專利名稱：結(jié)合bmp2的硫酸類肝素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能夠結(jié)合BMP2的糖胺聚糖，包括它們的分離和鑒定，以及分離的糖胺聚糖在組織生長(zhǎng)和/或發(fā)育中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
糖胺聚糖(GAG)是復(fù)雜的碳水化合物大分子，其負(fù)責(zé)執(zhí)行和調(diào)控多種基本細(xì)胞功能。GAG與數(shù)百種已知的肝素結(jié)合生長(zhǎng)和粘附因子協(xié)作參與信號(hào)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)或介導(dǎo)。 已考慮生長(zhǎng)因子與GAG的結(jié)合通過多種作用調(diào)節(jié)它們的多種活動(dòng)，如通過保護(hù)它們不被蛋白水解降解來延長(zhǎng)它們的半衰期，調(diào)節(jié)這些細(xì)胞因子在細(xì)胞表面上的定位，介導(dǎo)分子相互作用和穩(wěn)定配基-受體復(fù)合物。已鑒別的肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子的數(shù)目不斷增加，加上數(shù)百種已知的肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子，它們中大多數(shù)是通過肝素親合色譜純化的。它們包括較大的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF) 家族、PDGF、多效營養(yǎng)因子(或多效生長(zhǎng)因子，pleiotropin)以及細(xì)胞因子TGF-β超家族。 后一個(gè)因子家族涵蓋了骨誘導(dǎo)性骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)亞家族，該亞家族是根據(jù)它們誘導(dǎo)異位骨形成的能力命名的。GAG與生長(zhǎng)因子間相互作用的性質(zhì)和作用仍不清楚。盡管已表明FGF2與肝素內(nèi)存在的特定糖序列之間的相互作用具有高親合性，但是一般來說，仍不清楚其它生長(zhǎng)因子與類肝素之間的結(jié)合是否涉及蛋白質(zhì)生長(zhǎng)因子上的氨基酸序列或構(gòu)象表位與嵌入GAG中的糖序列之間的高親合性或特異結(jié)合相互作用，或者這種結(jié)合是否是由GAG與蛋白生長(zhǎng)因子之間的低親合性、非特異相互作用所介導(dǎo)的。如果GAG與存在于細(xì)胞外基質(zhì)中或分泌到細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白質(zhì)之間的相互作用是特異性的，那么需要鑒別結(jié)合配偶體(binding partner)以解釋該相互作用并理解可以如何使用或調(diào)節(jié)這些相互作用以提供新型治療。因此，所產(chǎn)生的主要問題是在與生長(zhǎng)因子多肽主鏈內(nèi)的一級(jí)氨基酸序列/3維三級(jí)構(gòu)象匹配的GAG分子鏈中是否嵌入了糖序列，從而以絕對(duì)或至少相對(duì)的特異性控制它們的結(jié)合，并由此控制它們的生物活性。骨形態(tài)發(fā)生蛋白2 (也稱作骨形態(tài)形成蛋白2、BMP2或BMP-幻是與骨和軟骨發(fā)育密切相關(guān)的TGF-β超家族的成員。它是一種成骨蛋白，即成骨細(xì)胞分化的強(qiáng)效誘導(dǎo)劑 (Marie等人，(2002) “ Regulation of human cranial osteoblast phenotype by FGF-2, FGFR-2and BMP_2signaling〃 . Histol. Histopathol. 17(3) :877-85)。浸漬有 BMP2 的膠原海綿的植入顯示出對(duì)新骨形成的誘導(dǎo)(Geiger M，Li RH,Friess W(2003年11月).Collagen sponges for bone regeneration with rhBMP-2. Adv. Drug Deliv. Rev. 55(12) :1613-29)。 在美國，重組人BMP2可用于整形外科應(yīng)用(例如，INFUSE Bone Graft,Medtronic Inc, USA)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及硫酸類肝素制劑、硫酸類肝素HS/BMP2。已發(fā)現(xiàn)HS/BMP2能夠提高結(jié)締組織的生成、修復(fù)和再生。在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了硫酸類肝素HS/BMP2?？梢蕴峁┓蛛x形式或基本純化形式的HS/BMP2。這可以包括提供其中硫酸類肝素組分為至少80% HS/BMP2的組合物，更優(yōu)選地，為至少 85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100%之一。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，HS/BMP2能夠結(jié)合具有氨基酸序列SEQ IDNO :1或6或由該氨基酸序列組成的肽或多肽。在一些實(shí)施方式中，該肽為SEQ ID NO :1或6，在其它實(shí)施方式中，它為BMP2蛋白。在一些實(shí)施方式中，HS/BMP2與具有氨基酸序列SEQ ID NO :1或 6或由該氨基酸序列組成的肽結(jié)合的Kd小于100 μ Μ,更優(yōu)選地，小于50 μ Μ、40 μ m、30 μ m、 20μΜ或 10 μ M 之一。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，HS/BMP2為N-硫酸化的。這可以包括硫酸類肝素寡糖鏈中N-乙酰-D-葡糖胺(GlcNAc)殘基的N-硫酸化。優(yōu)選地，HS/BMP2中的至少80% N-乙酰-D-葡糖胺(GlcNAc)殘基被N-硫酸化。在一些實(shí)施方式中，這可以是至少85%、90%、 95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 之一。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，HS/BMP2被6_0_硫酸化(N-硫酸葡糖胺(GlcNQ殘基在C6處的0-硫酸化)。優(yōu)選地，HS/BMP2中的至少80 % N-硫酸葡糖胺(GlcNS)殘基被 6-0-硫酸化。在一些實(shí)施方式中，這可以是至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或 100% 之一。根據(jù)本發(fā)明人在本文中所述的方法，可以獲得、鑒定、分離或富集HS/BMP2，所述方法可以包括下列步驟(i)提供固體載體，其具有附著到該載體上的多肽分子，其中所述多肽包含具有氨基酸序列SEQ ID NO :1或6的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域；(ii)使所述多肽分子與包含糖胺聚糖的混合物接觸從而使得形成多肽-糖胺聚糖復(fù)合物；(iii)將多肽-糖胺聚糖復(fù)合物流分與混合物的其余部分分開；(iv)使糖胺聚糖從多肽-糖胺聚糖復(fù)合物解離；(ν)收集解離的糖胺聚糖。在本發(fā)明人的方法中，所述混合物可以包含得自可商購來源的糖胺聚糖。一種適合來源為硫酸類肝素流分，例如，可商購的硫酸類肝素。一種適合的硫酸類肝素流分可以在從豬腸粘膜分離肝素期間獲得(例如，Celsus Laboratories he.-有時(shí)被稱為“Celsus HS”)。硫酸類肝素的其它適合來源包括來自任何哺乳動(dòng)物(人或非人)的硫酸類肝素，尤其是來自腎、肺或腸粘膜的硫酸類肝素。在一些實(shí)施方式中，硫酸類肝素來自豬(豬科)或母牛(?？?的腸粘膜、腎或肺。另一種適合來源為成骨細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)材料，或者獲自成骨細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)材料的硫酸類肝素流分。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了包含根據(jù)上述任一方面的HS/BMP2和BMP2蛋白的組合物。在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了包含根據(jù)上述方面的HS/BMP2的藥物組合物或藥劑。所述藥物組合物或藥劑還可以包含藥用載體、佐劑或稀釋劑。
在一些實(shí)施方式中，所述藥物組合物用于在治療方法中使用，所述方法包括斷骨的修復(fù)和/或再生。在一些實(shí)施方式中，該藥物組合物或藥劑還可以包含BMP2蛋白。在一些實(shí)施方式中，該藥物組合物或藥劑還可以包含間充質(zhì)干細(xì)胞。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了 HS/BMP2，其用于在醫(yī)療方法中使用。該醫(yī)療方法可以包括體內(nèi)傷口愈合的方法、結(jié)締組織的修復(fù)和/或再生、骨的修復(fù)和/或再生和/或哺乳動(dòng)物或人骨的修復(fù)和/或再生。在本發(fā)明的相關(guān)方面中，提供了 HS/BMP2在制造用于醫(yī)療方法的藥劑中的應(yīng)用。 在一些實(shí)施方式中，該醫(yī)療方法包括哺乳動(dòng)物或人的斷骨的修復(fù)和/或再生。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了包含生物材料和HS/BMP2的生物相容性植入物或假體。在一些實(shí)施方式中，該植入物或假體涂覆有HS/BMP2。在一些實(shí)施方式中，該植入物或假體浸漬有HS/BMP2。所述植入物或假體還可以涂覆或浸漬有BMP2蛋白和/或間充質(zhì)干細(xì)胞。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了形成生物相容性植入物或假體的方法，該方法包括用HS/BMP2涂覆或浸漬生物材料的步驟。在一些實(shí)施方式中，該方法還包括用BMP2蛋白和間充質(zhì)干細(xì)胞中的之一或兩者涂覆或浸漬生物材料。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了治療患者骨折的方法，所述方法包括向所述患者給予治療有效量的HS/BMP2。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括將HS/BMP2施用至骨折周圍的組織。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括將HS/BMP2注射至骨折周圍的組織。在這些方法中，可以將HS/BMP2配制成包含HS/BMP2和藥用載體、佐劑或稀釋劑的藥物組合物或藥劑。在一些實(shí)施方式中，所述方法還可以包括將BMP2蛋白施用至患者。在這些方法中，可以將HS/BMP2和BMP2蛋白配制成包含HS/BMP2和BMP2蛋白以及可藥用載體、佐劑或稀釋劑的藥物組合物。在一些實(shí)施方式中，所述方法還可以包括向患者給予間充質(zhì)干細(xì)胞。在這些方法中，可以將HS/BMP2、BMP2蛋白和間充質(zhì)干細(xì)胞中的至少兩種配制成包含HS/BMP2、BMP2蛋白和間充質(zhì)干細(xì)胞中的至少兩種以及藥用載體、佐劑或稀釋劑的藥物組合物。優(yōu)選地，分別以治療有效量提供HS/BMP2、BMP2蛋白和間充質(zhì)干細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，治療骨折的方法還包括以下步驟將治療有效量的HS/BMP2和/或BMP2蛋白和/ 或間充質(zhì)干細(xì)胞配制成包含HS/BMP2和/或BMP2蛋白和/或間充質(zhì)干細(xì)胞以及藥用載體、 佐劑或稀釋劑的藥物組合物，其中向患者給予該藥物組合物。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了治療患者骨折的方法，所述方法包括將生物相容性植入物或假體手術(shù)植入到在骨折部位處或骨折部位周圍的患者組織中，該植入物或假體包含生物材料和HS/BMP2。在一些實(shí)施方式中，所述植入物或假體涂覆有HS/BMP2。在一些實(shí)施方式中，所述植入物或假體浸漬有HS/BMP2。在一些實(shí)施方式中，所述植入物或假體還浸漬有BMP2蛋白和間充質(zhì)干細(xì)胞中之一或兩者。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包含HS/BMP2。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了 HS/BMP2在體外細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用。在本發(fā)明的相關(guān)方面，提供了 HS/BMP2在結(jié)締組織體外生長(zhǎng)中的應(yīng)用。在本發(fā)明的另一個(gè)相關(guān)方面，提供了結(jié)締組織體外生長(zhǎng)的方法，所述方法包括培養(yǎng)與外源添加的HS/BMP2接觸的間充質(zhì)干細(xì)胞。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了促進(jìn)骨生成的方法，所述方法包括將HS/BMP2施用至骨前體細(xì)胞或骨干細(xì)胞。所述方法可以包括使骨前體細(xì)胞或骨干細(xì)胞與HS/BMP2體內(nèi)或體外接觸。在一些實(shí)施方式中，使骨前體細(xì)胞或骨干細(xì)胞與BMP2蛋白接觸，并同時(shí)與HS/ BMP2接觸。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，骨前體細(xì)胞或骨干細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了在需要該治療的人或動(dòng)物患者中骨組織的修復(fù)、 置換或再生的方法，所述方法包括(i)將與HS/BMP2接觸的間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)足以使所述細(xì)胞形成骨組織的一段時(shí)間；(ii)收集所述骨組織；(iii)將所述骨組織在創(chuàng)傷或疾病部位處植入到患者的身體中以修復(fù)、置換或再生患者的骨組織。在一些實(shí)施方式中，所述方法還包括使培養(yǎng)物中的間充質(zhì)干細(xì)胞與外源BMP2蛋白接觸。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了通過在存在HS/BMP2的情況下體外培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞所獲得的骨組織。在一些實(shí)施方式中，該骨組織是通過在存在HS/BMP2和BMP2蛋白的情況下體外培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞獲得的。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，所述方法包括培養(yǎng)與 HS/BMP2接觸的間充質(zhì)干細(xì)胞。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了包含多個(gè)部件的試劑盒，所述試劑盒包含預(yù)定量的HS/BMP2和預(yù)定量的BMP2。所述試劑盒可以包含含有預(yù)定量HS/BMP2的第一容器和含有預(yù)定量BMP2的第二容器。所述試劑盒還可以包含預(yù)定量的間充質(zhì)干細(xì)胞。可以提供該試劑盒以在醫(yī)療方法中使用。該醫(yī)療方法可以包括體內(nèi)傷口愈合、結(jié)締組織的修復(fù)和/或再生、骨的修復(fù)和/或再生和/或哺乳動(dòng)物或人骨的修復(fù)和/或再生的方法?？梢耘c所述試劑盒一同提供說明單獨(dú)、順序或同時(shí)施用HS/BMP2、BMP2蛋白和/或間充質(zhì)干細(xì)胞以提供醫(yī)學(xué)治療的說明書。在本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了產(chǎn)品，所述產(chǎn)品含有治療有效量的下列物質(zhì)(i)HS/BMP2 ；和以下中的之一或兩者(ii)BMP2 蛋白；(iii)間充質(zhì)干細(xì)胞，以用于在醫(yī)療方法中同時(shí)、單獨(dú)或順序使用。該醫(yī)療方法可以包括體內(nèi)傷口愈合、 結(jié)締組織修復(fù)和/或再生、骨的修復(fù)和/或再生和/或哺乳動(dòng)物或人骨的修復(fù)和/或再生的方法?？梢钥蛇x地將該產(chǎn)品配制為用于同時(shí)給藥的復(fù)合制劑。以下說明了本發(fā)明的其它方面。在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了對(duì)BMP2具有高結(jié)合親合力的GAG。更優(yōu)選地，GAG為硫酸類肝素(HS)。在一種實(shí)施方式中，按照本文所述的方法，從成骨細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)獲得的GAG混合物中分離出HS，其中將包含BMP2的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO :1)的多肽連接到固體載體上并且使得形成GAG-多肽復(fù)合物。GAG組分從GAG-多肽復(fù)合物的解離導(dǎo)致在本文被稱為“HS/BMP2”(有時(shí)稱為“HS-3”或“HS3”)的獨(dú)特HS的分離。在另一種實(shí)施方式中，使用相同方法從肝素與豬腸粘膜分離期間獲得的并且得自 Celsus Laboratories Inc (Cincinnatti, USA)的可商購硫酸類肝素(Celsus HS)(例如， 1爾-08-045，硫酸類肝素1丄618118 Lab Inc，H0-03102，H0_10595，IOX IOOmg)中分離出 HS/ BMP2。本發(fā)明人相信，能夠從獲自多種來源的HS流分中獲得HS/BMP2，所述來源包括哺乳動(dòng)物(人和非人)組織和/或細(xì)胞外基質(zhì)。因此，在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了 HS/BMP2?？梢蕴峁┓蛛x或純化形式的HS/ BMP2。在另一個(gè)方面，提供了包含HS/BMP2的培養(yǎng)基。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了包括HS/BMP2的藥物組合物或藥劑，其可選地與藥用載體、佐劑或稀釋劑組合。在一些實(shí)施方式中，藥物組合物或藥劑還可以包含BMP2蛋白。提供了用于創(chuàng)傷或疾病的預(yù)防或治療的包含HS/BMP2的藥物組合物或藥劑。還提供了 HS/BMP2在制造用于預(yù)防或治療創(chuàng)傷或疾病的藥劑中的應(yīng)用。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了預(yù)防或治療需要治療的患者中創(chuàng)傷或疾病的方法，所述方法包括向患者給予有效量的HS/BMP2?？梢詫⑺o予的HS/BMP2配制到適合的藥物組合物或藥劑中，并且還可以包含藥用載體、佐劑或稀釋劑?？蛇x地，該藥物組合物或藥劑還可以包含BMP2蛋白。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了促進(jìn)或抑制骨生成(骨細(xì)胞和/或骨組織形成) 的方法，包括向骨前體細(xì)胞或骨干細(xì)胞施用HS/BMP2。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了促進(jìn)或抑制軟骨組織形成(軟骨形成)的方法，包括向軟骨前體細(xì)胞或軟骨干細(xì)胞施用HS/BMP2?？蛇x地，提供了在存在外源加入的BMP2蛋白的情況下，通過使骨或軟骨前體細(xì)胞或干細(xì)胞與HS/BMP2接觸，可以體外實(shí)施刺激或抑制骨生成或軟骨組織形成的方法。所述前體細(xì)胞或干細(xì)胞可以是間充質(zhì)干細(xì)胞。在促進(jìn)組織形成的情況下，可以收集所形成的組織并用于向人或動(dòng)物患者移植。因此，在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了結(jié)締組織，其中該結(jié)締組織是在存在HS/ BMP2 (即，外源HS/BMP2)，并且可選地在存在BMP2 (即，外源BMP2)的情況下，通過間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)獲得的。所述結(jié)締組織可以是骨、軟骨、肌肉、脂肪、韌帶或腱。使用HS/BMP2的疾病預(yù)防或治療可以包括組織的修復(fù)、再生或置換，尤其是結(jié)締組織，如骨、軟骨、肌肉、脂肪、韌帶或腱。在這些組織之一發(fā)生惡化的患者中，可向惡化部位施用HS/BMP2以用于刺激該部位的組織生長(zhǎng)、增殖和/或分化。例如，對(duì)施用部位處或附近的間充質(zhì)干細(xì)胞的刺激(優(yōu)選地，當(dāng)該部位處也存在BMP2時(shí))會(huì)導(dǎo)致間充質(zhì)干細(xì)胞增殖且分化為適當(dāng)?shù)慕Y(jié)締組織，由此提供了對(duì)損傷組織的置換/再生以及創(chuàng)傷的治療?？商娲?，可收集從與HS/BMP2接觸的間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)物中獲得的結(jié)締組織并且在創(chuàng)傷或疾病部位處植入以置換損傷或惡化的組織。可選地，可以首先將損傷或惡化的組織從創(chuàng)傷或疾病部位切除。在另一個(gè)方面，可以提供含有干細(xì)胞(優(yōu)選間充質(zhì)干細(xì)胞)和HS/BMP2的藥物組合物。組合物在創(chuàng)傷、疾病或惡化部位處的施用(例如，注射)提供了該部位處組織的再生。
因此，HS/BMP2可用于體內(nèi)傷口愈合，包括組織修復(fù)、再生和/或置換(例如，瘢痕組織或斷骨的愈合)，其通過將HS/BMP2，可選地與BMP2和/或干細(xì)胞組合而直接應(yīng)用至需要治療的患者來起作用。HS/BMP2還可用于組織的體外生成，所述組織適合于移植到需要組織修復(fù)、再生和/或置換的患者體內(nèi)。下列編號(hào)段落包含了對(duì)本文所公開的創(chuàng)造性技術(shù)特征的廣泛組合的說明1、一種分離能夠與具有肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)結(jié)合的糖胺聚糖的方法，所述方法包括(i)提供固體載體，其具有附著到該載體上的多肽分子，其中該多肽包含肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域；(ii)使該多肽分子與包含糖胺聚糖的混合物接觸從而使得能夠形成多肽-糖胺聚糖復(fù)合物；(iii)將多肽-糖胺聚糖復(fù)合物與該混合物的其余部分分開；(iv)使糖胺聚糖從該多肽-糖胺聚糖復(fù)合物解離；(ν)收集解離的糖胺聚糖。2、一種鑒別能夠刺激或抑制細(xì)胞和/或組織生長(zhǎng)和/或分化的糖胺聚糖的方法， 所述方法包括(i)提供固體載體，其具有附著到該載體上的多肽分子，其中所述多肽包含肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域；(ii)使該多肽分子與包含糖胺聚糖的混合物接觸從而使得能夠形成多肽-糖胺聚糖復(fù)合物；(iii)將多肽-糖胺聚糖復(fù)合物與混合物的其余部分分開；(iv)使糖胺聚糖從多肽-糖胺聚糖復(fù)合物解離；(ν)收集解離的糖胺聚糖；(vi)將收集的糖胺聚糖添加到細(xì)胞或組織中，其中存在含有肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(vii)測(cè)量以下的一項(xiàng)或多項(xiàng)細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、一種或多種蛋白質(zhì)/糖蛋白/ 糖脂標(biāo)記物的表達(dá)。3、第1段或第2段所述的方法，其中包含糖胺聚糖的混合物含有細(xì)胞外基質(zhì)材料。4、第3段所述的方法，其中細(xì)胞外基質(zhì)材料來源于結(jié)締組織或結(jié)締組織細(xì)胞。5、第1段至第4段中任一段所述的方法，其中包含糖胺聚糖的混合物含有硫酸葡聚糖、硫酸軟骨素、硫酸類肝素中的一種或多種。6、第1段至第5段中任一段所述的方法，其中包含糖胺聚糖的混合物富含硫酸葡聚糖、硫酸軟骨素、硫酸類肝素中的一種。7、第1段至第6段中任一段所述的方法，其中所述方法還包括對(duì)所收集的糖胺聚糖進(jìn)行進(jìn)一步分析以確定GAG的結(jié)構(gòu)特征。8、第1段至第7段中任一段所述的方法，其中糖胺聚糖-多肽復(fù)合物與裂合酶接觸。9、第1段至第8段中任一段所述的方法，其中所述多肽為SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2 之一或包含 SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO 2 之一。
10、硫酸類肝素 HS/BMP2。11、包含HS/BMP2的培養(yǎng)基。12、包含HS/BMP2的藥物組合物或藥劑。13、第12段所述的藥物組合物或藥劑，還包含藥用載體、佐劑或稀釋劑。14、第12段或第13段所述的藥物組合物或藥劑，還包含BMP2蛋白。15、第12段至第14段中任一段的藥物組合物或藥劑，用于預(yù)防或治療創(chuàng)傷或疾病。16、HS/BMP2在制造用于預(yù)防或治療創(chuàng)傷或疾病的藥劑中的應(yīng)用。17、第15段或第16段所述的藥物組合物或應(yīng)用，其中所述預(yù)防或治療選自結(jié)締組織的修復(fù)、再生或置換以及傷口愈合。18、一種預(yù)防或治療需要治療的患者中創(chuàng)傷或疾病的方法，所述方法包括向患者給予有效量的HS/BMP2。19、第18段所述的方法，其中將所給予的HS/BMP2配制為藥物組合物或藥劑。20、第19段所述的方法，其中所述藥物組合物或藥劑還包含BMP2蛋白。21、一種促進(jìn)或抑制骨生成的方法，包括將HS/BMP2施用于骨前體細(xì)胞或骨干細(xì)胞。22、第21段所述的方法，其中所述骨前體細(xì)胞或骨干細(xì)胞與HS/BMP2體外接觸。23、第21段所述的方法，其中所述骨前體細(xì)胞或骨干細(xì)胞與HS/BMP2體內(nèi)接觸。24、第21段至第23段中任一段所述的方法，其中骨前體細(xì)胞或骨干細(xì)胞與BMP2 接觸，同時(shí)與HS/BMP2接觸。25、一種促進(jìn)或抑制軟骨組織形成的方法，包括向軟骨前體細(xì)胞或軟骨干細(xì)胞施用 HS/BMP2。26、第25段所述的方法，其中軟骨前體細(xì)胞或軟骨干細(xì)胞與HS/BMP2在體外接觸。27、第25段所述的方法，其中軟骨前體細(xì)胞或軟骨干細(xì)胞與HS/BMP2在體內(nèi)接觸。28、第25段至第27段中任一段所述的方法，其中軟骨前體細(xì)胞或軟骨干細(xì)胞與 BMP2接觸，同時(shí)與HS/BMP2接觸。29、一種用于修復(fù)、置換或再生需要治療的人或動(dòng)物患者中的結(jié)締組織的方法，該方法包括(i)將與HS/BMP2接觸的間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)足以使所述細(xì)胞形成結(jié)締組織的一段時(shí)間；(ii)收集該結(jié)締組織；(iii)將所述結(jié)締組織在創(chuàng)傷或疾病部位處植入到患者的身體中以修復(fù)、置換或再生患者的結(jié)締組織。30、第四段所述的方法，還包括使培養(yǎng)物中的間充質(zhì)細(xì)胞與外源BMP2接觸。31、在存在HS/BMP2的情況下，通過間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)獲得的結(jié)締組織。32、第31段中所述的結(jié)締組織，其中在存在外源BMP2，并且可選地在存在BMP2的情況下培養(yǎng)該間充質(zhì)細(xì)胞。33、一種藥物組合物，包含干細(xì)胞和HS/BMP2。34、第32段所述的藥物組合物，其中所述干細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞。
35、第33段或第34段所述的藥物組合物，其中所述組合物還包含BMP2。36、第33段至第35段中任一段的藥物組合物，用于治療創(chuàng)傷或疾病。37、一種治療需要治療的患者中的創(chuàng)傷或疾病的方法，包括向所述患者給予包含干細(xì)胞和HS/BMP2的藥物組合物。38、第37段所述的方法，其中所述干細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞。39、第37段或第38段所述的方法，其中所述方法還包括向患者給予BMP2。40、HS/BMP2在結(jié)締組織體外生長(zhǎng)中的應(yīng)用。41、一種用于體外生長(zhǎng)結(jié)締組織的方法，包括培養(yǎng)與外源加入的HS/BMP2接觸的間充質(zhì)干細(xì)胞。42、一種生物植入物，包含浸漬有HS/BMP2的固體或半固體基質(zhì)材料。43、第42段所述的生物植入物還浸漬有BMP2。44、第42段或第43段所述的生物植入物還浸漬有間充質(zhì)干細(xì)胞。45、一種試劑盒，包含對(duì)具有肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)具有高親合力的預(yù)定量的糖胺聚糖和預(yù)定量的所述蛋白質(zhì)。46、第45段所述的試劑盒，其中所述糖胺聚糖為HS/BMP2，所述蛋白質(zhì)為BMP2。優(yōu)選實(shí)施方式的說明HS/BMP2本發(fā)明涉及HS/BMP2，其可通過富集含有一種或多種GAG的化合物的混合物的方法獲得，所述GAG與對(duì)應(yīng)于BMP2的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽結(jié)合。該富集方法可用于分離 HS/BMP2。本發(fā)明還涉及富含HS/BMP2的化合物的混合物，以及使用這樣的混合物的方法。HS/BMP2被認(rèn)為能夠加強(qiáng)(例如，促進(jìn))BMP_2的活性，并且因此加強(qiáng)了它刺激干細(xì)胞增殖和骨形成的能力。除了可通過本文所述方法獲得之外，還可以在功能和結(jié)構(gòu)上限定HS/BMP2。在功能上，HS/BMP2能夠結(jié)合具有氨基酸序列SEQ ID NO :1或SEQID NO 6或由氨基酸序列SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 6組成的肽。優(yōu)選地，HS/BMP2結(jié)合SEQ ID NO :1或 6 的肽的 Kd 小于 100 μ M，更優(yōu)選地，小于 50口] 、4(^]\1、3(^]\1、2(^]\1或1(^]\1之一。優(yōu)選地，HS/BMP2還結(jié)合ΒΜΡ2蛋白，其Kd小于100 μ Μ，更優(yōu)選地，小于50 μ Μ、 40 μ Μ、30 μ Μ、20 μ m或10 μ M之一?？梢酝ㄟ^以下測(cè)定方法確定HS/BMP2和ΒΜΡ2蛋白之間的結(jié)合。將ΒΜΡ2以3 μ g/ml的濃度溶解于封閉液(Blocking Solution) (0. 2%明膠在SAB 中的溶液)，并用封閉液建立0-3 μ g/ml的稀釋系列。將200 μ 1的每種ΒΜΡ2的稀釋液分配到用肝素預(yù)涂覆的肝素/GAG結(jié)合板的三個(gè)孔中；在37°C溫育2小時(shí)，用SAB和200 μ 1的加入封閉液中的250ng/ml的生物素化抗BMP2小心清洗三次。在37°C溫育1小時(shí)，用SAB、 200 μ 1加入封閉液中的220ng/ml的ExtrAvidin-AP小心清洗三次，在37°C溫育30分鐘， 用SAB和自來水小心清洗三次以除去殘余液體，加入200 μ 1顯色試劑(SigmaFAST磷酸對(duì)硝基苯酯)。在室溫下溫育40分鐘，在1小時(shí)內(nèi)在405nm處讀取吸光度。在該測(cè)定中，可以通過測(cè)量吸光度來確定結(jié)合并且可相對(duì)于對(duì)照確定結(jié)合，所述對(duì)照例如是不加入硫酸類肝素的BMP2蛋白，或者加入了不與BMP2蛋白結(jié)合的硫酸類肝素的BMP2蛋白。相對(duì)于非特異性結(jié)合并且在HS/BMP2可通過以下方法選自其它硫酸類肝素和/或 GAG的情況下，HS/BMP2的結(jié)合優(yōu)選地為特異性的，所述方法涉及對(duì)表現(xiàn)出與SEQ ID NO=I 或SEQ ID NO :6的肽或與BMP2蛋白具有高親合力結(jié)合相互作用的硫酸類肝素的選擇。根據(jù)本發(fā)明的HS/BMP2優(yōu)選地使小鼠成肌細(xì)胞系C2C12細(xì)胞中BMP2誘導(dǎo)的堿性磷酸酶(ALP)活性增加到比單獨(dú)添加相應(yīng)量的BMP2蛋白或肝素所獲得的增加更高的程度。 優(yōu)選地，它還使C2C12細(xì)胞中BMP2誘導(dǎo)的ALP活性增加到比組合加入相應(yīng)量的BMP2蛋白和肝素，或者BMP2蛋白和與BMP2蛋白不能高親合力結(jié)合的硫酸類肝素所誘導(dǎo)的活性增加更高的程度(例如，參見圖46)?？梢酝ㄟ^實(shí)施以下ALP測(cè)定來測(cè)量ALP活性的增加。在37°C /5% CO2的條件下， 將C2C12細(xì)胞以20，000個(gè)細(xì)胞/cm2鋪于24孔板中的DMEM(例如，Sigma-Aldrich Inc.， St. Louis, MO)中，所述 DMEM 含有 10% FCS(例如，Lonza Group Ltd.，Switzerland)和抗生素(1%的青霉素和的鏈霉素)(例如，Sigma-Aldrich Inc.，St. Louis, MO)。24小時(shí)后，將培養(yǎng)基換成含有 100ng/mL BMP2(例如，R & D Systems, Minneapolis, MN) ,3mg/mL Celsus HS和不同濃度的BMP2特異性(+ve HS)和非特異性(_veHS) Celsus HS制劑的不同組合的5% FCS低血清培養(yǎng)基。3天后，使用含有Triton X_100、150mM NaClUOmM Tris pH 7. 4、2mM EDTA.0. 5% Ig印al (NP40)、0· 十二烷基硫酸鈉(SDS)和蛋白酶抑制劑混合物III (Calbiochem,德國)的RIPA緩沖液進(jìn)行細(xì)胞溶解。通過使用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(Pierce Chemical Co. , rockford, IL)確定細(xì)胞裂解物的蛋白質(zhì)含量。然后，通過將細(xì)胞裂解物與磷酸對(duì)硝基苯酯底物anvitrogen，Carload，CA) —同溫育來確定細(xì)胞裂解物中的ALP活性。將讀數(shù)歸一化為總蛋白量并表示為相對(duì)于只含有BMP2處理組的相對(duì)量。還可以通過如圖47所示出的以下ALP染色實(shí)驗(yàn)方案的免疫組織化學(xué)技術(shù)來跟蹤 C2C12細(xì)胞中ALP活性的提高。ALP染色。如上述測(cè)定方法中所述，培養(yǎng)C2C12細(xì)胞。處理 3天后，在PBS中清洗細(xì)胞層，并根據(jù)制造商的說明書使用白細(xì)胞堿性磷酸酶試劑盒(例如， Sigma-Aldrich Inc. ,St. Louis,MO)進(jìn)行染色。將細(xì)胞層固定在用檸檬酸鹽緩沖的60%丙酮中，并且在含有萘酚AS-MX堿性磷酸酶和重氮鹽的堿性染料混合物中染色。使用邁爾蘇木紫染液(Mayer，s Hematoxylin solution)進(jìn)行核染色。這些技術(shù)可用于將HS/BMP2鑒別為與非特異性硫酸類肝素(例如，不結(jié)合BMP-2 蛋白的硫酸類肝素)相比，能夠?qū)2C12細(xì)胞中BMP2蛋白誘導(dǎo)的ALP活性更大程度增加的硫酸類肝素。根據(jù)本發(fā)明的HS/BMP2還將BMP2信號(hào)作用延長(zhǎng)到等于或超過肝素那些作用的水平。這可以通過下列測(cè)定進(jìn)行評(píng)價(jià)。將C2C12細(xì)胞暴露于(i)無、(ii) RBMP2、(iii)BMP2+ 肝素或(iv)BMP2+HS/BMP2 72小時(shí)，并且通過免疫印跡法監(jiān)測(cè)BMP2特異性胞內(nèi)信號(hào)分子 Smadl/5/8的磷酸化水平。HS/BMP2的重要功能特性是其增強(qiáng)骨修復(fù)過程的能力，尤其是在哺乳動(dòng)物受試者中。這可以在骨修復(fù)模型中進(jìn)行測(cè)試，如實(shí)施例8和實(shí)施例9中所述的模型，其中比較了對(duì)照動(dòng)物(例如，未給予HS的動(dòng)物或者給予了不結(jié)合BMP2蛋白或SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 6所示的肽的HS的動(dòng)物)和HS/BMP2治療動(dòng)物中骨修復(fù)的速度和質(zhì)量。通過分析傷口部位處的骨體積隨時(shí)間的生成(例如，通過對(duì)傷口進(jìn)行X射線和微CT成像分析)來評(píng)價(jià)骨修復(fù)的速度和質(zhì)量。在結(jié)構(gòu)上，已發(fā)現(xiàn)HS/BMP2中N-乙酰-D-葡糖胺(GlcNAc)殘基的N-硫酸化對(duì)于保持對(duì)BMP2蛋白的結(jié)合親合力是重要的。N-脫硫酸化顯示會(huì)導(dǎo)致BMP2蛋白結(jié)合親合力顯著降低(圖49)。還發(fā)現(xiàn)N-硫酸葡糖胺(GlcNS)殘基的6_0_硫酸化(C6處的0_硫酸化)對(duì)于保持對(duì)BMP2蛋白的結(jié)合親合力具有中等程度的重要性。6-0-脫硫酸化導(dǎo)致BMP2蛋白結(jié)合親合力發(fā)生一定程度的降低(圖49)。發(fā)現(xiàn)IdoA和/或D-葡萄糖醛酸(GlcA)殘基的2_0_硫酸化(C2處的0_硫酸化) 不影響B(tài)MP2蛋白結(jié)合。這樣，HS/BMP2可以可選地為2_0_硫酸化的或2_0_脫硫酸化的。圖43示出了 HS/BMP2的二糖組成。根據(jù)本發(fā)明的HS/BMP2包括二糖組成在圖43 中標(biāo)題為“BMP2特異性HS”一欄中對(duì)每種二糖所示數(shù)值的士 10% (更優(yōu)選士9^^8^^7%、 6%、5%、4%、3%、2% 或之一)以內(nèi)的并且對(duì) BMP2 蛋白或 SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO: 6所示的肽表現(xiàn)出高親合力結(jié)合的硫酸類肝素，如本說明書中所述的。還通過進(jìn)行表面等離子共振分析說明了 HS/BMP2與不結(jié)合BMP2蛋白的硫酸類肝素相比的結(jié)構(gòu)差異。例如，圖44所示的角偏移曲線可用于區(qū)分HS/BMP2和其它硫酸類肝素。通過進(jìn)行強(qiáng)陰離子交換高壓液相色譜法(SAX-HPLC)進(jìn)一步說明了 HS/BMP2與不結(jié)合BMP2蛋白的硫酸類肝素相比的結(jié)構(gòu)差異。圖40示出了 HS/BMP2的SAX-HPLC譜圖，其可以與不結(jié)合BMP2蛋白的硫酸類肝素的SAX-HPLC譜圖(圖41和圖42)進(jìn)行比較。為了鑒別HS/BMP2，本發(fā)明人發(fā)明了涉及富集對(duì)具有肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的特定多肽表現(xiàn)出結(jié)合的糖胺聚糖分子的方法。從而能夠鑒別分離的GAG混合物和/或分子并測(cè)試它們對(duì)表達(dá)含有肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的細(xì)胞和組織的生長(zhǎng)和分化的調(diào)節(jié)能力。這使得能夠受控地分析特定GAG糖序列對(duì)細(xì)胞和組織的生長(zhǎng)和分化的體外和體內(nèi)影響。本發(fā)明人對(duì)骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP》應(yīng)用了該方法以分離和表征對(duì)BMP2具有高結(jié)合性的GAG。因此，為了鑒別HS/BMP2，本發(fā)明人提供了分離能夠與具有肝素/類肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)結(jié)合的糖胺聚糖的方法，所述方法包括(i)提供固體載體，其具有附著到該載體上的多肽分子，其中所述多肽包含肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域；(ii)使所述多肽分子與包含糖胺聚糖的混合物接觸從而使得能夠形成多肽-糖胺聚糖復(fù)合物；(iii)將多肽-糖胺聚糖復(fù)合物與該混合物的其余部分分開；(iv)使糖胺聚糖從多肽-糖胺聚糖復(fù)合物解離；(ν)收集解離的糖胺聚糖。本發(fā)明人還提供了通過它們調(diào)節(jié)細(xì)胞或組織的生長(zhǎng)或分化的能力所鑒別的分離的糖胺聚糖。為了實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)，他們提供了鑒別能夠刺激或抑制細(xì)胞和/或組織的生長(zhǎng)和 /或分化的糖胺聚糖的方法，所述方法包括(i)提供固體載體，其具有附著到該載體上的多肽分子，其中所述多肽包含肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域；(ii)使所述多肽分子與包含糖胺聚糖的混合物接觸從而使得能夠形成多肽-糖胺聚糖復(fù)合物；
(iii)將多肽-糖胺聚糖復(fù)合物與混合物的其余部分分開；(iv)使糖胺聚糖從多肽-糖胺聚糖復(fù)合物解離；(ν)收集解離的糖胺聚糖；(vi)將收集的糖胺聚糖添加到細(xì)胞或組織中，其中存在含有肝素結(jié)構(gòu)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(vii)測(cè)量以下一項(xiàng)或多項(xiàng)細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、一種或多種蛋白質(zhì)標(biāo)記物的表達(dá)。本發(fā)明人使用這些方法來鑒別能夠結(jié)合于ΒΜΡ2的GAG(他們稱之為HS/BMP2或 HS3或HS-3)，其中在本發(fā)明人的方法中使用的多肽包含來自ΒΜΡ2的氨基酸序列的SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 6的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明人的方法中，包含GAG的混合物可以含有合成糖胺聚糖。然而，得自細(xì)胞或組織的GAG是優(yōu)選的。例如，所述混合物可以含有細(xì)胞外基質(zhì)，其中所述細(xì)胞外基質(zhì)材料是通過原位刮取活組織獲得的(即，直接從獲得所述材料的人或動(dòng)物身體中的組織獲得)或者通過刮取已從人或動(dòng)物身體中提取的組織(活或死組織)獲得。可替代地，該細(xì)胞外基質(zhì)材料可以活自在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的細(xì)胞。該細(xì)胞外基質(zhì)材料可以獲自結(jié)締組織或結(jié)締組織細(xì)胞，例如， 骨、軟骨、肌肉、脂肪、韌帶或腱。對(duì)于HS/BMP2的分離，細(xì)胞外基質(zhì)材料的一個(gè)適合來源為成骨細(xì)胞，如小鼠MC3T3細(xì)胞。GAG組分可以從組織或細(xì)胞樣品中提取或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的一系列常規(guī)分離步驟(例如，陰離子交換色譜法)提取。GAG混合物可以含有不同類型糖胺聚糖的混合物，所述糖胺聚糖可以包括硫酸葡聚糖、硫酸軟骨素和硫酸類肝素。優(yōu)選地，與固體載體接觸的GAG混合物富含硫酸類肝素。 可通過對(duì)GAG混合物對(duì)適當(dāng)流分具有選擇的實(shí)施柱色譜法以獲得富含硫酸類肝素的GAG部分，例如，弱、中或強(qiáng)陰離子交換色譜法以及強(qiáng)高壓液相色譜法(SAX-HPLC)?？蓪?duì)收集的GAG進(jìn)行進(jìn)一步分析以鑒別GAG，例如，確定GAG組成或序列，或確定 GAG的結(jié)構(gòu)特征。GAG的結(jié)構(gòu)通常是高度復(fù)雜的，并且考慮到現(xiàn)有可用的分析技術(shù)，在大多數(shù)情況下對(duì)GAG序列結(jié)構(gòu)進(jìn)行準(zhǔn)確確定是不可能的。然而，可對(duì)收集的GAG分子進(jìn)行部分或完全糖消化(例如，通過亞硝酸進(jìn)行化學(xué)消化或通過如肝素酶III的裂合酶進(jìn)行酶消化)以獲得GAG的具有特征性和診斷性的糖片段。具體地，消化得到二糖(或四糖)可用于測(cè)量所獲得的每種二糖的百分比，其將提供 GAG的特征二糖“指紋圖譜”。還可以確定GAG的硫酸化類型并且利用該硫酸化類型來確定GAG結(jié)構(gòu)。例如，對(duì)于硫酸類肝素，在氨基糖以及在C2、C3和C6位置處的硫酸化類型可以用于表征硫酸類肝素。二糖分析、四糖分析和硫酸化分析可以與諸如HPLC、質(zhì)譜和NMR的其它分析技術(shù)結(jié)合使用，所述其它分析技術(shù)可以各自提供GAG的獨(dú)特光譜。組合時(shí)，這些技術(shù)可提供GAG 的明確結(jié)構(gòu)表征。GAG與肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間的高親合力結(jié)合相互作用表明GAG將含有有助于高親合力結(jié)合相互作用的特定糖序列。其它步驟可以包括參與該結(jié)合相互作用的GAG完整或部分糖序列或GAG關(guān)鍵部分的確定。
可以用裂解糖胺聚糖鏈的試劑(例如，裂合酶)處理GAG-多肽復(fù)合物。裂合酶處理可以切割結(jié)合的GAG上不參與多肽結(jié)合相互作用的部分。參與多肽結(jié)合相互作用的GAG 部分可以被保護(hù)不受裂合酶的作用。除去裂合酶后，例如，在清洗步驟后，仍保持與多肽結(jié)合的GAG分子代表了多肽的特異結(jié)合配偶體(“GAG配體”)。由于較短GAG分子的復(fù)雜性較低，因此GAG配體解離和收集后，可以期望獲得GAG配體的高度結(jié)構(gòu)表征。例如，糖序列 (即，包含在GAG配體中的單糖一級(jí)(線性)序列)、硫酸化類型、二糖和/或四糖消化分析、 NMR光譜、質(zhì)譜光譜和HPLC譜的任何組合可以提供GAG配體的高水平結(jié)構(gòu)表征。如本文所使用的，術(shù)語“富集”、“富集的”等說明了這樣一種方法(或狀態(tài))，即混合物的相對(duì)組成以由一種或多種實(shí)體組成的該混合物流分增加，而由一種或多種不同實(shí)體組成的該混合物部分降低的方式改變(或已經(jīng)發(fā)生改變)。通過富集分離的GAG可以是純的，即基本只含有一種類型的GAG，或者可以繼續(xù)為不同類型GAG的混合物，但是相比于起始混合物，該混合物具有較高比例的與肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合的特定GAG。在與表達(dá)或包含含有肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的細(xì)胞或組織接觸時(shí)，所鑒別的 GAG優(yōu)選地表現(xiàn)出功能性作用。該功能性作用可以是調(diào)節(jié)或增強(qiáng)作用。該功能性作用可以是促進(jìn)(刺激)或抑制某種類型細(xì)胞的增殖或者一種細(xì)胞類型向另一種細(xì)胞類型的分化，或者一種或多種蛋白標(biāo)記物的表達(dá)。例如，GAG可促進(jìn)細(xì)胞增殖 (即，細(xì)胞數(shù)目增加)，或者促進(jìn)干細(xì)胞向特化細(xì)胞類型的分化(例如，結(jié)締組織中的間充質(zhì)干細(xì)胞)，促進(jìn)或抑制指示細(xì)胞多能性或分化狀態(tài)的蛋白標(biāo)記物的表達(dá)(例如，標(biāo)記物，如堿性磷酸酶活性、RUNX2、奧斯特利斯(osterix)、膠原I、II、IV、VII、X、骨橋蛋白、骨鈣素、 BSPII、S0X9、聚集蛋白聚糖、ALBP、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白-a (C/EBP α )、脂肪細(xì)胞脂質(zhì)結(jié)合蛋白(ALBP)、堿性磷酸酶(ALP)、骨唾液酸糖蛋白2 (BSPII)、膠原2al (Co 112a)和S0X9的檢測(cè))。如本文所使用的，術(shù)語“調(diào)節(jié)作用”應(yīng)理解為表示第一實(shí)體對(duì)第二實(shí)體的作用，其中通過第一實(shí)體的存在改變了第二實(shí)體在另一過程中的正常功能。該調(diào)節(jié)作用可以是激動(dòng) (或促進(jìn)，agonistic)或拮抗的。該調(diào)節(jié)作用可以是增強(qiáng)作用。術(shù)語“增強(qiáng)作用”應(yīng)理解為表示提高效力的作用。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，術(shù)語“增強(qiáng)作用”是指第一實(shí)體對(duì)第二實(shí)體的作用，該作用使第二實(shí)體在另一過程中的效力增加。在本發(fā)明的其它優(yōu)選實(shí)施方式中，增強(qiáng)作用應(yīng)理解為表示分離的GAG對(duì)肝素結(jié)合因子的作用，其中所述作用使所述肝素結(jié)合因子的效力增加。該增強(qiáng)作用可以是肝素結(jié)合因子生物利用率的提高。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，增強(qiáng)作用是BMP2生物利用率的提高。測(cè)量肝素結(jié)合因子生物利用率提高的一種方法是通過確定肝素結(jié)合因子局部濃度的增加。增強(qiáng)作用可以是保護(hù)肝素結(jié)合因子不被降解。在本發(fā)明的一種特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，增強(qiáng)作用是保護(hù)BMP-2不被降解。確定肝素結(jié)合因子降解降低的一種方法是通過測(cè)量肝素結(jié)合因子半衰期的增加。增強(qiáng)作用可以是將肝素結(jié)合因子與細(xì)胞受體隔離或者可以是穩(wěn)定配基-受體相互作用?？梢酝ㄟ^使用適當(dāng)測(cè)定來確定增強(qiáng)作用(例如，生長(zhǎng)或分化的調(diào)節(jié))。例如，可以通過ELISA確定HS對(duì)BMP-2穩(wěn)定性的作用?？梢酝ㄟ^測(cè)量SMAD 1、5或8中的一種或多種的激活/表達(dá)，或者測(cè)量一種或多種成骨標(biāo)記物基因(如Rimx2、堿性磷酸酶、奧斯特利斯 (Osterix)、骨鈣素和BSP1)的表達(dá)，或者使用如茜素紅和馮庫薩(von Kossa)染色的染色方法測(cè)量礦化作用的水平來確定HS對(duì)BMP-2活力的作用。如本文所使用的，“接觸”的過程包括使兩種或更多種不連續(xù)實(shí)體在物理上靠近。 “接觸”的過程包括使兩種或更多種不連續(xù)實(shí)體在物理上靠近一段時(shí)間并且在一定的條件下，從而足以使兩種或更多種不連續(xù)實(shí)體的一部分在分子水平上發(fā)生相互作用。優(yōu)選地，如本文所使用的，“接觸”的過程包括使具有一個(gè)或多個(gè)GAG的化合物的混合物與對(duì)應(yīng)于肝素結(jié)合因子的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽靠近?！敖佑|”過程的實(shí)例包括混合、溶解、溶脹、清洗。 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，GAG混合物與多肽的“接觸”足以在彼此表現(xiàn)出高親合力的GAG和多肽之間形成復(fù)合物，其可以是共價(jià)的，但優(yōu)選非共價(jià)的。多肽可以包含具有肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的所選蛋白質(zhì)的全長(zhǎng)或接近全長(zhǎng)的一級(jí)氨基酸序列。由于較長(zhǎng)的多肽中會(huì)發(fā)生折疊從而會(huì)導(dǎo)致肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域可能被掩蓋從而不能與 GAG混合物接觸，因此優(yōu)選該多肽較短。優(yōu)選地，多肽將具有包含肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列并且可選地在肽的N和C末端之一或每一個(gè)包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸。這些另外的氨基酸可以使得將多肽連接至固體載體所需的接頭或連接分子能夠被加入到多肽中。在本發(fā)明人發(fā)明的方法的優(yōu)選實(shí)施方式中，除了肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的氨基酸數(shù)之外，所述多肽還含有1-20個(gè)，更優(yōu)選地1-10個(gè)，更優(yōu)選地1-5個(gè)其它氨基酸。在一些實(shí)施方式中，肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列占多肽氨基酸的至少80 %，更優(yōu)選地占至少90 %， 更優(yōu)選地占至少95%。為了將多肽附著到固體載體的表面上，優(yōu)選地對(duì)多肽進(jìn)行修飾以包含分子標(biāo)記， 并且修飾固體載體的表面以摻入對(duì)該分子標(biāo)記具有高親合力的相應(yīng)分子探針，即，分子標(biāo)記和探針形成結(jié)合對(duì)。標(biāo)記和/或探針可以選自以下任一種抗體、細(xì)胞受體、配體、生物素、這些結(jié)構(gòu)的任何片段或衍生物、上述項(xiàng)的任意組合，或者通過其可以設(shè)計(jì)或配置探針以進(jìn)行特異性結(jié)合或聯(lián)合的任何其它結(jié)構(gòu)。適合用作標(biāo)記和探針的優(yōu)選結(jié)合對(duì)為生物素和抗生物素蛋白。多肽來源于所關(guān)心的蛋白質(zhì)，其在本發(fā)明中為BMP2?！皝碓从凇北硎居捎诤兴P(guān)心蛋白質(zhì)中存在的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，因此選擇、選定或制備了該多肽?？梢孕揎椝P(guān)心蛋白質(zhì)中出現(xiàn)的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列(例如)以研究肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域序列的變化對(duì)GAG結(jié)合的影響。在本說明書中，所述蛋白質(zhì)為BMP2。來自BMP2的優(yōu)選肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列為 QAKHKQRKRLKSSCKRHP (SEQ ID NO :1)，其位于 SEQ ID NO :2(圖 35)的氨基酸 283-300 處，或者為 QAKHKQRKRLKSSCKRH(SEQ ID NO 6)，其位于 SEQ ID NO 2 的氨基酸 283-299 處。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，特定多肽的氨基酸序列的微小改變會(huì)保持該部分的固有功能。還應(yīng)理解用同配的(isosteric)和/或等電子的其它氨基酸殘基取代肽內(nèi)的某些氨基酸殘基可保持或改善未取代肽的某些性能。這些改變也涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如， 有時(shí)可以用氨基酸丙氨酸取代氨基酸甘氨酸(反之亦然)并且同時(shí)保持該肽的一種或多種性能。術(shù)語“同配的”是指兩種實(shí)體之間的空間類似性。在中等高溫下同配部分的兩個(gè)實(shí)例為異丙基和叔丁基基團(tuán)。術(shù)語“等電子的”是指兩種實(shí)體之間的電子類似性，實(shí)例為兩種實(shí)體具有相同或相似PKa功能性的情況。對(duì)應(yīng)于肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽可以是合成的或重組的。固體載體可以是具有可通過共價(jià)或非共價(jià)鍵直接或間接連接于分子的表面的任何基底。所述固體載體可以包括能夠?yàn)檫B接到該表面上的探針提供物理支持的任何基底材料。它可以是基質(zhì)載體。該材料通常能夠承受與將探針連接至所述表面有關(guān)的條件以及執(zhí)行測(cè)定期間所遇到的任何后續(xù)處理、操作和加工。所述材料可以是天然存在的材料、合成材料或經(jīng)修飾的天然材料。所述固體載體可以是塑料材料(包括聚合物，例如，聚氯乙烯)； 環(huán)-烯烴共聚物、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚甲基丁烯)、聚苯乙烯、 聚甲基丙烯酸酯、聚(對(duì)苯二甲酸亞乙酯)、聚四氟乙烯(PTFE或Teflon )、尼龍，聚(丁酸乙烯酯))等，它們單獨(dú)使用或結(jié)合其它材料使用?？梢钥紤]諸如玻璃的其它剛性材料，其包括二氧化硅并且還包括，例如，可作為生物玻璃獲得的玻璃?？梢允褂玫钠渌牧习ǘ嗫撞牧希?，可控多孔玻璃珠。還考慮了能夠(例如)在其表面上摻入一種或多種官能團(tuán) (如氨基、羧基、巰基或羥基官能團(tuán)中的任一種或多種)的本領(lǐng)域已知的任何其它材料。優(yōu)選的固體載體包括將多肽固定在柱表面上的柱。所述表面可以是該柱的壁和/ 或可以由裝填到柱中央空間內(nèi)的珠提供。可以將多肽固定在固體載體上。固定方法的實(shí)例包括吸附、共價(jià)結(jié)合、包埋和膜包覆。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，多肽和基質(zhì)之間的相互作用基本上是永久性的。在本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式中，肽和基質(zhì)之間的相互作用對(duì)離子交換色譜具有適當(dāng)?shù)亩栊?。在?yōu)選的安排中，將多肽連接到固體載體的表面。應(yīng)理解本領(lǐng)域技術(shù)人員將具有許多種可選項(xiàng)以供選擇從而將兩個(gè)實(shí)體彼此化學(xué)和/或物理連接。這些選項(xiàng)均涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在優(yōu)選的安排中，通過生物素與抗生蛋白鏈菌素之間的相互作用將多肽吸附到固體載體上。在這種安排的代表性實(shí)例中，將生物素分子共價(jià)鍵合到多肽上，生物素-多肽綴合物與抗生蛋白鏈菌素結(jié)合，而抗生蛋白鏈菌素又已經(jīng)共價(jià)鍵合到固體載體上。在另一種安排中，間隔區(qū)或接頭部分可以用于將生物素分子與多肽連接，和/或?qū)⒖股鞍祖溇嘏c基質(zhì)連接。通過將GAG混合物與固體載體接觸使得形成了 GAG-多肽復(fù)合物。通過(例如) 清洗固體載體以洗脫未結(jié)合材料將剩余的混合物從固體載體中除去從而使這些混合物與剩余的混合物分離。在使用柱作為固體載體的情況下，可以從柱上洗脫GAG混合物的未結(jié)合組分，從而留下與柱結(jié)合的GAG-多肽復(fù)合物。應(yīng)理解某些寡糖可通過非特異方式與多肽相互作用。在某些實(shí)施方式中，通過非特異方式與多肽相互作用的寡糖可以包括在富含調(diào)節(jié)肝素結(jié)合因子作用的一種或多種GAG 的化合物的混合物中或排除在所述混合物之外。非特異相互作用的實(shí)例為在合適尺寸和/ 或形狀分子的袋(pocket)中的暫時(shí)包覆。另外，應(yīng)理解這些寡糖可能要比對(duì)肽根本未表現(xiàn)出相互作用的那些寡糖洗脫得更慢。另外，應(yīng)理解非特異結(jié)合的化合物可能不需要輸入相同的外界刺激以使得它們?nèi)缤ㄟ^特異方式結(jié)合(例如，通過離子相互作用)的那些化合物一樣被洗脫。本發(fā)明人的方法能夠?qū)⒐烟腔旌衔锓殖稍摶旌衔锏囊韵履切┙M分以特異方式與多肽結(jié)合的那些；以非特異方式與多肽結(jié)合的那些；和不與多肽結(jié)合的那些。對(duì)每一種GAG-肽對(duì)運(yùn)用性地(operationally)定義了這些名稱。通過改變發(fā)生GAG和多肽結(jié)合的固體載體表面上所存在的條件(例如，鹽濃度)，
18可以選擇對(duì)肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有最大親合力和/或特異性的那些GAG。因此，可以獲得對(duì)所關(guān)心蛋白和/或所關(guān)心蛋白的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有高結(jié)合親合力的GAG。結(jié)合親合力(Kd)可以選自下列之一小于101^、小于11^、小于ΙΟΟηΜ、小于 ΙΟηΜ、小于 InM、小于 IOOpMo通過所述方法獲得的GAG可用于一系列體外和/或體內(nèi)應(yīng)用中?？梢蕴峁〨AG 用于刺激或抑制體外細(xì)胞或組織培養(yǎng)物中或者體內(nèi)細(xì)胞或組織中的細(xì)胞或組織的生長(zhǎng)和/ 或增殖和/或分化。出于該目的，可以提供作為制劑的GAG。例如，可以提供培養(yǎng)基，其包含通過所述方法獲得的GAG，即，包含HS/BMP2?？梢允占诖嬖贖S/BMP2的情況下從體外細(xì)胞或組織培養(yǎng)物中獲得的細(xì)胞或組織并將其植入到需要治療的人或動(dòng)物患者中。因此，提供了細(xì)胞和/或組織植入的方法，所述方法包括以下步驟(a)體外培養(yǎng)與HS/BMP2接觸的細(xì)胞和/或組織；(b)收集所述細(xì)胞和/或組織；(c)將所述細(xì)胞和/或組織植入到需要治療的人或動(dòng)物受試者中。可對(duì)部分(a)中與HS/BMP2接觸的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)足以使所述細(xì)胞或組織生長(zhǎng)、增殖或分化的一段時(shí)間。例如，所述的一段時(shí)間可以選自至少5天、至少10天、至少20天、 至少30天或至少40天。在另一實(shí)施方式中，可以配制HS/BMP2以在醫(yī)療方法中使用，包括創(chuàng)傷或疾病的預(yù)防或治療?？梢蕴峁┌琀S/BMP2和藥用稀釋劑、載體或佐劑的藥物組合物或藥劑。可以提供該類藥物組合物或藥劑以用于創(chuàng)傷或疾病的預(yù)防或治療。還提供了 HS/BMP2在制造用于預(yù)防或治療創(chuàng)傷或疾病的藥劑中的使用?？蛇x地，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物和藥劑還可以包含具有與GAG結(jié)合的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的所關(guān)心的蛋白(即BMP2)。在其它實(shí)施方式中，所述藥物組合物和藥劑還可以包含干細(xì)胞，例如，間充質(zhì)干細(xì)胞。創(chuàng)傷或疾病的治療可以包括細(xì)胞或組織的修復(fù)、再生或置換，所述組織如結(jié)締組織(例如，骨、軟骨、肌肉、脂肪、腱或韌帶)。對(duì)于組織修復(fù)，可以將包含HS/BMP2的藥物組合物或藥劑直接施用于創(chuàng)傷或疾病部位以刺激新組織的生長(zhǎng)、增殖和/或分化從而起到修復(fù)創(chuàng)傷的作用或者治愈或減輕疾病狀況(例如，減輕癥狀)的作用?？梢酝ㄟ^將干細(xì)胞混合在藥物組合物或藥劑中來改善組織的修復(fù)或再生。對(duì)于組織置換，可以在細(xì)胞和/或組織的體外培養(yǎng)期間使HS/BMP2與細(xì)胞和/或組織接觸以產(chǎn)生用于在患者創(chuàng)傷或疾病部位植入的細(xì)胞和/或組織。細(xì)胞或組織的植入可以通過受傷或患病組織的置換來用于對(duì)患者的受傷或患病組織產(chǎn)生修復(fù)作用。這可以包括受傷/患病組織的切除和通過與HS/BMP2接觸的細(xì)胞和/或組織的培養(yǎng)所制備的新組織的植入。因此，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物和藥劑可以包含以下之一(a) HS/BMP2 ；(b) HS/BMP2與干細(xì)胞結(jié)合；(c)HS/BMP2與含有HS/BMP2結(jié)合的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(即，SEQ IDNO :1或SEQ ID NO 6)的蛋白結(jié)合；
(d)HS/BMP2與干細(xì)胞和含有HS/BMP2結(jié)合的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(即，SEQ ID NO 1 或SEQ ID NO 6)的蛋白結(jié)合；(e)從與HS/BMP2接觸的細(xì)胞或組織的培養(yǎng)物中獲得的組織或細(xì)胞。HS/BMP2可用于身體組織的修復(fù)或再生，特別是骨再生、神經(jīng)再生、骨胳組織構(gòu)建、 心血管創(chuàng)傷修復(fù)以及胚胎和成體干細(xì)胞的擴(kuò)增和自更新。因此，HS/BMP2可用于預(yù)防或治療多種疾病和創(chuàng)傷，其包括骨關(guān)節(jié)炎、軟骨置換、任何種類的斷骨(例如，椎間盤融合治療、 長(zhǎng)骨斷裂、顱骨缺損)、臨界或不連接骨缺損再生。HS/BMP2在組織修復(fù)、再生或置換中的應(yīng)用可以包括在傷口愈合中的應(yīng)用，例如， 加速傷口愈合、疤痕或骨組織愈合以及組織移植。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含HS/BMP2的生物支架。在一些實(shí)施方式中，可以在整形外科、血管、假體、皮膚和角膜應(yīng)用中使用本發(fā)明的生物支架。本發(fā)明所提供的生物支架包括延長(zhǎng)釋放藥物遞送裝置、組織瓣膜、組織瓣膜小葉、藥物洗脫支架、血管移植物、傷口愈合或皮膚移植物以及整形外科假體，如骨、韌帶、腱、軟骨和肌肉。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，生物支架是導(dǎo)管，其中內(nèi)(和/或外)表面包含連接到該導(dǎo)管上的一種或多種 GAG化合物(包括HS/BMP2)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了通過所述方法分離的一種或多種GAG(包括HS/ BMP2)，其用作佐劑。所述佐劑可以是免疫佐劑。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了藥用制劑，其包含含有一種或多種GAG的化合物的混合物，所述混合物相對(duì)于HS/BMP2含量豐富。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了藥用制劑，其包含(i)包含一種或多種GAG的化合物的混合物，所述混合物中富含HS/BMP2 ；和(ii)BMP-2,其用于單獨(dú)、同時(shí)或順序給予。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述制劑包含含有一種或多種GAG的化合物的混合物，所述混合物富含緊密混合物(均勻混合物，intimate admixture)中的HS/BMP2和BMP-2，并且向需要治療的患者同時(shí)給予所述制劑。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了在組織修復(fù)或再生中使用的試劑盒，所述試劑盒包含⑴預(yù)定量的HS/BMP2，和(ii)預(yù)定量的BMP2?？蓪⒈景l(fā)明富集的混合物的化合物作為其藥用鹽給予受試者。例如，本發(fā)明富集的混合物的化合物的堿性鹽包括，但不限于，與可藥用陽離子所形成的那些鹽，所述可藥用陽離子如鈉、鉀、鋰、鈣、鎂、銨和烷基銨離子。陽離子鹽包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，例如，鈉鹽或鉀鹽。應(yīng)理解，可以將具有羧基的本發(fā)明富集的混合物的化合物以可給予的前體藥物的形式遞送，其中酸部分被酯化(以具有-C02R’的形式)。術(shù)語“前體藥物”具體地涉及-OR’ 基團(tuán)體內(nèi)轉(zhuǎn)化為-OH基團(tuán)，或其來源的羧酸根陰離子。因此，本發(fā)明的前體藥物可以起到提高藥物吸收和/或藥物向細(xì)胞遞送的作用?？梢酝ㄟ^細(xì)胞酶(如脂肪酶或酯酶)或通過化學(xué)切割(如體內(nèi)酯水解)促進(jìn)前體藥物的體內(nèi)轉(zhuǎn)化?？蓪⒏鶕?jù)本發(fā)明各方面的藥劑和藥物組合物配制成用于通過多種途徑施用，包括，但不限于，疾病或創(chuàng)傷部位處的注射?？梢詫⑺巹┖徒M合物配制成液體或固體形式?？梢耘渲埔后w制劑以用于通過注射對(duì)人或動(dòng)物身體的所選區(qū)域施用。
優(yōu)選地，以“治療有效量”給予，這足以顯示出對(duì)個(gè)體的益處。所給予的實(shí)際量以及給藥速率和時(shí)間過程將取決于所治療的創(chuàng)傷或疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度。治療的確定， 例如，劑量的決定等，是全科醫(yī)生及其他醫(yī)生的職責(zé)，并且通常會(huì)考慮待治療的病癥、個(gè)體患者的病況、遞送位點(diǎn)、給藥方法以及醫(yī)師已知的其它因素?？梢栽凇袄酌黝D藥物科學(xué) (Remington ‘ sPharmaceutical Sciences)，，，第 20 版，2000, pub. Lippincott, Williams &ffiIkins中查找到上述技術(shù)和方案的實(shí)例。在本說明書中，待治療的患者可以是任何動(dòng)物或人。所述患者可以是非人哺乳動(dòng)物，但是更優(yōu)選地為人類患者。所述患者可以是男性或女性。如所說明的，可以體外或體內(nèi)實(shí)施根據(jù)本發(fā)明的方法。術(shù)語“體外”旨在涵蓋使用培養(yǎng)物中細(xì)胞的程序，而術(shù)語“體內(nèi)”旨在涵蓋使用完整多細(xì)胞有機(jī)體的程序。干細(xì)胞與HS/BMP2接觸的細(xì)胞包括干細(xì)胞。本文中所培養(yǎng)并描述的干細(xì)胞可以是任何種類的干細(xì)胞。它們可以是全能性或多能性的。它們可以是來自任何組織的胚胎干細(xì)胞或成體干細(xì)胞，并且可以是造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞或者間充質(zhì)干細(xì)胞。優(yōu)選地，它們是成體干細(xì)胞。更優(yōu)選地，它們是成體間充質(zhì)干細(xì)胞，例如，能夠分化成結(jié)締組織和/或骨細(xì)胞，如軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。干細(xì)胞可以獲自任何動(dòng)物或人，例如，非人動(dòng)物，例如，兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其它嚙齒動(dòng)物(包括來自嚙齒目中任何動(dòng)物的細(xì)胞)、貓、狗、豬、綿羊、山羊、牛、馬、非人靈長(zhǎng)類或其它非人脊椎動(dòng)物；和/或非人哺乳動(dòng)物；和/或人?？蛇x地，它們是非人的。在本說明書中，干細(xì)胞是指能夠分裂(即自更新)并且保持全能性或多能性并且如果需要能夠產(chǎn)生特化細(xì)胞的任何細(xì)胞類型。在本發(fā)明中所培養(yǎng)的干細(xì)胞可以獲自或來源于現(xiàn)有的培養(yǎng)物或者直接獲自或來源于任何成體、胚胎或胎兒組織，包括血液、骨髓、皮膚、上皮或者臍帶(通常被丟棄的組織)?？梢酝ㄟ^利用適合的測(cè)定來確定干細(xì)胞的多能性。這些測(cè)定可以包括檢測(cè)多能性的一種或多種標(biāo)記物，例如，堿性磷酸酶活性、檢測(cè)RUNX2、osterix、膠原I、II、IV、VII、 X、骨橋蛋白、骨鈣素、BSPII, S0X9、聚集蛋白聚糖、ALBP、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白-α (C/ ΕΒΡα)、脂肪細(xì)胞脂質(zhì)結(jié)合蛋白(ALBP)、堿性磷酸酶(ALP)、骨唾蛋白2、(BSPII)、膠原 2a1(Co112a)和 S0X9。將間充質(zhì)干細(xì)胞或人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞定義為具有產(chǎn)生軟骨、骨、肌肉、腱、韌帶和脂肪能力的多能性祖細(xì)胞。這些原始祖代細(xì)胞在出生后存在并顯示出干細(xì)胞的特征，即低發(fā)生率和廣泛的更新潛力。這些性質(zhì)結(jié)合它們的發(fā)育可塑性使得對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞置換受損組織的潛在使用產(chǎn)生了很大的興趣。本質(zhì)上，可以培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞以使它們的數(shù)量增加， 然后移植到創(chuàng)傷部位或者在接種到支架中/上后產(chǎn)生適當(dāng)?shù)慕M織構(gòu)建。因此，骨骼、肌肉、腱和韌帶修復(fù)的替代方法是在骨結(jié)合傳導(dǎo)或誘導(dǎo)支架以支持和引導(dǎo)性再生以及正確選擇特異性組織生長(zhǎng)因子的情況下，選擇、擴(kuò)增和調(diào)節(jié)適當(dāng)?shù)淖婕?xì)胞 (如，骨祖細(xì)胞)?？梢允褂眠x擇性標(biāo)記物分離和檢測(cè)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，所述標(biāo)記物例如來自 CD34+流分的STRO-I，其指示它們的骨髓再增殖潛力。這些細(xì)胞表面標(biāo)記物僅存在于間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞表面并且是細(xì)胞多能性的指征。通過微創(chuàng)技術(shù)能夠容易地從骨髓獲得間充質(zhì)細(xì)胞并且可以將其在培養(yǎng)物中擴(kuò)增并使其分化成所需的細(xì)胞系?？梢酝ㄟ^應(yīng)用特異性生長(zhǎng)因子來誘導(dǎo)分化。如骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β (TGF-β)超家族成員蛋白是間充質(zhì)干細(xì)胞軟骨形成和成骨分化的重要因子。適合的MSC可以獲自或來源于從骨髓抽出物中采集的骨髓單核細(xì)胞(BMMNC)(例如，Wexler等人，成人骨髓是人類間充質(zhì)“干”細(xì)胞的豐富來源，而臍帶和被動(dòng)員起來的成人血液貝Ij不是。(Adult bone marrow is a rich source of human mesenchyma 1"stem"ce 11 s but umbilical cord and mobilized adult blood are not.)HAEMOPOIESIS AND LEUCOCYTES British Journal of Haematology 121(2) :368-374, 2003 年 4 月)或者獲自或來源于臍帶的臍帶膠樣組織(華頓氏膠，Wharton' s Jelly)(例如，Ta等人，Long-term Expansion and Pluripotent Marker Array Analysis of Wharton ' sJelly-Derived Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells Dev. 2009 年 7 月 20 日(Epub))。如本領(lǐng)域所熟知的，可以通過應(yīng)用適合的分化因子從多能性干細(xì)胞的分化中獲得間充質(zhì)干細(xì)胞，所述多能性干細(xì)胞如人胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了包含通過本發(fā)明的任何方法所產(chǎn)生的干細(xì)胞或者它的片段或產(chǎn)物的藥物組合物。所述藥物組合物在醫(yī)療方法中有用。適合的藥物組合物還可以包含藥用載體、佐劑或稀釋劑。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，通過本發(fā)明的任何方法所產(chǎn)生的干細(xì)胞可以在醫(yī)療方法中使用，優(yōu)選地，提供醫(yī)療方法，包括向需要治療的個(gè)體給予治療有效量的所述藥劑或藥物組合物。通過根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)方法和技術(shù)獲得的干細(xì)胞可以用于分化為在醫(yī)療方法中使用的另一種細(xì)胞類型。因此，分化的細(xì)胞類型可以來源于并且可以視為通過所述培養(yǎng)方法和技術(shù)獲得的并且隨后能夠發(fā)生分化的干細(xì)胞的產(chǎn)物?？梢蕴峁┧幬锝M合物，其包含該類分化細(xì)胞(可選地)和藥用載體、佐劑或稀釋劑。該藥物組合物可以在醫(yī)療方法中使用。糖胺聚糖如本文所使用的，術(shù)語“糖胺聚糖”和“GAG”可以替換使用并且應(yīng)理解為是指多種包含寡糖的分子，其中那些結(jié)合的糖中的一種或多種具有氨基取代基或其衍生物。GAG的實(shí)例為硫酸軟骨素、硫酸角質(zhì)素、肝素、硫酸皮膚素、透明質(zhì)酸酯和硫酸類肝素。硫酸類肝素是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。如本文所使用的，術(shù)語“GAG”還延伸至涵蓋作為GAG綴合物的那些分子。GAG綴合物的實(shí)例為蛋白糖胺聚糖(PGAG，蛋白聚糖)，其中肽組分共價(jià)鍵合到寡糖組分上。 在本發(fā)明中，應(yīng)理解存在多個(gè)GAG化合物來源，包括天然的、合成的或半合成的來源。GAG的優(yōu)選來源為生物組織。GAG的優(yōu)選來源為干細(xì)胞。GAG的特別優(yōu)選來源為干細(xì)胞，其能夠分化為對(duì)應(yīng)于將要接受治療的受試者的組織的細(xì)胞。例如，GAG可以來源于前成骨細(xì)胞以用于骨再生或骨骼組織構(gòu)建。在本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，GAG可以來源于永生化細(xì)胞系。在本發(fā)明的其它優(yōu)選實(shí)施方式中，GAG可以來源于在生物反應(yīng)器中生長(zhǎng)的永生化細(xì)胞系。GAG的另一個(gè)優(yōu)選來源為合成來源。在這一方面，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的或能夠獲知的技術(shù)從將可商購起始材料轉(zhuǎn)化為更復(fù)雜的化學(xué)形式的合成加工中獲得GAG。這種可商購起始材料的實(shí)例為葡糖胺。GAG的另一個(gè)優(yōu)選來源為半合成來源。在這一方面，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的或能夠獲知的技術(shù)通過合成加工了具有所需材料天然起始材料的大部分復(fù)雜性的合成加工。該天然起始材料的實(shí)例為幾丁質(zhì)和葡聚糖，并且將起始材料加工成適合在本發(fā)明中使用的GAG混合物的合成步驟類型的實(shí)例為酰胺鍵水解、氧化和硫酸化。具有所需結(jié)構(gòu)的GAG的半合成途徑的另一個(gè)實(shí)例包括相關(guān)GAG的合成互變以獲得適合在本發(fā)明中使用的GAG。硫酸類肝素(HS)在本發(fā)明的優(yōu)選方面，糖胺聚糖或蛋白聚糖優(yōu)選為硫酸類肝素。類肝素硫酸蛋白聚糖(HSPG)代表蛋白聚糖的高度多樣化亞組，并且它們是由共價(jià)連接到蛋白質(zhì)主鏈的硫酸類肝素糖胺聚糖側(cè)鏈組成的。核心蛋白以三種主要形式存在 稱為基底膜蛋白聚糖的分泌形式、稱為磷脂?；嫉鞍拙厶堑腻^定在質(zhì)膜上的形式以及稱為多配體蛋白聚糖的跨膜形式。它們是哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面和大多數(shù)細(xì)胞外基質(zhì)的普遍組成。還存在其它蛋白質(zhì)，如集聚蛋白或淀粉樣前蛋白，其中HS鏈可以連接到不太常見的核心?！傲蛩犷惛嗡亍?“硫酸類肝素”或“HS”)最初是在高爾基體中作為由D-葡萄糖醛酸(GlcA)和N-乙酰-D-葡糖胺(GlcNAc)的串聯(lián)重復(fù)所組成的多糖進(jìn)行合成。隨后， 可以對(duì)剛合成的多糖進(jìn)行一系列的修飾步驟=GIcNAc的N-脫乙?；?N-硫酸化，GlcA向艾杜糖醛酸(IdoA)的C5差向異構(gòu)化，IdoA和GlcA在C2處的0-硫酸化，N-硫酸葡糖胺 (GlcNS)在C6處的0-硫酸化和GlcNS偶爾在C3處的0-硫酸化。HS的N-脫乙?；?N-硫酸化、2-0-、6-0_和3-0-硫酸化分別是通過HS N-脫乙?；?N-磺基轉(zhuǎn)移酶(HSNDST)、 HS 2-0-磺基轉(zhuǎn)移酶(HS2ST)、HS 6_0_磺基轉(zhuǎn)移酶(HS6ST)和HS 3_0_磺基轉(zhuǎn)移酶所介導(dǎo)的。在每個(gè)修飾步驟中，僅有一部分可能的底物被修飾，從而導(dǎo)致產(chǎn)生了相當(dāng)大的序列多樣性。HS的這種結(jié)構(gòu)復(fù)雜性使得難以確定它的序列并了解HS結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系。硫酸類肝素側(cè)鏈?zhǔn)怯赏ㄟ^(1 — 4)糖苷鍵連接的交替排列的D-葡萄糖醛酸或者 L-艾杜糖醛酸和D-葡糖胺所組成的。葡糖胺通常是N-乙酰化的或N-硫酸化的，并且糖醛酸和葡糖胺均可另外被0-硫酸化。特定HSPG對(duì)特定結(jié)合配偶體的特異性是由連接到葡糖胺和糖醛酸上的羧基、乙?；土蛩狨セ鶊F(tuán)的特定類型所產(chǎn)生的。與肝素相比，硫酸類肝素含有較少的N-和0-硫酸酯基團(tuán)，而含有較多的N-乙?；鶊F(tuán)。硫酸類肝素側(cè)鏈通過四糖鍵(-葡萄糖醛酸基-(1 — 3)-半乳糖基-β-(1 — 3)-半乳糖基-β-(1 — 4)-木糖基-β -1-0-(絲氨酸))區(qū)域連接到核心蛋白的絲氨酸殘基。硫酸類肝素鏈和核心蛋白均可經(jīng)受最終可影響它們生物活性的一系列修飾。已經(jīng)認(rèn)識(shí)到HS的復(fù)雜性超過了核酸的復(fù)雜性(Lindahl等人，1998，J. Biol. Chem. 273,24979 ； Sugahara 和 Kitagawa，2000，Curr. Opin. Struct. Biol. 10，518)。HS 類物質(zhì)的變型是由被含有N-乙酰化葡糖胺的二糖的未硫酸化區(qū)域分開的糖殘基的非隨機(jī)的、高度硫酸化序列的合成所產(chǎn)生的。N-乙酰葡糖胺向N-硫酸葡糖胺的最初轉(zhuǎn)化產(chǎn)生了對(duì)其它修飾的關(guān)注， 包括葡萄糖醛酸向艾杜糖醛酸的差向異構(gòu)化和葡糖胺或艾杜糖醛酸上0-硫酸化的復(fù)雜類型。另外，在未修飾、低硫酸化的N-乙酰化序列中，己糖醛酸酯殘基仍保持為葡萄糖醛酸酯，而在高度硫酸化的N-硫酸化區(qū)域中，以C-5差向異構(gòu)體艾杜糖醛酸酯為主。這限制了任意給定鏈中可能的潛在二糖變體的數(shù)目，但是未限制每種變體的豐度。大部分修飾發(fā)生在N-硫酸化區(qū)域，或直接與它們相鄰，從而在成熟鏈中存在被低硫酸化結(jié)構(gòu)域分開的高硫酸化區(qū)域(Brickman 等人，(1998)，J. Biol. Chem. 273 (8)，4350-4359，該文獻(xiàn)以其整體作為參考并入本文)。假設(shè)高度可變的硫酸類肝素鏈通過自分泌、鄰分泌和旁分泌反饋環(huán)的復(fù)雜組合在多種胞外配基的調(diào)節(jié)作用中起關(guān)鍵作用，包括對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和粘附因子的調(diào)控和表現(xiàn)，從而控制胞內(nèi)信號(hào)并由此控制干細(xì)胞的分化。例如，盡管可能在遺傳學(xué)上說明了硫酸類肝素糖胺聚糖(Alberts 等人，(1989)Garland Publishing, Inc，New York&London，第 804 和 805 頁)，但是從單一來源分離的硫酸類肝素糖胺聚糖類在生物活性上可能是不同的。如在 Brickman等人，1998，Glycobiology 8，463中所示的，根據(jù)促有絲分裂的狀態(tài)，獲自神經(jīng)上皮細(xì)胞的硫酸類肝素糖胺聚糖的兩種單獨(dú)混合物(pool)可特異性地激活FGF-I或FGF-2。 類似地，在WO 96/23003中說明了硫酸類肝素(HS)與FGF-I或FGF-2之間相互作用的能力。 根據(jù)本專利申請(qǐng)，在胚胎的約11至約13天從鼠細(xì)胞中獲得了能夠與FGF-I相互作用的各個(gè)HS，而在胚胎的約8至約10天獲得了能夠與FGF-2相互作用的HS。如上所述，HS的結(jié)構(gòu)是高度復(fù)雜的并且在HS之間是可變的。的確，HS結(jié)構(gòu)的變化被認(rèn)為是對(duì)有助于每種HS在促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和指導(dǎo)細(xì)胞分化中具有不同活力起到了重要作用。這種結(jié)構(gòu)復(fù)雜性被認(rèn)為是超過了核酸的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性，并且盡管可以將HS結(jié)構(gòu)表征為具有特異和獨(dú)特硫酸化類型的重復(fù)二糖單元的序列，但是目前尚沒有與可用于核酸測(cè)序的那些技術(shù)相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)測(cè)序技術(shù)以用于確定HS序列結(jié)構(gòu)。在不存在確定明確HS序列結(jié)構(gòu)的簡(jiǎn)單方法的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過使用多種分析技術(shù)明確地鑒別了并在結(jié)構(gòu)上表征了 HS分子。這些包括二糖分析、四糖分析、HPLC和分子量確定中的一種或組合。這些分析技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知和使用的。從HS產(chǎn)生二糖和四糖的兩種技術(shù)包括亞硝酸消化和裂合酶消化。僅僅是出于舉例說明的目的，以下提供了執(zhí)行這些消化技術(shù)中一種方法的描述，這樣的描述未限制本發(fā)明的范圍。亞硝酸消化硫酸類肝素基于亞硝酸的解聚在完成時(shí)導(dǎo)致碳水化合物鏈最終降解為其各個(gè)二糖組分。例如，可以通過分別在冰上將250 μ 1 0. 5Μ的H2SO4和0. 5Μ的Ba (NO2) 2冷卻15分鐘來制備亞硝酸。冷卻后，將Ba(NO2)2與H2SO4混合并在離心除去硫酸鋇沉淀前渦流混合。 將125 μ 1 HNO2加入到懸浮于20 μ IH2O中的GAG樣品中并且渦流混合，然后在不時(shí)混合的情況下在25°C溫育15分鐘。溫育后，將IM Na2CO3加入到樣品中使其pH為6。接著，將 100 μ 1 0. 25Μ的NaBH4在0. IM NaOH中的溶液加入到樣品中并將混合物加熱至50°C，保持 20分鐘。然后，將混合物冷卻至25°C并加入酸化的冰醋酸使樣品的pH為3。然后，用10M NaOH中和混合物并通過冷凍干燥縮小體積。將最終樣品上Bio-Gel P_2柱以分離二糖和四糖從而驗(yàn)證降解程度。裂合酶消化肝素酶III在葡萄糖醛酸鍵處切割糖鏈。一系列肝素酶(I、II和III)分別通過在特定硫酸化識(shí)別位點(diǎn)使某些硫酸類肝素序列解聚而顯示出相對(duì)特異的活性。肝素酶I沿 HS鏈切割具有NS區(qū)域的HS鏈。這導(dǎo)致硫酸化結(jié)構(gòu)域的斷裂(disruption)。肝素酶III使具有NA域的HS解聚，從而導(dǎo)致碳水化合物鏈分解成各個(gè)硫酸化結(jié)構(gòu)域。肝素酶II主要切割HS鏈的NA/NS “肩(shoulder)”結(jié)構(gòu)域，其中存在不同的硫酸化類型。注類肝素聚合物的重復(fù)二糖主鏈為連接到氨基糖葡糖胺上的糖醛酸。“NS”表示氨基糖，其在氨基上帶有硫酸酯，從而能夠使C2、C6和C3處的其它基團(tuán)硫酸化?！癗A”表示未被硫酸化且其仍保持乙?；陌被?。例如，對(duì)于使用肝素酶III在NA區(qū)域中的解聚，在含有20mMTris-HCl、0. lmg/ml BSA和4mM CaCl2的緩沖液(pH 7.5)中制備了酶和凍干的HS樣品。僅僅是通過舉例說明的方式，可以以5mU/l μ gHS加入肝素酶III并在37°C溫育16h，然后通過加熱至70°C，保持 5分鐘使反應(yīng)停止。二糖和四糖可以通過柱色譜洗脫。肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域Cardin 禾口 Weintraub(Molecular Modeling of Protein-Glycosaminoglycan Interactions, Arteriosclerosis，第 9 卷，第 1 期，1989 年 1 月 /2 月，第 21-32 頁)說明了多肽肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的共有序列，該文獻(xiàn)以其整體作為參考并入本文。該共有序列具有終止于一個(gè)或多個(gè)堿性殘基的兩個(gè)或三個(gè)親水殘基分開的一段二-或三堿性殘基序列。鑒別出兩種特定的共有序列XBBXBX[SEQ ID NO 3]和XBBBXXBX[SEQ ID NO :4]，其中B為堿性殘基(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)，而X為親水殘基(例如，丙氨酸、甘氨酸、酪氨酸、 絲氨酸)。據(jù)報(bào)道，肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域富含氨基酸Asn、Ser.Ala, Gly、lie、Leu和Tyr而氨基酸Cys、Glu、Asp、Met、Phe和Trp的出現(xiàn)率較低。這些共有序列可以用于搜索蛋白質(zhì)或多肽氨基酸序列以鑒別候選肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域氨基酸序列，其可以合成并根據(jù)本發(fā)明測(cè)試GAG結(jié)合。WO 2005/014619A2還公開了多種肝素結(jié)合肽。WO 2005/014619A2的內(nèi)容以其整體作為參考并入本文。在一些方面，本發(fā)明涉及HS/BMP2的治療性使用(人和獸醫(yī))以治療骨折。本文報(bào)道了 HS/BMP2以增強(qiáng)骨傷口愈合。HS/BMP2刺激創(chuàng)傷后的骨再生并且有助于改善骨的傷口愈合。HS/BMP2加快了骨折修復(fù)的速度，從而能夠縮短創(chuàng)傷后的恢復(fù)時(shí)間。骨折是一種醫(yī)學(xué)病況。在本發(fā)明申請(qǐng)中，“骨折”包括骨的損傷或創(chuàng)傷，其中骨發(fā)生開裂、斷裂或碎裂。斷裂是指骨的不連續(xù)。骨折可以是由物理沖擊或機(jī)械應(yīng)力或者由如骨質(zhì)疏松癥或骨關(guān)節(jié)炎的醫(yī)學(xué)病況造成的。骨折的整形外科分類包括閉合性或開放性以及單碎片或多碎片骨折 (multi-fragmentary fracture)。在閉合性骨折中，皮膚保持完整，而在開放性骨折中，骨可以暴露穿過傷口部位，這使得感染的風(fēng)險(xiǎn)更高。單純性骨折是沿一條線發(fā)生的，趨于將骨分為兩段。多碎片折斷將骨分成多片。其它骨折類型包括壓縮骨折、嵌插骨折、螺旋骨折、完全和不完全骨折、橫骨折、線性骨折和斜骨折以及粉碎性骨折。在大部分受試者中，骨愈合(骨折連接)是自然發(fā)生的并且在創(chuàng)傷后開始。出血通常導(dǎo)致凝塊并吸引白血球和成纖維細(xì)胞，從而產(chǎn)生膠原纖維。接著，骨基質(zhì)(鈣羥磷灰石) 沉積(礦化作用)從而將膠原基質(zhì)轉(zhuǎn)化為骨。不成熟的再生骨通常比成熟的骨脆弱，并且
25不成熟的骨隨時(shí)間經(jīng)歷了重建過程以產(chǎn)生成熟的“板狀(lamellar)”骨。完全骨愈合過程通過需要相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間，通常為數(shù)月。發(fā)生骨折并且可以從使用HS/BMP2的治療中受益的骨包括所有的骨類型，尤其是所有哺乳動(dòng)物的骨，包括但不限于，長(zhǎng)骨(例如，股骨、肱骨、指骨)、短骨(例如，腕骨、跗骨)、扁平骨(例如，顱骨、肋骨、肩胛骨、胸骨、骨盆帶)、不規(guī)則骨(例如，椎骨)、籽骨(例如，膝蓋骨)。發(fā)生骨折并且可從使用HS/BMP2的治療中受益的骨包括骨骼骨(即，骨架的任何骨)、顱-面區(qū)域的骨、中軸骨骼的骨(例如，椎骨、肋骨)，附屬骨(例如，肢的骨骼)、骨盆骨骼的骨(例如，骨盆)。發(fā)生骨折并且可從使用HS/BMP2的治療中受益的骨還包括頭部(顱骨)和頸部的那些骨，包括面部的那些骨，如頌骨、鼻骨和頰骨。在這個(gè)方面，在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中， HS/BMP2可以用于輔助牙科或面部或顱骨手術(shù)中的骨修復(fù)和再生，其可以包括面部和/或口腔骨(不同于牙齒)的重建，例如，包括顎骨。骨折還包括病理性多孔性，如骨質(zhì)疏松癥受試者所表現(xiàn)出的。盡管未限制本發(fā)明，但是HS/BMP2的主要作用可以是針對(duì)傷口部位內(nèi)、傷口部位附近或造成遷移到傷口部位中的細(xì)胞，并且可以是針對(duì)骨干細(xì)胞、前成骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞， 或者針對(duì)存在于傷口床內(nèi)或造成遷移到傷口床中或在傷口床內(nèi)遷移的任何輔助細(xì)胞或血管源性細(xì)胞。提供了 HS/BMP2和包含HS/BMP2的藥物組合物和藥劑以用于哺乳動(dòng)物受試者的骨折治療方法中。治療可以包括骨中的傷口愈合。治療可以包括骨的修復(fù)、再生和生長(zhǎng)。HS/BMP2通過促進(jìn)新骨生長(zhǎng)來促進(jìn)骨折修復(fù)。HS/BMP2起到改善骨折修復(fù)的速度的作用，從而使骨愈合的發(fā)生更快，導(dǎo)致創(chuàng)傷后恢復(fù)時(shí)間的縮短。治療可以導(dǎo)致骨強(qiáng)度得到改善。治療還可以包括骨質(zhì)疏松癥或骨關(guān)節(jié)炎的治療。優(yōu)選地，將HS/BMP2施用于骨折周圍的組織。這可以包括直接施用于其中發(fā)生骨折的骨組織?？梢允┯糜诠腔蚬钦壑車慕Y(jié)締組織或者施用于靠近并供給骨的脈管系統(tǒng) (例如，血管)?？梢灾苯邮┯糜趧?chuàng)傷部位，并且可以施用于由傷口初始愈合所形成的骨痂?？梢耘渲聘鶕?jù)本發(fā)明的藥劑和藥物組合物以通過多種途徑施用。最優(yōu)選地，將HS/ BMP2配制為用于注射的液體或液態(tài)形式。在一些實(shí)施方式中，將HS/BMP2配制為控釋制劑，例如，在用于植入到傷口部位的藥物膠囊中。HS/BMP2可以附著于、浸漬于或吸收到載體材料中(例如，生物材料)，如納米纖維或生物可降解的紙或織物。包含HS/BMP2的藥物組合物、藥劑、植入物和假體還可以包含BMP2。由于HS/BMP2 與BMP2結(jié)合的能力，HS/BMP2可以起到BMP2載體的作用以輔助將BMP2遞送到傷口部位并維持BMP2的穩(wěn)定性。優(yōu)選地，以“治療有效量”給予，與相應(yīng)的未治療骨折相比，這足以改善骨折的愈合。所給予的實(shí)際量以及給藥速率和時(shí)間過程將取決于骨折的性質(zhì)和嚴(yán)重程度。治療的確定，例如，劑量的決定等，是全科醫(yī)生以及其他醫(yī)生的職責(zé)，并且通常將會(huì)考慮骨折的性質(zhì)、 個(gè)體患者的病況、遞送部位、給藥方法以及醫(yī)師已知的其它因素。根據(jù)主治醫(yī)生的指導(dǎo)，可以單次或多次給予HS/BMP2劑量。僅僅是通過舉例說明的方式，可將HS/BMP2以至少Ing/ ml的劑量遞送，更優(yōu)選地，以至少5ng/ml的劑量遞送并且可選地以lOng/ml或以上的劑量遞送。各個(gè)HS/BMP劑量可以為約小于Img并且大于lyg，例如，約5yg、約IOygJA 25μ g、約30μ g、約50μ g、約ΙΟΟμ g、約0. 5mg或約Img之一。可以在“雷明頓藥物科學(xué) (Remington ‘ sPharmaceutical Sciences)，，，第 20 版，2000, pub. Lippincott, Williams &ffiIkins中查找到上述技術(shù)和方案的實(shí)例。HS/BMP2可以與其它治療一起用于治療骨折，所述其它治療是例如給予止痛劑或抗炎藥劑、骨固定和正骨(例如，在石膏模中固定受創(chuàng)傷的肢體)、手術(shù)干預(yù)(例如，重新放置骨或移動(dòng)骨以修正位移、彎曲或脫位)。如果需要手術(shù)的話，可以在手術(shù)過程中將HS/ BMP2直接施用于(例如，應(yīng)用于)骨折。牛物材料本發(fā)明的藥物組合物和藥劑可以采用涂覆有和/或浸漬有HS/BMP2的生物材料的形式。可以由生物材料形成植入物或假體?？梢詫⑦@些植入物或假體通過手術(shù)植入以輔助骨生長(zhǎng)、再生、重建和/或再成型。可以將HS/BMP2應(yīng)用于植入物或假體以加快所需位置的新骨形成。應(yīng)理解，不同于蛋白質(zhì)，硫酸類肝素是特別強(qiáng)健的并且對(duì)制造合成生物支架以及對(duì)植入物和假體的應(yīng)用所需的溶劑具有更好的耐受能力。生物材料可以涂覆或浸漬有HS/BMP2。浸漬可以包括(例如)在聚合期間通過將 HS/BMP2與生物材料的組成成分混合以形成該生物材料，或者將HS/BMP2吸收到該生物材料中。涂覆可以包括將HS/BMP2吸附到該生物材料表面上。當(dāng)施用于或植入到受試者中時(shí)，生物材料應(yīng)能夠使得涂覆或浸漬的HS/BMP2從該生物材料上釋放?？梢酝ㄟ^改變生物材料的結(jié)構(gòu)(例如，多孔性)來改變生物材料的釋放動(dòng)力學(xué)。除了用HS/BMP2涂覆或浸漬生物材料外，可以將一種或多種生物活性分子浸漬或涂覆到生物材料上。例如，選自由以下組成的組中的至少一種BMP-2、BMP-4、OP-1、FGF-1、 FGF-2、TGF-i3 1、TGF-β 2、TGF-β 3 ；VEGF ；膠原；層粘連蛋白；纖連蛋白；玻璃粘連蛋白。除了上述生物活性分子以外或者作為上述生物活性分子的替代物，可以將一種或多種二膦酸鹽與HS/BMP2 —起浸漬或涂覆到生物材料上。有用的二膦酸鹽的實(shí)例可以包括選自由以下組成的組中的至少一種依替膦酸鹽；氯屈膦酸鹽；阿侖膦酸鹽；帕米膦酸鹽；利塞膦酸鹽； 唑來膦酸鹽。涂覆或浸漬了 HS/BMP2的生物材料可以在醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)中使用。應(yīng)該理解本發(fā)明可以改善患者的生活質(zhì)量或者潛在地延長(zhǎng)動(dòng)物的壽命，例如，用于繁殖的珍貴的賽馬。生物材料提供了支架或基質(zhì)載體。生物材料可以適合于組織中的植入或者可以適合于給藥(例如，作為溶液中的微膠囊)。植入物或假體應(yīng)是生物相容性的，例如，無毒并且低免疫原性(最優(yōu)選無免疫原性)。生物材料可以是可生物降解的，從而隨著傷口愈合的發(fā)生，生物材料降解，并且在受試者中最終僅原位留下再生骨。作為另外一種選擇，可以使用非生物降解的生物材料(例如)以在較大的斷裂處引導(dǎo)骨再生和/或用作骨愈合過程中的結(jié)構(gòu)支撐，并且傷口成功愈合后，手術(shù)除去該生物材料是可選的要求。
生物材料可以是軟的和/或柔性的，例如，水凝膠、纖維蛋白網(wǎng)或網(wǎng)狀物，或者膠原海綿?！八z”是有機(jī)聚合物(可以是天然的或合成的)凝固或固化以產(chǎn)生捕獲水或其它溶液分子的立體開放柵格結(jié)構(gòu)從而形成凝膠時(shí)所形成的物質(zhì)。可以通過聚集、凝結(jié)、疏水性相互作用或交聯(lián)發(fā)生固化?？商娲?，生物材料可以是相對(duì)剛性的結(jié)構(gòu)，例如，由例如塑料或生物惰性金屬 (如鈦)的固體材料形成。生物材料可以具有多孔基質(zhì)結(jié)構(gòu)，其可以通過交聯(lián)聚合物提供。優(yōu)選地，該基質(zhì)是骨生長(zhǎng)所需的營養(yǎng)物和生長(zhǎng)因子可透過的?；|(zhì)結(jié)構(gòu)可以通過交聯(lián)纖維形成，例如，纖維蛋白或膠原，或者海藻酸鈉、殼聚糖或其它多糖通過適合的交聯(lián)劑(例如，鈣鹽、聚丙烯酸、肝素)的液膜?？商娲?，可以形成作為凝膠的支架，其通過膠原或海藻酸鹽制成，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的已建立的方法交聯(lián)。用于基質(zhì)形成的適合的聚合材料包括，但不限于，可生物降解/可生物吸收的聚合物，其可以選自由以下物質(zhì)組成的組瓊脂糖、膠原、纖維蛋白、殼聚糖、聚己酸內(nèi)酯、聚 (DL-丙交酯-共-己內(nèi)酯)、聚(L-丙交酯-共-己內(nèi)酯-共-乙交酯)、聚乙交酯、聚交酯、 聚羥基烷基酸酯、它們的共聚物，或者非生物可降解的聚合物，其可以選自由以下物質(zhì)組成的組醋酸纖維素；丁酸纖維素、海藻酸鹽、聚砜、聚氨脂、聚丙烯腈、磺化聚砜、聚酰胺、聚丙烯腈、聚甲基丙烯酸甲酯、它們的共聚物。由于膠原的生物相容性和支持細(xì)胞附著和功能的有利性質(zhì)，其是基質(zhì)構(gòu)建的優(yōu)良材料(美國專禾丨J No. 5019087 ；Tanaka, S. ；Takigawa, T. ；Ichihara, S. & Nakamura, T. Mechanical properties of the bioabsorbable polyglycolicacid-collagen nerve guide tube Polymer Engineering & Science 2006，46，1461-1467)。臨床上可用的膠原海綿是基質(zhì)的一個(gè)實(shí)例并且在本領(lǐng)域中是熟知的(例如，來自^itegra Life kiences的膠原海綿)。纖維蛋白支架(例如，纖維蛋白膠)提供了替代性基質(zhì)材料。作為傷口密封劑、遞送生長(zhǎng)因子的貯器以及作為放置和固定生物植入物的輔助物，纖維蛋白膠在臨床上得至Ij 了廣泛應(yīng)用(Rajesh Vasita, Dhirendra S Katti. Growth factor delivery systems for tissue engineering :a materials perspective. Expert Reviews in Medical Devices. 2006 ；3(1) :29-47 ；Wong C, Inman. Ε, Spaethe R. Helgerson S.Thromb. Haemost. 2003. 89(3) :573-582 ；Pandit AS, Wilson DJ, Feldman DS. Fibrin scaffold as an effective vehicle for the delivery of acidic growth factor (FGF-I). J. Biomaterials Applications. 2000 ；14(3) :229-242 ；DeBlois Cote MF. Doillon CJ.Heparin-fibroblast growth factor fibrincomplex :in vitro and in vivo applications to collagen based materials. Biomaterials. 1994 ；15 (9) :665-672)。Luong-Van 等人(In vitro biocompatibi 1 ity and bioactivity of microencapsulated heparan sulphate Biomaterials 28 (2007) 2127-2136)說明了 HS 從聚己酸內(nèi)酯微膠囊中延長(zhǎng)的局部遞送，該文獻(xiàn)作為參考并入本文。生物材料的另一個(gè)實(shí)例是摻入羥基磷灰石或透明質(zhì)酸的聚合物。適合于與HS/BMP2結(jié)合使用的生物材料的一個(gè)實(shí)例為JAX 骨填料(Smith&Nephew)。Jax顆粒是由高純度硫酸鈣構(gòu)成的并且保留了它們的形狀以提供具有可控顆粒間孔隙度和顆粒遷移穩(wěn)定性的支架。Jax顆粒在體內(nèi)能夠安全并且完全溶解。其它適合的生物材料包括陶瓷或金屬(例如，鈦)、羥基磷灰石、磷酸三鈣、去礦物質(zhì)骨基質(zhì)(DBM)、自體移植物(即，來源于患者組織的移植物)或同種移植物(來源于患者以外動(dòng)物組織的移植物)。生物材料可以是合成的(例如，金屬、纖維蛋白、陶瓷)或生物的 (例如，由動(dòng)物組織制成的載體材料，例如，非人哺乳動(dòng)物(例如，母牛、豬)或人)。生物材料可以補(bǔ)充有其它細(xì)胞。例如，可以用未分化的骨前體細(xì)胞“接種”生物材料(或與之共合成)，所述未分化的骨前體細(xì)胞例如，干細(xì)胞，如間充質(zhì)干細(xì)胞，更優(yōu)選人間充質(zhì)干細(xì)胞。待治療的受試者可以是任何動(dòng)物或人。所述受試者優(yōu)選地為哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選地為人。所述受試者可以是非人哺乳動(dòng)物(例如，兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其它嚙齒動(dòng)物(包括來自嚙齒目中任何動(dòng)物的細(xì)胞)、貓、狗、豬、綿羊、山羊、牛(包括母牛，例如，奶?；蚺僦械娜魏蝿?dòng)物)、馬(包括馬科中的任何動(dòng)物)、驢和非人靈長(zhǎng)類)。非人哺乳動(dòng)物可以是家養(yǎng)寵物或者出于商業(yè)目的飼養(yǎng)的動(dòng)物，例如，賽馬，或者家畜，如豬、羊或牛。受試者可以是雄性或雌性。受試者可以是患者。培養(yǎng)基包含HS/BMP2的培養(yǎng)基可以是任何種類的，但是優(yōu)選地為液體或凝膠，并且可以含有其它營養(yǎng)物和生長(zhǎng)因子(例如，F(xiàn)GF-2)。HS/BMP2優(yōu)選地以非痕量存在。例如，培養(yǎng)基中HS/BMP2的濃度可以在約1. Ong/ml培養(yǎng)基至約lOOOng/ml培養(yǎng)基的范圍內(nèi)。優(yōu)選地，培養(yǎng)基中HS/BMP2的濃度在約5ng/ml培養(yǎng)基至200ng/ml培養(yǎng)基之間，更優(yōu)選地，在約20ng/ ml培養(yǎng)基至170ng/ml培養(yǎng)基之間。BMP2 蛋白在本說明書中，BMP2是指骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(也稱為骨形態(tài)發(fā)生蛋白2、BMP2或 BMP-2)，它是TGF- β超家族的成員并且與骨和軟骨發(fā)育有關(guān)。圖35中示出了來自人(Homo sapiens)的BMP2前蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO 2)。氨基酸1至23代表信號(hào)肽，而氨基酸M至396代表前蛋白的氨基酸序列。本文中，成熟蛋白質(zhì)的氨基酸序列表示為SEQ IDNO :5。在本說明書中，“BMP2蛋白”包括與圖35中所示的BMP2前體蛋白(pr印rotein) 或BMP2前蛋白(proprotein)的氨基酸序列或者與SEQ IDNO :5所示的成熟BMP2蛋白的氨基酸序列具有至少70%序列同一性的蛋白質(zhì)，更優(yōu)選具有75 %、80%、85 %、90%、95 %、 96%、97%、98%、99%或100%之一的序列同一性的蛋白質(zhì)。BMP2蛋白優(yōu)選地還包括肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其具有SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列(存在于SEQ ID NO :2的氨基酸觀3-300處)，或者具有與SEQ ID NO 1 或 SEQ ID NO :6 具有 75%、80%，85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%之一的序列同一
性的氨基酸序列。對(duì)于BMP2蛋白，優(yōu)選地包括Ruppert等人(Eur J. Biochem 1996)中所述的BMP-2蛋白。BMP2蛋白優(yōu)選地為成骨的，即，具有誘導(dǎo)或輔助誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化的活性。BMP2蛋白可以來自或來源于任何動(dòng)物或人，例如，非人動(dòng)物，例如，兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其它嚙齒動(dòng)物(包括來自嚙齒目中任何動(dòng)物)、貓、狗、豬、綿羊、山羊、牛(包括母牛， 例如，奶牛，或牛屬中的任何動(dòng)物)、馬(包括馬科中的任何動(dòng)物)、驢和非人靈長(zhǎng)類或者其它非人脊椎動(dòng)物；和/或非人哺乳動(dòng)物；和/或人。除明顯不允許或者明確應(yīng)避免的組合之外，本發(fā)明包括所述方面和優(yōu)選特征的組合。本文所使用的章節(jié)標(biāo)題僅是出于組織結(jié)構(gòu)的目的，而不應(yīng)視作對(duì)所述主題內(nèi)容的限制?，F(xiàn)在，將通過舉例說明并參考附圖對(duì)本發(fā)明的方面和實(shí)施方式進(jìn)行說明。其它方面和實(shí)施方式對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將是顯而易見的。本文中所提到的所有文件均將并入本文作為參考。


現(xiàn)在，將參考附圖對(duì)說明本發(fā)明原理的實(shí)施方式和實(shí)驗(yàn)進(jìn)行討論，其中圖1.使用8M尿素/CHAPS緩沖液破壞的MX樣品的陰離子交換色譜。在IM NaCl 洗脫后觀察到了較大的GAG峰。圖2.在來源于MX的GAG純化期間，脫鹽系統(tǒng)的代表性色譜圖。初始峰(12-18min) 代表全長(zhǎng)GAG鏈。電導(dǎo)率峰和碎片峰(19-30min)代表鹽和GAG碎片的洗脫。圖3.加載到未衍生化的Hi-Trap抗生蛋白鏈菌素柱上的tGAG(2. 5mg)。所有GAG 在流過液中從柱洗脫，表明GAG與柱無“背景”附著。圖4. BMP2-HBP (Img)與tGAGQ5mg)預(yù)溫育30分鐘。洗脫分布圖示出了肽Q80nm) 與tGAG樣品一起在流過液中離開柱。圖5.加載到Hi-Trap柱上的BMP2-HBP (Img)。280nm的吸光度水平表明即使在高鹽條件下，肽仍保持附著于柱；因此，生物素化的肽與抗生蛋白鏈菌素接頭成功偶聯(lián)。圖6.加載了 25mg tGAG的BMP2-HBP(Img)偶聯(lián)的柱。色譜圖(232nm)清楚地示出了流過液中的柱過載以及一些GAG與BMP2-HBP床的結(jié)合。圖7.上次實(shí)驗(yàn)(圖6)中的GAG (流過)流分的再次應(yīng)用。顯著的GAG+洗脫峰的存在表明所有可用的BMP2-HBP結(jié)合位點(diǎn)已飽和，從而導(dǎo)致大部分易結(jié)合的GAG在流過液中離開柱。圖8.加載了 tGAG(6mg)的BMP2-HBP(^ig)偶聯(lián)的柱。色譜圖032nm)清楚地示出了柱未過載，并且存在對(duì)BMP2-HBP具有相對(duì)親合力的GAG亞組。圖9.上次運(yùn)行(圖8)中GAG(流過)的再次運(yùn)行。GAG+洗脫峰的消失表明在上次運(yùn)行中可用的BMP2-HBP結(jié)合位點(diǎn)未飽和，從而使得能夠在單次運(yùn)行中有效提取GAG+糖。圖10.分離的全長(zhǎng)GAG+流分Qmg)的再次施加顯示在肝素酶III消化前對(duì) BMP2-HBP (2mg)柱的親合力未發(fā)生變化。對(duì)BMP2-HBP柱再次施加GAG-流分還顯示親合力未發(fā)生變化，基本如圖9所示，所有GAG均在流過液中離開柱。圖11.在加載到BMP2-HBP(2mg)柱之前，用肝素酶III消化的GAG-流分(Img)。 色譜圖032nm)清楚地顯示GAG樣品未與柱保持結(jié)合，而是在流過液中離開。這表明全長(zhǎng) GAG-鏈中不存在任何GAG+結(jié)構(gòu)域。圖12.在加載到BMP2-HBP (2mg)柱之前，用肝素酶3消化的GAG+流分(^iig)。色譜圖032nm)證明GAG+樣品保留在柱上，表明全長(zhǎng)GAG+鏈上的所有結(jié)構(gòu)域均對(duì)BMP2-HBP 具有相對(duì)親合力。與相同干重的GAG+相比(圖10)，吸光度峰的增加表明肝素酶3處理的效力。圖13.使用排阻限在1. 5kDa至20kDa之間的Biogel PlO柱分離全長(zhǎng)GAG+鏈。色譜圖顯示大部分樣品鏈具有大于20kDa的整體分子量。圖14.將全長(zhǎng)GAG+糖鏈用亞硝酸處理20分鐘以診斷性地降解硫酸類肝素類物質(zhì)。由Biogel PlO排阻色譜柱產(chǎn)生的色譜圖顯示與圖13相比，所有GAG+鏈幾乎完全降解， 表明GAG+分離鏈主要由硫酸類肝素組成。圖15.加載到BMP2-HBP(ang)柱上的4_硫酸軟骨素(6mg)。色譜圖清楚地顯示由于在與GAG+樣品相似的鹽濃度洗脫，因此大部分GAG鏈對(duì)肽具有親合力。圖16.加載到BMP2-HBP (2mg)柱上的6_硫酸軟骨素(6mg)。色譜圖表明幾乎沒有 C6S GAG鏈對(duì)肽柱具有任何親合力。圖17.加載到BMP2_HBP(aiig)親合柱上的硫酸皮膚素(6mg)。色譜圖表明幾乎沒有DS GAG鏈對(duì)肽具有任何親合力，只有少量GAG在與GAG+樣品相似的鹽濃度洗脫。圖18.加載到BMP2-HBP(ang)柱上的牛硫酸類肝素(2. 5mg)。色譜圖032nm)顯示僅有一小部分GAG與柱結(jié)合。圖19.加載到BMP2-HBP (ang)柱上的肝素-LMW(50mg)。色譜圖Q32nm)顯示幾乎沒有GAG與肽結(jié)合。圖20.加載到BMP2-HBP (ang)柱上的肝素_HMK28mg)。色譜圖Q32nm)顯示幾乎沒有GAG與肽結(jié)合。圖21.將用肝素酶I預(yù)消化的肝素_HMK25mg)加載到BMP2-HBP(^iig)柱上。色譜圖032nm)顯示極少GAG片段與肽結(jié)合。圖22.示出了親合色譜分離BMP-2肽特異性HS的步驟的色譜圖。圖23.示出了親合色譜洗脫BMP-2肽特異性HS (GAG+)的色譜圖。圖24.示出了親合色譜洗脫BMP-2肽非特異性HS(GAG_)的色譜圖。圖25.示出了通過排阻色譜法在Superdex 75柱上洗脫Sigma HS (H9902)標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖。圖26.示出了通過排阻色譜法在Superdex 75柱上洗脫BMP-2肽特異性HS (GAG+) 的色譜圖。圖27.示出了對(duì)對(duì)照培養(yǎng)基、100ng/ml BMP2和300ng/ml BMP2響應(yīng)的C2C12細(xì)胞中Osterix表達(dá)的圖。圖28.示出了對(duì)對(duì)照培養(yǎng)基、100ng/ml BMP2禾Π 300ng/ml BMP2響應(yīng)的C2C12細(xì)胞中骨鈣素表達(dá)的圖。圖29.示出了對(duì)對(duì)照培養(yǎng)基、100ng/ml BMP2禾Π 300ng/ml BMP2響應(yīng)的C2C12細(xì)胞中Runx2表達(dá)的圖。圖30.示出了對(duì)對(duì)照培養(yǎng)基、BMP-2,陰性GAG (GAG-)、陽性GAG (GAG+)、總HS和肝素Ofep)響應(yīng)的C2C12細(xì)胞中通過定量PCR測(cè)量的堿性磷酸酶表達(dá)的圖。圖31.示出了對(duì)對(duì)照培養(yǎng)基、BMP-2，陰性GAG (GAG_)+BMP-2、陽性 GAG(GAG+)+BMP-2、總HS和肝素Ofep)響應(yīng)的C2C12細(xì)胞中通過定量PCR測(cè)量的Osterix表達(dá)的圖。圖32.示出了對(duì)對(duì)照培養(yǎng)基、BMP-2，陰性GAG (GAG_)+BMP-2、陽性 GAG(GAG+)+BMP-2、總HS和肝素Ofep)響應(yīng)的C2C12細(xì)胞中通過定量PCR測(cè)量的Bspll表達(dá)的圖。圖33.示出了對(duì)對(duì)照培養(yǎng)基、BMP-2，陰性GAG (GAG-)+BMP-2、陽性 GAG(GAG+)+BMP-2、總HS和肝素Ofep)響應(yīng)的C2C12細(xì)胞中通過定量PCR測(cè)量的Runx2表達(dá)的圖。圖34.示出了對(duì)BMP和從MC3T3-E1細(xì)胞分離的GAG+(+BMP_2)響應(yīng)的C2C12細(xì)胞中骨鈣素表達(dá)的圖。圖35.來自人的骨形態(tài)發(fā)生蛋白2前蛋白的氨基酸序列，NCBI登錄號(hào) No. NP_001191(NP_001191. IGI :4557369)(SEQ ID NO 2)。圖36.示出了親合色譜洗脫BMP-2肽特異性HS的色譜圖。將6mg生物素化的 BMP2-肽(SEQ ID NO :1)偶聯(lián)到Iml抗生蛋白鏈菌素柱。色譜圖顯示所有生物素化的 BMP2-肽與柱結(jié)合。圖37.示出了 BMP2-肽(SEQ ID NO 1)特異性硫酸類肝素純化的色譜圖。圖38.示出了 BMP2肽(SEQ ID NO 1)柱結(jié)合的硫酸類肝素脫鹽的色譜圖。圖39.示出了 BMP2肽(SEQ ID NO 1)柱未結(jié)合的硫酸類肝素脫鹽的色譜圖。圖40. 二糖消化后BMP2陽性硫酸類肝素的SAX-HPLC分布圖。圖41. 二糖消化后BMP2陰性硫酸類肝素的SAX-HPLC分布圖。圖42. 二糖消化后Celsus HS的SAX-HPLC分布圖。圖43.示出了 BMP2特異性HS、BMP2非特異性HS和Celsus HS的裂合酶來源的二糖百分比組成的表。對(duì)每個(gè)峰下方的面積積分以計(jì)算每種二糖的百分比。一=未檢出。圖44.示出了 BMP2陽性和BMP2陰性HS表面等離子共振(SPR)分析的圖。圖45.示出了涂覆在Iduron肝素/GAG結(jié)合板上的BMP2陽性和BMP2陰性Celsus HS制劑的BMP2結(jié)合量的圖。圖46.示出了 C2C12細(xì)胞上BMP2陽性和BMP2陰性HS的堿性磷酸酶(ALP)活性的圖。圖47. ALP活性的HS增強(qiáng)的免疫組織化學(xué)分析的照片。當(dāng)通過組織化學(xué)評(píng)價(jià)時(shí)， 與非特異性HS相比，BMP2特異性HS提高BMP2誘導(dǎo)的ALP活力的程度更高。結(jié)合0、0. 3、 3 禾口 30 μ g/ml 的 BMP2 陽性或 BMP2 陰性 HS，引入了 100ng/ml 的 BMP2。圖48.無圖。圖49.示出了選擇性O(shè)-0、6-0和N-)去硫酸化的BMP2陽性HS的BMP2結(jié)合量并且表明結(jié)合BMP2所需的HS鏈的電荷取代類型的圖。圖50.示出了肝素對(duì)BMP-2穩(wěn)定性作用的圖。圖51. JAX -磷酸三鈣骨填料的SEM照片，兔尺骨缺損模型的X光照片。與位于 200 μ 1水凝膠(88%水、甘油、羧甲基纖維素鈉)中的30μ gHS/BMP2組合的說明。圖52.在處理第4周時(shí)，用JAX 骨填料(對(duì)照)或JAX 骨填料加HS/BMP2處理的兔尺骨缺損模型的X光和微CT掃描分析。圖53.在處理第8周時(shí)，用JAX 骨填料(對(duì)照)或JAX 骨填料加HS/BMP2處理的兔尺骨缺損模型的X光和微CT掃描分析。 圖54.示出了在JAX 骨填料(對(duì)照)、JAX 骨填料加HS/BMP2 (HS3)或JAX 骨填料加BMP2陰性HS處理的兔尺骨缺損模型中通過微CT掃描評(píng)價(jià)的處理第4周(A)和處理第8周(B)時(shí)的％骨體積的圖。圖55.示出了暴露于陰性對(duì)照、僅BMP2、BMP2+肝素或BMP2+HS3后，Smad 1/5/8 磷酸化水平的免疫印跡圖。圖56.不連接的嚴(yán)重兔尺骨缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的圖示說明。圖57.示出了肝素隨時(shí)間從JAX 顆粒上釋放的百分比的圖。圖58.示出了在第0、4和8周時(shí)，對(duì)用JAX 骨填料加對(duì)照(無HS)、30 μ g HS3 (HS30)或IOOyg HS3 (HS100)處理的兔尺骨缺損模型治愈時(shí)的X光顯微照片。圖59.示出了與圖像處理過的X光重建(新骨用黃色表示)相比，術(shù)后4和8周后骨缺損內(nèi)Jax星的3D圖像再現(xiàn)的微CT(計(jì)算機(jī)斷層)顯微照片。與右側(cè)的X光圖像相比，微CT的圖像為灰色。圖60.示出了第4和8周時(shí)，處理組(對(duì)照組相對(duì)于HS30組和HS100組)中總體積的％骨體積(BV/TV)定量的圖。圖61.示出了 3個(gè)處理組(對(duì)照組(無HS)、30 μ g HS3組(HS30)或100 μ g HS3 組(HS100))在4和8周中的H&E染色(見下文)的顯微照片。圖62.示出了 3個(gè)處理組(對(duì)照組(無HS)、30 μ g HS3組(HS30)或100 μ g HS3 組(HS100))在4和8周中的H&E染色的高倍放大顯微照片(與圖61相比)。圖63.示出了 3個(gè)處理組(對(duì)照組(無HS)、30 μ g HS3組(HS30)或100 μ g HS3 組(HS100))在4和8周中的Rails四色染色(見下文)的顯微照片。圖64.示出了 3個(gè)處理組(對(duì)照組(無HS)、30 μ g HS3組(HS30)或100 μ g HS3 組(HS100))在4和8周中的Rails四色染色的高倍放大顯微照片(與圖63相比)。圖65.示出了 3個(gè)處理組(對(duì)照組(無HS)、30 μ g HS3組(HS30)或100 μ g HS3 組(HS100))在4和8周中的骨鈣素免疫染色(見下文)的顯微照片。圖66.示出了 3個(gè)處理組(對(duì)照組(無HS)、30 μ g HS3組(HS30)或100 μ g HS3 組(HS100))在4和8周中的骨鈣素免疫染色的高倍放大顯微照片(與圖65相比)。圖67.扭轉(zhuǎn)測(cè)試設(shè)備的照片。圖68.示出了 8周時(shí)，HS30的典型扭轉(zhuǎn)相對(duì)于未受損尺骨角度，加剛度和最大轉(zhuǎn)矩的圖。圖 69.示出了用吸收了 30 μ g HS3U0y g ΒΜΡ-2,30μ g HS3+10 μ gBMP-2 或等體積PBS中的一種治療劑(總計(jì)300 μ L，溶于PBS)的膠原海綿處理的兔尺骨缺損模型在第0 周時(shí)的X光顯微照片。圖 70.示出了用吸收了 30 μ g HS3、10yg ΒΜΡ-2,30μ g HS3+10 μ gBMP-2 或等體積PBS中的一種治療劑(總計(jì)300 μ L，溶于PBS)的膠原海綿處理的兔尺骨缺損模型中的愈合在第4周時(shí)的X光顯微照片。圖 71.示出了用吸收了 30 μ g HS3、10yg ΒΜΡ-2,30μ g HS3+10 μ gBMP-2 或等體積PBS中的一種治療劑(總計(jì)300 μ L，溶于PBS)的膠原海綿處理的兔尺骨缺損模型中的愈合在第8周時(shí)的X光顯微照片。
圖 72.示出了用吸收了 30 μ g HS3U0y g ΒΜΡ-2,30μ g HS3+10 μ gBMP-2 或等體積PBS中的一種治療劑(總計(jì)300 μ L，溶于PBS)的膠原海綿處理的兔尺骨缺損模型在第4 和8周時(shí)的微CT分析的圖。圖 73.示出了用吸收了 30 μ g HS3、10yg BMP_2、30yg HS3+10 μ gBMP-2 或等體積PBS中的一種治療劑(總計(jì)300 μ L，溶于PBS)的膠原海綿處理的兔尺骨缺損模型在第8 周時(shí)的最大轉(zhuǎn)矩和剛度的圖。圖 74.示出了用吸收了 30 μ g HS3、10yg BMP_2、30yg HS3+10 μ gBMP-2 或等體積PBS中的一種治療劑(總計(jì)300 μ L，溶于PBS)的膠原海綿處理的兔尺骨缺損模型在第4 周時(shí)的百分比骨體積的圖和微CT圖像。圖 75.示出了當(dāng)與 10 μ g BMP-2 (BMPlO)、30 μ g HS3 (HS30)、10 μ gBMP-2+30 μ g HS3U00yg HS3 (HSlOO)或?qū)φ战Y(jié)合時(shí)，比較采用JAXtmTCP星和膠原海綿處理的兔尺骨缺損模型在第4周時(shí)的百分比骨體積的圖。
具體實(shí)施例方式通過舉例，在以下說明中說明了本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式的細(xì)節(jié)，包括本發(fā)明人對(duì)實(shí)施本發(fā)明所考慮的最佳方式的具體細(xì)節(jié)。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的是， 可對(duì)這些具體細(xì)節(jié)不加限制地實(shí)踐本發(fā)明。我們研究了 GAG增強(qiáng)骨形態(tài)形成蛋白2 (BMP2)活力的潛力。已很好地說明了 BMP2 對(duì)鼠肌性細(xì)胞系C2C12的高成骨誘導(dǎo)活性。該細(xì)胞系中的研究和體內(nèi)研究均顯示出糖胺聚糖在調(diào)節(jié)該活性中的作用。類似地，很好地說明了 BMP2對(duì)肝素的親合力。已經(jīng)進(jìn)行了大量研究來設(shè)法檢驗(yàn) BMP2和GAG之間的動(dòng)態(tài)相互作用。一些研究提出這種相互作用是抑制性的，并因此負(fù)責(zé)將細(xì)胞因子與受體隔離或誘導(dǎo)其與其多種抑制劑結(jié)合，如已類似地對(duì)肝素顯示出親合力的頭蛋白(noggin)。替代性發(fā)現(xiàn)表明BMP2與GAG之間的相互作用是維持需要其信號(hào)以分化為成骨細(xì)胞系的細(xì)胞周圍的細(xì)胞因子局部濃度的方法之一。這些發(fā)現(xiàn)還表明結(jié)合用于顯著延長(zhǎng)同型二聚體的半衰期，從而允許它在ECM中保持較長(zhǎng)時(shí)間的活性。通常對(duì)于大多數(shù)系統(tǒng)來說，這種相互作用的真實(shí)作用可能是上述一些或全部作用的混合。盡管許多研究已提供了 BMP2對(duì)模型糖具有相互作用的證據(jù)，但是BMP2肝素結(jié)合肽(BMP2-HBP)，即位于每個(gè)BMP2單體N末端的一串氨基酸(QAKHKQRKRLKSSCKRHP [SEQ ID NO :1])，與適合的糖胺聚糖之間的特異性相互作用卻很少受到關(guān)注。這產(chǎn)生的主要問題在于HS鏈中是否嵌入了控制絕對(duì)、或至少相對(duì)特異性結(jié)合的互補(bǔ)糖序列。我們?cè)O(shè)法分離可以通過與細(xì)胞因子的直接相互作用調(diào)節(jié)BMP2活性的序列特異性糖胺聚糖。實(shí)施例1材料和方法緩沖液制備在嚴(yán)格關(guān)注質(zhì)量的情況下，配制了用于GAG提取和分析的所有緩沖液。關(guān)鍵的是將緩沖液的PH維持在正確的水平并且對(duì)所有緩沖液實(shí)施過濾和脫氣以避免沉淀物或氣泡
34堵塞色譜柱。具體地，氣泡的形成會(huì)造成柱的嚴(yán)重?fù)p壞，并且對(duì)于密封的預(yù)裝柱來說，會(huì)導(dǎo)致它們不能使用。用不含Ca2+或Mg2+的1 XPBS (150mM NaCl)或雙蒸水(ddH20)過濾所有使用的緩沖液以制備最終溶液。破碎緩沖液8M尿素/CHAPS破碎緩沖液是由加入CHAPS、8M尿素和0. 02% NaN3(防止在儲(chǔ)存期間被微生物生長(zhǎng)污染)的PBS(150mM NaCl)組成的。該溶液用于破碎基質(zhì)(MX)樣品， 因此未經(jīng)脫氣或過濾。PGAG陰離子交換低鹽U50mM)緩沖液低鹽PGAG陰離子交換緩沖液包含具有另外IOOmM NaCl的PBS(150mM NaCl)。用 NaOH和0. 02% Ne^3將緩沖液平衡至pH 7. 3。然后，在負(fù)壓下對(duì)溶液脫氣并且在通過0. 4 μ m 過濾器過濾之前持續(xù)攪拌直至不再釋放氣泡。PGAG陰離子交換較高鹽(IM)緩沖液高鹽PGAG陰離子交換緩沖液包含具有另外850mM NaCl的PBS(150mM NaCl)。用加入的NaOH和0. 02% NaN3將緩沖液平衡至pH 7. 3。然后，在負(fù)壓下對(duì)溶液脫氣并且在通過0. 4 μ m過濾器過濾之前持續(xù)攪拌。/mmmm PGAG 籠■碰該緩沖液用于在陰離子交換后使脫鹽的PGAG樣品復(fù)原以制備它們用于進(jìn)行相關(guān)核心蛋白的酶消化。它是由25mM的醋酸鈉(CH3COOHNa)組成的。用冰醋酸(CH3COOH)將緩沖液平衡至PH 5.0。根據(jù)生產(chǎn)商的說明，復(fù)原鏈霉蛋白酶和神經(jīng)氨酸酶。GAG親合餼譜低鹽(150mM)緩沖液使用未加入任何其它鹽的PBS (150mM NaCl)制備低鹽GAG陰離子交換緩沖液。用 NaOH和0.02% Ne^3將緩沖液平衡至pH 7.3。在負(fù)壓下對(duì)溶液脫氣并且在通過0. 4 μ m過濾器過濾之前持續(xù)攪拌直至不再釋放氣泡。GAG親合餼譜高鹽(IM)終緩沖液使用加入另外850mM NaCl的PBS (150mM NaCl)制備高鹽GAG陰離子交換緩沖液。 用NaOH將緩沖液平衡至pH 7. 3，并且加入0. 02% NaN3,然后將溶液脫氣并通過0. 4 μ m過濾器過濾。脫鹽溶液使用通過0. 02% NaN3平衡至pH 7. 0的ddH20制備脫鹽溶液。然后，將溶液脫氣
并過濾ο樣品制備使用破碎緩沖液(8M尿素/CHAPS)利用破碎基質(zhì)樣品，然后在該緩沖液中刮去培養(yǎng)表面，并在37°C攪拌過夜以確保最大的細(xì)胞溶解。然后，將樣品在5000g離心30min，并且將上清液通過0. 4 μ m過濾器凈化以準(zhǔn)備用于通過陰離子交換色譜的PGAG提取。柱準(zhǔn)備和使用用于GAG分離和表征中每個(gè)順序步驟的柱類型的選擇和準(zhǔn)備對(duì)于該方案的成功是至關(guān)重要的。在每個(gè)步驟中，小心平衡和清洗該柱是重要的。陰離子交換柱
由于用于GAG提取的MX底物的量相對(duì)較大，且加載到柱系統(tǒng)上的加載量大，因此必須手動(dòng)裝填和準(zhǔn)備專門用于該研究的大陰離子交換柱。將Capto Q陰離子交換珠 (Pharmacia)裝填到Wiarmacia XK 26柱(Pharmacia)中以產(chǎn)生每次運(yùn)行的最大加載量為 500ml MX裂解物的柱。使用前，將柱和所有緩沖液平衡至室溫30分鐘，然后將該柱在PGAG陰離子交換低鹽Q50mM)緩沖液中清洗和平衡30分鐘直至所有吸光度通道保持穩(wěn)定。然后，將澄清的細(xì)胞裂解物通過該柱，并且再用500ml低鹽緩沖液清洗該柱以除去任何非特異性結(jié)合的碎片。然后，使用250mlPGAG陰離子交換高鹽(IM)緩沖液洗脫P(yáng)GAG，并且在脫鹽前凍干。然后，將該柱在低鹽緩沖液中清洗并返回4°C保存。脫鹽方案PGAG/GAG分離后，必須除去從柱中洗脫時(shí)在樣品中積累的大量的鹽。對(duì)于該步驟，合并相同實(shí)驗(yàn)組的所有洗脫樣品，并且將其加載到4XWmrmacia HiPrepTM 26/10脫鹽柱上。使用前，將柱和所有溶液平衡至室溫30分鐘，然后將該柱在脫鹽溶液中清洗和平衡 30min直至所有吸光度通道達(dá)到穩(wěn)定。將凍干樣品在能夠獲得透明溶液的最小可能體積的脫鹽溶液中復(fù)原。柱的這種組合允許加載多達(dá)60ml樣品。將先從柱上洗脫的那些流分凍干并且保留用于進(jìn)一步分離或細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用。然后，將柱在脫鹽溶液中清洗并返回4°C保存。BMP2-HBP 柱的制備使用BMP2-HBP柱分離了對(duì)BMP2具有相對(duì)親合力的GAG。在ImlGAG親合色譜低鹽(150mM)緩沖液中制備了約2mg生物素化的BMP2-HBP。將該量加載到HiTrap抗生蛋白鏈菌素HP柱(Pharmacia)上并且允許對(duì)該柱連接5分鐘。然后，在不存在GAG的情況下對(duì)該柱進(jìn)行完整的運(yùn)行循環(huán)。以0. 5ml/min的流速用13ml低鹽緩沖液清洗該柱，然后以Iml/ min運(yùn)行IOml GAG高鹽緩沖液。最后，用IOml低鹽緩沖液清洗該柱。在該過程中，小心監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)以確保未觀察到肽的洗脫或柱降解。GAG+樣品分離一旦制備好BMP2-HBP柱并在正常運(yùn)行條件下測(cè)試了穩(wěn)定性，就已準(zhǔn)備好用于 GAG+鏈從tGAG(總GAG)樣品中分離。在:3ml GAG親合低鹽(150mM)緩沖液中制備了 tGAG 樣品(6mg)并將其注射到用于對(duì)柱進(jìn)行加載的靜態(tài)進(jìn)樣環(huán)(static loop)中。使用前，將 BMP2-HBP柱和所有緩沖液平衡至室溫30分鐘，然后將該柱在低鹽緩沖液中清洗和平衡30 分鐘直至所有吸光度通道穩(wěn)定。然后，以0. 5ml/min將樣品加載到該柱上并且以0. 5ml/min 用IOml低鹽緩沖液清洗柱和樣品。隨后，通過用IOml高鹽(IM)緩沖液洗脫回收保留的 GAG+樣品并將其凍干用于脫鹽。然后，將該柱在IOml低鹽緩沖液中清洗并在4°C保存。鏈霉蛋白酶/神經(jīng)氨酸酶處理為了將GAG鏈與它們的核心蛋白分離，用鏈霉蛋白酶和神經(jīng)氨酸酶對(duì)它們進(jìn)行消化。將凍干的PGAG樣品再懸浮于最小體積的25mM醋酸鈉(pH 5.0)中并通過用0.4μπι注射器式過濾器過濾澄清。將總樣品體積以500μ 1的等份分配到IOml玻璃管中。加入500μ 1 lmg/ml的神經(jīng)氨酸酶并在37°C溫育4h。溫育后，向每個(gè)樣品中加入5ml IOOmM的Tris-乙酸(pH 8. 0)。向每個(gè)樣品中加入用500mM Tris-乙酸、50mM乙酸鈣(pH 8. 0)復(fù)原的另外的l.aiil 10mg/ml的鏈霉蛋白酶并在36°C溫育Mh。處理后，合并所有體積并將其通過離心和過濾準(zhǔn)備用于陰離子交換處理。GAG消化方案通過使用包括亞硝酸或裂合酶降解的已建立的方案對(duì)GAG進(jìn)行分析，包括其硫酸化結(jié)構(gòu)域的大小和相對(duì)硫酸化水平。亞硝酸消化硫酸類肝素的基于亞硝酸的解聚在完成時(shí)導(dǎo)致碳水化合物鏈最終降解為其各個(gè)二糖組分。通過在冰上分別將250 μ 1 0. 5Μ的H2SO4和0. 5Μ的Ba(NO2)2冷卻15分鐘來制備亞硝酸。冷卻后，將Ba(NO2)2與H2SO4混合并在離心以除去硫酸鋇沉淀前渦流混合。將 125 μ 1 HNO2加入到懸浮于20 μ 1 H2O中的GAG樣品中并且渦流混合，然后在不時(shí)混合的情況下在25°C溫育15分鐘。溫育后，將IM Na2CO3加入到樣品中使pH為6。接著，將100 μ 1 0. 25Μ的妝8扎在0. IM NaOH中的溶液加入到樣品中并將混合物加熱至50°C，保持20分鐘。 然后，將混合物冷卻至25°C并在通風(fēng)櫥中用冰醋酸酸化使pH為3。然后，用IOM NaOH中和混合物并通過冷凍干燥使體積減小。將最終樣品在Bio-Gel P-2柱上運(yùn)行以分離二糖和四糖從而驗(yàn)證降解。肝素酶III消化肝素酶III是在葡萄糖醛酸鍵處切割糖鏈的酶。一系列肝素酶(I、II和III)分別通過在特定硫酸化識(shí)別位點(diǎn)使某些硫酸類肝素序列解聚來顯示相對(duì)特異性活性。肝素酶 I沿鏈切割具有NS區(qū)域的HS鏈。這導(dǎo)致認(rèn)為具有HS大部分生物活性的硫酸化結(jié)構(gòu)域的破碎。肝素酶III使NA結(jié)構(gòu)域內(nèi)的HS解聚，從而導(dǎo)致碳水化合物鏈分解成各個(gè)硫酸化結(jié)構(gòu)域。最后，肝素酶II主要切割HS鏈的NA/NS “肩”結(jié)構(gòu)域，其中存在不同的硫酸化類型。為了分離潛在的活性結(jié)構(gòu)域，我們關(guān)注GAG+的NA區(qū)域的解聚。在含有20mM Tris-HCl,0. lmg/ml BSA和4mM CaCl2的緩沖液(pH 7. 5)中制備了酶和凍干的HS。加入至每個(gè)樣品中的肝素酶III的濃度取決于樣品中HS組分的相對(duì)量。我們通過亞硝酸解聚的分析表明GAG+樣品主要由HS組成；因此，以5mU/l μ g HS使用該酶。將樣品在37°C溫育 16h，然后通過加熱至70°C，保持5min來終止反應(yīng)。然后，將樣品應(yīng)用于適當(dāng)?shù)闹到y(tǒng)進(jìn)行進(jìn)一步分析。細(xì)胞培養(yǎng)GAG 生產(chǎn)為了分離代表正在發(fā)育的成骨細(xì)胞的GAG類物質(zhì)，使MC3T3細(xì)胞在成骨條件下生長(zhǎng)8天。通過在25°C，在0.02M氫氧化銨(NH4OH)稀釋溶液中溫育5分鐘以除去細(xì)胞組分。 5分鐘后，通過翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)表面除去NH4OTL使處理過的培養(yǎng)物在超凈工作臺(tái)中干燥過夜。第二天，用無菌PBS將處理過的培養(yǎng)物清洗三次，并使其在超凈工作臺(tái)中干燥。然后，將所制備的基質(zhì)培養(yǎng)物在4°C的無菌條件下存放直至通過破碎緩沖液和陰離子交換色譜處理釋放出主要的蛋白聚糖為止。BMP2-特異性GAG的生物活性通過在添加了 10% FCS的達(dá)爾伯克改良的伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)上以1. 3X IO4個(gè)細(xì)胞/cm2鋪板，將C2C12成肌細(xì)胞每4 繼代培養(yǎng)至最多15代。以2 X IO4個(gè)細(xì)胞/cm2，在添加了 5% FCS的DMEM中誘導(dǎo)成骨分化，重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 (rhBMP2)和對(duì)rhBMP2 具有陽性或陰性親合力的糖胺聚糖部分(分別為GAG+和GAG-)的標(biāo)稱濃度。在加入至其相應(yīng)的C2C12培養(yǎng)物中之前，將rhBMP2和GAG部分在25°C預(yù)溫育30min。使該培養(yǎng)物在這些條件下生長(zhǎng)5天，每48小時(shí)更換用于每種條件的培養(yǎng)基，然后提取mRNA樣品并將其準(zhǔn)備用于 RQ-PCR 分析。使用 ABIPrism7000 序列檢測(cè)系統(tǒng)(PerkinElmer Life Sciences)進(jìn)行骨鈣素表達(dá)的實(shí)時(shí)PCR。使用引物表達(dá)軟件(v2. 1，PE Applied Biosystems)設(shè)計(jì)引物和探針。重新設(shè)計(jì)靶標(biāo)探針以摻入LNA堿基并用BHQ-I (Sigma-Proligo)標(biāo)記。將核糖體亞基基因18S(VIC/TAMRA)用作內(nèi)源對(duì)照，每個(gè)條件包括三個(gè)重復(fù)，每一測(cè)試重復(fù)三次。使用ABI序列檢測(cè)器軟件分析原始PCR數(shù)據(jù)。在計(jì)算相對(duì)表達(dá)單位(REU)前，將靶標(biāo)基因表達(dá)值歸一化為18S的表達(dá)。結(jié)果陰離子交換餼譜為了從MX樣品中成功提取GAG，必須除去可能污染該樣品的其它基質(zhì)蛋白。由于 GAG構(gòu)成了 ECM中帶負(fù)電荷最強(qiáng)的分子，因此采用陰離子交換色譜能夠最有效地完成。使用8M尿素/CHAPS緩沖液破碎樣品并將其加載到陰離子交換色譜柱上。從柱上清洗掉不想要的蛋白和ECM碎片并用IM NaCl洗脫帶負(fù)電的GAG。典型的色譜圖(圖1)清楚地顯示大量未附著的碎片從中流過，并且從MX制備的大量GAG清潔并且緊密地洗脫。因此，該結(jié)果不但證明了通過該方法對(duì)GAG的純化，而且它還確認(rèn)用NH4OH處理后ECM中保留了大量GAG。皿在各個(gè)處理階段，幾乎所有用于純化和分析GAG的色譜方法均需要使用高鹽緩沖液洗脫。由于高鹽條件干擾了基于親合力的色譜方法，因此在每個(gè)處理階段后必須對(duì)樣品脫鹽。該過程通常是使用排阻色譜完成的。在這些條件下，諸如GAG的較大分子在包括鹽和小GAG碎片的小分子之前離開柱?？梢酝ㄟ^所得的色譜圖(圖2)觀察GAG與污染鹽的分離，該色譜圖還用于確認(rèn)GAG鏈在處理過程中保持完整。BMP2-HBP 柱系統(tǒng)柱制備由于使用可商購試劑制備BMP2生長(zhǎng)因子柱的成本限制，我們?nèi)《厥褂昧艘阎腂MP2肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BMP2-HBP)的生物素化制備物。將該肽固定在Hi-Trap抗生蛋白鏈菌素HP柱(Iml)上以特異性地保留對(duì)特定肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域肽具有親合力的GAG鏈。首先，通過對(duì)不含BMP2-HBP的柱床運(yùn)行總GAG (tGAG)流分來檢查GAG對(duì)空白抗生蛋白鏈菌素柱可能具有的任何背景親合力(圖3)。我們的結(jié)果確認(rèn)從MX獲得的tGAG樣品對(duì)抗生蛋白鏈菌素柱不具有固有的親合力。我們還研究了兩種不同的方法，其將tGAG暴露于BMP2-HBP以便分離具有特異親合力的鏈。在加載到抗生蛋白鏈菌素柱上之前，將該肽與 25mg tGAG預(yù)溫育30min，或者先加載該肽，隨后將tGAG流過柱床。tGAG與BMP2-HBP的預(yù)溫育表明該肽完全不能與柱結(jié)合(圖4)，更不必說介導(dǎo)特異性GAG的任何分離了。然而，當(dāng)將該肽單獨(dú)加載到該柱上時(shí)，它與柱的結(jié)合是絕對(duì)的，即使在IM鹽的條件下也不能有效地洗脫該肽(圖幻。這種高親合力結(jié)合表明生物素-抗生蛋白鏈菌素的結(jié)合正確地起作用，并且表明當(dāng)與tGAG —同加載時(shí)，由于位阻而對(duì)與柱之間的結(jié)合產(chǎn)生可能的抑制。柱加載量
由于對(duì)BMP2-HBP可能具有相對(duì)親合力的tGAG的比例未知，因此我們首先將每次分離運(yùn)行中加載到肽柱上的tGAG的量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。通過固定Img BMP2-HBP制備了 Hi-Trap 柱以用于提取對(duì)BMP2肝素結(jié)合位點(diǎn)具有特異親合力的tGAG。選擇該量以使得用于今后實(shí)驗(yàn)的可用肽的量最大化，這會(huì)使柱穩(wěn)定性隨時(shí)間而被破壞。不穩(wěn)定性是肽柱的顯著問題，會(huì)相應(yīng)地影響一致性。開始嘗試將25mg tGAG加載到Img BMP2-HBP偶聯(lián)柱上，其導(dǎo)致明顯過載，如通過232nm的流過液吸光度所觀察的(圖6)。盡管觀察到了明顯的洗脫峰，但是由于過載，在流過液中損失了對(duì)HBP具有親合力的tGAG。通過使流過液再次通過肽柱來檢查這種情況(圖7)。這導(dǎo)致產(chǎn)生了明顯的GAG+(洗脫)峰，表明上次運(yùn)行使該柱飽和。進(jìn)一步的優(yōu)化使我們通常將不超過6mg的tGAG加載至aiigBMP2-HBP柱。如流過液峰(圖8)和陽性結(jié)合部分的缺少(圖9)所證明的，這防止了柱過載。反過來，在單次通過中從每個(gè)樣品組提取對(duì)BMP-HBP具有親合力的那些tGAG使我們能夠更有效地分離GAG+ 和GAG-流分。GAG結(jié)構(gòu)域分析GAG+鏈特異件通過建立標(biāo)準(zhǔn)化方案，我們能夠可復(fù)現(xiàn)地分離GAG+部分以用于進(jìn)一步分析?？紤]到介導(dǎo)蛋白結(jié)合特異性的硫酸類肝素的域結(jié)構(gòu)，很有可能是與柱結(jié)合的多域 GAG鏈實(shí)際上是由對(duì)BMP2具有較低特異性親合力或不具有特異性親合力的大部分鏈組成的。類似地，有可能表現(xiàn)為GAG-的鏈實(shí)際上可能含有對(duì)BMP2-HBP具有一定親合力的結(jié)構(gòu)域。為了檢查這些可能性，必須將GAG鏈破壞成它們的組分域以進(jìn)行更廣泛的檢查。肝素酶111(類肝素酶I)主要在側(cè)接高硫酸化區(qū)域的那些區(qū)域切割HS鏈，由此釋放與敏感生長(zhǎng)因子結(jié)合的高荷電蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，在本文中為BMP2-HBP。將GAG+和GAG-部分暴露于肝素酶消化，盡管任一個(gè)流分都未在對(duì)BMP2-HBP的親合力方面顯示出任何變化 (圖 10)。隨后，對(duì)全長(zhǎng)GAG+和GAG-流分進(jìn)行肝素酶III消化，然后將兩個(gè)消化的樣品組加載到BMP2-HBP柱上以評(píng)價(jià)保留親合力。酶消化后，通過相同干重樣品相對(duì)吸光度的增加驗(yàn)證了肝素酶消化的效力，如圖 10和圖12所示。由于232nm下GAG鏈的監(jiān)測(cè)是通過糖鏈本身進(jìn)行的并且，具體地，是通過不飽和鍵進(jìn)行的，因此導(dǎo)致產(chǎn)生了 HS片段不飽和鍵的肝素酶III沿鏈長(zhǎng)的任何切割都會(huì)造成吸光度的增加。有趣的是，全長(zhǎng)GAG-鏈的肝素酶消化未得到對(duì)BMP2-HBP具有任何明顯親合力的流分(圖11)。然而，類似地，全長(zhǎng)GAG+樣品的消化未產(chǎn)生對(duì)BMP2-HBP缺乏親合力的部分 (圖12)。該結(jié)果表明所產(chǎn)生的全部BMP結(jié)合的GAG鏈含有對(duì)HBP具有特異親合力的域重復(fù)。作為另外一種選擇，在這些最低的條件下，HBP可能不能在具有不同親合力的GAG+域之間得到充分的區(qū)分。GAG+ 組合物全長(zhǎng)GAG+的尺寸估計(jì)(sizing)為了檢查來自BMP2-HBP柱的GAG+組合物流分，我們首先檢查了它們的平均尺寸。 這是為了確保我們確實(shí)分離了具有適當(dāng)長(zhǎng)度的GAG鏈，而不是不帶有任何特異性親合力的小片段。盡管由于它們具有相對(duì)剛性的桿狀構(gòu)象，GAG鏈的任何尺寸估計(jì)都是有問題的，但
39是可以做出涉及斯托克半徑(Stoke' s radiu)和表觀球形度的一組假設(shè)。將全長(zhǎng)GAG+樣品加載到排阻限為20kDa至1. 5kDa之間的BiogelPlO凝膠過濾柱 (IcmX 120cm)上。232nm下測(cè)量的吸光度表明大部分GAG+分子具有大于20kDa的總表觀尺寸(圖13)。已假設(shè)糖鏈必須長(zhǎng)于約10-14個(gè)環(huán)以增強(qiáng)對(duì)有絲分裂原FGF家族的顯著生物活性。就表觀分子量而言，14個(gè)完全硫酸化的二糖鏈對(duì)應(yīng)于約8. 7kDa。由于GAG+樣品中存在的大多數(shù)鏈表現(xiàn)出> 20kDa的表觀分子量，因此假設(shè)它們對(duì)BMP2-HBP所具有的相互作用具有一定特異親合性并且不是由常規(guī)非特異相互作用所造成的是合理的。GAG+糖類物質(zhì)存在五種主要的糖胺聚糖家族透明質(zhì)酸糖胺多糖(hyaluronan)、硫酸角質(zhì)素、 硫酸皮膚素、硫酸軟骨素和硫酸類肝素。在這五種糖胺聚糖中，只有硫酸類肝素、硫酸軟骨素和硫酸皮膚素具有產(chǎn)生不同硫酸化的結(jié)構(gòu)域的能力，這些不同硫酸化的結(jié)構(gòu)域可以編碼與特定細(xì)胞因子(如BMP2)的特異性相互作用。鑒定使用BMP2-HBP柱分離的糖類物質(zhì)的類型對(duì)本研究是至關(guān)重要的，并且使用診斷化學(xué)和酶降解的組合確定了對(duì)它們的鑒定。具體地，作為與BMP2相互作用的主要GAG候選物，硫酸類肝素在存在亞硝酸的情況下可以完全降解為其二糖組分。因此，將我們的HBP保留的GAG樣品與亞硝酸溫育20分鐘，然后在Biogel PlO篩分柱上分離。對(duì)所得色譜圖的檢查表明如對(duì)232nm和226nm處的吸光度所測(cè)量的，所有GAG+ 糖樣品幾乎完全降解(圖14)。該結(jié)果明確表明由于其它糖鏈不受亞硝酸解聚的影響，因此對(duì)BMP2-HBP特異性分離的全長(zhǎng)糖鏈主要是由硫酸類肝素組成的。盡管幾乎所有GAG+鏈都可以按照這種方式降解，但是在較高分子量(> 20kDa) 處還是觀察到了小峰?？梢约俣ㄋ怯闪蛩彳浌撬亟M成的，其中CS-B(硫酸皮膚素)和 CS-E (4，6-硫酸軟骨素)證明了與硫酸類肝素類似的硫酸化復(fù)雜性。GAG類物質(zhì)分析BMP2-HBP特異性GAG (替代物質(zhì))全長(zhǎng)GAG+鏈通過暴露于亞硝酸的降解清楚地表明大多數(shù)GAG+糖鏈?zhǔn)怯闪蛩犷惛嗡靥穷愇镔|(zhì)組成的(圖14)。然而，由于在高分子量區(qū)域中觀察到了殘余的峰，因此GAG+樣品的降解是不完全的。該峰的存在明顯指出了其它種類糖鏈的可能性，如硫酸軟骨素或硫酸皮膚素。接著，我們首先通過檢查多種可商購的軟骨素和皮膚素糖對(duì)BMP2-HBP柱的親合力來設(shè)法檢查另外兩種糖類對(duì)該細(xì)胞因子可能具有的可能親合力。通過在每種情況下，在與用于將GAG+鏈從MC3T3基質(zhì)樣品中分離的相同條件下將 6mg糖加載到BMP2-HBP柱上，我們測(cè)試了 4-硫酸軟骨素(C4S)、6_硫酸軟骨素(C6S)和硫酸皮膚素(DS)。顯示3種糖鏈類型中每一種的親合力的色譜圖顯示只有C4S(圖1 對(duì)該肽具有任何明顯的親合力。這種親合力連同對(duì)C6S(圖16)和DS(圖17)樣品所觀察到的對(duì) BMP2-HBP柱缺乏親合力一起似乎表明C4S對(duì)BMP2肝素結(jié)合位點(diǎn)具有特定的、潛在顯著的相
互作用。由于尚未良好表征硫酸軟骨素和BMP2之間的任何可能相互作用，因此這些結(jié)果使我們懷疑柱色譜作為BMP2/類肝素相互作用的精確監(jiān)控的有效性。為了進(jìn)一步研究動(dòng)態(tài)相互作用的特異性，我們測(cè)試了幾種可商購糖類對(duì)柱的親合力。這些糖類包括硫酸類肝素、 低分子量肝素(肝素-LMW)、高分子量肝素(肝素-HMW)和用肝素酶I處理過的肝素-HMW。有趣的是，這些可商購的GAG類物質(zhì)無一看上去能夠證明與該肽柱的任何特異相互作用。來自牛腎的硫酸類肝素具有極低的親合力(圖18)，通過其不能正向增強(qiáng)FGF2介導(dǎo)的細(xì)胞增殖(數(shù)據(jù)未示出)進(jìn)一步確認(rèn)了該行為，如在存在HS2的情況下所觀察到的。該 GAG樣品與柱結(jié)合能力的這種降低可能是由于它是以相對(duì)未硫酸化的形式出售所造成的。所測(cè)試的肝素樣品無一對(duì)柱顯示出即使是較低的親合力。由于在歷史上BMP2本身首先是使用肝素柱分離的，因此這是特別有趣的。為了確認(rèn)該結(jié)果，測(cè)試了 LMW(圖19) 和HMW(圖20)肝素；兩者均未對(duì)該柱顯示出任何明顯的親合力。由于我們推測(cè)相對(duì)小的BMP2-HBP肽可能難以維持其與明顯更大的肝素分子的結(jié)合，因此我們接著使用肝素酶I預(yù)消化了肝素-HMW樣品。然后，將這些較小的肝素-HMW 片段在BMP2-HBP柱上運(yùn)行；然而，這種處理似乎不能改善任一種肝素樣品結(jié)合肽柱的能力 (圖 21)。由于BMP2通常是通過肝素親合力分離的，因此，肽柱不能對(duì)各種肝素制劑中的任一種表現(xiàn)出任何特異相互作用是有些出乎意料的。然而，可能的原因是，這可能是由于“受體-配體”相互作用順序的顛倒所造成的；在這種情況下，BMP2-HBP代表固定的“受體”，與代表“配體”的肝素相對(duì)，或者BMP2-HBP或可溶性肝素的濃度有利于能夠快速消除流速/鹽壓力下的任何親合力的解離狀態(tài)。結(jié)論前成骨細(xì)胞來源的ECM底物的使用為我們提供了用于模擬與這種成骨誘導(dǎo)有關(guān)的天然分泌的、ECM相關(guān)GAG的活力的有用模型。盡管先前的許多研究已經(jīng)檢查了這種天然相互作用在調(diào)節(jié)BMP2活性中的作用，但是這通常是在細(xì)胞因子水平上進(jìn)行的，而不是著眼于研究生物調(diào)節(jié)GAG的序列特異性。因此，在本文中我們?cè)O(shè)法開發(fā)了 MX底物中天然分泌的GAG的可用性和它們對(duì)于直接、序列特異的相互作用以及調(diào)節(jié)BMP2誘導(dǎo)的C2C12成肌細(xì)胞成為成骨系的潛力。陰離子交換使用這種特別的標(biāo)準(zhǔn)并且良好說明的方案為我們提供了從NH4OH處理的MX底物可接近GAG的結(jié)論性證據(jù)。我們開始的關(guān)注點(diǎn)集中在用于使ECM細(xì)胞組分溶解的苛刻化學(xué)處理，并且這還可能導(dǎo)致大部分GAG從ECM中剝離。然而，陰離子交換色譜圖中所觀察到的顯著高親合力的峰清楚地顯示出大量GAG在MX底物中的保留。盡管這種特定方法不能夠鑒別各種GAG類物質(zhì)，但是由于它們作為細(xì)胞分泌的帶負(fù)電荷最多的分子之一，因此確實(shí)提供了它們?cè)跇悠分写嬖诘慕Y(jié)論性證據(jù)。BMP2-HBP 柱系統(tǒng)對(duì)BMP2肝素結(jié)合肽的功能性作用的先前研究為我們研究BMP2對(duì)GAG所具有的潛在特異相互作用提供了有用工具。位于每個(gè)BMP2單體N-末端的氨基酸單鏈似乎僅負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)BMP2對(duì)GAG的親合力。因此，我們研究了 BMP2分子的這個(gè)區(qū)域作為配基“誘餌”的使用以嘗試保留對(duì)細(xì)胞因子具有相對(duì)親合力的那些GAG鏈。以這種方式使用BMP2-HBP導(dǎo)致HS在肽柱(GAG+)上的顯著保留。柱制備使用N-末端生物素化的HBP，我們制備了 BMP2-HBP親合色譜柱，并且能夠成功保留作為控制天然BMP2同型二聚體候選物的GAG樣品。柱的初始制備顯現(xiàn)出了一些有趣的問題。與tGAG預(yù)混合的生物素化的BMP2-HBP的制備顯示不能與柱結(jié)合。由于隨后的測(cè)試顯示當(dāng)加載到其自身時(shí)，BMP2-HBP易于連接到抗生蛋白鏈菌素柱上，因此該結(jié)果表明GAG 干擾肽生物素化位點(diǎn)與抗生蛋白鏈菌素柱結(jié)合的能力。tGAG本身對(duì)抗生蛋白鏈菌素不具有親合力，這表明與BMP2-HBP可能通過位阻的直接相互作用是造成這種情況的原因。柱優(yōu)化在沒有使我們能夠估計(jì)我們的樣品中GAG+糖的結(jié)合量的任何直接信息的情況下，需要優(yōu)化我們的肽柱以確保過量的樣品加載不會(huì)導(dǎo)致柱飽和以及隨后的樣品損失。這起初包括故意使柱飽和以檢查已知量BMP2-HBP的結(jié)合量。即使使用大量tGAG，肽仍能夠保留大部分GAG+糖鏈。在這些條件下，少至Img的BMP2-HBP能夠在兩次循環(huán)中完全保留所有GAG+鏈。因此，該柱似乎“模擬” 了真實(shí)的BMP2生長(zhǎng)因子柱并且提供了提取GAG+樣品的非常有效的方法。針對(duì)特異GAG的分離，對(duì)基于肽的柱的優(yōu)化是復(fù)雜的程序，其根據(jù)所使用的蛋白質(zhì)的尺寸和個(gè)體化學(xué)特性而有較大不同。利用FGF-I和2生長(zhǎng)因子柱(Turnbull和 Nurcombe,personal communication(個(gè)人通信))的上述研究還顯示出顯著需要對(duì)柱進(jìn)行持續(xù)的維護(hù)以及柱的可用壽命周期較短。這些研究證明了使用肽柱的繁復(fù)的性質(zhì)以及必須小心地正確優(yōu)化該類系統(tǒng)。遺憾的是，盡管存在用于分析特異性蛋白-GAG相互作用的其它系統(tǒng)，但是這些系統(tǒng)通常缺乏分離足夠量的GAG以用于進(jìn)一步分析的能力，從而使它們不適合我們所設(shè)計(jì)的研究過程。GAG結(jié)構(gòu)域分析特別地，對(duì)于硫酸類肝素0B)來說，GAG硫酸化類型經(jīng)常集中在與較少硫酸化的區(qū)域相間隔的高硫酸化結(jié)構(gòu)域中。這種將硫酸化位點(diǎn)分為結(jié)構(gòu)域的分組是提供配體與GAG 鏈區(qū)域特異結(jié)合的集合，從而使得單個(gè)糖分子有可能結(jié)合多個(gè)不同靶標(biāo)，并且穩(wěn)定這些靶標(biāo)之間的相互作用，如在FGF系統(tǒng)中所顯示的。對(duì)于所提出的HS-配體相互作用的這種模型的例外情況包括干擾素Y (IFNy)和硫酸類肝素之間的相互作用。在這種情況下，GAG 和IFNy之間的相互作用導(dǎo)致細(xì)胞因子效力的提高。仍保持與局部GAG解離的IFNY被快速加工成失活形式，由此防止其在擴(kuò)散后在不適合的區(qū)域中發(fā)出信號(hào)。IFNy還顯示出四個(gè)不同的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中每一個(gè)都具有不同的序列，這是對(duì)于肝素結(jié)合蛋白不常見的發(fā)現(xiàn)。然而，已表明只有緊鄰蛋白質(zhì)C末端存在的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)INFy的肝素結(jié)合特性。重要的是，對(duì)這兩個(gè)IFNy肝素結(jié)合位點(diǎn)具有特異型親合力的HS序列的序列分析表明了與HS-配體相互作用的通常所觀察的模型相比的有趣差異。在這種情況下，發(fā)現(xiàn)負(fù)責(zé) IFNy結(jié)合的HS序列主要是由具有較少硫酸化的N-乙酰化區(qū)域組成的。該區(qū)域側(cè)接了兩個(gè)小N-硫酸化區(qū)域。這與FGF中所觀察到的系統(tǒng)顯著不同，在對(duì)TOF所觀察的系統(tǒng)中，NS 結(jié)構(gòu)域中的硫酸化類型是造成介導(dǎo)FGF和HS之間的相互作用的原因。近年來，已在多個(gè)其它系統(tǒng)中觀察到了這類相互作用，如PDGF、IL-8和內(nèi)皮抑素(內(nèi)皮他丁，endostatin)。如在這些細(xì)胞因子中所觀察的，與HS的這種相互作用的發(fā)現(xiàn)可能能夠解釋在透明質(zhì)酸糖胺多糖中所觀察到的生物活性，其中透明質(zhì)酸糖胺多糖在沿其鏈的任一點(diǎn)上不具有硫酸化類型，但是卻具有調(diào)節(jié)該類因子(如NF-κ B)活力的能力。配體和GAG之間的這些所觀察到的相互作用，具體地，IFN γ的相互作用，與所提出的以及我們所觀察到的HS與ΒΜΡ2之間的相互作用模式明顯不同。ΒΜΡ2的單個(gè)N末端肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域未表現(xiàn)出二級(jí)結(jié)構(gòu)并且似乎僅基于電荷與HS相互作用。盡管未對(duì)結(jié)合該肽序列的HS進(jìn)行深入序列分析，但是其需要在約300mM NaCl的條件下洗脫使我們懷疑存在適當(dāng)程度的硫酸化，由此將該相互作用歸于介導(dǎo)特異相互作用的硫酸化類型的傳統(tǒng)模型中。GAG+鏈特異件將硫酸化類型分配成使HS能夠穩(wěn)定蛋白質(zhì)組相互作用的結(jié)構(gòu)域還會(huì)導(dǎo)致存在這種可能性，即具有足夠長(zhǎng)度和復(fù)雜性的GAG+糖鏈可帶有其本身對(duì)BMP2-HBP不具有直接親合力的幾個(gè)結(jié)構(gòu)域，這是由于這些結(jié)構(gòu)域帶有不同的硫酸化序列所造成的。相反地，也有可能鑒別為對(duì)BMP2-HBP(GAG_)具有較低親合力的一些全長(zhǎng)糖鏈可能含有一些確實(shí)帶有這種親合力的隱蔽結(jié)構(gòu)域。近年來，已發(fā)表了為這些復(fù)雜碳水化合物鏈內(nèi)存在“硫酸化編碼”提供強(qiáng)有力證據(jù)的多個(gè)報(bào)告。盡管該“硫酸化編碼”的詳細(xì)情況仍難以闡明，并且硫酸化碳水化合物長(zhǎng)鏈的測(cè)序是復(fù)雜并且費(fèi)時(shí)的過程，但還是由此已提出了 GAG和配基之間特異相互作用的多種可能模式。具體地，一種觀察已導(dǎo)致產(chǎn)生了對(duì)多種GAG-配基模型的表征；沿多種類型GAG (如硫酸類肝素)的長(zhǎng)度，將硫酸化分組為不連續(xù)的區(qū)域或“結(jié)構(gòu)域”。有趣的是，尚未觀察到這種現(xiàn)象的模板，并且它似乎主要是由負(fù)責(zé)GAG合成這一階段的磺基轉(zhuǎn)移酶的暫時(shí)活性所造成的。特別地，研究特異GAG序列的有用工具為可以用于檢查復(fù)雜碳水化合物鏈的靶向解聚的多種肝素裂合酶，借此提供了對(duì)它們結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)。一種特別的類肝素裂合酶，即肝素酶III (類肝素酶)，在側(cè)接可以在硫酸類肝素鏈中存在的高度硫酸化結(jié)構(gòu)域的位點(diǎn)切割硫酸肝素鏈。因此，使用該酶，有可能從全長(zhǎng)糖鏈中釋放這些潛在活性區(qū)域并且如果它們作為單一結(jié)構(gòu)域起作用，則有可能通過親合色譜將它們與對(duì)BMP2-HBP不具有特異親合力的區(qū)域分離。重要的是要注意對(duì)于GAG-配體相互作用來說，序列的親合力不一定能保證生物活性。在與它們的各種配體結(jié)合期間，GAG介導(dǎo)的活性模式根據(jù)系統(tǒng)而明顯不同。在其中糖鏈通過穩(wěn)定蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)來起到延長(zhǎng)蛋白-蛋白相互作用的作用的一些情況下，如在FGF 與其受體之間所存在的以及HGF/SF和Met之間的相互作用，多個(gè)不連續(xù)的硫酸化區(qū)域可以參與調(diào)節(jié)糖鏈的預(yù)定生物活性。在這樣的情況下，各個(gè)硫酸化結(jié)構(gòu)域與全長(zhǎng)碳水化合物鏈的分離實(shí)際上會(huì)造成糖生物活性的抑制，這是因?yàn)楸M管每個(gè)“結(jié)構(gòu)域片段”仍與其預(yù)定靶標(biāo)結(jié)合，但是它不能介導(dǎo)混合的全長(zhǎng)碳水化合物鏈的預(yù)定生物效應(yīng)。有趣的是，GAG-配體相互作用的這種特定特征正是使這種方法對(duì)調(diào)節(jié)BMP2活性有用的原因。對(duì)BMP2生物活性的GAG調(diào)節(jié)所提出的模型包括細(xì)胞因子在ECM中的GAG或在細(xì)胞表面上的固定化。在這樣的系統(tǒng)中，應(yīng)用對(duì)BMP2的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異的外源GAG 將會(huì)阻止這種相互作用，從而提高短期BMP2介導(dǎo)的信號(hào)，這與在加入可溶肝素期間所觀察到的效果類似。盡管存在這種方式的相互作用將會(huì)繼續(xù)保護(hù)細(xì)胞因子不被蛋白水解降解的一些指示，但是從長(zhǎng)遠(yuǎn)來看，BMP2從其生物活性預(yù)計(jì)區(qū)域的離域(delocalization)將有可能對(duì)細(xì)胞因子的有效性造成負(fù)面影響。我們的全長(zhǎng)GAG+和GAG-鏈的對(duì)照測(cè)試產(chǎn)生了與在它們一次分離期間所觀察的類似的分布圖。然而，對(duì)用肝素酶III處理后的GAG+和GAG-鏈的分析獲得了出人意料的結(jié)果。GAG+鏈的消化似乎不能產(chǎn)生僅根據(jù)對(duì)BMP2-HBP的親合力而可分離的片段。此外，全長(zhǎng) GAG-鏈的消化未獲得從陰性糖鏈中釋放的陽性結(jié)構(gòu)域。有一定可能性的是酶消化未達(dá)到完全。然而，所得的色譜圖清楚地顯示與全長(zhǎng)GAG鏈相比，在232nm處的吸光度極大提高。由于232nm下糖胺聚糖的大部分吸光度是通過不飽和鍵(如，酶解聚期間所形成的那些)的吸光度所介導(dǎo)的，因此它明確地表明事實(shí)上酶消化是成功的。該結(jié)果的含意有些不同尋常。該數(shù)據(jù)表明GAG鏈不僅是通過細(xì)胞合成以特異地與 BMP2相互作用，而且對(duì)于MC3T3細(xì)胞來說，這些糖鏈帶有對(duì)BMP2代謝方面特異的多個(gè)序列重復(fù)。BMP2作為極其強(qiáng)效因子的事實(shí)可能為該觀察現(xiàn)象提供解釋。已經(jīng)充分地記載了 BMP2 對(duì)間充質(zhì)祖細(xì)胞的成骨誘導(dǎo)作用，例如它在甚至從成骨系中除去的細(xì)胞中誘導(dǎo)異位骨形成的能力。考慮到該效力，已知BMP2的異位信號(hào)對(duì)治愈和發(fā)育均具有有害的后果。有可能的是在前成骨細(xì)胞GAG上設(shè)計(jì)了 BMP2-HBP相互作用序列的多個(gè)重復(fù)以確保最大結(jié)合，并由此調(diào)節(jié)該細(xì)胞因子誘導(dǎo)改變的細(xì)胞結(jié)局的能力。相反地，體內(nèi)產(chǎn)生的極低濃度的BMP2也可能需要這類糖鏈的產(chǎn)生以確保保留足夠的局部濃度，即由體外誘導(dǎo)C2C12成肌細(xì)胞的成骨分化所需的極高濃度的BMP2所支持的觀察現(xiàn)象。BMP2-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的這種重復(fù)是通過模板或時(shí)間機(jī)制尚未被闡明的合成途徑所產(chǎn)生的這一事實(shí)是特別有趣的。單一糖鏈內(nèi)的序列特異性結(jié)構(gòu)域的準(zhǔn)確性和可復(fù)現(xiàn)性(與對(duì)應(yīng)于其它配基的該類域的隨機(jī)成簇相反)明確地表明這些細(xì)胞實(shí)際上確實(shí)具有指導(dǎo)特異性糖序列產(chǎn)生的能力。當(dāng)前對(duì)HS結(jié)構(gòu)的了解表明，在序列特異性區(qū)域的產(chǎn)生中對(duì)碳水化合物鏈的進(jìn)行性合成后“編輯”，其中一些觀察現(xiàn)象是針對(duì)酶“模板”的一些方式的，借此使用特定磺基轉(zhuǎn)移酶以及其它相互作用分子的局部濃度以直接控制特異性糖序列的產(chǎn)生。我們當(dāng)前對(duì)特異合成的這種模式的理解在很大程度上是根據(jù)多項(xiàng)研究所獲得的，包括Lindahl 等人對(duì)抗凝血酶III和肝素之間高親合力相互作用的研究以及hko等人有關(guān)具有不同GAG 合成途徑的中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞突變體的研究。盡管這些研究在GAG分析方法方面差異顯著，但是它們均針對(duì)用于受指導(dǎo)地調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和受體活性的特異GAG合成的高度保守系統(tǒng)。重要地，這些研究還用于說明這些BMP2重復(fù)的可能產(chǎn)生，如在我們的研究中所觀察到的。GAG+ 組成全長(zhǎng)GAG+尺寸各個(gè)GAG鏈對(duì)于FGF的生物活性與碳水化合物鏈的長(zhǎng)度密切相關(guān)。評(píng)價(jià)GAG生物活性的常用方法是測(cè)定不斷縮短的硫酸化結(jié)構(gòu)域片段，并且從而確定介導(dǎo)所觀察的活性所需的最短可能序列。使用該方法，我們首先檢查了全長(zhǎng)GAG+糖鏈，并且確定它們的尺寸為> 20kDa，其足夠長(zhǎng)以帶有對(duì)BMP2具有親合力的多個(gè)結(jié)構(gòu)域。有趣的是，該觀察現(xiàn)象為用肝素酶3處理的GAG+樣品表現(xiàn)出對(duì)BMP2具有特異親合力的碳水化合物鏈部分的多個(gè)重復(fù)的早期觀察現(xiàn)象提供了支持，這是因?yàn)檫@種尺寸的不同硫酸化的糖鏈具有帶有多個(gè)硫酸化結(jié)構(gòu)域的能力。GAG+糖類物質(zhì)由于組成“糖組”的五種糖胺聚糖類型中的大部分能夠編碼所觀察到的與BMP2之間的特異相互作用，因此必須闡明這些GAG類型中有哪些可以參與這種特異性結(jié)合。盡管這種相互作用的主要候選物為硫酸類肝素，但是還對(duì)硫酸軟骨素和硫酸皮膚素鑒別了類似生長(zhǎng)因子相互作用。使用亞硝酸可以將硫酸類肝素完全解聚成其二糖組分。這種與硫酸肝素和硫酸角質(zhì)素共有的特定特征是分析特異GAG群體所必不可少的。對(duì)于我們的GAG+樣品的碳水化合物組成的分析來說，由于亞硝酸所造成的降解是硫酸類肝素的判斷特征(diagnostic)。 這種可能性主要是由于與硫酸肝素或硫酸角質(zhì)素相比，通過硫酸化其硫酸類肝素的更高度的帶電類型所造成的。最終，這種帶電類型是造成BMP2與HS的特異性相互作用的原因。我們使用亞硝酸方案的分析顯示了 GAG+樣品組的完全降解，這表明GAG+樣品組中大部分的糖實(shí)際上是1，3-連接的，并因此是硫酸類肝素。該結(jié)果支持有關(guān)硫酸類肝素細(xì)胞因子相互作用特異性所觀察到的多種現(xiàn)象，特別是BMP2對(duì)肝素和HS表現(xiàn)出的相互作用。GAG類分析BMP2-HBP特異件GAG (替代件物質(zhì))在亞硝酸降解GAG+樣品后所觀察到的小殘余峰是對(duì)GAG+樣品組中可能存在帶有對(duì)BMP2具有一定特異親合力的其它硫酸化GAG的支持。考慮到我們當(dāng)前所了解的硫酸化在介導(dǎo)GAG和BMP2之間相互作用中的影響，軟骨素和皮膚素是最有可能顯示出與BMP2具有特異相互作用的替代糖，這是因?yàn)樗鼈冊(cè)诹蛩峄愋椭酗@示出最大的可能多樣性。經(jīng)常用于GAG分析的方法包括檢查各個(gè)硫酸化位置對(duì)GAG-配體相互作用的影響。 這種分析方法是各個(gè)硫酸化位置在維持GAG鏈與其特異的靶標(biāo)之間相互作用中的重要性的指征。此外，由于不同類的GAG僅可能帶有對(duì)它們的種類特異的硫酸化類型，因此這能夠輔助縮小可能對(duì)特異性配體表現(xiàn)出親合力的可能糖胺聚糖候選物的范圍。為此，我們檢查了不同硫酸化的CS鏈、C4S和C6S以及標(biāo)準(zhǔn)DS對(duì)BMP2-HBP所帶有的親合力。有趣的是，僅C4S對(duì)BMP2-HBP帶有任何顯著的親合力。該數(shù)據(jù)表明4_0_硫酸化有可能是CS與BMP2-HBP相互作用所必須的。有趣的是，硫酸皮膚素對(duì)BMP2-HBP未顯示出親合力。由于DS是表現(xiàn)出與HS類似的硫酸化多樣性的唯一 CS類，因此所觀察到的該現(xiàn)象是很有意思的。此外，我們的觀察表明DS中GlcA向IdoA的差向異構(gòu)化有可能損害了這種糖類型結(jié)合BMP2-HBP的能力。C4S和DS均能夠帶有4_0_硫酸化，但是與C4S相比僅有少量DS保留在柱上?？商娲兀@種親合力的缺乏可能只是因?yàn)檫@一特定批次的DS未帶有足夠的4-0-硫酸化以有效介導(dǎo)與BMP2-HBP的結(jié)合。有趣的是，所觀察到的這些特別現(xiàn)象似乎表明了 BMP2與帶有4-0-硫酸化的CS之間的相互作用。盡管上述研究已對(duì)藥物遞送系統(tǒng)中CS-BMP2相互作用的使用進(jìn)行了研究，但是對(duì)各個(gè)CS類和BMP2之間的任何序列特異相互作用仍知之甚少。然而，由于HS鏈?zhǔn)怯?，4_連接的二糖單元組成的，因此在 HS-BMP2相互作用中未發(fā)現(xiàn)造成CS-BMP2相互作用的所觀察到的4_0_硫酸化，表明在CS中未發(fā)現(xiàn)序列特異相互作用。因此，有可能的是亞硝酸處理后所觀察到的殘余峰可能含有少量帶有C4S或DS的4-0-硫酸鹽。進(jìn)一步研究顯示，可商購的HS和肝素均未對(duì)肽柱保持任何明顯的親合力。用于該
45測(cè)定的HS商購自Sigma-Aldrich并且來源于牛腎?？紤]到對(duì)HS組織特異性的了解，從牛腎來源中分離的這種可商購的HS有可能帶有特異性地介導(dǎo)與BMP2的相互作用所需要的可忽略的碳水化合物序列。類似地，LMW和HMW肝素均未對(duì)肽柱表現(xiàn)出任何親合力。用于該分析的肝素也購自Sigma-Aldrich，并且來源于豬腸粘膜。盡管已經(jīng)很好地描述了肝素與抗凝血酶III的相互作用，以及它在敏感分子分離中的多種作用，但是由于其均一的硫酸化，一般不認(rèn)為肝素與生長(zhǎng)因子的相互作用是特異性的。然而，考慮到肝素通常用于分離BMP2，有些出人意料的是兩種肝素樣品中無一與肽柱的相互作用達(dá)到任何顯著程度。肽柱與肝素之間缺乏相互作用的另一種可能是由于兩種分子之間分子量的差異。連接到柱上的小BMP2-HBP可能難以維持它與較大的高度硫酸化的肝素鏈的結(jié)合。然而，肝素酶切割的肝素不能與柱結(jié)合似乎表明對(duì)柱使用全長(zhǎng)肝素的空間效應(yīng)不是破壞糖與 BMP2-HBP之間可能相互作用的唯一原因。對(duì)于商購肝素不能與BMP2-HBP柱結(jié)合來說，還沒有發(fā)現(xiàn)非常明確的原因，盡管可以假定通過間隔區(qū)鏈將BMP2-HBP與其結(jié)合的珠在空間上進(jìn)一步分開可以有助于改善該問題?？偨Y(jié)在本研究中，我們證明了使用親合色譜分離帶有對(duì)BMP2-HBP的特異親合力的糖胺聚糖亞組，并且顯示了該程序獲得可復(fù)現(xiàn)結(jié)果的可能性。在我們對(duì)基于基質(zhì)的GAG與 BMP2之間相互作用的這部分研究中，我們對(duì)參與介導(dǎo)這種結(jié)合的GAG類型以及它們的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了幾項(xiàng)觀察。我們的結(jié)果表明，硫酸類肝素用于調(diào)節(jié)BMP2對(duì)前成骨細(xì)胞ECM所具有的大部分親合力，這是逐漸被認(rèn)為負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)BMP2活性的相互作用。此外，我們研究了根據(jù)對(duì)BMP2肝素結(jié)合位點(diǎn)的親合力分離ECM保留的GAG的可能結(jié)構(gòu)，并得到了出人意料的結(jié)果。 我們的數(shù)據(jù)表明全長(zhǎng)BMP2GAG+鏈不是由對(duì)BMP2具有特異親合力的各個(gè)結(jié)構(gòu)域并且在這些結(jié)構(gòu)域之間間隔了對(duì)該因子具有較低或不具有親合力的區(qū)域所組成的。相反，我們的結(jié)果表明這些GAG+鏈?zhǔn)怯啥鄠€(gè)BMP2-結(jié)合結(jié)構(gòu)域重復(fù)組成的。該結(jié)果在幾種水平上都是出人意料的。首先，完成在全長(zhǎng)> 20kDa的碳水化合物鏈上的這種觀察所需的重復(fù)表明存在一定方式的合成模板。的確，盡管上述研究已不能獲得組裝組織特異性GAG鏈的模板，但是存在這種特異性的確切事實(shí)支持存在基于模板的系統(tǒng)。盡管尚未對(duì)該過程闡明基因組模板，但是存在一定可能性的蛋白質(zhì)組學(xué)模板，或者可能是酶模板。第二，該觀察現(xiàn)象提供了一些有關(guān)BMP2與GAG之間相互作用的重要性的證據(jù)?？赡苄枰靥妓衔镦滈L(zhǎng)度上的BMP2親合力位點(diǎn)的多個(gè)重復(fù)以確保BMP2與ECM的最大結(jié)合。已表明這種特定的結(jié)合顯著地延長(zhǎng)了該因子的半衰期，并且可能負(fù)責(zé)維持顯著的局部濃度以維持信號(hào)發(fā)送。可替代地，一些研究提出了模型，借此由于與基于ECM的GAG之間的相互作用，在空間上抑制了 BMP2與其受體的相互作用。在這種特定的方案中，BMP2親合序列的重復(fù)將確保該因子的最大結(jié)合，因此降低了它與其受體相互作用的機(jī)會(huì)。我們的累積性結(jié)果表明用于將GAG與ECM分離的這種系統(tǒng)是可行的并且有可能獲得對(duì)BMP2具有特異親合力的GAG鏈。本研究支持了有關(guān)GAG與BMP2之間相互作用的上述發(fā)現(xiàn)。盡管通過加入外源GAG+ 來防止BMP2與ECM體外結(jié)合似乎提高了 BMP2的信號(hào)并且上調(diào)了成骨基因的表達(dá)，但是還報(bào)道了相反的觀察現(xiàn)象。在這些研究中，通過HBP對(duì)BMP2調(diào)節(jié)的體內(nèi)檢查顯示當(dāng)與ECM GAG 的結(jié)合得到提高時(shí)，長(zhǎng)期骨生成得到顯著改善。這種相互作用有可能是通過防止該因子擴(kuò)散遠(yuǎn)離基本活性位點(diǎn)以在維持局部濃度中起到重要作用。按照這些研究和我們自己觀察到的現(xiàn)象，我們提出了通過其與GAG的結(jié)合正調(diào)和負(fù)調(diào)了 BMP2的活力。通過Katagiri及同事所提出的模型可以精確地發(fā)生負(fù)調(diào)，由此BMP2遠(yuǎn)離其受體在ECM中的保留導(dǎo)致BMP2信號(hào)的下調(diào)。然而，需要通過該因子發(fā)送信號(hào)的細(xì)胞可以潛在地分泌各種酶(如硫酸酯酶和肝素酶)以使細(xì)胞外糖鏈再成型，從而“剪開”保留ECM中BMP2的GAG，借此釋放該因子并允許其發(fā)送信號(hào)，從而導(dǎo)致BMP2-ECM的相互作用最終成為細(xì)胞因子活力正維持中的一種。 可替代地，通過細(xì)胞表面GAG的BMP2負(fù)調(diào)控可以是通過GAG鏈與它們相關(guān)BMP2分子的內(nèi)化作用進(jìn)行的，如Jiao及同事所觀察到的。這些上述研究結(jié)合我們自己的觀察使我們得到以下結(jié)論BMP2與硫酸肝素 (heparin sulfate)之間的序列特異性相互作用代表了能夠正調(diào)控和負(fù)調(diào)控BMP2信號(hào)的復(fù)雜控制機(jī)理。在生理學(xué)上，該相互作用負(fù)責(zé)在胚胎發(fā)育、前體提交和傷口愈合等多個(gè)方面迫使對(duì)該強(qiáng)效細(xì)胞因子產(chǎn)生背景依賴性應(yīng)答。實(shí)施例2-BMP2肽特異性HS的純化我們使用來自成熟BMP-2序列的具有肝素結(jié)合性質(zhì)的肽來鑒別與該肽結(jié)合的新型HS。成熟BMP-2氨基酸序列QAKHKQRKRLKSSCKRHPLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYHAFYCHGECPFPLADHLNSTNHAIVQTLVNS VNSKIPKACCVPTELSAISMLYLDENEKVVLKNYQDMVVEGCGCR[SEQ ID NO 5]肝素結(jié)合肽的氨基酸序列QAKH KQRKRLKSSCKRHP [SEQ ID NO 1]為了復(fù)制肝素結(jié)合位點(diǎn)的天然存在形式，我們?cè)谄銫-末端對(duì)該肽進(jìn)行生物素化并且保留了脯氨酸(P)以改善該肽一旦結(jié)合到抗生蛋白鏈菌素柱上的柔性/可接近性。BMP2肽特異性HS的分離所使用的材料包括BMP2-肽偶聯(lián)的抗生蛋白鏈菌素柱、HiPrep脫鹽柱(GE Healthcare)、20mM PBS+150mM NaCl (低鹽緩沖液)、20mMPBS+l. 5M NaCl (高鹽緩沖液)、 HPLC 級(jí)水(Sigma)、Biologic-Duoflow 色譜系統(tǒng)(Bio-fcid)和冷凍干燥機(jī)。用低鹽緩沖液平衡該柱，并且將Img的Sigma HS(H9902)溶于低鹽緩沖液并通過BMP2-抗生蛋白鏈菌素柱。通過清洗低鹽緩沖液OOmMPBS，pH 7. 2,150mM NaCl)直至 232nm下的流出液吸光度幾乎返回為零為止，將未結(jié)合的媒介組分從柱上除去。用高鹽緩沖液(20mM PBS, pH 7. 2，1. 5MNaCl)洗脫結(jié)合到基質(zhì)上的HS。混合峰組分并凍干48小時(shí)。將Img HS應(yīng)用于該柱，并且用含有低(150mM)NaCl濃度的20mMPBS緩沖液清洗。 在用低鹽緩沖液清洗后，用含有高(1. 5M)NaCl濃度的20mM PBS緩沖液洗脫結(jié)合的HS。收集表示保留流分的峰(在232nm處監(jiān)測(cè))并進(jìn)行進(jìn)一步脫鹽。冷凍干燥后，獲得了 6mg陽性HS (GAG+)和1. ^g陰性HS (GAG-)。實(shí)施例3-BMP-2特異性硫酸類肝素的評(píng)價(jià)C2C12為小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞，其通常表現(xiàn)出生肌分化但是能夠通過在第3代時(shí)添加BMP-2誘導(dǎo)為成骨系。將第3代C2C12細(xì)胞保持在具有1000g/L葡萄糖(低葡萄糖)10% FCS、1 % P/S并且不含L-谷氨酰胺的DMEM中(維持培養(yǎng)基)。將加入1000g/L葡萄糖(低葡萄糖)、5% FCS、1% P/S并且不含L-谷氨酰胺的 DMEM用作分化培養(yǎng)基。BMP-2對(duì)骨牛成的影響我們通過測(cè)量成骨標(biāo)記物(骨鈣素、奧斯特利斯(osterix) ,Runx2)的表達(dá)水平評(píng)價(jià)了外源BMP-2對(duì)骨生成的影響。通過測(cè)定將不同量(lOOng/ml和300ng/ml)的BMP-2加入至細(xì)胞中的影響，我們觀察到了與加入300ng/ml BMP-2相比，在第5天時(shí)加入100ng/ml BMP-2的細(xì)胞中奧斯特利斯(osterix)、骨鈣素和Rimx2的表達(dá)顯著降低(圖27-圖29)。因此，由于任何變化應(yīng)易于觀察，所以我們選擇該時(shí)間點(diǎn)用于今后的測(cè)試。材料和方法使用了第3代的C2C12細(xì)胞。以1 X IO6個(gè)細(xì)胞/瓶，將第3代細(xì)胞保持在液氮中。一旦從液氮中取出細(xì)胞，我們加入500μ 1培養(yǎng)基，來回吸取以使細(xì)胞再凍結(jié)并立即加入15ml培養(yǎng)基。培養(yǎng)基為加入1000g/L葡萄糖(低葡萄糖)、10 % FCS、1 % P/S并且不含L-谷氨酰胺的DMEM。處理培養(yǎng)基為加入1000g/L葡萄糖(低葡萄糖)、5% FCSU% P/S并且不含 L-谷氨酰胺的DMEM。在從培養(yǎng)基中收獲前，允許C2C12細(xì)胞生長(zhǎng)至75%匯合(通常2至3天)。如下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。首先吸取/棄去培養(yǎng)基；加入15ml PBS,棄去PBS并加入3ml 胰蛋白酶，在37°C溫育5分鐘以將細(xì)胞從燒瓶中提高。加入9ml培養(yǎng)基以中和胰蛋白酶。使用GUAVA確定用于隨后在實(shí)驗(yàn)板上進(jìn)行細(xì)胞接種的細(xì)胞量。例如，對(duì)于3組12孔板，30000 細(xì)胞X36孔X3. 7cm2 = 4，000，000個(gè)細(xì)胞。從母液中稀釋細(xì)胞，并且加入用于細(xì)胞接種的所需量的培養(yǎng)基(每個(gè)孔需要500 μ 1包含30，000個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)基)。要制備ΒΜΡ2母液，將10 μ g rhBMP2 (骨形態(tài)發(fā)生蛋白2)再懸浮于100 μ 1的4mM HC1/0. BSA 中。使用了以下的RNA提取方案。將350 μ 1 RAl緩沖液用于細(xì)胞溶解。將細(xì)胞與RAl 一起在-80°C冷凍1天，然后將細(xì)胞融化并且將裂解物在11，OOOg過濾1分鐘。將過濾液與 350 μ 1 70%的乙醇在1. 5ml管中混合并在11，000g離心30s。加入350 μ 1 MDB緩沖液并將混合物在11，OOOg離心1分鐘。加入95 μ 1 DNA酶反應(yīng)混合物并將混合物在室溫下保持至少15分鐘。然后，用200 μ 1的RA2緩沖液清洗(以使DNA酶失活)，并且在11，OOOg離心30s。用600 μ 1 RA3緩沖液清洗，并且在IlOOOg離心30秒。用250 μ 1RA3緩沖液清洗， 并且在11，OOOg離心2分鐘。用60 μ 1不含RNA酶的H2O洗脫RNA，并且在11，OOOg離心1 分鐘。使用Nanodrop測(cè)量濃度(以ng/ μ 1為單位)。如下進(jìn)行RT(反轉(zhuǎn)錄)實(shí)驗(yàn)。在PCR管中混合下列物質(zhì)隨機(jī)引物(0. Ιμ )、 DNTP(1 μ 1)、RNAQ50/500ng)、不含RNA酶的H20(裝滿至最終體積為13μ 1)。在65°C溫育5分鐘。在冰上溫育至少1分鐘。收集內(nèi)含物并且在加入以下物質(zhì)前簡(jiǎn)單離心第一鏈緩沖液1)、DTT (1 μ 1)、RnaseOUT(l μ 1)、SSIII反轉(zhuǎn)錄酶(1 μ 1)。加滿至最終體積為 20μ1。通過來回吸取進(jìn)行混合。在室溫下溫育5分鐘。在50°C溫育60分鐘。在70°C使反應(yīng)失活15分鐘。
在不同天中進(jìn)行兩次反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，并且將PCR產(chǎn)物混合在一起并稀釋至2. 5ng/ μ 1的最終濃度以用于隨后的實(shí)時(shí)PCR。使用TaqMan 快速通用PCR master Mix(2X) (Applied Biosystem)進(jìn)行實(shí)時(shí) PCR0 將 PCR master Mix (10 μ 1) ,ABI 探針(1 μ 1) ,cDNA(l μ 1) ^ddH2O (8 μ 1)、GAPDH 禾口 β 肌動(dòng)蛋白用作相對(duì)于實(shí)驗(yàn)標(biāo)靶OSX(Osterix)、OCN(骨鈣素)和Runx2對(duì)照基因。BMP-2特異件HS GAG+對(duì)骨牛成的影響通過使用定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)測(cè)量成骨標(biāo)記物(osterix、Runx2、堿性磷酸酶和Bspll)的表達(dá)水平，我們?cè)u(píng)價(jià)了實(shí)施例2中分離的BMP-2特異性HS(GAG+)對(duì)骨生成的影響。準(zhǔn)備了時(shí)間過程以比較標(biāo)志物在10天過程中的表達(dá)從而將對(duì)照與低和高劑量BMP-2 進(jìn)行比較，其中高劑量是誘導(dǎo)細(xì)胞分化的最優(yōu)條件。材料和方法將細(xì)胞以30，000個(gè)細(xì)胞/cm2接種到維持培養(yǎng)基中并保持進(jìn)行連接過夜。第二天， 我們將其轉(zhuǎn)換為含有以下物質(zhì)的分化培養(yǎng)基 無添加物· 100ng/ml BMP_2(陽性對(duì)照)· 100ng/ml ΒΜΡ-2+30 μ g/ml_GAG(陰性 GAG)· 100ng/ml BMP-2+30 μ g/ml+GAG(陽性 GAG)· lOOng/ml BMP-2+30 μ g/ml 肝素(Sigma#H3149)· lOOng/ml BMP-2+30 μ g/ml 總硫酸類肝素(Sigma#H9902_ 分離前的 HS)將碳水化合物和BMP-2以最小可能體積混合在一起，并且在將它們加入到培養(yǎng)基和細(xì)胞上之前在室溫下溫育30分鐘。5天后，使用Macherey-Nagel試劑盒提取RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。如我們?cè)趫D30-圖33中所示出的，來自豬粘膜的硫酸類肝素(總HS)可以提高 BMP-2的活力(通過GAG+誘導(dǎo)的堿性磷酸酶、osterix、Bspll和RunX2表達(dá)的提高所顯示的)并且這種活力包含在結(jié)合BMP2的流分中(陽性GAG)。這意味著我們可以通過將它們通過BMP-HBD肽柱來分離商購HS的BMP提高的流分。實(shí)施例4在添加了 10% FCS、2mM L-谷氨酰胺、ImM丙酮酸鈉和青霉素/鏈霉素的α MEM培養(yǎng)基中每72小時(shí)擴(kuò)增MC3T3-El(sl4)前成骨細(xì)胞(從胚胎顱頂建立起的小鼠胚胎顱頂成纖維細(xì)胞系)直至產(chǎn)生了用于鋪板的足夠細(xì)胞為止。通過在添加了 10%FCS、2mM L-谷氨酰胺、25 μ g/ml抗壞血酸、IOmM β -磷酸甘油和青霉素/鏈霉素的α MEM培養(yǎng)基中以5 X IO4 個(gè)細(xì)胞/cm2鋪板使細(xì)胞分化。每72小時(shí)更換培養(yǎng)基，進(jìn)行8天，此時(shí)收獲細(xì)胞和培養(yǎng)基。 通過高速離心并且通過0. 4 μ m過濾器過濾使培養(yǎng)基保留和澄清。使用細(xì)胞刮刀和含有 PBS(150mM NaCl w/o Ca2+ 和 Mg2+), 1 % CHAPS,8M 尿素和 0. 02% NaN3 的提取緩沖液使細(xì)胞層破碎。在所有階段(除非另外說明)，在將樣品加載到柱系統(tǒng)上之前使樣品澄清。該過程包括在5，OOOg高速離心30分鐘，并通過0. 4 μ m注射器式過濾器過濾。在加載通過柱系統(tǒng)前，始終使樣品澄清以防止在不流動(dòng)的溶液中形成沉淀物。使用陰離子交換色譜從培養(yǎng)基和細(xì)胞層樣品中分離蛋白糖胺聚糖(PGAG)流分。在每種情況下，將培養(yǎng)基或細(xì)胞層樣品以5ml/min的流速在使用QuadTec UV-Vis檢測(cè)器的Biologic DuoFlow系統(tǒng)(Biorad)上通過裝填了 Capto Q陰離子交換珠(Biorad)的 Pharmacia XK 26 (56-1053-34)柱。在含有PBS (150mM NaCl w/o Ca2+和Mg2+)、IOOmM NaCl、 0.02% NaR的低鹽緩沖液(pH 7.3)中加載樣品。在含有PBS (150mM NaCl w/oCa2+和Mg2+)、 850mM NaCl和0.02% NaR的高鹽緩沖液(pH 7.3)中洗脫樣品。收集相關(guān)流分并混合成單一的PGAG樣品，并且凍干以備用于脫鹽。將PGAG樣品以10ml/min的流速在使用QuadTec UV-Vis檢測(cè)器的Biologic DuoFlow 系統(tǒng)(Biorad)中通過四個(gè)順序連接的 Pharmacia HiPrep 26/10 (17-5087-01)柱進(jìn)行脫鹽。收集相關(guān)部分并混合成單一樣品組，并且凍干以準(zhǔn)備用于進(jìn)一步處理。在第四步中，對(duì)從脫鹽程序中獲得的PGAG樣品組進(jìn)行鏈霉蛋白酶和神經(jīng)氨酸酶處理以消化掉核心蛋白質(zhì)并隨后釋放GAG鏈。在這個(gè)方面，將凍干的PGAG樣品再懸浮于最小體積的25mM醋酸鈉(pH 5.0)中并通過0. 4 μ m注射器式過濾器過濾澄清。將總樣品體積以500 μ 1等份分配到IOml玻璃管中。向該等份中加入500 μ 1 lmg/ml的神經(jīng)氨酸酶，然后將混合物在37°C溫育4小時(shí)。溫育后，將5ml IOOmM的Tris-乙酸鹽(pH 8. 0)加入至每個(gè)樣品。將在500mM的Tris-乙酸鹽和50mM乙酸鈣(pH 8. 0)中復(fù)原的另外1. 2ml IOmg/ ml的鏈霉蛋白酶加入到每個(gè)樣品中，然后將混合物在36°C溫育M小時(shí)。在該處理后，合并所有體積并通過離心和過濾準(zhǔn)備用于陰離子交換色譜。在第五步中，在蛋白切割后將分離的GAG樣品以5ml/min的流速在使用QuadTec UV-Vis檢測(cè)器的Biologic DuoFlow系統(tǒng)(Biorad)上通過裝填了 Capto Q陰離子交換珠 (Biorad)的 Pharmacia XK 26(56-1053-34)柱洗脫。在這個(gè)方面，在含有 PBS (150mM NaCl w/o Ca2+和Mg2+)和0.02% Ne^3的低鹽緩沖液(pH 7.3)中加載樣品。在含有PBS(150mM NaCl w/oCa2+ 和 Mg2+)、850mM NaCl 和 0. 02% NaN3 的高鹽緩沖液(pH 7. 3)中洗脫樣品。將相關(guān)部分混合、凍干并根據(jù)用于PGAG樣品脫鹽的上述方案進(jìn)行脫鹽。將對(duì)應(yīng)于BMP-2的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域并且包含QAKHKQRKRLKSSCKRH[SEQ ID NO 6] 所表示的氨基酸序列的N-末端生物素化的肽(Img)與含有PBS(150mM NaCl w/o Ca2+和 Mg2+)的低鹽緩沖液混合。通過裝填了抗生蛋白鏈菌素涂覆的樹脂基質(zhì)的柱洗脫混合物。然后，將該柱暴露于含有 PBS(150mM NaCl w/o Ca2+和 Mg2+)、850mM NaCl 和 0· 02% NaN3 的高鹽緩沖液(PH 7. 3)以確定在那些條件下所述的肽是否與基質(zhì)牢固地結(jié)合。未觀察到肽從該柱上的明顯損失。隨后，用制備樣品加載的低鹽緩沖液清洗該柱。將使用實(shí)施例1中所提到的程序分離的GAG混合物(^iig)懸浮于低鹽磷酸鈉緩沖液(ImL)，并加載到實(shí)施例2所述的肽柱上。用含有PBS(150mM NaCl w/o Ca2+和Mg2+)的低鹽緩沖液洗脫該樣品。在UV-Vis檢測(cè)器示蹤中觀察到了對(duì)應(yīng)于具有可忽略的BMP-2親合力的GAG的峰。合并導(dǎo)致產(chǎn)生該峰的柱流分。這些流分被稱為“GAG-”-減號(hào)表示對(duì)該柱缺乏親合力。當(dāng)在UV-Vis檢測(cè)器中明顯可以看出示蹤拉平至基線并且不再有寡糖洗脫時(shí)，將洗脫溶劑更換為含有 PBS (150mM NaCl w/o Ca2+和 Mg2+)、850mM NaCl 和 0. 02% NaN3 的高鹽緩沖液(PH 7. 3)。更換沖洗溶劑后，在UV-Vis檢測(cè)器示蹤中觀察到了對(duì)應(yīng)于BMP-2 特異性GAG的峰。合并導(dǎo)致產(chǎn)生該峰的柱流分。這些流分被稱為“GAG+”-加號(hào)表示對(duì)該柱存在親合力。對(duì)于來源于前成骨細(xì)胞的GAG化合物來說，GAG+流分代表整個(gè)GAG混合物的 10%。
實(shí)施例5BMP2的加入對(duì)誘導(dǎo)C2C12成肌細(xì)胞的成骨分化具有明顯有限的能力。類似地， BMP2與肝素的預(yù)溫育已顯示出能夠延長(zhǎng)細(xì)胞因子的半衰期及其體外直接活力。本文中，我們檢查了 GAG+和GAG-流分通過BMP2增強(qiáng)C2C12細(xì)胞體外成骨誘導(dǎo)的能力。將實(shí)施例4 中的 GAG+樣品(0、10、100、1000ng/ml)在存在 BMP-2 (0、50、100ng/ml) 的情況下體外加入到C2C12成肌細(xì)胞中。骨鈣素基因相對(duì)表達(dá)的測(cè)量表明GAG+樣品能夠增強(qiáng)BMP-2從而在遠(yuǎn)低于目前在治療中所使用的BMP-2 (300ng/ml)的水平下使骨鈣素基因表達(dá)。在圖34中示出了該測(cè)定的結(jié)果(包括計(jì)算的ρ-值和誤差)，其中每種“培養(yǎng)條件” 的實(shí)驗(yàn)條件如下所示1、對(duì)照細(xì)胞，未加入BMP-2，未加入GAG2、50ng/mL 的 BMP-23、50ng/mL 的 BMP-2、10ng/mL 的 GAG+4、50ng/mL 的 BMP-2、100ng/mL 的 GAG+5、50ng/mL 的 BMP-2、1000ng/mL 的 GAG+6、100ng/mL 的 BMP—27、100ng/mL 的 BMP-2、10ng/mL 的 GAG+8、100ng/mL 的 BMP-2、100ng/mL 的 GAG+9、100ng/mL 的 BMP-2、1000ng/mL 的 GAG+有趣的是，盡管lOOOng/ml的GAG+能夠顯著增強(qiáng)BMP2介導(dǎo)的骨鈣素表達(dá)，但是加入濃度低于lOOOng/ml的GAG+似乎逐漸抑制了該表達(dá)。此外，加入足夠的GAG+還能夠使通過50ng/ml BMP2的骨鈣素誘導(dǎo)超過僅加入lOOng/ml BMP2的骨鈣素誘導(dǎo)，從而表明了該相互作用的效力。這種基于細(xì)胞培養(yǎng)的分析證明將GAG+連同BMP2加入到C2C12成骨培養(yǎng)物中導(dǎo)致骨鈣素表達(dá)的顯著上調(diào)，從而表明了 BMP2信號(hào)效力的提高。該結(jié)果支持GAG+鏈與BMP2的特異性結(jié)合，借此阻斷了 BMP2-HBP并防止它與基于基質(zhì)的PGAG的結(jié)合。成骨基因表達(dá)的所得的上調(diào)與利用肝素的上述研究中所觀察到的結(jié)果可比較，從而達(dá)到了類似的作用。有趣地，加入濃度低于lOOOng/ml的GAG+似乎對(duì)BMP2信號(hào)具有初始的拮抗作用。解釋該觀察現(xiàn)象的一個(gè)可能假設(shè)是圍繞著一定數(shù)量GAG+分子結(jié)合一定數(shù)量BMP2 分子的能力進(jìn)行的。在培養(yǎng)系統(tǒng)中未加入外源GAG+的情況下，大部分BMP2分子將能夠與 ECM結(jié)合，借此定位到遠(yuǎn)離它們的同源受體的位置并且不能立即引發(fā)信號(hào)。自發(fā)地和通過它們結(jié)合的GAG鏈的靶標(biāo)酶改變，BMP2隨后從ECM上的解離具有誘導(dǎo)長(zhǎng)期BMP2信號(hào)的能力。如添加了 lOOOng/ml GAG+的樣品中的情況，將大量GAG+分子加入到該系統(tǒng)中使得大部分BMP2分子保留在溶液中，在此它們能夠自由地介導(dǎo)受體二聚作用并誘導(dǎo)下游信號(hào)。細(xì)胞因子/受體相互作用的這些過程可能需要特定的濃度閾值以維持有效的信號(hào)水平。在含有50ng/ml BMP2的培養(yǎng)條件下，低濃度GAG+的加入使得一部分可用的細(xì)胞因子仍保持溶解而其余部分與ECM結(jié)合。在這些條件下，僅有少量BMP2保持溶解，但是由于其濃度較低， 因此將在培養(yǎng)基中高度擴(kuò)散，從而導(dǎo)致產(chǎn)生了可忽略的信號(hào)。類似地，由于一部分BMP2保持溶解，因此ECM中可以存在較少量的BMP2，從而導(dǎo)致通過直接細(xì)胞活性從ECM中釋放的 BMP2的信號(hào)降低。然而，在含有l(wèi)OOng/ml BMP2的培養(yǎng)條件下，在加入lOOng/mlGAG+的情
51況下，溶解的和基于ECM的BMP2的綜合作用足以誘導(dǎo)與對(duì)照水平類似的BMP2信號(hào)。然而， 在沒有進(jìn)一步研究的情況下，對(duì)涉及BMP2/GAG+信號(hào)的動(dòng)態(tài)過程仍不清楚。利用表面等離子共振的今后的研究可以幫助闡明BMP2/GAG+相互作用的效力并且可以輔助解釋這些觀察現(xiàn)象。實(shí)施例6根據(jù)以下的方法，使用類肝素酶3切割實(shí)施例4中的GAG+和GAG-糖鏈。分別用類肝素酶3 (250mU酶/100 μ g寡糖)對(duì)濃度為％ig/mL的GAG+和GAG-在37°C處理16小時(shí)。隨后，將混合物在70°C加熱5分鐘使類肝素酶3失活。對(duì)消化的GAG+和GAG-混合物分別單獨(dú)通過肽柱進(jìn)行處理。每個(gè)色譜運(yùn)行的UV-Vis檢測(cè)器示蹤表明消化的材料對(duì)該柱表現(xiàn)出與未消化材料相同的親合力。實(shí)施例7牛物素化flt與杭牛蛋白鏈菌素梓的偶聯(lián)方法以lmg/ml的濃度，將BMP2HB-肽溶解于含有150mM NaCl的20mM磷酸鹽緩沖液(低鹽緩沖液)中。使用低壓液相色譜(Biologic-Duoflow色譜系統(tǒng)，Bio-Rad)，將肽溶液在用低鹽緩沖液平衡的抗生蛋白鏈菌素柱(Iml)上進(jìn)行親合色譜。以0. aiil/min的流速加載培養(yǎng)基，并且用相同的緩沖液清洗該柱直至基線為零。要檢查肽確實(shí)連接到該柱上， 用1.5M NaCl (高鹽緩沖液)的分級(jí)梯度對(duì)柱進(jìn)行洗脫并用低鹽緩沖液重新平衡。合成了BMP2 肝素結(jié)合位點(diǎn)(5mg)序列(QAKHKQRKRLKSSCKRHP-NHET 生物素(SEQ ID NO 1))并偶聯(lián)到Iml抗生蛋白鏈菌素柱(GE Healthcare)上。色譜圖(圖36)顯示所有肽均緊密結(jié)合在抗生蛋白鏈菌素柱上。BMP2-特異性硫酸類肝素的純化方法以lmg/ml的濃度，將Celsus HS溶解于含有150mM NaCl的20mM磷酸鹽緩沖液(低鹽緩沖液)中。使用低壓液相色譜(Biologic-Duoflow色譜系統(tǒng)，Bio-Rad)，將肽溶液在用低鹽緩沖液平衡的抗生蛋白鏈菌素柱(Iml)上進(jìn)行親合色譜。以0. aiil/min的流速加載培養(yǎng)基，并且用相同的緩沖液清洗該柱直至基線為零。用1. 5M NaCl (高鹽緩沖液) 的分級(jí)梯度洗脫結(jié)合的BMP2特異性HS，收集峰流分并用低鹽緩沖液重新平衡該柱。分別收集洗脫峰(BMP2+ve)和流過峰(BMP2-ve)，將它們凍干并在-20°C保存。色譜圖(圖37)顯示了特異地結(jié)合在柱上的一小部分HS( 15-20% )并且它在高鹽緩沖液中洗脫。BMP2肽柱結(jié)合的HS的脫鹽方法將BMP2特異性HS溶解于IOml蒸餾水中。使用低壓液相色譜 (Biologic-Duoflow色譜系統(tǒng)，Bio-Rad)，將樣品在用蒸餾水平衡的Hi-pr印脫鹽柱(IOml) 上進(jìn)行脫鹽色譜。將HS以lOml/min的流速加載并用蒸餾水清洗該柱。收集純HS流分，將其凍干并在-20°C保存。色譜圖(圖38)顯示了純BMP2特異性HS(吸光度峰)與鹽緩沖液(電導(dǎo)率峰) 的完全分離。BMP2肽柱未結(jié)合的HS的脫鹽方法將非特異性HS溶解于IOml蒸餾水中。使用低壓液相色譜 (Biologic-Duoflow色譜系統(tǒng)，Bio-Rad)，將樣品在用蒸餾水平衡的Hi-pr印脫鹽柱(IOml)上進(jìn)行脫鹽色譜。將HS以lOml/min的流速加載并用蒸餾水清洗該柱。收集純HS流分，將其凍干并在-20°C保存。色譜圖(圖39)顯示了未結(jié)合的HS(吸光度峰)與鹽緩沖液(電導(dǎo)率峰)的完全分離。SAX-HPLC 二糖分析-BMP2 陽件 HS方法將樣品(100 μ g)溶解于IOOmM醋酸鈉/0. 2M醋酸鈣中(pH 7. 0)。肝素酶、 類肝素酶I和II均以10mu/ml的濃度在相同緩沖液中使用。將每個(gè)樣品順序消化以回收二糖用于SAX-HPLC分析；對(duì)于此，將樣品如下所示在37°C進(jìn)行消化肝素酶消化池，類肝素酶I消化lh，類肝素酶II消化18h，并且最后用每種裂合酶的等份消化他。在用0. 25M NH4HCO3平衡的BioGel P-2柱(lX120cm)上運(yùn)行樣品。將二糖峰凍干，然后溶于酸化水 (用HCl酸化，pH 3. 5)中。將其通過連接到高壓液相色譜系統(tǒng)上的ftOPac PA-1SAX-HPLC 柱(Dionex，USA)，并且以lml/min的流速在60分鐘內(nèi)用O至1. OM NaCl (pH 3. 5)的線性梯度洗脫 HS 二糖。在 A232nm 監(jiān)測(cè)使用 HS 二糖標(biāo)準(zhǔn)品(Seikagaku，Tokyo，Japan and Iduron) 鑒別的峰。通過暴露于肝素裂合酶(肝素酶、類肝素酶I和II)的組合至完成，然后將所得的二糖片段進(jìn)行強(qiáng)陰離子交換HPLC (SAX-HPLC)，對(duì)BMP2肽親合柱保留的HS進(jìn)行酶二糖分析。 色譜圖(圖40)上的峰使我們能夠估計(jì)結(jié)合HS的群組中每種組成二糖的相對(duì)比例。該分析顯示BMP2結(jié)合肽HS群組中較大比例的二糖具有N-硫酸化葡糖胺。SAX-HPLC 二糖分析-BMP2 陰件 HS通過暴露于肝素裂合酶(肝素酶、類肝素酶I和II)的組合至完成，然后將所得的二糖片段進(jìn)行強(qiáng)陰離子交換HPLC(SAX-HPLC)，對(duì)BMP2肽親合柱不保留的HS進(jìn)行酶二糖分析。色譜圖(圖41)上的峰使我們能夠估計(jì)HS群組中每種組成的二糖的相對(duì)比例。該分析顯示流過的HS群組中較大比例的二糖具有N-硫酸化葡糖胺。Celsus 總 HS 的 SAX-HPLC 二糖分布圖通過暴露于肝素裂合酶(肝素酶、類肝素酶I和II)的組合至完成，然后將所得的二糖片段進(jìn)行強(qiáng)陰離子交換HPLC (SAX-HPLC)，還對(duì)作為起始材料購自Celsus的總HS進(jìn)行了酶二糖分析。色譜圖(圖4 上的峰使我們能夠估計(jì)HS群組中每種組成二糖的相對(duì)比例。ESPR-BMP2陽性和BMP2陰性HS的分析方法將BMP2+ve 和 _ve HS(10mg/ml)溶解于 Iml 0. IM 的 MES(pH5. 5)中，并且將含有 2mg/ml 生物素-LC-酰胼(Pierce)、EDC (7mg)的 300 μ 1 的 0. IMES (pH 5. 5)加入到混合物中，并且在室溫下溫育2h，然后加入另外7mg的EDC。另外溫育池后，用脫鹽柱 (Amersham Pharmacia)除去未摻入的生物素。對(duì)BMP2+ve和_ve HS測(cè)試它們結(jié)合溶解的 BMP2的能力。使用sra進(jìn)行實(shí)時(shí)結(jié)合分析，其中將生物素硫醇涂覆的金傳感器芯片用作固定化抗生蛋白鏈菌素的平臺(tái)。使用生物素-抗生蛋白鏈菌素-生物素橋，可以將生物素化的HS固定在傳感器芯片上。然后，將生長(zhǎng)因子QOOnM)加入到浸泡固定化HS的溶液中，并溫育20min。通過測(cè)量最小反射角(Θ)隨時(shí)間的變化來監(jiān)測(cè)實(shí)時(shí)結(jié)合。圖44顯示了蛋白質(zhì)-糖相互作用的表面等離子共振(SPR)分析。如曲線所示，其反映“結(jié)合率(on-rate) ”的強(qiáng)度(Ka)，如較小的角遷移所證明的，BMP2與“流過”的HS的結(jié)合不如與BMP2-結(jié)合HS的結(jié)合強(qiáng)。涂覆在Iduron肝素/GAG結(jié)合板上的BMP2+ve和BMP2_ve Celsus HS制劑的BMP2 結(jié)合能力方法將BMP2以3 μ g/ml的濃度溶解于阻斷溶液(0. 2 %的明膠在SAB中的溶液)， 并且用阻斷溶液建立0-3 μ g/ml的稀釋系列。將200 μ 1的ΒΜΡ2的每種稀釋液分配到用肝素預(yù)涂覆的肝素/GAG結(jié)合板的三個(gè)孔中；在37°C溫育2小時(shí)，用SAB和加入到阻斷溶液中的200 μ 1 250ng/ml的生物素化抗-BMP2小心清洗三次。在37°C溫育1小時(shí)，用SAB、加入到阻斷溶液中的200 μ 1 220ng/ml的ExtrAvidin-AP小心清洗三次。在37°C溫育30分鐘， 用SAB和自來水小心清洗三次以除去殘余液體，加入200 μ 1顯色試劑(SigmaFAST磷酸對(duì)硝基苯酯)。在室溫下溫育40分鐘，并且在1小時(shí)內(nèi)在405nm讀數(shù)。特別制備的板表面(lduron)吸附未修飾的GAG，并且同時(shí)保留了它們的蛋白結(jié)合特征。在室溫下，在生理緩沖液中發(fā)生結(jié)合。結(jié)果(圖4 證明BMP2選擇性HS制劑對(duì)BMP2 的親合力比對(duì)流過或天然制劑的親合力更大。BMP2用作對(duì)照。C2C12細(xì)胞上BMP2陽件和陰件HS的ALP活力方法:ALP測(cè)定。在37°C /5% CO2的條件下，將C2C12細(xì)胞以20，000個(gè)細(xì)胞/cm2 鋪板在M孔板中含有10% FCS(Lonza Group Ltd.，Switzerland)和抗生素(1%青霉素和
鏈霉素)(Sigma-Aldrich Inc. ,St. Louis,MO)的 DMEM(Sigma_Aldrich Inc. St. Louis, MO)中。M小時(shí)后，將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換為5% FCS低血清培養(yǎng)基，其中含有l(wèi)OOng/mL BMP2 (R & D Systems，Minneapolis，MN)、3mg/mL Celsus HS 和不同濃度的 BMP2 特異性(+veHS)和非特異性(_ve HS)Celsus HS制劑的不同組合。3天后，使用含有1 % Triton X_100、150mM NaClUOmM Tris (pH 7.4)、2mM EDTA、0. 5% 的意格倍(Ig印al，NP40)、0. 1 % 的十二烷基硫酸鈉(SDS)和的蛋白酶抑制劑混合組III(Calbiochem，Germany)的RIPA緩沖液進(jìn)行細(xì)胞溶解。通過使用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(Pierce Chemical Co.，Rockford，IL)確定細(xì)胞裂解物的蛋白質(zhì)含量。然后，通過將細(xì)胞裂解物與磷酸對(duì)硝基苯酯底物(Irwitrogen， Carlsbad, CA)溫育來確定細(xì)胞裂解物中的ALP活力。將讀數(shù)歸一化為總蛋白量并且表示為對(duì)于僅包含BMP2處理的組的相對(duì)量。圖46顯示與非特異性HS (-ve HS)相比，BMP-2特異性HS (+ve HS)對(duì)BMP-2誘導(dǎo)的堿性磷酸酶(ALP)活力提高的程度更高。將lOOng/mL的BMP-2單獨(dú)引入或結(jié)合30 μ g/ mL的Celsus HS或不同濃度的特異性和非特異性HS引入。單獨(dú)引入30 μ g/mL的特異性和非特異性HS。ALP 染餼方法ALP染色。如上所述，溫育C2C12細(xì)胞。處理3天后，用PBS清洗細(xì)胞層并且根據(jù)生產(chǎn)商的說明，使用白細(xì)胞堿性磷酸酶試劑盒(Sigma-Aldrich Inc. ,St. Louis,MO) 染色。簡(jiǎn)要地，將細(xì)胞層固定在檸檬酸鹽緩沖的60%的丙酮中，并在含有萘酚AS-MX堿性磷酸酶和重氮鹽的堿性染料混合物中染色。使用邁爾蘇木紫溶液進(jìn)行核染色。當(dāng)通過組織化學(xué)評(píng)價(jià)時(shí)(圖47)，與非特異性HS (-ve)相比，BMP-2特異性HS (+ve HS)對(duì)BMP-2誘導(dǎo)的堿性磷酸酶(ALP)活力提高的程度更高。將lOOng/mL的BMP-2結(jié)合 0,0. 3、3 和 30 μ g/mL 的 GAG 引入。BMP2 穩(wěn)定性
方法=Smad 1/5/8磷酸化。在37°C /5% CO2的條件下，將C2C12細(xì)胞以20，000個(gè)細(xì)胞/cm2鋪板在M孔板中含有10% FCS (Lonza Group Ltd.，Switzerland)和抗生素(1% 青霉素和鏈霉素)(Sigma-Aldrich Inc.，St. Louis, MO)的 DMEM(Sigma-Aldrich Inc. St. Louis,MO)中。M小時(shí)后，將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換為5% FCS低血清培養(yǎng)基。在細(xì)胞已經(jīng)在低血清培養(yǎng)基中平衡24小時(shí)后，加入含有100ng/mL BMP2 (R & D Systems, Minneapolis, MN) 并且存在 / 不存在:3mg/mL 肝素(Sigma-Aldrich Inc. ,St. Louis,MO)或 BMP2 特異性(+ve HS)Celsus HS的處理?xiàng)l件。在0、24、48和72小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)處，在IXLaemmli緩沖液中收獲細(xì)胞裂解物。在 NuPAGE Novex4-12% Bis-Tris 凝膠(Invitrogen, Carlsbad, CA)中分離該裂解物，并使用抗磷酸-Smad 1/5/8 (Cell Signaling，Danvers，MA)和 Smad 1/5/8 (Santa Cruz Biotechnology Inc. , Santa Cruz，CA)的抗體通過蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行分析。將BMP2結(jié)合的HS (即HS3)延長(zhǎng)BMP2對(duì)細(xì)胞作用的能力(可能部分是通過保護(hù)蛋白不被蛋白水解降解)與商購肝素的作用進(jìn)行比較。將C2C12細(xì)胞對(duì)無、僅BMP2、BMP2+ 肝素或BMP2+HS3暴露72小時(shí)，并通過免疫印跡監(jiān)測(cè)BMP2特異性胞內(nèi)信號(hào)分子Smad 1/5/8 的磷酸化水平(圖55)。結(jié)果表明HS3可以將BMP2信號(hào)延長(zhǎng)至等于或超過肝素的水平。實(shí)施例8設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)以研究當(dāng)與Smith&N印hew的骨填料JAX 凝膠+磷酸三鈣(TCP)星混合時(shí)，HS3是否可以加速長(zhǎng)骨修復(fù)。在成年兔的尺骨中造成不連接的嚴(yán)重缺損，在缺損處放置星，閉合傷口并且在4 和8周后，使用組織學(xué)和成像的組合監(jiān)測(cè)修復(fù)。生物材料JAX 是由 Smith and Nephew Orthopaedics Ltd，USA 生產(chǎn)的 β-磷酸三鈣(TCP) 合成骨代用品。JAX 是由具有六個(gè)臂的顆粒組成的，其連結(jié)以在缺損位點(diǎn)提供55%的粒間孔隙度，從而允許細(xì)胞和血管滲入。臨床適應(yīng)征為4-5cm的非承重骨缺損。JAX 還包括水凝膠組分。體外研究通過首先用Alexa Flour 488染料標(biāo)記，然后監(jiān)測(cè)其向培養(yǎng)板中PBS的釋放評(píng)價(jià)了肝素以高或低濃度(作為HS的替代物)從JAX凝膠/TCP混合物的體外釋放。兩種情況下的釋放均是快速和爆發(fā)式的。肝素的熒光標(biāo)記。對(duì)于非生物體外測(cè)定，使用我們的研究小組先前發(fā)表的方法(Ε.V.Luong, L.Grondahl, V. Nurcombe, S.Cool.In vitrobiocompatibi1ity and bioactivity of microencapsulated heparan sulfate Biomaterials 2007 ；28 21272136)，將作為HS糖胺聚糖家族的超硫酸化成員的肝素與Alexa Fluor 488(A488， Molecular Probes,UK)連接。簡(jiǎn)言之，將 3mg 肝素(H-3149)溶解于 300 μ L 0. IM 的 4-嗎啉乙烷磺酸(MES，M3671)緩沖溶液(pH 4.5)并與50 μ L 10%的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)二亞胺碳鹽酸鹽(EDC，F(xiàn)luka 03449)在0. IM MES緩沖液中的溶液混合。隨后， 將1%A488在0. IM MES緩沖液中的溶液(501)加入到肝素/EDC溶液中。將混合物避光并在室溫下溫育過夜。將結(jié)合了熒光的肝素在Amersham PDlO脫鹽柱上洗脫。標(biāo)記效率為約 1. 3mol A488/mol 肝素。釋放分布圖。將三種JAX 顆粒與17或170 μ g的A488-肝素(50 μ 1，在100 μ 1水凝膠中)一同加載，避光，并且置于ImL PBS中，在37°C放置48h。在1、2、3、4、5、6、M和 48h，采集100 μ L調(diào)節(jié)過的磷酸鹽緩沖溶液(PBQ用于采樣并用新鮮的PBS替換。通過熒光測(cè)定法定量釋放的Α488-肝素的濃度，并且將Α488-肝素的積累釋放報(bào)告為加載濃度的百分比(圖57)。體內(nèi)研究實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。(參見圖56)對(duì)二十只雄性新西蘭白兔0-2.5公斤重)造成雙側(cè)尺骨缺損。將每種缺損隨機(jī)分配到三個(gè)實(shí)驗(yàn)組之一。每個(gè)缺損接受18個(gè)JAX 顆粒以及含有下列治療劑之一的150 μ 1水凝膠30 μ g HS、100 μ g HS或等體積的PBS (50 μ L)。移植4和 8周后，將兔處死并收獲尺骨。使用2D X射線和微計(jì)算機(jī)斷層(微CT)，非破壞性地評(píng)價(jià)了每種治療的四塊尺骨在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的礦物形成。隨后，處理這些尺骨進(jìn)行組織學(xué)和免疫組織化學(xué)研究。第8周，每種治療加入另外三個(gè)樣品用于扭力測(cè)試評(píng)價(jià)。將一些缺損保持為空以用作內(nèi)部對(duì)照從而確保該模型確實(shí)是不連接的。缺損位點(diǎn)中新骨形成的X射線監(jiān)測(cè)以兩種不同的濃度(30和100μ g，稱為HS30和HS100)將HS3應(yīng)用到Jax凝膠中， 并且與無治療劑相比，評(píng)價(jià)0、4和8周中的新骨形成。HS治療的動(dòng)物與對(duì)照相比表現(xiàn)出新骨形成的明顯跡象。射線照相分析。JAX 顆粒是射線不透明的，并且因此難以通過2D X射線與缺損位點(diǎn)中的新骨進(jìn)行區(qū)分。然而，在早期的時(shí)間點(diǎn)處，顆粒之間以及緊鄰橈骨的空隙是清晰可見的并且可以監(jiān)測(cè)這些空間中骨形成的進(jìn)展(S.A. Clarke, N. L. Hoskins，G. R. Jordan, D. R. Marsh. Healing of an ulnardefect using a proprietary TCP bone graft substitute, JAX , in association with autologous osteogenic cells and growth factors. Bone 2007 ；40 :939-947)。使用成像射線照相系統(tǒng)(MUX-100, shimadzu)來獲得手術(shù)后即刻以及4周和8周時(shí)的尺骨缺損2D圖像。然后，拍攝X射線的數(shù)字顯微照片。在全身麻醉的情況下拍攝X射線照片。圖52、圖53和圖58中示出了 X射線顯微照片。缺損位點(diǎn)中新骨形成的微CT監(jiān)測(cè)使用微CT (計(jì)算機(jī)斷層)成像(圖52、圖53和圖59)，將手術(shù)時(shí)以30和 100 μ g(HS30和HS100)劑量施用的HS3與僅有PBS星的對(duì)照進(jìn)行比較。微CT分析。在第4周和第8周，用微CT掃描儀(Skyscan 1076 ；Skyscan,比利時(shí))掃描收獲的尺骨。以35 μ m的分辨率和68mm的掃描寬度進(jìn)行掃描。掃描儀設(shè)置為電壓104kV，電流98 μ Α。使用錐束CT-重建A Sasov軟件(Skyscan)，將所獲得的各向同性片層數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為2D圖像。對(duì)于該重建來說，骨的上下閾值假定為-315和543豪恩斯菲爾德單位(Hounsfieldunit)。然后，使用用于定量的相關(guān)CTAn軟件(Skyscan)和Mimics 11. 1 軟件(Materialise，比利時(shí))分析并重建數(shù)據(jù)以產(chǎn)生3D圖像。對(duì)于所有的樣品，將所關(guān)心的圓柱形區(qū)域(R0I，相對(duì)于缺損位點(diǎn)同心定位)和總片層數(shù)(對(duì)應(yīng)于缺損的長(zhǎng)度)保持恒定。通過對(duì)總含骨量、皮層骨(JAX 和橈骨)以及小梁骨(或新形成的骨)分配預(yù)定閾值來測(cè)量ROI內(nèi)新形成骨的總體積。將數(shù)據(jù)報(bào)告為骨體積/總體積(％ )。與對(duì)照相比，HS3(30yg和IOOyg劑量)顯著提高了 BV/TV(% )。HS30 和 HS100 治療的尺骨之間沒有顯著差異(圖60)。組織學(xué)
在指定的實(shí)驗(yàn)時(shí)間段后，收獲骨，并將其固定、脫鈣、切片并固定用于各種染料的染色。圖61和圖62示出了 3個(gè)治療組在4和8周內(nèi)的H&E染色(參見下文)。HS3的治療清楚地顯示與對(duì)照相比，有更多組織滲入缺損。高倍放大的H&E染色顯微照片(圖6 顯示新骨在緊鄰Jax星處沉積(更清晰的島)，其中HS治療動(dòng)物中出現(xiàn)了更大量的骨、骨髓和軟骨組織。到第8周，HS治療的尺骨中，新骨已再成型并成熟。組織學(xué)分析。將提取的尺骨在真空下固定到10%中性緩沖福爾馬林中，并且在室溫下在15%的EDTA(pH 7.2)中脫鈣4周。然后，以14h的程序，使用真空組織脫水機(jī) (Sakura Finetek,日本)處理尺骨。脫水并清洗后，將骨包埋在Paraplast石蠟(Thermo Scientific)中，并使用輪轉(zhuǎn)切片機(jī)(Leica Microsystems，德國)將石蠟塊以5 μ M縱向切片。將石蠟切片置于正電荷顯微鏡載玻片上，干燥，用蘇木紫/伊紅以及改性的四色染劑染色并且最后在Olympus Stereo (SZX12)和直立熒光顯微鏡(B)(51)下檢查。圖63和圖64示出了 4和8周內(nèi)3個(gè)治療組的Ralis四色染劑(Z.A.Ralis， G. ffatkins. Modified tetrachrome method for osteoid and defectively mineralized bone in paraffin sections. Biotech and Histochem 1992 ；67 :339-345)染色(參見下文)。HS治療的缺損清楚地顯示與對(duì)照相比，有更多組織滲入缺損。高倍放大的Ralis四色染劑染色的顯微照片(圖64)顯示新骨在緊鄰Jax星處沉積(更清晰的島)，其中HS3治療動(dòng)物中出現(xiàn)了更大量的編織骨、骨髓和毛細(xì)血管。到第8 周，HS治療的尺骨中，新骨已再成型并成熟。免疫染代在指定的實(shí)驗(yàn)時(shí)間段后，收獲骨，并將其固定、脫鈣、切片并固定用于各種染料的染色。圖65示出了 4和8周內(nèi)3個(gè)治療組的晚成骨標(biāo)志物骨鈣素的免疫染色(參見下文)。 HS3治療的樣本清楚地顯示與對(duì)照相比，有更多陽性(棕色)染色填充缺損。骨鈣素染色的高倍放大圖(圖66)顯示新骨在緊鄰Jax星處沉積(更清晰的島)， 其中存在由骨髓、毛細(xì)血管和成骨細(xì)胞劃線的邊界組成的更大量的再成型腔。免疫組織化學(xué)分析。用PBS清洗脫石蠟的切片，并與蛋白酶XXIV(BioGeneX，San Ramon, USA)溫育10分鐘以用于抗原修復(fù)，隨后在室溫下與0. 3%的過氧化氫水溶液溫育20 分鐘。清洗后，將切片用5%的正常山羊血清在PBS中的溶液封閉30min。將組織切片與適當(dāng)濃度的第一抗體骨鈣素(abl3420，l 150, Abeam, UK)或相同濃度的小鼠IgG(MG100， Caltage Lab,USA ；作為陰性對(duì)照)在封閉緩沖液中在4°C溫育過夜。用PBS清洗切片三次， 然后與大鼠吸收的生物素標(biāo)記的抗小鼠IgG(Vector Lab Inc,USA) 一起溫育lh。將切片用 PBS清洗，并與抗生物素蛋白-生物素過氧化物酶復(fù)合物(ABC)溶液(Immunopure ABC過氧化物酶染色試劑盒，Vector Lab. Inc)溫育lh。使用3，3_ 二氨基聯(lián)苯胺-四氫氯(DAB ； DAK0，USA)檢測(cè)過氧化物酶活力。清洗切片，固定并使用01ympusSZX12立體顯微鏡在明視野顯微鏡下檢查。扭力測(cè)試在指定的實(shí)驗(yàn)時(shí)間段后，測(cè)試骨的機(jī)械強(qiáng)度。圖67示出了扭力測(cè)試裝置。扭力測(cè)試。在術(shù)后8周將兔處死，取出兔的尺骨，包裹在PBS滲透的紗布中以保持水分，并且在-20°C冷凍直至進(jìn)行扭轉(zhuǎn)測(cè)試。融化后，將尺骨末端放入盛放在定制塑料塊中的聚甲基丙烯酸甲酯(Meliodent Rapid Repair, Heraeus Kulzer)中，并使其固化從而能夠穩(wěn)定固定。隨后，將尺骨固定到MTS 858Mini Bionix II測(cè)試系統(tǒng)(MTS，Eden Prairie, MN)中。在測(cè)試之前，輕輕地除去聚合物塊和紗布。然后，對(duì)每個(gè)樣本測(cè)試扭轉(zhuǎn)破損并記錄所得的扭轉(zhuǎn)角位移曲線。所使用的轉(zhuǎn)速為每秒1度直至達(dá)到35度，并且以IOOHz采集數(shù)據(jù)。對(duì)每個(gè)樣本記錄剛度、最大轉(zhuǎn)矩和破損角度，其中將剛度測(cè)量為扭轉(zhuǎn)角位移曲線的直線胃^>的余斗· (M. Bostrom, J. M. Lane, Ε. Tomin, Μ. Browne, W. Berberian, Τ. Turek, J. Smith, J. ffozney, T. Schildhauer. Use of bone morphogenetic protein_2in the rabbit ulnarnon-union model. Clin Orthop Relat Res 1996 ；327 :272-282)。統(tǒng)計(jì)分析。以三次重復(fù)獲得定量數(shù)據(jù)，并報(bào)告為平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差。使用學(xué)生氏 t檢驗(yàn)(GraphPad software)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，認(rèn)為ρ-值小于0. 05為顯著。對(duì)照和HS治療的尺骨中評(píng)價(jià)的剛度和最大轉(zhuǎn)矩的定量。HS治療骨的剛度得到顯著改善。由于星占據(jù)了大部分的缺損，其成為新骨滲入的物理屏障，因此它導(dǎo)致了有限的 (與顯著相反)改善-參見圖68。實(shí)施例9-評(píng)價(jià)HS3加載的膠原海綿誘導(dǎo)的極限缺損中的骨再生在第二項(xiàng)研究中使用了與實(shí)施例8相同的整個(gè)方法，除了用FDA批準(zhǔn)的膠原海綿代替Jax TCP星。生物材料。膠原海綿購自htegra Life Sciences (HELISTAT, Integra Life Sciences Corp,USA)并測(cè)量為7X21 X5mm。從牛深屈肌腱加工得到了這些海綿，它們是生物可吸收的并且是無熱原性的。使用掃描電子顯微術(shù)(SEM)評(píng)價(jià)了海綿的形態(tài)。簡(jiǎn)要地，用金濺涂膠原海綿，然后使用SEM(Jeol JSM 5310LV)以IOkV的加速電壓進(jìn)行檢查。生物分子。本研究中測(cè)試的硫酸類肝素OB)為骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)特異性HS， 也稱為HS3。體內(nèi)研究本研究使用每片海綿加載30 μ g的HS3 (HS30)和每片海綿加載10 μ g的 BMP-2 (BMP2-10)。產(chǎn)生雙側(cè)尺骨缺損并用HS30、BMP2_10或HS30+BMP2-10或PBS對(duì)照進(jìn)行處理。將HS3(30y g)單獨(dú)或結(jié)合BMP2 (10 μ g)應(yīng)用到膠原海綿中，并且與無治療相比評(píng)價(jià)了 0、4和8周內(nèi)的新骨形成。這些是相對(duì)于陰性膠原海綿對(duì)照和陽性BMP2對(duì)照評(píng)價(jià)的。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。對(duì)二十只雄性新西蘭白兔(2-2. 5公斤重)造成雙側(cè)尺骨缺損。將每種缺損隨機(jī)分配到三個(gè)實(shí)驗(yàn)組之一。每個(gè)缺損接受浸有下列治療劑(總計(jì)300μ 1，在PBS中) 之一的 1 塊膠原海綿30μ g HSUOy g BMP-2 (有時(shí)稱為 BMP10)、30 μ g HS+10 μ g BMP-2 或等體積的PBS。移植4和8周后，將兔處死并收獲尺骨。使用2D X射線和微計(jì)算機(jī)斷層 (微CT)，非破壞性地評(píng)價(jià)了每種治療的四塊尺骨在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的礦物形成。隨后，處理這些尺骨進(jìn)行組織學(xué)和免疫組織化學(xué)研究。第8周，每種治療加入另外三個(gè)樣品用于扭轉(zhuǎn)測(cè)試評(píng)價(jià)。將一些缺損保持為空以用作內(nèi)部對(duì)照從而確保該模型確實(shí)是不連接的。手術(shù)程序。在兔中進(jìn)行雙側(cè)尺骨截骨術(shù)的研究方案通過了動(dòng)物護(hù)理和使用學(xué)會(huì)的批準(zhǔn)，并且按照所有適當(dāng)?shù)闹笇?dǎo)進(jìn)行。所有手術(shù)程序均在全身麻醉和無菌條件下進(jìn)行。麻醉包括氯胺酮(75mg/kg)和賽拉嗪(10mg/kg)注射劑的組合以及通過吸氣室和面具用于維持的異氟烷。切開6厘米的皮膚切口并且將疊加肌肉層分開直至暴露出尺骨的長(zhǎng)度。使用 Acculan在中央骨干產(chǎn)生1. 5厘米的縱向缺損。射線照相分析。使用成像射線照相系統(tǒng)(MUX-100，shimadzu,日本)來捕獲手術(shù)后即刻以及4周和8周時(shí)的尺骨缺損2D圖像。然后，拍攝X射線的數(shù)字顯微照片(圖69-圖
70)。在全身麻醉的情況下拍攝X射線照片。膠原海綿不是射線不透明的；因此它易于在2D X射線上鑒別缺損位點(diǎn)中的新骨。4周后監(jiān)測(cè)的X射線顯示與陰性對(duì)照相比，在所有治療情況下有大量新骨填充缺損位點(diǎn)(圖70)。8周后監(jiān)測(cè)的X射線顯示所有治療均實(shí)現(xiàn)骨連接，但是在陰性對(duì)照中未實(shí)現(xiàn)(圖
71)。有趣地，單獨(dú)遞送HS3所產(chǎn)生的骨連接與BMP2的情況一樣好，由于已達(dá)到最大，因此 HS3結(jié)合BMP2不會(huì)加速該作用。微CT分析。在第4和8周，用μ CT掃描儀(Skyscan 1076 ；Skyscan,比利時(shí))掃描收獲的尺骨。以35 μ m的分辨率和68mm的掃描寬度進(jìn)行掃描。掃描儀設(shè)置為電壓104kV， 電流98μΑ。使用錐束CT-重建A Sasov軟件(Skyscan)，將所獲得的各向同性片層數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為2D圖像。對(duì)于該重建來說，骨的上下閾值假定為315和543豪恩斯菲爾德單位。然后， 使用用于定量的相關(guān)CTAn軟件(Skyscan)和Mimics 11. 1軟件(Materialise,比利時(shí)) 分析并重建數(shù)據(jù)以產(chǎn)生3D圖像。對(duì)于所有的樣品，將所關(guān)心的圓柱形區(qū)域(R0I，相對(duì)于缺損位點(diǎn)同心定位)和總片層數(shù)(對(duì)應(yīng)于缺損的長(zhǎng)度)保持恒定。通過對(duì)總含骨量、皮層骨 (橈骨)以及小梁骨(或新形成的骨)分配預(yù)定閾值來測(cè)量ROI內(nèi)新形成骨的總體積。將數(shù)據(jù)報(bào)告為骨體積/總體積(％ )_參見圖72。4和8周后，處理組中總體積的百分比骨體積(BV/TV)的微CT定量確認(rèn)單獨(dú)使用 HS3的效果與FDA批準(zhǔn)的BMP2的效果顯著可比較(圖72)。扭力測(cè)試。在術(shù)后8周將兔處死，取出兔的尺骨，包裹在PBS滲透的紗布中以保持水分，并且在-20°C冷凍直至進(jìn)行扭力測(cè)試。融化后，將尺骨末端放入盛放在定制塑料塊中的聚甲基丙烯酸甲酯(Meliodent Rapid Repair, Heraeus Kulzer)中，并使其固化從而能夠穩(wěn)定固定。隨后，將尺骨固定到MTS 858Mini Bionix II測(cè)試系統(tǒng)(MTS，Eden Prairie, MN)中。在測(cè)試之前，輕輕地除去聚合物塊和紗布。然后，對(duì)每個(gè)樣本測(cè)試扭轉(zhuǎn)破損并記錄所得的扭轉(zhuǎn)角位移曲線。所使用的轉(zhuǎn)速為每秒1度直至達(dá)到35度，并且以IOOHz采集數(shù)據(jù)。對(duì)每個(gè)樣本記錄剛度、最大轉(zhuǎn)矩和破損角度，其中將剛度測(cè)量為扭轉(zhuǎn)角位移曲線的直線胃^>的余斗· (M. Bostrom, J. M. Lane, Ε. Tomin, Μ. Browne, W. Berberian, Τ. Turek, J. Smith, J. ffozney, T. Schildhauer. Use of bone morphogenetic protein_2in the rabbit ulnarnon-union model. Clin Orthop Relat Res 1996 ；327 :272-282)。統(tǒng)計(jì)分析。以三次重復(fù)獲得定量數(shù)據(jù)，并報(bào)告為平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差。使用學(xué)生氏 t檢驗(yàn)(GraphPad software)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，認(rèn)為ρ-值小于0. 05為顯著。對(duì)照、BMP2和HS治療的尺骨中評(píng)價(jià)的剛度和最大轉(zhuǎn)矩的定量。對(duì)于治療組，剛度和最大轉(zhuǎn)矩均得到顯著改善。顯著地，單獨(dú)使用HS3的治療在第8周時(shí)導(dǎo)致產(chǎn)生了類似于 BMP2治療的機(jī)械性質(zhì)和完整的骨(圖73)。
權(quán)利要求
1.硫酸類肝素HS/BMP2。
2.分離的或基本純化形式的HS/BMP2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的HS/BMP2，其中，所述HS/BMP2能夠結(jié)合SEQID NO 1或 SEQ ID NO:6。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的HS/BMP2，其結(jié)合至SEQID NO 1的KD小于100 μ Μ。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的HS/BMP2，其中，所述HS/BMP2為N-硫酸化的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的HS/BMP2，其中，所述HS/BMP2為6_0_硫酸化的。
7.一種獲得權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的HS/BMP2或者分離的或基本純化形式的 HS/BMP2的方法，包括(i)提供固體載體，其具有附著于所述載體上的多肽分子，其中所述多肽包含具有氨基酸序列SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 6的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域；( )使所述多肽分子與包含糖胺聚糖的混合物接觸從而使得能夠形成多肽-糖胺聚糖復(fù)合物；(iii)將多肽-糖胺聚糖復(fù)合物與所述混合物的其余部分分開；(iv)使糖胺聚糖從所述多肽-糖胺聚糖復(fù)合物解離；(ν)收集解離的所述糖胺聚糖。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述包含糖胺聚糖的混合物獲自成骨細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)材料。
9.一種組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的HS/BMP2和ΒΜΡ2蛋白。
10.一種藥物組合物或藥劑，包含根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的HS/BMP2。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的藥物組合物或藥劑，其用于治療方法中，所述方法包括斷骨的修復(fù)和/或再生。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的藥物組合物或藥劑，還包含ΒΜΡ2蛋白。
13.根據(jù)權(quán)利要求10至12中任一項(xiàng)所述的藥物組合物或藥劑，其中，所述藥物組合物或藥劑還包含間充質(zhì)干細(xì)胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的HS/BMP2，用于醫(yī)療方法中。
15.在根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的醫(yī)療方法中使用的HS/BMP2，其中，所述醫(yī)療方法包括體內(nèi)傷口愈合的方法。
16.在根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的醫(yī)療方法中使用的HS/BMP2，其中，所述醫(yī)療方法包括結(jié)締組織的修復(fù)和/或再生。
17.在根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的醫(yī)療方法中使用的HS/BMP2，其中，所述醫(yī)療方法包括骨的修復(fù)和/或再生。
18.在根據(jù)權(quán)利要求14所述的醫(yī)療方法中使用的HS/BMP2，其中，所述治療方法包括哺乳動(dòng)物或人的骨的修復(fù)和/或再生。
19.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的HS/BMP2在制備用于哺乳動(dòng)物或人的斷骨修復(fù)和/或再生的藥劑中的應(yīng)用。
20.一種生物相容性植入物或假體，包含生物材料和HS/BMP2。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的植入物或假體，其中，所述植入物或假體涂覆有HS/BMP2。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的植入物或假體，其中，所述植入物或假體浸漬有HS/BMP2。
23.根據(jù)權(quán)利要求20至22中任一項(xiàng)所述的植入物或假體，其中，所述植入物或假體還涂覆或浸漬有BMP2蛋白和/或間充質(zhì)干細(xì)胞。
24.一種形成生物相容性植入物或假體的方法，所述方法包括用HS/BMP2涂覆或浸漬生物材料的步驟。
25.根據(jù)權(quán)利要求M所述的方法，其中，所述方法還包括用BMP2蛋白和間充質(zhì)干細(xì)胞中的一種或兩種涂覆或浸漬所述生物材料。
26.一種治療患者骨折的方法，所述方法包括向所述患者給予治療有效量的HS/BMP2。
27.根據(jù)權(quán)利要求沈所述的方法，其中，所述方法包括向骨折周圍的組織給予HS/ BMP2。
28.根據(jù)權(quán)利要求沈或27所述的方法，其中，HS/BMP2的給予包括將HS/BMP2注射至骨折周圍的組織。
29.根據(jù)權(quán)利要求沈至觀中任一項(xiàng)所述的方法，其中，將所述HS/BMP2配制成包含HS/ BMP2和藥用載體、佐劑或稀釋劑的藥物組合物或藥劑。
30.根據(jù)權(quán)利要求沈至四中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述方法還包括向所述患者給予BMP2蛋白。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中，將所述HS/BMP2和BMP2蛋白配制為包含HS/ BMP2和BMP2蛋白以及藥用載體、佐劑或稀釋劑的藥物組合物。
32.根據(jù)權(quán)利要求沈至31中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述方法還包括向所述患者給予間充質(zhì)干細(xì)胞。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中，將HS/BMP2、BMP2蛋白和間充質(zhì)干細(xì)胞中的至少兩種配制為包含HS/BMP2、BMP2蛋白和間充質(zhì)干細(xì)胞中的至少兩種以及藥用載體、佐劑或稀釋劑的藥物組合物。
34.一種治療患者骨折的方法，所述方法包括將生物相容性植入物或假體手術(shù)植入到在所述骨折部位處或骨折部位周圍的所述患者組織中，所述植入物或假體包含生物材料和 HS/BMP2。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中，所述植入物或假體涂覆有HS/BMP2。
36.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中，所述植入物或假體浸漬有HS/BMP2。
37.根據(jù)權(quán)利要求34至36中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述植入物或假體還浸漬有 BMP2蛋白和間充質(zhì)干細(xì)胞中的一種或兩種。
38.一種培養(yǎng)基，包含HS/BMP2。
39.HS/BMP2在體外細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用。
40.HS/BMP2在結(jié)締組織體外生長(zhǎng)中的應(yīng)用。
41.一種用于結(jié)締組織體外生長(zhǎng)的方法，包括培養(yǎng)與外源添加的HS/BMP2接觸的間充質(zhì)干細(xì)胞。
42.一種促進(jìn)骨生成的方法，所述方法包括將HS/BMP2施用至骨前體細(xì)胞或骨干細(xì)胞。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中，所述骨前體細(xì)胞或骨干細(xì)胞與HS/BMP2體外接觸。
44.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中，所述骨前體細(xì)胞或骨干細(xì)胞與HS/BMP2在體內(nèi)接觸。
45.根據(jù)權(quán)利要求42至44中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述骨前體細(xì)胞或骨干細(xì)胞與 BMP2蛋白接觸，同時(shí)與HS/BMP2接觸。
46.根據(jù)權(quán)利要求42至45中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述骨前體細(xì)胞或骨干細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞。
47.一種在需要這種治療的人或動(dòng)物患者中骨組織修復(fù)、置換或再生的方法，所述方法包括(i)將與HS/BMP2接觸的間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)足以使所述細(xì)胞形成骨組織的一段時(shí)間；( )收集所述骨組織；(iii)將所述骨組織在創(chuàng)傷或疾病部位植入到所述患者的身體中以修復(fù)、置換或再生所述患者的骨組織。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，還包括使所培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞與外源BMP2蛋白接觸。
49.一種骨組織，其是在存在HS/BMP2的情況下通過間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)獲得的。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的骨組織，其中，所述間充質(zhì)干細(xì)胞是在存在BMP2蛋白的情況下培養(yǎng)的。
51.一種培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，包括培養(yǎng)與HS/BMP2接觸的間充質(zhì)干細(xì)胞。
52.一種試劑盒，包含預(yù)定量的HS/BMP2和預(yù)定量的BMP2。
53.一種產(chǎn)品，用于在醫(yī)療方法中同時(shí)、單獨(dú)或順序使用，所述產(chǎn)品含有治療有效量的以下物質(zhì)(i)HS/BMP2 ；和以下中的之一或兩者 ( )ΒΜΡ2 蛋白； (iii)間充質(zhì)干細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過使用BMP2的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的親合色譜所獲得的硫酸類肝素GAG。所述GAG獲自成骨細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)和可商購的硫酸類肝素(Celsus HS)。
文檔編號(hào)C07K14/51GK102209731SQ200980144774
公開日2011年10月5日 申請(qǐng)日期2009年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月11日
發(fā)明者克里斯蒂安·多姆布勞斯基, 維克托·努爾科姆比, 西蒙·麥肯齊·庫爾 申請(qǐng)人:新加坡科技研究局