專利名稱：針對il-25的抗體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及針對白細胞介素25(IL_25)的抗體，包括其結合片段。
背景技術：
哮喘哮喘是常見的慢性氣道炎性病癥。近幾十年來，患者數(shù)目急劇增加，并且世界衛(wèi)生組織估計世界范圍內(nèi)大約有300，000, 000人患有哮喘。過敏性哮喘的特征在于，由多種激發(fā)性刺激物誘導的不可控的氣道反應過度(AHR)，并且與2型炎性浸潤物進入肺相關。2型細胞因子在介導針對寄生的蠕蟲感染的保護性免疫力、調(diào)節(jié)效應子功能例如 B細胞生長和IgE分泌、誘導杯狀細胞增生和相關的粘液產(chǎn)生、嗜曙紅細胞增多、肥大細胞增多和纖維化中具有重要作用(1)。正是這些細胞因子在調(diào)節(jié)這些效應子功能中所起的關鍵作用，使它們成為哮喘中的主要治療靶標。事實上，在過表達這些細胞因子的小鼠模型中，顯示出哮喘的顯著特征。然而令人驚奇的是，除了抑制IL-13之外，通過阻斷特定的2 型細胞因子來改善實驗性哮喘的努力卻證明是不成功的。IL-13的抑制阻抑AHR和氣道炎癥，雖然其機理仍然未知0，3)。然而，鑒于哮喘的病理生理學的復雜性以及對其病因學知之甚少，仍然不確定的是，靶向單一的途徑最終是否會在治療上取得成功。最近證明，IL-25/IL_17E(結構上相關的IL-17細胞因子家族的成員)(8)的過表達在體內(nèi)誘導2型應答(4-6)并且增強對氣道激動劑的反應性(7)。1125+小鼠未能有效驅除蠕蟲寄生蟲；還已經(jīng)表明，在來自具有哮喘的患者的樣品中，無效2型應答的關鍵指征 IL-25(9，10)上調(diào)。炎癥性腸病炎癥性腸病(IBD)是慢性炎癥，其影響大腸或結腸的粘膜層，其通常包括選自下列的一種或多種疾病病況潰瘍性結腸炎(UC)和克羅恩病(CD)。UC被認為是Th2介導的疾病，其代表性小鼠模型顯示出2型細胞因子參與腸炎癥的產(chǎn)生(16)。已經(jīng)在慢性結腸炎的小鼠模型中觀察到了 IL-25的產(chǎn)生，伴隨從Thl至Th2型應答的轉變(17)，并且已經(jīng)報道了 IL-25mRNA在小鼠整個胃腸道中的高表達(18)。此外，IL-25基因位于14號染色體上的克羅恩病易感區(qū)內(nèi)，雖然其與該疾病的潛在關聯(lián)仍待研究(19)。此外，IBD可以包括一種或多種選自下列的疾病病況膠原性結腸炎、淋巴細胞性結腸炎、缺血性結腸炎、轉向性結腸炎、白塞病、感染性結腸炎和未定型結腸炎。用于治療IBD的常規(guī)治療法包括抗生素或留體衍生的藥物；然而目前這些在誘導或維持患者的臨床緩解上是不成功的00)。包括抗-TNF-α試劑的治療法也是目前可以獲得的，雖然其顯示出差的功效01，22)。這說明顯然需要新的和更有效的用于治療炎癥性腸病的治療法?？贵w抗體的基本結構在本領域中是熟知的。天然存在的抗體通常具有4個多肽鏈通過二硫鍵連接的2個相同的重鏈和2個相同的輕鏈。重鏈和輕鏈各具有恒定區(qū)和可變區(qū) (或域)，即VH和VL?？勺儏^(qū)主要負責抗原的結合。在每個可變區(qū)內(nèi)，被稱作互補決定區(qū) (OTR)的三個亞區(qū)與抗原接觸。每個可變域的⑶R從N-末端至C-末端編號為⑶R1、⑶R2 和CDR3。N-和-C末端與CDR之間是4個所謂的框架區(qū)，其不與抗原接觸或接觸極少。在下文列舉的很多文獻中詮釋了關于抗體結構的更詳細的內(nèi)容，這些文獻通過引用方式并入本文。有多種方式可以產(chǎn)生針對靶抗原的抗體。使用雜交瘤技術產(chǎn)生單克隆抗體是此類方法之一。通常在小鼠或其它嚙齒類動物中產(chǎn)生抗體。這可以是產(chǎn)生高親和性抗體的有用方式。然而，對于隨后要用于人類治療中的此類抗體而言，通常需要將抗體的CDR轉移進入人類框架區(qū)。這是為了避免在患者中出現(xiàn)人-抗-小鼠抗體應答。Jones 等人和 Riechman 等人(11，12)描述了 CDR 移植(grafting)的一般原理。 即，將小鼠抗體的CDR移植進入受體人抗體的框架區(qū)內(nèi)。在實踐中，雖然得到的抗體將與相同的靶抗原結合，如同原始供體小鼠抗體一樣，但是，移植的抗體的親和性通常會大大降低。此外，移植的抗體的熱穩(wěn)定性通常會被破壞。試圖恢復并優(yōu)化原始抗體的性質(zhì)的多種方式是本領域已知的。例如，框架區(qū)內(nèi)包含一些與某些種系⑶R相關的“典型(canonical)結構”殘基，見Chothia & Lesk(13)。另外，F(xiàn)oote & Winter(H)已經(jīng)鑒定了“微調(diào)區(qū)”殘基(其中有一些也是典型結構殘基)，其支持抗原結合環(huán)構象及其相對排列，因此被認為在抗體與抗原的適合性的微調(diào)中具有重要作用。此外，認為框架區(qū)內(nèi)的其它殘基使VH/VL界面穩(wěn)定并維持該界面。因此，研究抗體人源化的技術人員通常尋找這樣的人類框架其中微調(diào)區(qū)、典型殘基和界面殘基(“VCI”)盡可能接近地對應于原始供體抗體中的那些殘基。然而，每種抗體都代表了對本領域技術人員的獨特挑戰(zhàn)，不能確定的是，任意一般性的已知的用于CDR移植的方法對于每種情況都是直接適用的。本發(fā)明人和合作者(Ballantyne等人(15))報道了與IL-25結合的小鼠單克隆抗體2C3的產(chǎn)生，其能夠在體內(nèi)阻斷過敏性哮喘中的氣道反應過度。迄今為止，該抗體的序列是公眾不可獲得的。PCT/GB2008/001365,
公開日為 2008 年 10 月 30 日，公開號為 W02008/U^63，報道了 2C3抗體的序列及其在阻斷氣道反應過度中的用途。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及基于2C3序列的人源化的(CDR-移植的)抗體。在產(chǎn)生該抗體時，需要克服多種挑戰(zhàn)。本發(fā)明人首先選擇了具有最大的VCI同源性的受體(recipient)人類抗體VH鏈，其具有22個VCI殘基中的20個。然而發(fā)現(xiàn)，得到的抗體(“RHA”)與IL-25的結合程度顯著小于2C3本身與IL-25結合的程度。雖然對該抗體進行了很多進一步的修飾，包括改變VCI指定的氨基酸和那些似乎代表罕見的體細胞突變的殘基，但是對抗體結合的改善收效甚微。在試圖克服VCI同源性方法在抗體人源化中的失敗時，選擇了不同的人類VH框架，其具有較低的VCI殘基匹配(17/22)，但是具有稍高的總體同源性。得到的抗體提供了比“RHA”抗體更高的結合，雖然其結合仍然不如母體2C3抗體高。為了使結合最大化并且使具有激發(fā)抗體應答的風險的非人殘基最少化，進行了另外的框架ILCDR變化。發(fā)現(xiàn)得到的抗體與2C3相比，具有增強的結合，并且在體內(nèi)測試對氣道反應過度的抑制時發(fā)現(xiàn)，該抗體的效力顯著高于2C3。該抗體還顯示出良好的熱穩(wěn)定性。本發(fā)明涉及衍生自2C3的人源化VH鏈。在一些方面，本發(fā)明涉及包含該鏈的抗體。 所述抗體可以包含含有2C3 VL⑶R的人源化VL鏈。因此，在一個方面，本發(fā)明提供了抗體VH域，其包含SEQ ID NO=I Glu Val Gln Leu ValGlu Ser Gly Ala GluValLysLysProGlyAlaSer ValLys ValSer Cys Lys Ala SerGly Tyr Ser Phe XalXa2TyrThrMetAsnTrpVal ArgGln AlaPro Gly Gln Arg LeuGlu Trp Xa3 Gly LeulieAsnProTyrAsnGlyGly ThrSer TyrAsn Gln Asn Phe LysGly Arg Val Thr LeuThrXa4AspThrSerAlaSer ThrAla TyrLeu Glu Leu Asn SerLeu Arg Ser Glu AspThrGlyValTyrTyrCysAla ArgGlu Xa5Tyr Asp Gly Tyr LeuTyr Phe Ala Met AspTyrTrpGlyGlnGlyThrLeu Val
Thr ValSer Ser其中Xal 是 Ser 或 Thr ；Xa2 Mi Gly> Asp> Ala> Ser> Val> Asn> Lys> Tyr Met ；Xa3 是 Met 或 lie;Xa4 是 Val 或 Arg ；并且Xa5 是 Asp、Asn 或 Gly0在一個方面，殘基Xal至Xa5可以選自下列組合Xal 是 Ser 或 Thr ；Xa2 是 Gly 或 Asp ；Xa3 是 Met 或 lie;Xa4 是 Val 或 Arg ；并且Xa5 是 Asp、Asn 或 Gly0在一些實施方式中，Xa2是Gly并且Xa5是Asp或Asn，優(yōu)選是Asp。在一些實施方式中(包括那些其中Xa2是Gly并且Xa5是Asp或Asn，優(yōu)選是Asp 的實施方式)，Xal是義！·。在一些實施方式中(包括那些其中Xa2是Gly并且Xa5是Asp或Asn，優(yōu)選是Asp 的實施方式)，Xal是Thr。在一些實施方式中(包括所有以上描述的)(a2、Xa5和Xal的組合)，Xa3是Met。在一些實施方式中(包括所有以上描述的fe2、Xa5和Xal的組合)，Xa3是lie。
所有上述實施方式可以與)(a4的任一選項即Val或Arg組合。上述殘基的特定組合顯示于下表中。為了技術人員方便起見并且為了與隨附的實施例保持一致，表中列出了殘基的Kabat編號。在一些情況下，這與序列表中的編號不同。
權利要求
1.抗體VH域，其包含SEQID NO 1GluValGlnLeuValGluSerGlyAlaGluValLysLysProGlyAlaSerValLysValSerCysLysAlaSerGlyTyrSerPheXalXa2TyrThrMetAsnTrpValArgGlnAlaProGlyGlnArgLeuGluTrpXa3GlyLeulieAsnProTyrAsnGlyGlyThrSerTyrAsnGlnAsnPheLysGlyArgValThrLeuThrXa4AspThrSerAlaSerThrAlaTyrLeuGluLeuAsnSerLeuArgSerGluAspThrGlyValTyrTyrCysAlaArgGluXa5TyrAspGlyTyrLeuTyrPheAlaMetAspTyrTrpGlyGlnGlyThrLeuValThrValSerSer，其中Xal 是 kr 或 Ilir ；Xa2 是 Gly、Asp、Ala、Ser、Val、Asn、Lys> Tyr 或 Met ； Xa3 是 Met 或 lie ； Xa4是Val或Arg ；并且 Xa5 是 Asp、Asn 或 Gly0
2.權利要求1的VH域，其中Xa2是Gly并且Xa5是Asp或Asn。
3.權利要求2的VH域，其中Xa2是Gly并且Xa5是Asp。
4.權利要求1的VH域，其中Xal是kr。
5.權利要求1的VH域，其中Xal是Thr。
6.權利要求1的VH域，其中Xa3是Met。
7.權利要求1的VH域，其中Xa3是lie。
8.權利要求1的VH域，其中Xa4是Val。
9.權利要求1的VH域，其中Xa4是Arg。
10.權利要求1的VH域，其中殘基fel-Xa5是以下組合CN 102245638 A權利要求書2/3頁Kabat殘基3031487196SEQ ID NO: 1 中30314872100的位置序列表殘基XalXa2Xa3Xa4Xa5SEQ ID NO:2SerGlyMetValAspSEQ ID NO:3ThrGlyMetArgAspSEQ ID NO:4SerGlyMetArgAspSEQ ID NO:5ThrGlyMetValAspSEQ ID NO:6SerAspMetValAspSEQ ID NO:7ThrAspMetArgAspSEQ ID NO:8ThrAspMetValAspSEQ ID NO:9SerGlylieValAspSEQ ID NO: 10ThrGlylieArgAspSEQ ID NO: 11ThrGlylieValAspSEQ ID NO: 12SerAsplieValAspSEQ ID NO: 13ThrAsplieArgAspSEQ ID NO: 14ThrAsplieValAsp
11.靶結合成員，其與IL-25結合并且包含抗體VH域，其中所述VH域是根據(jù)權利要求 1的VH域。
12.權利要求11的靶結合成員，其包含VL域，所述VL域的Kabat⑶Rl-⑶R3分別是SEQ ID NO 15 的殘基 24-34 (SEQ ID NO 29) ,50-56 (SEQ ID NO 30)和 89-97 (SEQ ID NO :31)。
13.權利要求12的靶結合成員，其中所述VL域還包括SEQID NO 15的殘基35-38，其鄰近 CDRl (SEQ ID NO 29)。
14.權利要求12的靶結合成員，其包含SEQID NO :15。
15.權利要求12的靶結合成員，其中所述VL域是人源化的。
16.權利要求15的靶結合成員，其序列包含SEQID NO 25的氨基酸21-127。
17.權利要求11的靶結合成員，其是Fab、F(ab')2、scFv、Fv或dAb抗體片段。
18.權利要求11的靶結合成員，其包含抗體恒定區(qū)。
19.權利要求18的靶結合成員，其中所述恒定區(qū)是人IgGl或IgG4恒定區(qū)。
20.權利要求18的靶結合成員，其包括完整抗體。
21.分離的核酸，其包含編碼權利要求1的VH域的核苷酸序列。
22.表達載體，其包含與啟動子可操作地連接的權利要求21的核酸。
23.宿主細胞，其攜帶權利要求22的表達載體。
24.產(chǎn)生靶結合成員的方法，所述方法包括在產(chǎn)生所述靶結合成員的條件下培養(yǎng)根據(jù)權利要求23的宿主細胞。
25.權利要求對的方法，其還包括分離所述靶結合成員。
26.權利要求25的方法，其還包括將所述靶結合成員配制進入包括至少一種另外的成分的組合物中。
27.組合物，其包含權利要求11的靶結合成員和藥學上可接受的載體。
28.權利要求27的組合物，其為凍干的粉末形式。
29.用于治療或預防哮喘的方法，所述方法包括向有治療需要的受試者給予有效量的權利要求11的靶結合成員。
30.用于治療或預防哮喘的權利要求11的靶結合成員。
31.用于治療或預防炎癥性腸病的方法，所述方法包括向有治療需要的受試者給予有效量的權利要求11的靶結合成員。
32.用于治療或預防潰瘍性結腸炎的方法，所述方法包括向有治療需要的受試者給予有效量的權利要求11的靶結合成員。
33.用于治療或預防克羅恩病的方法，所述方法包括向有治療需要的受試者給予有效量的權利要求11的靶結合成員。
34.用于治療或預防炎癥性腸病的權利要求11的靶結合成員。
35.用于治療或預防潰瘍性結腸炎的權利要求11的靶結合成員。
36.用于治療或預防克羅恩病的權利要求11的靶結合成員。
37.產(chǎn)生針對IL-25的抗體的方法，其包括(a)提供權利要求1的抗體VH域；(b)將所述VH域與多種抗體VL域組合以提供抗體分子；(c)就與IL-25的結合篩選所述抗體分子；和(d)選擇與IL-25結合的抗體分子。
38.分離的核酸，其包含編碼權利要求11的靶結合成員的核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及IL-25抗體VH域和包含此類抗體VH域并且與IL-25結合的靶結合成員(例如抗體)。本發(fā)明還涉及包含與IL-25結合的靶結合成員(例如抗體)的組合物，產(chǎn)生此類靶結合成員的方法，以及此類靶結合成員用于治療或預防疾病和病況(例如哮喘、炎癥性腸病)的用途。
文檔編號C07K16/24GK102245638SQ200980147932
公開日2011年11月16日 申請日期2009年9月30日 優(yōu)先權日2008年9月30日
發(fā)明者A·N·J·麥肯茲, D·J·馬修斯, J·巴羅 申請人:醫(yī)療研究局