專利名稱：用于抗微生物應(yīng)用的肽序列、其分枝形式以及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及有效的抗微生物肽序列的鑒定，特別是抗蛋白酶活性并因此非常適合于在體內(nèi)使用的抗微生物肽序列的鑒定，特別是當(dāng)以四分枝MAP形式合成時(shí)。本發(fā)明的序列(KKIRVRLSA，SEQ ID No. 1，RRIRVRLSA, SEQ ID No. 2, KRIRVRLSA, SEQ ID No. 3, RKIRVRLSA，SEQ ID No. 4)來源于以前報(bào)道的以谷氨酰胺作為第一個(gè)氨基末端殘基的肽M6。 去除谷氨酰胺給予了肽穩(wěn)定性和批次與批次之間均一性預(yù)料之外的且令人驚奇的改善，并因此提供了肽合成的可靠方法，其對(duì)于M6肽是特別困難的。
背景技術(shù)：
多藥物抗性細(xì)菌的不斷出現(xiàn)是全球關(guān)注的事情，這些國家中的大部分都將抗生素廣泛地使用于臨床。許多病原體如金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus)、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、一些腸球菌(enterococci),銅綠假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)和許多其他革蘭氏陰性細(xì)菌都已經(jīng)產(chǎn)生了對(duì)大多數(shù)常規(guī)抗生素以及對(duì)那些新一代抗生素的抗性(Wenzel和Edmond 2000)。因此，研發(fā)新的抗生素變得越來越重要。這種需求促使研究團(tuán)體和藥物公司考慮新的抗微生物劑?？刮⑸镫谋徽J(rèn)為是對(duì)通常引起抗性細(xì)菌選擇的常規(guī)抗生素的最佳替代物之一(Hancock和Sahl 2006)。大多數(shù)抗微細(xì)菌是動(dòng)物包括人類、植物和真菌的天然免疫組分(ZasloffdOO》。它們通常由 6-50個(gè)氨基酸殘基組成，并具有凈正電荷。陽離子肽選擇性地與陰離子細(xì)菌膜和與其他負(fù)電荷結(jié)構(gòu)例如LPS和DNA相互作用。真核細(xì)胞的膜的外層通常比細(xì)菌的膜的外層帶更少的負(fù)電荷，并且與細(xì)菌的膜不同，它們也通過膽固醇分子穩(wěn)定化。這些差異是陽離子肽的特異性的基礎(chǔ)。因此，陽離子抗微生物肽的作用機(jī)制歸因于它們與細(xì)菌膜的特異結(jié)合，其引起細(xì)胞通透，并且在某些情況下引起代謝途徑抑制。因而，許多研究旨在通過研究它們的作用機(jī)制、當(dāng)局部地或者全身地施用時(shí)它們對(duì)真核細(xì)胞的毒性和它們的治療有效性來鑒定和表征抗微生物肽序列。遺憾地是，迄今為止，兩個(gè)主要的問題阻礙了抗微生物肽藥物的研發(fā)。第一個(gè)問題是用于細(xì)菌的天然抗微生物肽的選擇性通常太低并且它們對(duì)真核細(xì)胞特別是紅細(xì)胞有劇毒，產(chǎn)生了高水平的溶血。 第二個(gè)問題與肽在體內(nèi)普遍的短半衰期有關(guān)。這是過去10年僅有很少的陽離子肽進(jìn)入市場(chǎng)的主要原因(多粘菌素和達(dá)托霉素是兩個(gè)成功的例子)。幾年前，研究者開始致力于鑒定在實(shí)驗(yàn)室中通過合理設(shè)計(jì)或者組合文庫的篩選而選擇的非天然來源的新肽序列。目的是根據(jù)一般毒性和對(duì)細(xì)菌的特異性以及改進(jìn)的半衰期為藥物研發(fā)發(fā)現(xiàn)具有更好的生物學(xué)特性的肽。在本發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)室中，鑒定了非天然肽序列，其特別地顯示出對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌強(qiáng)的抗微生物活性(Pini等，200幻。通過合理地修飾鑒定自組合文庫的序列獲得了肽 (QKKIRVRLSA，SEQ ID No. 5，稱為M6)，其以MAP四分枝形式合成，其中4個(gè)相同的肽序列通過賴氨酸核心連接到一起。這種分子顯示出對(duì)蛋白酶和肽酶高的抗性，因而克服了短半衰期的問題(Bracci等，2003 ；Falciani等，2007)。已經(jīng)在以下方面對(duì)分枝狀的抗微生物肽M6進(jìn)行了表征其對(duì)許多細(xì)菌包括幾種多藥物抗性臨床分離物的生物學(xué)活性，其與DNA的相互作用，其對(duì)幾種真核細(xì)胞系的體外毒性，以及其溶血活性，其免疫原性，當(dāng)腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)注射時(shí)其在體內(nèi)的毒性(Pini等，2007)。在M6的表征中進(jìn)行的所有實(shí)驗(yàn)期間，我們注意到具有非均一的活性的M6產(chǎn)生的肽的不同合成(批次與批次之間不同)(

圖1A)。質(zhì)譜分析顯示，M6的第一個(gè)氨基酸，即谷氨酰胺，轉(zhuǎn)變成了焦谷氨酸(圖1B)。含有焦谷氨酸而非谷氨酰胺的不同的肽的存在以不可預(yù)測(cè)的百分率隨批次而改變。事實(shí)上，完全去除這種副產(chǎn)物是不可能的，首先，因?yàn)樵贖PLC 純化期間由于其與主要產(chǎn)物具有類似的保留時(shí)間而不容易除去它，第二，因?yàn)楫?dāng)在溶液中時(shí)，它會(huì)持續(xù)從親代肽中產(chǎn)生。由于焦谷氨酸類似物相對(duì)于谷氨酰胺類似物顯示出明顯降低的抗微生物活性，所以混合物的整體活性因批次而異(圖1A)。為了最小化批次與批次之間的不同，在用于臨床前實(shí)驗(yàn)和可能地用于工業(yè)生產(chǎn)的大規(guī)模肽生產(chǎn)方面，我們從M6中去除了第一個(gè)谷氨酰胺殘基并也用精氨酸替換了前兩個(gè)賴氨酸或者用賴氨酸和精氨酸更換了這前兩個(gè)殘基。這產(chǎn)生了缺失M6序列中存在的第一個(gè)谷氨酰胺的下列9聚體序列KKIRVRLSA，SEQ ID No. 1，稱為M33 ；RRIRVRLSA, SEQ ID No. 2，稱為 M34, KRIRVRLSA, SEQ ID No. 3，稱為 M35, RKIRVRLSA, SEQID No. 4，稱為 M36。這些序列是本申請(qǐng)的主題。將新肽進(jìn)行描述于下文實(shí)施例中中的幾種表征。事實(shí)上，去除M6肽序列N末端的單一氨基酸殘基和可能地更換前兩個(gè)位置中的賴氨酸和精氨酸產(chǎn)生了更好的抗微生物活性，并且不造成毒副作用和作用機(jī)制方面的任何不同行為。實(shí)際上，它導(dǎo)致合成可靠性的有力改善，使得肽M33、M34、M35和M36的序列相對(duì)于M6更適合于工業(yè)研發(fā)。由于改善的穩(wěn)定性和批次與批次之間的均一性，M33、M34、M35和 M36序列是用于抗微生物藥物研發(fā)的理想候選物。發(fā)明描述本發(fā)明的目的是以單體結(jié)構(gòu)或者樹狀聚體結(jié)構(gòu)，優(yōu)選地以多抗原肽(MAP)形式合成的肽序歹Ij KKIRVRLSA, SEQ ID No. 1，M33 ；RRIRVRLSA, SEQ ID No. 2，M34, KRIRVRLSA, SEQ ID No. 3，M35, RKIRVRLSA, SEQ ID No. 4，M36，所述多抗原肽(MAP)形式具有通式
權(quán)利要求
1.抗菌肽，其具有選自KKIRVRLSA，SEQ ID No. 1，RRIRVRLSA，SEQ ID No. 2，KRIRVRLSA， SEQ ID No. 3，RKIRVRLSA，SEQ ID No. 4的從氨基末端到羧基末端的氨基酸序列或其功能性衍生物，其中一個(gè)氨基酸殘基由丙氨酸殘基取代或者其中一個(gè)帶正電荷的氨基酸由另一個(gè)帶正電荷的氨基酸取代。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其是線性形式。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的肽，其在聚丙烯酰胺骨架上、在葡聚糖單位骨架上或者在乙二醇單位骨架上多聚化。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其是多抗原肽(MAP)形式，具有下列通式其中，R是如在權(quán)利要求1中所要求保護(hù)的肽；X是三功能性分子；m = 0或1 ;n = 0或 1 ；當(dāng)m和η是0時(shí)，所述肽是二聚體；當(dāng)m = 1且η = 0時(shí)，所述肽是四聚體，當(dāng)m = 1且η =1時(shí)，所述肽是八聚體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的MAP肽，其中X是三功能性單位。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的MAP肽，其中所述三功能性單位包含至少兩個(gè)功能性氨基基團(tuán)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的MAP肽，其中X是賴氨酸、鳥氨酸、降賴氨酸或者氨基丙氨酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的MAP肽，其中X是天冬氨酸或者谷氨酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的MAP肽，其中X是丙二醇、丁二酸、二異氰酸酯或者二胺衍生物。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的肽，用于藥物用途。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的肽，作為抗菌藥物。
12.藥物組合物，其包含藥學(xué)上可接受的且有效量的根據(jù)權(quán)利要求10或者11的肽。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的藥物組合物，其以溶液劑形式在個(gè)體中注射用于全身使用。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的藥物組合物，其以溶液劑形式作為解毒劑注射用于LPS中和。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的藥物組合物，其以洗眼劑、漱口劑、軟膏劑或者溶液劑形式用于局部使用。
16.具有抗菌活性的消毒劑和/或洗滌劑制劑，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至11的肽。
17.根據(jù)權(quán)利要求1至11所述的肽的用途，用作防腐劑用于制備食物產(chǎn)品和/或美容產(chǎn)品和/或順勢(shì)療法產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有選自KKlRVRLSA，SEQ ID No.1，RRIRVRLSA，SEQ ID No.2，KRIRVRLSA，SEQ ID No.3，RKlRVRLSA，SEQ ID No.4的從氨基末端到羧基末端的氨基酸序列的抗菌肽或其衍生物及其用途。
文檔編號(hào)C07K7/06GK102170899SQ200980139093
公開日2011年8月31日 申請(qǐng)日期2009年10月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月5日
發(fā)明者A·皮尼, C·法爾恰尼, L·布拉奇 申請(qǐng)人:錫耶納大學(xué)