專利名稱：早期骨關(guān)節(jié)炎的治療的制作方法
早期骨關(guān)節(jié)炎的治療序列表
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本發(fā)明涉及骨關(guān)節(jié)炎的治療，特別涉及通過施用甲狀旁腺素或由甲狀旁腺素衍生的物質(zhì)來治療早期骨關(guān)節(jié)炎的方法。背景
關(guān)節(jié)炎包括涉及身體關(guān)節(jié)損傷的一類疾病。關(guān)節(jié)炎是五十五歲以上人群殘疾的最主要原因。關(guān)節(jié)炎的最常見的形式——骨關(guān)節(jié)炎(OA)是由關(guān)節(jié)創(chuàng)傷、關(guān)節(jié)感染或年長引起的。骨關(guān)節(jié)炎是一種臨床綜合癥，輕微的炎癥會導(dǎo)致關(guān)節(jié)疼痛，它是由覆蓋關(guān)節(jié)并在關(guān)節(jié)內(nèi)起襯墊作用的軟骨的非正常磨損以及潤滑關(guān)節(jié)的滑液的性質(zhì)的破壞或改變而引起的。當骨表面變得被軟骨保護得不太好時，負重(包括走路或站立)時患者會感到疼痛。由于疼痛使得移動增加，則局部肌肉可能萎縮，韌帶會變得更加松弛。骨關(guān)節(jié)炎在美國影響近兩千一百萬人群，占初級護理醫(yī)生出診人數(shù)的25%以及非類固醇抗炎藥(NSAID)處方的一半。據(jù)估計，這些人的80%到65歲時X光照相會顯示有患骨關(guān)節(jié)炎，即使只有60%會表現(xiàn)出癥狀。隨著許多國家年長者數(shù)量的增加，骨關(guān)節(jié)炎成為了一種日益普遍的關(guān)節(jié)疾病。例如，在美國，60歲以上人群的10%都患有OA。OA的當前治療主要包括使用抗炎藥、止痛劑和潤滑補充劑。因此，開發(fā)能夠在早期抑制OA進展的藥劑是優(yōu)先考慮的事項。在患OA的患者中，軟骨細胞，例如在骨骺生長板中的軟骨細胞，已知能夠恢復(fù)表型改變，其中軟骨細胞經(jīng)歷從肥大到礦物質(zhì)沉積到最終凋亡的終末分化過程(Blanco FJ et al. , Arthritis Rheum 1998; 41: 284-9； Kirsch T et al. , Osteoarthritis Cartilage 2000; 8: 294-302)。OA中的軟骨細胞表達肥大軟骨細胞的標記蛋白，包括膜聯(lián)蛋白(armexin)、堿性磷酸酶和X型膠原(Col X)(非II型膠原(Col II))。在生長板中調(diào)節(jié)軟骨內(nèi)骨化的反饋回路包括甲狀旁腺素相關(guān)肽(PTHrP)、IHH蛋白andian hedgehog)和Bcl_2。PTHrP維持增殖性軟骨細胞的功能并抑制軟骨細胞朝肥大分化(Horton WE Jr et al. , Matrix Biol 1998; 17: 107-15; Weisser J et al., Exp Cell Res, 2002; 279: 1-13) 0先前的報道已表明，OA進展期間的關(guān)節(jié)軟骨細胞的生物學(xué)變化與軟骨內(nèi)骨化類似(Blanco FJ, et al.，Arthritis Rheum 1998; 41 284-9； Kirsch T et al. , Osteoarthritis Cartilage 2000; 8: 294-30 。生長板中的軟骨細胞分化的生物學(xué)變化與在骨關(guān)節(jié)炎的進展中觀察到的類似。已報道稱，在骨關(guān)節(jié)炎中，軟骨細胞的表型變化類似于在骨骺生長板中的變化，在骨骺生長板中，軟骨細胞經(jīng)歷終末分化、肥大、礦物質(zhì)沉積和最終的凋亡(Arthritis. Rheum. (1998) 41(2) 284-9； Ann. Rheum. Dis. (2000) 59(12) 959-65; Osteoarthritis Cartilage (2000) 8(4): ^4-30 。骨關(guān)節(jié)炎的軟骨細胞表達肥大軟骨細胞的標記蛋白，包括鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白、堿性磷酸酶和X型膠原(Col X)，但不表達II型膠原(Col II)。
之前已表明，甲狀旁腺素相關(guān)蛋白(PTHrP)可能可以用于治療骨關(guān)節(jié)炎。例如PCT 專利申請，W02008/156725，描述了通過將PTHrP注射到關(guān)節(jié)軟骨的深層區(qū)域來抑制關(guān)節(jié)軟骨礦化。如上所述，軟骨細胞分化涉及復(fù)雜的過程，包括細胞分化、肥大、終末分化、礦化和細胞死亡(凋亡)。但是，現(xiàn)有技術(shù)并未顯得提供任何會逆轉(zhuǎn)軟骨細胞退化進程的方法，所述退化進程包括在患者骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展期間出現(xiàn)的關(guān)節(jié)軟骨礦化。因此，需要一種可抑制或預(yù)防軟骨礦化和軟骨細胞凋亡的方法，所述方法將抑制或逆轉(zhuǎn)早期骨關(guān)節(jié)炎的軟骨細胞的退化進程并且可被用來治療骨關(guān)節(jié)炎，特別是早期骨關(guān)節(jié)炎。概述
一方面，本發(fā)明提供一種用于治療動物的早期骨關(guān)節(jié)炎的方法，所述方法包括將治療有效量的選自甲狀腺旁素(PTH)和PTH衍生物質(zhì)的試劑，例如PTH (1-34)，遞送至需要這種治療的動物的受侵害的關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)腔中。另一方面，本發(fā)明提供一種用于抑制動物的關(guān)節(jié)軟骨細胞凋亡的方法，所述方法包括將治療有效量的選自甲狀腺旁素(PTH)和PTH衍生物質(zhì)的試劑，例如PTH (1-34)，遞送至需要這種治療的動物的受侵害的關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)腔中。另一方面，本發(fā)明提供一種用于抑制動物的受侵害的關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)軟骨細胞的退化進程的方法，所述方法包括將治療有效量的選自甲狀腺旁素和甲狀腺旁素衍生物質(zhì)的試劑遞送至需要這種治療的動物的受侵害的關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)腔中，從而關(guān)節(jié)軟骨細胞接觸所述試劑。在本文公開的方法的某些實施方式中，所述試劑包括PTH的氨基酸1-34，在這種實施方式的一個具體方面，所述試劑包括人甲狀旁腺素的氨基酸1-34。在本文公開的方法的其他實施方式中，所述試劑本質(zhì)上由PTH的氨基酸1-34構(gòu)成，在這種實施方式的具體方面，所述試劑本質(zhì)上由人甲狀旁腺素的氨基酸1-34構(gòu)成。在一個實施方式中，所述試劑的遞送是通過關(guān)節(jié)內(nèi)注射實現(xiàn)的。在本文公開的方法的某些實施方式中，所治療的動物是人，并且受侵害的關(guān)節(jié)是選自指關(guān)節(jié)、腕關(guān)節(jié)、肘關(guān)節(jié)、肩關(guān)節(jié)、頸關(guān)節(jié)、臀關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)、踝關(guān)節(jié)和趾關(guān)節(jié)的滑液關(guān)節(jié)。在這些實施方式的某些方面，試劑的治療有效量是指在滑液關(guān)節(jié)的滑液中提供約0. 1 nM 至約 200 nM、約 0. 25 nM 至約 100 nM、約 0. 5 nM 至約 75 nM、約 0. 75 nM 至約 50 nM 或約1 nM至約25 nM的初始濃度的試劑。在本文公開的方法的某些實施方式中，試劑的治療有效量為約0. 1皮摩爾至約 5000皮摩爾、約0. 5皮摩爾至約1500皮摩爾、約1皮摩爾至約1000皮摩爾、約2. 5皮摩爾至約500皮摩爾或約5皮摩爾至約300皮摩爾。在某些實施方式中，遞送的溶液體積可為約0. 1 ml至約10 ml，試劑在溶液中的濃度為約1 nM至約500 nM、約2. 5 nM至約250 nM 或約5 nM至約100 nM。在另一個實施方式中，遞送的溶液體積為約1 ml至約3 ml，所含試劑的濃度為約5 nM至約100 nM。本發(fā)明的其他目的和特征將從以下結(jié)合附圖考慮的詳細說明中變得明顯。


本發(fā)明將根據(jù)以下結(jié)合附圖的詳細描述而進一步被理解。
圖1A-1F顯示各物質(zhì)在對照或azaC處理的人關(guān)節(jié)軟骨細胞(使用或未用 PTH(1-34)處理)中的水平的變化㈧聚集蛋白聚糖mRNA，⑶糖胺聚糖(GAG)，(C) IIal型膠原(Col2al)，(D)Xal 型膠原(CollOal)，(E)堿性磷酸酶(ALP)和(F) IHH，其中 PTH(1-34) 是由人甲狀腺旁素的氨基末端氨基酸1-34組成的34個氨基酸長的肽。圖2A-2C顯示各物質(zhì)在對照或azaC處理的人關(guān)節(jié)軟骨細胞(使用或未用 PTH(1-34)處理)中的變化(A) Bc 1-2 的 mRNA 表達，(B)Bax 的 mRNA 表達，(C)Bcl_2 與 Bax 的比率。圖3顯示在人關(guān)節(jié)軟骨細胞中ΡΤΗ(1-34)對azaC誘導(dǎo)的凋亡的影響。圖4顯示在正常的和骨關(guān)節(jié)炎(OA)大鼠關(guān)節(jié)軟骨中ΡΤΗ(1-34)對糖胺聚糖(GAG) 水平的影響。圖5顯示在正常的和骨關(guān)節(jié)炎(OA)大鼠關(guān)節(jié)軟骨中ΡΤΗ(1-34)對免疫定位的II 型膠原的影響。圖6顯示在正常的和骨關(guān)節(jié)炎(OA)大鼠關(guān)節(jié)軟骨中ΡΤΗ(1-34)對軟骨細胞凋亡的影響。圖7顯示在骨關(guān)節(jié)炎(OA)大鼠關(guān)節(jié)軟骨中三倍劑量的PTH(1_34)對糖胺聚糖 (GAG)水平的影響。詳細描述
以下優(yōu)選實施方式的描述和附圖僅用來說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明的限制，對于本發(fā)明的范圍請參考所附權(quán)利要求。本文中使用的術(shù)語僅是用來描述本發(fā)明的特定實施方式，而并非用來作為限制。 除非另有說明，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)的術(shù)語與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的含義相同。而且，本文無論在上文或在下文中所引用的所有公開文獻、專利和專利申請，都通過引用將它們?nèi)亢喜⒅帘疚闹小Ｗ詈?，除非另有明確說明，如在說明書和所附權(quán)利要求中所使用的，單數(shù)形式“一個”和“所述”包括復(fù)數(shù)個指代物。定義
本文的術(shù)語“甲狀旁腺素(PTH) ”和“PTH”是指甲狀旁腺素，特別是人甲狀旁腺素， 以及它的衍生物。在本發(fā)明的方法中使用的甲狀旁腺素可為各種形式，例如天然型的PTH、 通過基因工程技術(shù)生產(chǎn)的PTH或化學(xué)合成的PTH。PTH衍生物的例子有如上所述的PTH局部肽、PTH的或其局部肽的組成型氨基酸(可被其他氨基酸部分地取代)、PTH的或其局部肽的組成型氨基酸(可被部分缺失)、以及向PTH或其局部肽添加一個或多個氨基酸形成的肽。注意，例如PTH衍生物的肽可具有與PTH本身類似的活性。PTH的局部肽的例子包括人 PTH (1-；34)、人 PTH (1-64)、人 PTH (35-84)和牛 PTH (1-34)。PTH (1-34)是指從 PTH 的 N 末端計數(shù)共34個氨基酸組成的PTH的局部肽。在本文公開的方法的某些實施方式中，所施用的試劑是PTH(l-34)(即人ΡΤΗ(1-34))。因此，本文所用的術(shù)語“甲狀旁腺素(PTH)”和“PTH 衍生物質(zhì)”包括但不限于人PTH鹽、人PTH(1-34)、特立帕肽(teriparatide)人PTH類似物、緊密相關(guān)肽和具有與84個氨基酸人甲狀旁腺素的34 N-末端氨基酸(生物活性區(qū))序列相同功能的肽序列的試劑。術(shù)語“甲狀旁腺素(PTH) ”、“PTH”和“PTH衍生物質(zhì)”因此包括但不限于重組人ΡΤΗ(1-34)、合成人PTH(l-34)、PTH(1-34)、人PTH(1_34)鹽、特立帕肽、 人PTH(1-34)的簡單衍生物，例如人PTH(1-34)酰胺和緊密相關(guān)分子，例如人PTH(1_33)或人PTH(1-31)酰胺或緊密相關(guān)骨生肽(osteogenic peptide) 0合適的人PTH鹽的例子包括但不限于醋酸鹽、己二酸鹽、當歸酸鹽、溴化物、丁酸鹽、氯化物、檸檬酸鹽、檸康酸鹽、檸蘋酸鹽、巴豆酸鹽、丙酸鹽、戊酸鹽、己酸鹽、庚酸鹽、乙酰丙酸鹽、琥珀酸鹽、馬來酸鹽、乙醇酸鹽、葡萄糖酸鹽、葡糖醛酸鹽、3-羥基異丁酸鹽、丙三酸鹽(tricartallylicate)、丙二酸鹽、戊二酸鹽、衣康酸鹽、中康酸鹽、二亞甲醇丙酸鹽、惕各酸鹽(tiglicate)、甘油酸鹽、甲基丙烯酸鹽、異巴豆酸鹽酯、β-羥基丁酸鹽、羥基丙烯酸鹽、抗壞血酸鹽、天冬氨酸鹽、谷氨酸鹽、2-羥基異丁酸鹽、乳酸鹽、蘋果酸鹽、丙酮酸鹽、延胡索酸鹽、酒石酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、苯、磺酸鹽、甲磺酸鹽、硫酸鹽和磺酸鹽。所記載的術(shù)語“甲狀旁腺素(ΡΤΗ)”和“ΡΤΗ衍生物”還可包括各種形式，例如，酸、游離堿、帶電荷或不帶電荷的分子、分子復(fù)合物的組分或無刺激性的藥理上可接受的鹽。本文使用的術(shù)語“早期骨關(guān)節(jié)炎”包括但不限于如下醫(yī)療癥狀，在所述癥狀中，即使軟骨細胞有一些明顯的集簇，但患病的動物(例如，患病的人)的關(guān)節(jié)軟骨表現(xiàn)出非常少至沒有纖維性顫動的征兆并且明顯地保持了軟骨的整體厚度。術(shù)語“早期骨關(guān)節(jié)炎”通過觀察到患病的動物的軟骨樣本的不超過70%的軟骨細胞表現(xiàn)出對堿性磷酸酶、膜聯(lián)蛋白和X 型膠原的免疫染色來表征。(Τ. Kirsch et al. , Osteoarthritis and Cartilage (2000) 8: ^4-30 ?；加性缙诠顷P(guān)節(jié)炎的動物(例如，人類)可感覺到輕微的僵硬和偶然的關(guān)節(jié)痛，并且他們中的一些可感覺到局部關(guān)節(jié)痛。本文使用的術(shù)語“關(guān)節(jié)腔”是指滑液關(guān)節(jié)的骨頭之間充滿液體的空間。術(shù)語“關(guān)節(jié)內(nèi)注射”是指將藥物施加于患者的關(guān)節(jié)腔內(nèi)的方法，所述方法包括使用注射器和其他注射設(shè)備。根據(jù)公開的方法治療的患病的“受治者”、“患者”或“動物”可以是人類或非人類哺乳動物，因此，所述患病的“受治者”、“患者”或“動物”可以是人類和狗、貓、小鼠、大鼠、牛、 綿羊、豬、山羊或靈長類動物，并且可包括實驗室動物、牧畜和家畜。在一些實施方式中，所述患病的受治者、患者或動物是患有骨關(guān)節(jié)炎的人類，更加具體而言，是患有早期骨關(guān)節(jié)炎的人類。關(guān)于軟骨細胞退化的術(shù)語“退化進程”的特征是例如軟骨細胞的基質(zhì)組分的合成的變化，所述變化例如是II型膠原減少和X型膠原增加，并且術(shù)語“退化進程”包括但不限于軟骨細胞的終末分化。早期骨關(guān)節(jié)炎及其治療
早期骨關(guān)節(jié)炎的癥狀可包括疼痛、僵硬、關(guān)節(jié)活動受限制、腫脹和骨擴大。這些癥狀可在患病動物的各個部分表現(xiàn)出來，例如在臀部、膝蓋、手部或體內(nèi)的任何其他關(guān)節(jié)中表現(xiàn)出來。而且，在諸如彎曲、跪下、爬樓梯、跑步、劃船之類的一些活動過程中以及其他激烈的或長期的體力活動中這些癥狀可變得明顯，關(guān)節(jié)中的疼痛和僵硬，在使用期間或之后或靜止一段時間之后或其任何組合，會變得明顯。此外，所述癥狀可與天氣有關(guān)或隨天氣變化而加重，例如在天氣變化之前或過程中關(guān)節(jié)不適，例如，與大氣壓的變化有關(guān)。根據(jù)本發(fā)明公開的方法用PTH或PTH衍生物質(zhì)治療患有早期骨關(guān)節(jié)炎的動物(例如人類)可維持軟骨形成和關(guān)節(jié)軟骨細胞的繼續(xù)存活，從而抑制骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。
在骨關(guān)節(jié)炎中發(fā)生的軟骨細胞的變化通過已建立的細胞培養(yǎng)模型來模擬，所述已建立的細胞培養(yǎng)模型涉及azaC-誘導(dǎo)的人類關(guān)節(jié)軟骨細胞的終末分化，所述已建立的細胞培養(yǎng)模型用于確定將PTH用于治療早期骨關(guān)節(jié)炎。使用該人類關(guān)節(jié)軟骨細胞培養(yǎng)模型，發(fā)現(xiàn)ΡΤΗ(1-34)治療不僅緩解了 azaC-誘導(dǎo)的II型膠原抑制而且增加了 II型膠原的表達。 還發(fā)現(xiàn)了 PTH在糖胺聚糖水平的變化方面的類似作用。常見的關(guān)節(jié)軟骨細胞表達關(guān)節(jié)軟骨的正常作用所需的II型膠原和聚集蛋白聚糖。當經(jīng)過終末分化，產(chǎn)生骨關(guān)節(jié)炎時，軟骨細胞將表達標記物，所述標記物包括堿性磷酸酶和X型膠原，而II型膠原和聚集蛋白聚糖的表達降低。該退化進程可導(dǎo)致軟骨細胞礦化作用并且最終細胞死亡。因此，本發(fā)明公開的方法可抑制、終止或逆轉(zhuǎn)早期OA中的軟骨細胞的退化進程。根據(jù)本文公開的方法，用PTH或PTH衍生物質(zhì)(例如，PTH(1-34))治療早期骨關(guān)節(jié)炎可抑制或預(yù)防軟骨細胞的細胞死亡(凋亡)。骨關(guān)節(jié)炎的臨床特征包括關(guān)節(jié)疼痛、早晨僵硬持續(xù)超過30分鐘，關(guān)節(jié)不穩(wěn)定性或彎曲以及功能喪失。骨關(guān)節(jié)炎的征兆包括受影響的關(guān)節(jié)處骨擴大、活動范圍受限制、關(guān)節(jié)活動之后的咿軋音，活動疼痛、受影響的關(guān)節(jié)不成直線以及受影響的關(guān)節(jié)畸形。用于檢測早期骨關(guān)節(jié)炎的示范性的方法包括基于放射性方法的那些方法，所述放射性方法可檢測并確定關(guān)節(jié)軟骨中的糖胺聚糖的存在和濃度。這些方法包括稱為“軟骨的延遲釓增強 MRI”(dGEMRIC)和“基于化學(xué)交換的飽和傳遞”(gagCEST)(參見，例如，Ling et al. (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105(7) 2266-70)的MRI技術(shù)和基于計算機斷層攝影的方法(參見例如，Josh et al. (2009) J. Am. Chem. Soc. 131 (37): 13234-35) 用于診斷骨關(guān)節(jié)炎的其他方法包括超聲波檢查法和平片(χ-射線)以及包括關(guān)節(jié)造影術(shù)和關(guān)節(jié)內(nèi)窺鏡檢測在內(nèi)的侵入性方法(參見例如，iTsai et al. (2007) OsteoArthritis and Cartilage 15 245-50, and Lee et al. (2008) OsteoArthritis and Cartilage 16: 352-58)。一旦作出診斷，早期骨關(guān)節(jié)炎可使用本文公開的方法來治療。在一些實施方式中， 早期骨關(guān)節(jié)炎通過將選自PTH和PTH衍生的物質(zhì)(例如ΡΤΗ(1-34)(人類PTH(1_34)))的藥劑給藥于患者的患病的關(guān)節(jié)，例如向滑液關(guān)節(jié)的骨之間的液體填充空間注射來治療。在這些實施方式的一個方面，使用注射器或其他注射設(shè)備將所述藥劑注射進入患病的關(guān)節(jié)的滑液中。藥劑的量和劑型以及藥劑的給藥頻率的確定在本發(fā)明公開的內(nèi)容所提供的合適的醫(yī)生的專業(yè)范圍內(nèi)。所述藥劑的給藥量為約0. 1皮摩爾至約5000皮摩爾，約0.5皮摩爾至約 1500皮摩爾，約1皮摩爾至約1000皮摩爾，約2. 5皮摩爾至約500皮摩爾或約5皮摩爾至約300皮摩爾。在一些實施方式中，治療有效劑量為提供了滑液關(guān)節(jié)的滑液中的所述藥劑的初始濃度為約0. 1 nM至約200 nM,約0. 25 nM至約100 nM,約0. 5 nM至約75 nM,約 0. 75 nM至約50 nM或約1 nM至約25 nM的量。在另一方面，通過遞送約0. 1 ml至約10 HiL溶液提供所述藥劑的治療劑量，所述溶液中所述藥劑的濃度為約1 nM至約500 nM。在另一方面，以約1 mL至約3 ml的體積來遞送所述藥劑，并且在溶液中所述藥劑的濃度為約 5 nM 至約 100 nM。本發(fā)明公開的內(nèi)容提供大鼠中骨關(guān)節(jié)炎的木瓜蛋白酶誘導(dǎo)模型，所述模型用于測試ΡΤΗ(1-34)在體內(nèi)骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展過程中對關(guān)節(jié)軟骨的作用。在該骨關(guān)節(jié)炎的木瓜蛋白酶誘導(dǎo)的大鼠模型中，ΡΤΗ(1-34)的關(guān)節(jié)內(nèi)給藥使GAG的降低減弱并且恢復(fù)了 II型膠原。而且，在骨關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)的軟骨中治療5周使GAG恢復(fù)至正常水平并且使II型膠原提高至高于正常水平。此外，用ΡΤΗ(1-34)治療3至5周表現(xiàn)出抑制由骨關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)而產(chǎn)生的X型膠原的表達。此外，由OA誘導(dǎo)而產(chǎn)生的軟骨細胞的凋亡通過ΡΤΗ(1-34)的1至5周的治療顯著抑制。根據(jù)本文公開的方法，PTH(1-34)治療不表現(xiàn)出改變正常人類關(guān)節(jié)軟骨細胞和對照大鼠膝關(guān)節(jié)(即非骨關(guān)節(jié)炎大鼠膝關(guān)節(jié))中II型膠原、X型膠原、ALP、聚集蛋白聚糖和 GAG的表達。申請人認為而不希望堅持該觀點，PTH和PTH衍生物的物質(zhì)(例如PTH(1_34)) 的給藥可僅僅影響骨關(guān)節(jié)炎影響的關(guān)節(jié)。根據(jù)本發(fā)明公開的方法，PTH或PTH衍生物的物質(zhì)(例如，ΡΤΗ(1-34))可抑制、終止或逆轉(zhuǎn)人類關(guān)節(jié)軟骨細胞的終末分化的過程，所述人類關(guān)節(jié)軟骨細胞的終末分化的過程類似于骨關(guān)節(jié)炎中看到的過程。因此，PTH或PTH衍生的物質(zhì)(例如，ΡΤΗ(1-34))可用于治療早期骨關(guān)節(jié)炎而不影響正常軟骨。根據(jù)本發(fā)明公開的方法，PTH或PTH衍生的物質(zhì)(例如，PTH(1_34))可連續(xù)給藥或周期性給藥于患病的動物(例如患有早期骨關(guān)節(jié)炎的人類)，從而抑制或預(yù)防關(guān)節(jié)軟骨細胞凋亡，并且抑制、終止或逆轉(zhuǎn)關(guān)節(jié)軟骨細胞的退化進程。劑型和劑量
注射用劑型可包括載體，其是溶劑或分散介質(zhì)。合適的載體包括水、生理鹽水、抑菌水、 Cremophor EL (BASF, Parsippany NJ)、磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、乙醇、多元醇(例如，甘油、乙二醇、丙二醇等等)及其混合物。這些組合物必須是無菌的并且是可注射的液體。流動性可用諸如卵磷脂或表面活性劑之類的包衣來維持。微生物污染可通過包含諸如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸和硫柳汞之類的抗菌劑和抗真菌劑來預(yù)防。諸如甘露醇、 山梨糖、氯化鈉之類的糖類和多元醇可用于維持組合物中的等滲性。如本文所公開的，用于治療早期骨關(guān)節(jié)炎的選自PTH和PTH衍生的物質(zhì)(例如， PTH(l-34)(人類ΡΤΗ(1-34)))的藥劑的治療有效劑量為約0. 1皮摩爾至約5000皮摩爾，約0. 5皮摩爾至約1500皮摩爾，約1皮摩爾至約1000皮摩爾，約2. 5皮摩爾至約500皮摩爾，或約5皮摩爾至約300皮摩爾。在一些實施方式中，所述治療有效劑量為提供滑液關(guān)節(jié)的滑液中所述藥劑的起始濃度為約0. 1 nM至約200 nM，約0.25 nM至約100 nM，約0. 5 nM至約75 nM，約0. 75 nM至約50 nM，或約1 nM至約25 nM的量。在另一方面， 所述藥劑的治療劑量通過遞送約0.1 ml至約10 ml的溶液來提供，所述溶液中所述藥劑的濃度為約1 nM至約500 nM。在另一方面，所述藥劑以約1 ml至約3 ml的體積來遞送，并且溶液中所述藥劑的濃度為約5 nM至約100 nM。根據(jù)本發(fā)明的方法遞送的組合物可包括額外的或第二藥劑，例如有機二膦酸鹽、 化療藥劑、放射性藥劑、TNF-α拮抗劑、非類固醇抗炎藥劑、類固醇、抗氧化劑、血管生成抑制劑、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑、維生素、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERM)、雌激素-孕酮、雄激素、降血鈣素、抗生素、組織蛋白酶K抑制劑、抑制素、整合素受體拮抗劑、造骨細胞合成代謝劑或選擇性血清素再吸收抑制劑、葡糖胺、透明質(zhì)酸或其混合物。在一些實施方式中， 所述第二藥劑是葡糖胺、透明質(zhì)酸或其混合物。
實施例材料和方法人類關(guān)節(jié)軟骨細胞培養(yǎng)
從死于車禍的23周歲亞種男性的膝關(guān)節(jié)中獲得正常人類關(guān)節(jié)軟骨樣品。從患有OA的 64周歲女性捐獻者獲得的膝關(guān)節(jié)正常區(qū)域中獲得另一關(guān)節(jié)軟骨樣品，該捐獻者已經(jīng)歷關(guān)節(jié)造型術(shù)。將軟骨樣品切碎并依次在透明質(zhì)酸酶(0. 5 mg/ml)、鏈霉蛋白酶(1 mg/ml)和膠原酶(1 mg/ml)中消化。然后將分離的軟骨細胞包在海藻酸鹽小球中。在6孔平板的每個孔中的5 ml培養(yǎng)基中培養(yǎng)15個小球。培養(yǎng)基由含有100 mg/ml抗壞血酸、非基本氨基酸、青霉素/鏈霉素、1%胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒和10%胎牛血清(FBQ的Dulbecco改性的Eagle 培養(yǎng)基組成。在每次試驗之前，將小球在37°C條件下、在潮濕的5%ω2孵育器中培養(yǎng)7天， 并且每三天更換一次培養(yǎng)基。
AzaC誘導(dǎo)和PTH治療軟骨細胞培養(yǎng)物
將軟骨細胞培養(yǎng)物分為四組。azaC加PTH組首先經(jīng)過azaC誘導(dǎo)，然后用PTH治療。 azaC組經(jīng)過azaC誘導(dǎo)，但沒有隨后用PTH治療。PTH組接受PTH，但沒有經(jīng)過azaC誘導(dǎo)。對照組沒有經(jīng)過azaC誘導(dǎo)且沒有用PTH治療。^aC誘導(dǎo)用于誘導(dǎo)軟骨細胞的終末分化(參見，例如，Cell Biol Int (2006) 30(3) 288-94)。簡單來說，用 15 μ g/ml 的 5-氮雜胞苷(Sigma，St. Louis, MO)處理培養(yǎng)物48小時。azaC誘導(dǎo)之后PTH治療包括在含有10 nM的ΡΤΗ(1-34)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)軟骨細胞。在PTH治療的第3天、第7天和第10天收集所有組中的細胞。當將小球在PH為7. 4條件下溶解于含有0. 05 M檸檬酸二鈉和0.03 M的 EDTA 二鈉的0. 9% NaCl溶液中時，從海藻酸鹽小球中釋放出軟骨細胞。通過以1，500 rpm 的低速離心處理5分鐘來收集細胞。定量實時聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)
使用RNeasy Mini試劑盒Oliagen，Valencia, CA)分離軟骨細胞中的總RNA。使用 Advantage RT-for-PCR 試劑盒(Clontech, Palo Alto, CA)通過 1 μ g RNA 來轉(zhuǎn)換第一互補鏈 DNA。S0X9、聚集蛋白聚糖、IIa 1 型膠原(CoUal)、Χ α 1 型膠原(CollOal)、ALP、IHH、 Bcl-2和Bax的信使RNA(mRNA)的水平使用具有Bio-Rad iQ5實時PCR檢測體系(Bio-Rad, Hercules, CA)的定量實時 PCR，使用 iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA) 來測量。在含有cDNA、每個基因的特異性引物和iQ SYBR Green Supermix的25 μ 1混合物中發(fā)生反應(yīng)。特異性PCR產(chǎn)物通過雙鏈DNA結(jié)合熒光染料STOR Green來檢測。相對mRNA水平通過每個PCR產(chǎn)物的閾值循環(huán)(Ct)值來計算并且使用比較Ct方法歸一化至GAPDH的水平。 將對照細胞中的每個基因表達的相對值設(shè)置為1，并且所有其他量轉(zhuǎn)化為比值。解離(熔融)曲線在每次PCR之后產(chǎn)生以檢查其特異性。以一式三份來進行所有PCR擴增并且試驗重復(fù)至少三次。二甲基亞甲基藍(DMMB)分析
如上所述，溶解海藻酸鹽小球并且進一步由木瓜酶蛋白(300 μ g/ml)在60°C消化18小時。樣品中DNA水平和硫酸化的糖胺聚糖水平使用Hoechst 33258染料和1，9-二甲基亞甲基藍染料來分別定量。DMMB分析的標準曲線使用濃度為0至25 μ g/ μ 1的硫酸軟骨素C 水溶液(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)來產(chǎn)生。TUNEL 染色
我們使用TUNEL (末端去氧-核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP末端標記)染色法，使用原位細胞死亡檢測試劑盒，TMR紅色(Roche，Mannheim, Germany)測量了凋亡的細胞。根據(jù)生產(chǎn)廠家的指南，將細胞用4%多聚甲醛的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)來固定，細胞密度為1 * IO6/ ml并在室溫下孵育10分鐘，然后通過以2，000 rpm的速度離心5分鐘使用細胞離心涂片器(Cytospin 3; Shandon, Cheshire, UK)固定在載玻片上。用PBS沖洗載玻片兩次，通過在冰上在透化作用溶液(0. 1 % Triton X-100的0. 1 %檸檬酸鈉)中孵育2分鐘使細胞被滲透。含有末端去氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶和若丹明(標記染料)的TUNEL反應(yīng)混合物加至載玻片上并在潮濕的腔室中、黑暗中、37°C條件下孵育60分鐘。通過阻斷緩沖液(溶于PBS 的0.1 % Triton X-100/0. 5%牛血清白蛋白)來停止反應(yīng)。通過4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)對細胞進行復(fù)染色。在熒光顯微鏡下，使用用于若丹明的580 nm的激發(fā)波長和用于DAPI的365 nm的激發(fā)波長來觀察載玻片。細胞核被DAPI染色為藍色，僅僅凋亡的細胞被若丹明染色為紅色。在每個載玻片上在5個顯微視野(1.566 mm2/視野)中對染色的細胞進行計數(shù)。使用 Image-Pro Plus 分析軟件(Media Cybernetics, Silver Spring, MD)來分析數(shù)據(jù)。軟骨細胞中的凋亡速度界定為染色為紅色的細胞(凋亡細胞)與染色為藍色的細胞(總細胞)的比例。動物實驗
從BioLASCO臺灣購買M只12周大的雄性Sprague-Dawley大鼠O50_300gm)并且將這些大鼠關(guān)在標準實驗室環(huán)境下(溫度M°C，12小時明暗循環(huán))，隨意地喂食和喂水。實驗之前這些動物適應(yīng)實驗室環(huán)境1周。骨關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)和PTH治療
將大鼠分為3組0Α(0Α誘導(dǎo)而沒有PTHP [1-34]治療)(n=18)，0A加PTH (OA誘導(dǎo)之后 ΡΤΗ[1-34]治療)(n=18)和PTH(PTH[1_34]治療而沒有OA誘導(dǎo))(n=18)。用作對側(cè)對照關(guān)節(jié)的每個左側(cè)膝蓋被注射沒有PTH治療或OA誘導(dǎo)的介質(zhì)。右側(cè)膝蓋是研究關(guān)節(jié)。在OA組和OA加PTH組中采用關(guān)節(jié)內(nèi)注射20 μ 1 4%木瓜蛋白酶溶液和20 μ 1 0. 03 M的半胱氨酸在大鼠的右側(cè)膝蓋中誘導(dǎo)0Α。所述注射采用沈-g針通過髕韌帶在實驗的第1天、第4天和第 7 天給予(參見，例如，Nucl Med Commun (1996) 17(6) 529-35) 在 OA 加 PTH 組中， 在OA誘導(dǎo)之后，每三天在右側(cè)膝蓋關(guān)節(jié)內(nèi)注射40 μ 1 10 ηΜ的PTH直至大鼠死亡。在PTH 組中，進行相同的PTH(1-34)治療但是不誘導(dǎo)0Α。當OA加PTH組中向大鼠給予PTH(1-34) 治療持續(xù)1周、3周和5周時，每個組中的六只大鼠在相同的時間點通過吸入CO2來殺死。組織學(xué)分析
殺死大鼠之后，收集膝蓋，并且收集具有關(guān)節(jié)軟骨的脛骨平臺，在組織學(xué)制備之前用 10%中性緩沖福爾馬林固定。然后，在10%甲酸/PBS中對樣品進行除去石灰質(zhì)處理。將除去石灰質(zhì)的脛骨關(guān)節(jié)樣品嵌入石蠟中，并制備在冠狀平面中的5- μ m磨片。用番紅精0-固綠(fast green)對GAG進行染色(1%番紅精0與0. 75%蘇木精和1%固綠一同復(fù)染色) (Sigma, St. Louis M0)。對局部化的II型膠原和X型膠原進行免疫染色。對軟骨中的凋亡細胞進行TUNEL染色。組織形態(tài)分析
用番紅精0對GAG進行染色為紅色，在每個脛骨近端的關(guān)節(jié)軟骨中總區(qū)域和紅色染色的區(qū)域使用Imane-Pro Plus軟件，5.0版本進行測量。計算每組中紅色染色的區(qū)域和總區(qū)域的比例(紅色總區(qū)域)。
免疫組化
將脛骨關(guān)節(jié)部分再水合，并且用3%過氧化氫阻斷組織中的內(nèi)源性過氧化物酶。在用一抗孵育之前，由酶消化樣品用于抗原修復(fù)(參見例如，J Histochem Cytochem (2002) 50(8) 1049-58)。用于II型膠原免疫染色的酶消化最佳條件是PBS (pH 7. 4，Sigma)中 2.5%透明質(zhì)酸酶和1 mg/ml鏈霉蛋白酶的混合物，在37°C條件下持續(xù)1小時。用于X型膠原免疫染色的最佳條件是0. 1單位/ml軟骨素酶ABC(Sigma)持續(xù)1小時以及Tris HCl (pH 3.0)中的1 mg/ml胃蛋白酶，在37°C下持續(xù)15分鐘。然后用胎牛血清(FBS)阻斷脛骨關(guān)節(jié)部分持續(xù)1小時，用II型膠原的一抗(小鼠單克隆抗體，Chemicon, Temecula, CA)和X型膠原的一抗(大鼠多克隆抗體)(1:200 ;C0sm0 Bio, Tokyo, Japan)或(小鼠單克隆抗體)(1:100) (Sigma)在37°C孵育4小時或在室溫下孵育1小時。使用II型膠原的生物素標記的山羊抗-小鼠免疫球蛋白(Dako，Carpinteha, CA)和X型膠原的生物素標記的山羊抗-兔免疫球蛋白(Biocare Medical, Walnut Creek, CA)以及辣根過氧化物酶共軛的抗生蛋白鏈菌素(Dako，Carpenteria CA or Biocare Medical)孵育二抗30分鐘。 用含有0.01%過氧化氫的3，3’ - 二氨基聯(lián)苯胺染色產(chǎn)生棕色。最后，用蘇木精對脛骨關(guān)節(jié)部分復(fù)染色并在顯微鏡下觀察。使用Image-Pro Plus軟件，5.0版本(Media Cybernetics) 測量免疫染色的相對密度(密度/區(qū)域；平均值士 SEM區(qū)域25. 44 士 2. 77 mm2)。用于脛骨關(guān)節(jié)部分的TUNEL染色
每個脛骨關(guān)節(jié)部分中的凋亡細胞通過TUNEL染色，使用原位細胞死亡檢測試劑盒，TMR 紅色來測量。再水合脛骨關(guān)節(jié)部分并且用蛋白酶K(Tris HCl [pH 7.4]中10 μ g/ml)孵育 20分鐘。透化作用之后，將脛骨關(guān)節(jié)部分用胃蛋白酶(在HCl[pH 2.0]中0.25%)在37°C 條件下孵育30分鐘。之后的過程與上述軟骨細胞培養(yǎng)物的過程相同。還用DAPI和蘇木精以及曙紅對脛骨關(guān)節(jié)部分進行染色以檢查細胞的局部化作用。對脛骨平臺中的軟骨的中心區(qū)域的DAPI染色的細胞(平均值士 SEM 150 士 40)進行計數(shù)。凋亡比例使用軟骨細胞培養(yǎng)物中所使用的相同方法來界定。統(tǒng)計學(xué)分析
數(shù)據(jù)表示為體內(nèi)研究中的6個樣品和體外研究中的4個樣品的結(jié)果的平均值和SEM。 所有試驗重復(fù)至少3次。統(tǒng)計學(xué)顯著性通過方差單向分析來評估，并且使用Scheffe測試進行多重比較。P值小于0.05認為是顯著的。實施例1 人關(guān)節(jié)軟骨細胞的退化進程的抑制(體外)
正常的關(guān)節(jié)軟骨細胞表達關(guān)節(jié)軟骨正常起效所需的II型膠原、GAG和聚集蛋白聚糖。 當經(jīng)過終末分化，導(dǎo)致OA時，軟骨細胞將表達包括堿性磷酸酶(ALP)、印度刺猬(IHH)和X 型膠原在內(nèi)的標記物，同時，II型膠原和聚集蛋白聚糖的表達將降低。這種退化進程可導(dǎo)致軟骨細胞礦化作用，并且最終細胞死亡。圖IA至圖IF表示了用甲狀旁腺素相關(guān)物質(zhì)ΡΤΗ(1-34)治療之后，人關(guān)節(jié)軟骨細胞中下列成分的水平的變化㈧聚集蛋白聚糖的mRNA、⑶糖胺聚糖(GAG)、(C) II α 1型膠原(Colhl)、(D)Xa 1型膠原(CoMOaI)、(E)進行磷酸酶(ALP)和(F)印度刺猬(IHH)。 左邊起依次為未處理(對照)的細胞、僅僅用PTH處理的細胞、僅僅用azaC處理的細胞或用azaC和PTH這兩者處理的細胞。當azaC加PTH組達到PTH治療3天、7天和10天時，收集所有組中的細胞。通過實時聚合酶鏈反應(yīng)定量mRNA表達。棒狀物表示4次復(fù)制的培養(yǎng)物的平均值和SEM。所有實驗重復(fù)至少3次。數(shù)據(jù)通過方差的單向分析來評估，使用^^時作方法進行多重比較。* =P<0. 05; * * =P < 0. 01相對于對照；#=P < 0. 05; ##=P < 0.01。分離軟骨細胞中總RNA，如上面材料與方法中所述，制備第一互補鏈DNA(cDNA)。 S0X9、聚集蛋白聚糖、II α 1 型膠原(Col2al)、Xa 1 型膠原(CoMOaI)、ALP、IHH、Bcl_2 和 Bax 的信使RNA(mRNA)的水平使用具有Bio-Rad iQ5實時PCR檢測體系(Bio-Rad, Hercules, CA)的定量實時 PCR，使用 iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA)來測量。反應(yīng)在含有cDNA、每個基因的特異性引物以及iQ SYBR Green Supermix的25 μ 1混合物中發(fā)生。循環(huán)條件如下對于IIa 1型膠原(co12al)、X a 1型膠原(collOal)和甘油醛-3-膦酸鹽脫氫酶(DAPDH)而言，循環(huán)條件為在95°C下1個循環(huán)持續(xù)3分鐘、接著在 95°C下40個循環(huán)持續(xù)10秒，61°C持續(xù)30秒以及55°C持續(xù)1分鐘或?qū)τ贏LP而言，循環(huán)條件為95°C下1個循環(huán)持續(xù)3分鐘，接著在95°C下40個循環(huán)持續(xù)10秒，65°C下持續(xù)30秒以及下持續(xù)1分鐘。引物序列如下所示(i)IIal型膠原(81 bp產(chǎn)物)正向引物 5，-CAA CAC TGC CAA CGT CCA GAT-3，，指定為 SEQ ID NO: 1，逆向引物5，-TCT TGC AGT GGT AGG TGA TGT TCT-3，，指定為 SEQ ID N0:2。(ii)Xal 型膠原(85 bp 產(chǎn)物)正向引物5' -CAG ATT TGA GCT ATC AGA CCA ACA A-3，，指定為 SEQ ID N0:3 ；逆向引物5' -AAA TTC AAG AGA GGC TTC ACA TAC G-3，，指定為 SEQ ID N0:4。(iii)GAPDH(126 bp產(chǎn)物)正向引物5，-TCT CCT CTG ACT TCA ACA GCG AC-3，，指定為 SEQ ID N0:5，逆向引物5，-CCC TGT TGC TGT AGC CAA ATT C-3，，指定為 SEQ ID N0:6。(iv)堿性磷酸酶(64 bp 產(chǎn)物)正向引物5' -AAC TTC CAG ACC ATT GGC TTG A-3，，指定為 SEQ ID N0:7 ；逆向引物5' -TTG CCG CGT GTC GTG TT-3，，指定為SEQ ID Ν0:8。(ν)聚集蛋白聚糖(189 bp產(chǎn)物)正向引物5' - ACA GCT GGG GAC ATT AGT GG -3，，指定為 SEQ ID N0:9，逆向引物5' - GTG GAA TGC AGA GGT GGT TT -3，，指定為 SEQ ID N0:10。(vi)印度刺猬(82 bp 產(chǎn)物)正向引物: 5' - TCA TCT TCA AGG ACG AGG AG-3，，指定為 SEQ ID N0:11，逆向引物5' - ATA GCC AGC GAG TTC AGG _3，，指定為 SEQ ID N0:12。(vii)Bcl-2 (254 bp 產(chǎn)物)正向引物5'- TCA TCT TCA AGG ACG AGG AG-3'，指定為 SEQ ID NO: 13，逆向引物5' - ATA GCC AGC GAG TTC AGG-3，，指定為 SEQ ID N0:14。(viii)Bax (161 bp產(chǎn)物)正向引物5'- TTT GCT TCA GGG TTT CAT CC，指定為 SEQ ID NO: 15，逆向引物5，- TCC TCT GCA GCT CCA TGT TA，指定為 SEQ ID N0:16。通過SYBR綠色、雙鏈DNA結(jié)合染料的熒光檢測特異性PCR產(chǎn)物(Biotechniques (1998) 24(6) 954-8, 960，962)。相對mRNA表達水平通過每個PCR產(chǎn)物的閾值循環(huán)(Ct) 值來計算并且通過使用對比Ct方法(Methods (2001 ) 25 (4) 402-8)使用GAPDH的水平歸一化。在AzaC-誘導(dǎo)后第3天，對照細胞中的每個基因的表達相對量設(shè)置為100%，所有其他轉(zhuǎn)化為相對于該基礎(chǔ)的百分比變化。PCR反應(yīng)之后，產(chǎn)生解離(熔融)曲線以檢查PCR 反應(yīng)的特異性。所有PCR擴增以一式三份來進行，并且試驗重復(fù)至少三次。在PTH組中聚集蛋白聚糖、Col2al (II型膠原)、Coll0al (X型膠原)、ALP以及IHH 基因的表達與在PTH治療3至10天后對照組中那些基因的表達沒有顯著差異(圖IA和圖IC至圖1F)。在azaC組中，聚集蛋白聚糖和Col2al的mRNA水平低于azaC誘導(dǎo)3天和 7天之后對照組中聚集蛋白聚糖和Col2al的mRNA的水平(圖IA和1C)。azaC誘導(dǎo)3天后，聚集蛋白聚糖水平是對照的56%(P<0. 05)并且Col2al水平是對照的46. 3%(P<0. 01)。 azaC誘導(dǎo)7天后，聚集蛋白聚糖水平是對照的31%(P<0.01)并且Col2al水平是對照的 64. 8%(P<0. 05)。而且，azaC組中CollOal水平(對照的2. 3至2. 4倍)和ALP水平(對照的5. 3至10. 9倍)顯著高于azaC誘導(dǎo)后7天和10天對照組中的水平(P<0. 01)(圖ID 和IE)。azaC誘導(dǎo)后3天、7天和10天，IHH表達也顯著提高(azaC誘導(dǎo)后3天，IHH表達水平為對照的6. 5倍[P<0. 01]，azaC誘導(dǎo)后7天，IHH表達水平是對照的2. 6倍[P<0. 05]， 以及azaC誘導(dǎo)后10天，IHH表達水平是對照的2. 7倍[P<0. 05])。(圖IF)。在azaC加 PTH組中，azaC誘導(dǎo)后PTH治療3天、7天和10天逆轉(zhuǎn)了 azaC誘導(dǎo)的、CoUal，CollOal, ALP, IHH和聚集蛋白聚糖的mRNA水平的變化(除了 Col2al和聚集蛋白聚糖的10天培養(yǎng)物)(圖1)。治療3天、7天之后，在azaC加PTH組中，聚集蛋白聚糖的mRNA水平顯著高于 azaC組中聚集蛋白聚糖的mRNA水平(治療3天，P<0. 05，治療7天P<0. 01)并且與對照組無顯著差異。然而，PTH治療10天后，聚集蛋白聚糖水平與azaC組中聚集蛋白聚糖的水平?jīng)]有差異，聚集蛋白聚糖水平低于對照組中的水平(P<0. 05)(圖1)。ΡΤΗ(1-34)治療3天后，在azaC加PTH組中Col2al表達水平顯著高于azaC組中Col2al表達水平(P<0. 05)并且與對照組無顯著差異。ΡΤΗ(1-34)治療7天后，azaC加PTH組中Col2al表達水平高于 azaC組中Col2al表達水平(Ρ<0· 01)或?qū)φ战M中Col2al表達水平(Ρ<0· 05)(圖1C)。然而， PTH(1-34)治療10天后，在所有3組中沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異。在ΡΤΗ(1-34)治療后，由azaC 誘導(dǎo)的CollOal、ALP和IHH的mRNA水平的變化在azaC加PTH培養(yǎng)物中顯著消除(治療3 天、7天和10天后CoMOal和ALP的P<0. 01，治療3天后IHH的P<0. 01，治療7天和10天后IHH的P<0.05)(圖ID至圖1F)。特別注意的是，在PTH(1_34)治療的第3天，在azaC加 PTH培養(yǎng)物中的CollOal和ALP的表達低于對照培養(yǎng)物中CollOal和ALP的表達(P<0. 01) (圖ID至圖1E)。然而，在治療的第7天，在任一種基因的表達方面，對照組和azaC加PTH 組之間沒有顯著差異。在治療的第10天，azaC加PTH培養(yǎng)物中ALP的表達高于對照培養(yǎng)物中ALP的表達(Ρ<0· 05)(圖IE)。PTH(1-34)治療3至10天之后，azaC加PTH組中的IHH 的mRNA水平比對照培養(yǎng)物中IHH的mRNA水平低47%至71%，但是僅僅10天后的差異是接近統(tǒng)計學(xué)顯著的(圖1F)。PTH組和對照組中軟骨細胞培養(yǎng)物中GAG水平之間沒有顯著差異。azaC組中GAG 水平顯著低于azaC誘導(dǎo)后第3天和第7天對照組中GAG水平(P<0. 01)(圖IB)。PTH (1-34) 治療后第3天、第7天和第10天，azaC加PTH組中GAG水平顯著高于azaC組中GAG水平 (P<0. 01)。雖然，在azaC加PTH組中治療10天后，聚集蛋白聚糖的mRNA表達不被PTH (1_34) 逆轉(zhuǎn)(圖1A)，但是azaC加PTH組中GAG水平仍然高于7天后和10天后對照組中GAG水平 (P<0. 01)(圖IB)。在用PTH治療患有azaC誘導(dǎo)的OA的人類的關(guān)節(jié)軟骨細胞過程中觀察到的ColIOal、ALP、IHH基因、聚集蛋白聚糖、Col2al和GAG的表達降低，這說明PTH治療可逆轉(zhuǎn)人類關(guān)節(jié)軟骨細胞的退化進程并且抑制軟骨細胞的終末分化。此外，正常人類關(guān)節(jié)軟骨細胞的聚集蛋白聚糖、Col2al和GAG的表達顯著不受PTH治療的影響，這說明PTH或PTH 衍生的物質(zhì)可用于治療早期OA而不影響正常軟骨細胞。實施例2抑制人類關(guān)節(jié)軟骨細胞凋亡(體外)
Bcl-2和Bax是細胞質(zhì)蛋白家族的成員，所述細胞質(zhì)蛋白調(diào)節(jié)凋亡。這兩種蛋白具有非常相似的氨基酸序列但是功能相反Bcl_2起抑制凋亡的作用，而Bax抵消這種作用(Hunter, JBiol Chem. (1996) 271(15):8521 -4)。圖2A至圖2C表示用甲狀旁腺素(PTH)治療之后，人類關(guān)節(jié)軟骨細胞中下列成分的變化(A)Bcl-2的mRNA表達，(B)Bax的mRNA表達，(c)Bcl_2與Bax的比值。左邊起為 未處理的(對照)細胞，僅僅用PTH處理的細胞，僅僅用azaC處理的細胞或用azaC和PTH 這兩者處理的細胞。當azaC加PTH組達到PTH治療3天、7天、10天和14天時，收集所有組中的細胞。通過實時聚合酶鏈反應(yīng)定量mRNA表達。棒狀物表示4次復(fù)制的培養(yǎng)物的平均值和SEM。所有實驗重復(fù)至少3次。數(shù)據(jù)通過方差的單向分析來評估，并且使用^^時作方法進行多重比較。* =P<0. 05; * * =P<0. 01相對于對照；#=P < 0. 05; ##=P< 0.01。為了研究經(jīng)過更長的時間段Bcl-2和Bax的表達的變化，加入了 14天組。在PTH 組中，相對于對照培養(yǎng)物，Bcl-2和Bax的表達顯示出無顯著變化。雖然，治療3至10天后， Bcl-2表達是對照中Bcl-2的表達的1. 7倍，但是沒有發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)上的顯著差異。在azaC 組中，在azaC誘導(dǎo)后3天和10天Bcl_2的mRNA水平顯著提高(治療3天后為對照的3. 2 倍[Ρ<0· 05]；治療10天后為對照的4. 7倍[Ρ<0· 01]) 2Α)。在azaC加PTH組中，Bcl_2 表達也高于對照培養(yǎng)物中Bcl-2表達(治療3天后為對照的2. 1倍[P<0. 05]，治療7天后為對照的2. 1倍[P<0. 05]，治療10天后為對照的6. 0倍[P<0. 01])，這說明PTH治療不可逆轉(zhuǎn)azaC對Bcl-2的表達的影響。用PTH治療14天后，各組之間的Bcl_2的表達沒有顯著差異(圖2A)。在用PTH治療3天至10天后，在azaC和azaC加PTH這兩組中，Bax的 mRNA表達水平略微降低(對照的61%至88%)，但是，這種差異不是統(tǒng)計學(xué)上顯著的。然而， 在azaC誘導(dǎo)14天后，azaC組中的Bax表達顯著提高(對照的2. 1倍[P<0. 01])并且azaC 加PTH組中Bax表達仍為對照培養(yǎng)物的1. 6倍，這說明PTH治療不可完全逆轉(zhuǎn)azaC對Bax 表達的影響(圖2B)。用PTH治療3天(Ρ<0· 05)后和10天(Ρ<0· 01)后，azaC組和azaC 加PTH組中Bcl-2和Bax的比值高于對照組中Bcl_2和Bax的比值。PTH治療7天或14天后，沒有發(fā)現(xiàn)azaC組和azaC加PTH組的Bcl_2 =Bax比值的顯著差異(圖2C)。當患者(例如患有晚期OA)發(fā)生了軟骨細胞凋亡時，PTH治療不可逆轉(zhuǎn)細胞死亡。通過使用TUNEL染色，比較PTH(1_34)(就azaC加PTH組而言)治療14天后，對照組、azaC組和azaC加PTH組中人類關(guān)節(jié)軟骨細胞培養(yǎng)物中的凋亡速度。圖3表示人類關(guān)節(jié)軟骨細胞中甲狀旁腺素對azaC誘導(dǎo)的凋亡的作用。比較了對照細胞、僅僅用azaC處理的細胞、用azaC加PTH處理的細胞的凋亡速度。棒狀物表示4次復(fù)制的培養(yǎng)物的平均值和SEM。數(shù)據(jù)通過方差的單向分析來評估并且使用Scheffe方法進行多重比較。* * =P <0.01相對于對照;##=P< 0.01。azaC培養(yǎng)物中的人類關(guān)節(jié)軟骨細胞中的凋亡速度顯著高于對照培養(yǎng)物中的凋亡速度(提高了 4.8倍，P<0.01)。在azaC加PTH培養(yǎng)物中的凋亡速度顯著低于azaC培養(yǎng)物中的凋亡速度(P<0. 01)，但是仍然高于對照培養(yǎng)物中的凋亡速度(提高了 3. 1倍，P<0. 01) (圖3)。雖然一旦開始凋亡，PTH治療不可逆轉(zhuǎn)軟骨細胞凋亡，但是PTH治療可預(yù)防軟骨細胞死亡并且通過逆轉(zhuǎn)早期OA過程中的軟骨細胞的退化進程來降低凋亡速度。實施例3大鼠動物模型中抑制關(guān)節(jié)軟骨細胞的退化進程
圖4表示在正常的和骨關(guān)節(jié)炎(OA)大鼠關(guān)節(jié)軟骨中甲狀旁腺素對糖胺聚糖(GAG)的作用。測量來自O(shè)A組中的大鼠的對側(cè)對照關(guān)節(jié)的脛骨近端中的番紅精-0染色的關(guān)節(jié)軟骨和OA組、OA加PTH組和PTH組中大鼠的研究關(guān)節(jié)的番紅精0染色的區(qū)域與總區(qū)域的比值。比較PTH治療1周、3周和5周之后的所有組中番紅精0染色的區(qū)域與總區(qū)域(紅色/總區(qū)域)的比值。棒狀物代表6個樣品的平均值和SEM。數(shù)據(jù)通過方差的單向分析來評估并且使用Scheffe方法進行多重比較。* * =P <0.01相對于在每個時間點的OA組中的研究關(guān)節(jié)，##=ρ < 0. 01。根據(jù)上述方法，產(chǎn)生了來自O(shè)A組中的大鼠的對側(cè)對照關(guān)節(jié)的番紅精0染色(GAG 陽性)的關(guān)節(jié)軟骨的顯微照片和來自O(shè)A組、OA加PTH組和PTH組中的大鼠的研究關(guān)節(jié)的番紅精0染色(GAG陽性)的關(guān)節(jié)軟骨的顯微照片。測量番紅精0染色的區(qū)域和總區(qū)域的比值(紅色總區(qū)域)并且比較各組之間的比值(圖4)。在任何時間點，所有3組中的OA 組、OA加PTH組和PTH組中的對側(cè)對照關(guān)節(jié)的紅色總區(qū)域比值沒有顯著差異。在OA誘導(dǎo)后1周、3周和5周，OA組中研究關(guān)節(jié)中的軟骨中紅色總區(qū)域的比值顯著低于對側(cè)對照關(guān)節(jié)的紅色總區(qū)域的比值(P<0. 01)(圖4)。OA誘導(dǎo)后PTH治療1周和3周后，OA加PTH組中研究軟骨中紅色總區(qū)域的比值還顯著低于對側(cè)對照組的紅色總區(qū)域的比值。然而，所述比值隨時間增加。ΡΤΗ(1-34)治療5周后，OA加PTH組中軟骨與對側(cè)對照軟骨沒有顯著差異(圖4)。PTH(1-34)治療1周、3周和5周后，OA加PTH組中的紅色總區(qū)域的比值顯著高于OA組中紅色總區(qū)域的比值(P<0.01)(圖4)。在PTH組中，在任何時間點，研究軟骨和對側(cè)對照軟骨之間沒有顯著差異(圖4)。根據(jù)上述方法，產(chǎn)生了來自O(shè)A組中的大鼠對側(cè)對照關(guān)節(jié)的免疫組化染色的關(guān)節(jié)軟骨的顯微照片和來自O(shè)A組和OA加PTH組中的大鼠的研究關(guān)節(jié)的免疫組化染色的關(guān)節(jié)軟骨的顯微照片。通過定量相對密度的免疫組化分析說明3組之間對側(cè)對照關(guān)節(jié)的免疫局部化的II型膠原的密度沒有顯著差異。圖5表示在正常的和骨關(guān)節(jié)炎(OA)大鼠關(guān)節(jié)軟骨中甲狀旁腺素對免疫局部化的 II型膠原的作用。測量了來自O(shè)A組中的大鼠的對側(cè)對照關(guān)節(jié)和來自O(shè)A組和OA加PTH組中的大鼠的研究關(guān)節(jié)的脛骨近端中用關(guān)節(jié)軟骨的II型膠原免疫染色的關(guān)節(jié)軟骨。生長板軟骨染色為陽性對照。未用一抗染色的生長板和關(guān)節(jié)軟骨樣品用作陰性對照。治療3周和5周后，比較了對側(cè)對照軟骨、OA軟骨和用PTH治療的OA軟骨。棒狀物表示6個樣品的平均值和SEM。數(shù)據(jù)通過方差的單向分析來評估并且使用Scheffe方法進行多重比較。* =P<0. 05; * * =P<0. 01，相對于每個時間點OA組中的研究關(guān)節(jié)，#=P<0. 05。相對于對側(cè)對照關(guān)節(jié)，OA誘導(dǎo)之后3周和5周，來自O(shè)A組中的大鼠的研究關(guān)節(jié)中免疫局部化的II型膠原明顯消失(P < 0. 05)。在來自O(shè)A加PTH組的研究關(guān)節(jié)中，免疫局部化的II型膠原的密度顯著高于OA組中免疫局部化的II型膠原的密度(P<0. 05)，但是與 OA誘導(dǎo)后ΡΤΗ(1-34)治療3周后對側(cè)對照關(guān)節(jié)中的免疫局部化的II型膠原的密度沒有差異(圖5)。用ΡΤΗ(1-34)治療5周后，來自O(shè)A加PTH組的研究關(guān)節(jié)中的免疫局部化的II 型膠原的密度不僅僅顯著高于OA組中免疫局部化的II型膠原的密度(P<0. 01)還顯著高于OA加PTH組的對側(cè)對照中的免疫局部化的II型膠原的密度(P<0. 05)。免疫局部化的X 型膠原主要在來自O(shè)A組的關(guān)節(jié)軟骨細胞中發(fā)現(xiàn)，但是在ΡΤΗ(1-34)治療3周和5周之后， 在OA加PTH組中的關(guān)節(jié)中不太明顯。在對側(cè)對照關(guān)節(jié)中沒有發(fā)現(xiàn)明顯的X型膠原染色的軟骨細胞。當PTH治療患有木瓜蛋白酶誘導(dǎo)的OA的大鼠時，GAG、II型膠原和X型膠原的表達還說明了逆轉(zhuǎn)關(guān)節(jié)軟骨細胞的退化進程的作用。實施例4 大鼠動物模型中抑制關(guān)節(jié)軟骨細胞凋亡根據(jù)上述方法，產(chǎn)生了來自O(shè)A組中大鼠的對側(cè)對照關(guān)節(jié)的TUNEL染色的關(guān)節(jié)軟骨的代表性的顯微照片和來自O(shè)A組和OA加PTH組中大鼠的研究關(guān)節(jié)的TUNEL染色的關(guān)節(jié)軟骨的代表性的顯微照片。圖6表示在正常的和骨關(guān)節(jié)炎(OA)大鼠關(guān)節(jié)軟骨中甲狀旁腺素對軟骨細胞凋亡的作用。在PTH治療1周、3周和5周之后，測量了來自O(shè)A組中大鼠對側(cè)對照關(guān)節(jié)和OA組以及OA加PTH組中大鼠研究關(guān)節(jié)的脛骨近端中的TUNEL染色的關(guān)節(jié)軟骨和4’，6- 二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染色的關(guān)節(jié)軟骨。比較了對側(cè)對照關(guān)節(jié)、OA關(guān)節(jié)和用PTH治療的 OA關(guān)節(jié)中的凋亡速度。棒狀物表示6個樣品的平均值和SEM。數(shù)據(jù)通過方差的單向分析來評估并且使用Scheffe方法進行多重比較。* =P<0. 05; * * =P<0. 01，相對于在每個時間點 OA 組中研究關(guān)節(jié)，#=P<0. 05; ##=P<0. 01。OA誘導(dǎo)后3周(P<0. 05)和5周(P<0. 01)的結(jié)果說明來自O(shè)A組的研究關(guān)節(jié)中細胞凋亡速度顯著高于對側(cè)對照關(guān)節(jié)中的細胞凋亡速度(圖6)。在OA加PTH組中，研究關(guān)節(jié)中的軟骨細胞凋亡速度顯著低于OA組中軟骨細胞的凋亡速度(P<0. 01)，并且與對側(cè)對照關(guān)節(jié)沒有表現(xiàn)出顯著差異(圖6)。因此，當用PTH治療患有木瓜蛋白酶誘導(dǎo)的OA的大鼠時，軟骨細胞的死亡得以預(yù)防并且凋亡速度降低。如本文所描述的，azaC誘導(dǎo)的軟骨細胞終末分化(模仿OA變化)培養(yǎng)模型和木瓜蛋白酶誘導(dǎo)的OA大鼠模型用于說明甲狀旁腺素(PTH)可用于治療早期骨關(guān)節(jié)炎、預(yù)防關(guān)節(jié)軟骨細胞凋亡和逆轉(zhuǎn)關(guān)節(jié)軟骨細胞的退化進程。此外，根據(jù)本發(fā)明公開的方法，木瓜蛋白酶誘導(dǎo)的OA大鼠模型可用于說明通過關(guān)節(jié)內(nèi)注射用PTH治療早期OA。實施例5 大鼠動物模型中抑制關(guān)節(jié)軟骨細胞的退化進程的劑量范圍
圖7表示治療5周之后，在正常和骨關(guān)節(jié)炎(OA)大鼠關(guān)節(jié)軟骨中甲狀旁腺素對糖胺聚糖(GAG)水平的影響。方法為上面標題為“動物實驗”和“骨關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)和PTH治療”的部分所述的，除了 PTH(1-34)的給藥劑量濃度為5 nM、10 ηΜ或100 ηΜ。測量了來自O(shè)A組中大鼠的對側(cè)對照關(guān)節(jié)和OA組以及OA加PHT組中大鼠的研究關(guān)節(jié)的脛骨近端中番紅精0染色的關(guān)節(jié)軟骨的番紅精0染色區(qū)域與總區(qū)域的比值。比較了 PTH治療5周后所有組中番紅精0染色的區(qū)域與總區(qū)域(紅色/總區(qū)域)的比值。棒狀物表示6個樣品的平均值和SEM。 數(shù)據(jù)通過方差的單向分析來評估并且使用Scheffe方法進行多重分析。* * =P <0.01:在指明的時間點OA組中對照關(guān)節(jié)相對于研究關(guān)節(jié)；##=Ρ <0. 01 在OA加5 ηΜ PTH、OA加10 nM PTH和OA加100 nM PTH組中OA關(guān)節(jié)相對于研究關(guān)節(jié)。根據(jù)上述方法，產(chǎn)生了來自O(shè)A組中大鼠的對側(cè)對照關(guān)節(jié)的番紅精0染色(GAG陽性)的關(guān)節(jié)軟骨的顯微照片以及來自O(shè)A組和OA加PTH組中大鼠的研究關(guān)節(jié)的番紅精0染色(GAG陽性)的關(guān)節(jié)軟骨的顯微照片。測量并比較了各組之間番紅精0染色區(qū)域與總區(qū)域 (紅色總區(qū)域)的比值。在所有三組之間，OA組和OA加PTH組中對側(cè)對照關(guān)節(jié)的紅色總區(qū)域比值沒有顯著差異。OA誘導(dǎo)后5周，來自O(shè)A組中研究關(guān)節(jié)的軟骨中的紅色總區(qū)域比值顯著低于對側(cè)對照關(guān)節(jié)的軟骨中的紅色總區(qū)域比值(P<0. 01)(圖7)。ΡΤΗ(1-34)治療 5周后，來自O(shè)A加PTH組的關(guān)節(jié)與對側(cè)對照關(guān)節(jié)沒有顯著差異(圖7)，S卩，PTH (1-34)治療 5周后，OA加PTH組中紅色總區(qū)域比值顯著大于OA組中紅色總區(qū)域比值(P<0.01)(圖 7)。這些結(jié)果說明用5 nM、10 nM和100 nM PTH(1-34)治療5周(每三天注射)可對GAG 損失產(chǎn)生顯著抑制。OA組的GAG水平顯著低于對照組的GAG水平(p<0. 01)。用5 nMUOnM和100 nM PTH(1-34)治療之后觀察到的GAG水平顯著高于OA組中GAG水平(ρ<0· 01)。 此外，對照組和PTH治療組之間沒有顯著差異。 雖然本發(fā)明已通過實施例的方式并根據(jù)優(yōu)選實施方式描述，應(yīng)理解的是本發(fā)明不限于所公開的實施方式。相反，本發(fā)明意在覆蓋各種改變和類似的排列(對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的)。因此，所附的權(quán)利要求書的范圍應(yīng)當被給予最廣泛的解釋以包含所有這些改變和類似的排列。
權(quán)利要求
1.一種治療動物中早期骨關(guān)節(jié)炎的方法，所述方法包括將治療有效量的藥劑遞送進入需要這種治療的動物的受侵害的關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)腔內(nèi)，所述藥劑選自甲狀旁腺素和甲狀旁腺素衍生物質(zhì)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述遞送通過關(guān)節(jié)內(nèi)注射來實現(xiàn)。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述治療有效量的藥劑為約0.1皮摩爾至約5000 皮摩爾范圍內(nèi)。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述治療有效量的藥劑通過遞送約0.1ml至約10 ml的溶液來提供，在所述溶液中所述藥劑的濃度為約1 nM至約500 nM。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述治療有效量的藥劑通過遞送約1ml至約3 ml 的溶液來提供，在所述溶液中所述藥劑的濃度為約5 nM至約100 nM。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述藥劑包含甲狀旁腺素的氨基酸1-34。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述藥劑基本上由甲狀旁腺素的氨基酸1-34構(gòu)成。
8.一種抑制動物中關(guān)節(jié)軟骨細胞凋亡的方法，所述方法包括將治療有效量的藥劑遞送至需要這種治療的動物的受侵害的關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)腔內(nèi)，所述藥劑選自甲狀旁腺素和甲狀旁腺素衍生物質(zhì)。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述遞送通過關(guān)節(jié)內(nèi)注射來實現(xiàn)。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述有效量的藥劑為約0.1皮摩爾至約5000皮摩爾范圍內(nèi)。
11.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述有效量的藥劑通過遞送約0.1ml至約10ml 溶液來提供，所述溶液中所述藥劑的濃度為約1 nM至約500 nM。
12.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述有效量的藥劑通過遞送約1ml至約3 ml溶液來提供，所述溶液中所述藥劑的濃度為約5 nM至約100 nM。
13.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述藥劑包含甲狀旁腺素的氨基酸1-34。
14.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述藥劑基本上由甲狀旁腺素的氨基酸1-34構(gòu)成。
15.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述動物患有早期骨關(guān)節(jié)炎。
16.一種抑制動物中受侵害的關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)軟骨細胞的退化進程的方法，所述方法包括將治療有效量的藥劑遞送進入需要這種治療的動物的受侵害的關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)腔內(nèi)，從而使所述關(guān)節(jié)軟骨細胞與所述藥劑接觸，所述藥劑選自甲狀旁腺素和甲狀旁腺素衍生物質(zhì)。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述遞送通過關(guān)節(jié)內(nèi)注射來實現(xiàn)。
18.如權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述有效量的藥劑為約0.1皮摩爾至約5000皮摩爾的范圍內(nèi)。
19.如權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述治療有效量的藥劑通過遞送約0.1ml至約 10 ml的溶液來提供，所述溶液中所述藥劑的濃度為約1 nM至約500 nM。
20.如權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述治療有效量的藥劑通過遞送約1ml至約 3ml的溶液來提供，所述溶液中所述藥劑的濃度為約5 nM至約100 nM。
21.如權(quán)利要求1、8或16所述的方法，其中所述動物是人類。
全文摘要
本發(fā)明提供一種治療動物中早期骨關(guān)節(jié)炎的方法。所述方法包括將治療有效量的甲狀旁腺素或甲狀旁腺素衍生的物質(zhì)遞送至患者的受影響的關(guān)節(jié)腔。本發(fā)明還提供一種抑制關(guān)節(jié)軟骨細胞凋亡的方法和一種抑制患病的動物中的關(guān)節(jié)軟骨細胞的退化進程的方法。
文檔編號C07K14/00GK102256996SQ200980150664
公開日2011年11月23日 申請日期2009年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月16日
發(fā)明者何美泠, 傅尹志, 張瑞根, 王國照, 陳崇桓 申請人:高雄醫(yī)學(xué)大學(xué)