)合通過從⑶18 β A置換抗-⑶18 β A或其保守變體的能力來定量。被置換的抗-CD18 β A或其保守變體可通過許多技術(shù)測定。例如，放射性標記的肽可使用市售放射性標記的氨基酸前體合成。用3H、14C或mS放射性標記的肽可通過常規(guī)液體閃爍技術(shù)定量?；蛘撸珊铣蔁晒鈽擞浀碾?。例如，可將賴氨酸插入非關(guān)鍵性位置并用異硫氰酸熒光素(“FITC”)標記。除FITC之外，還可用任何合適的熒光團 (flurophore)標記肽。從未結(jié)合的肽中分離結(jié)合的肽并定量被置換的肽可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)進行。本發(fā)明的這個實施方案不受用于定量被置換的肽的方法所限制，并且任何合適的分析技術(shù)都可使用并包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實施例9為了獲得更有效的抑制性肽，可將設計衍生物結(jié)構(gòu)的標準技術(shù)用于制備經(jīng)測試抑制能力增強的候選物。例如，一種衍生肽策略為使共有序列肽經(jīng)過如Cunningham和W^ells, 1989所述的丙氨酸篩選法?？蓪⒈彼岱謩e引入各個位置以確定肽中調(diào)節(jié)與CD18 β A結(jié)合的特異性側(cè)鏈。一旦確定以后，用保守氨基酸取代物替換這類氨基酸。這類取代物為具有類似電荷的氛基酸，例如如 Dayoff 等，Atlas of Protein Sequence and Structure (蛋白序列禾口結(jié)構(gòu)圖譜)；第 5 卷，增刊 3，第 3,45-362 頁(M. 0. Dayoff 編輯，Nat‘ 1 BioMedResearch Fdn.， Washington, D. C. 1979)中所述。對氨基酸側(cè)鏈取代基的大小、形狀和類型的分析顯示精氨酸、賴氨酸和組氨酸都是帶正電荷的殘基；丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸的大小都類似；以及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸都具有基本類似的形狀。因此，基于這些考慮，精氨酸、賴氨酸和組氨酸；丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸；以及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸；在本文中定義為保守變體。該類型的衍生策略已在鑒定較高親和力的肽上取得成功(Ohman等，1995 ;Adgey， 1998)。除了與⑶18 β A結(jié)合(通過例如上文實施例7的篩選測定)之外，還可根據(jù)其它所需性質(zhì)篩選保守變體，例如較長的血清半壽期或所需的其它藥代動力學性質(zhì)或藥效學 (pharmacodymanic) t生應該理解的是，本文所述的實施例和實施方案僅為說明性目的，并且根據(jù)其作出的各種修改或改變都由本領(lǐng)域的技術(shù)人員提出并包含在本申請的精神和范圍之內(nèi)。本文所提及或引用的所有專利、專利申請、臨時申請和出版物都通過引用以其整體(包括所有圖和表)結(jié)合到本文中，其結(jié)合程度直到其內(nèi)容與說明書的明確教導不一致為止。
權(quán)利要求
1.一種抗⑶18 β A抗體，所述抗體包含具有與靜息構(gòu)象和活性構(gòu)象的哺乳動物⑶18整聯(lián)蛋白的結(jié)合親和力的單個多肽鏈。
2.權(quán)利要求1的抗體，其中所述單個多肽具有SEQ ID NO. 5或SEQ ID NO. 5變體的氨基酸殘基序列；SEQ ID NO. 6 或SEQ ID NO. 6變體的氨基酸殘基序列；以及具有至少約60%或更多甘氨酸的接頭序列， 其中 SEQ ID NO. 5 或 SEQ ID NO. 5 變體位于 SEQ ID NO. 6 或 SEQ ID NO. 6 變體的 N端， 并且接頭序列介于SEQ ID NO. 5或SEQ IDN0. 5變體與SEQ ID NO. 6或SEQ ID NO. 6變體之間。
3.權(quán)利要求1的抗體，其中所述多肽具有以下序列中的一種或多種序列SYDID、SEQ ID NO. 7或具有70%同一性的SEQ ID NO. 7變體以及SEQ ID NO. 8或具有70%同一性的 SEQ ID NO. 8 變體。
4.權(quán)利要求1的抗體，其中所述多肽具有以下序列中的一種或多種的氨基酸殘基序列SEQ ID NO. 9或具有70%同一性的SEQ ID N0. 9變體、SEQ ID NO. 10或具有70%同一性的SEQ ID NO. 10變體、SEQID NO. 11或具有70%同一性的SEQ ID NO. 11變體。
5.權(quán)利要求1的抗體，其中所述多肽具有SEQID N0. 3或SEQID N0. 3變體的序列。
6.一種包含SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 1變體的氨基酸序列的整聯(lián)蛋白肽。
7.權(quán)利要求6的整聯(lián)蛋白肽，所述整聯(lián)蛋白肽的氨基酸序列具有與SEQID NO. 1的 70 %或更多的同一性或保守取代。
8.權(quán)利要求6或7的整聯(lián)蛋白肽，其中所述整聯(lián)蛋白肽能夠結(jié)合細菌脂多糖。
9.以下組合物在制備用于治療患有內(nèi)毒素介導的炎性反應的哺乳動物的藥物中的用途，其中所述組合物包含以下中的一種或多種A.單鏈多肽，其包含SEQID N0. 5或SEQ ID N0. 5變體的氨基酸殘基序列；SEQ ID N0. 6 或SEQ ID N0. 6變體的氨基酸殘基序列；以及具有至少約60%或更多甘氨酸的接頭序列， 其中SEQ ID N0. 5或SEQ ID N0. 5變體位于SEQ ID N0. 6或SEQ ID N0. 6變體的N端，并且接頭序列位于SEQ ID N0. 5或SEQ ID N0. 5變體與SEQ ID N0. 6或SEQ ID N0. 6變體之間；以及B.整聯(lián)蛋白肽，其包含具有SEQID NO. 1或SEQ ID NO. 1變體的氨基酸殘基序列的氨基酸序列。
10.權(quán)利要求9的用途，其中所述單鏈多肽具有SEQID N0. 3或SEQ ID N0. 3變體的序列。
全文摘要
細菌脂多糖(LPS)在全身循環(huán)中引發(fā)有害的超炎性反應，這在很多病癥如革蘭氏陰性膿毒病和壞死性小腸結(jié)腸炎中為關(guān)鍵的發(fā)病機理。目前沒有有效的治療性介入可用于保護患者免于死亡。本發(fā)明內(nèi)容為以下方法和治療劑其消減LPS在循環(huán)中的生物毒性(整聯(lián)蛋白肽)，以及終止白細胞浸潤至肺和肝中并阻抑粘附分子表達(整聯(lián)蛋白肽和抗-CD18 βA scFv)。這些治療劑可單獨或聯(lián)合用于治療內(nèi)毒素介導的促炎反應，尤其在急性膿毒病和壞死性小腸結(jié)腸炎的病例中。
文檔編號C07K14/705GK102239179SQ200980128192
公開日2011年11月9日 申請日期2009年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月14日
發(fā)明者潘冬平, 范上達, 陸滿晴, 黃廣輝 申請人:香港大學