專利名稱：蛋白的純化的制作方法
蛋白的純化對相關(guān)申請的交叉參考本申請要求2008 年 12 月 16 日提交的 U. S. Provisional Patent Application No. :61/201,880的權(quán)益，其全部內(nèi)容援引加入本文。本發(fā)明涉及生物分子的純化。更具體地，其涉及如蛋白、多肽、抗體、等生物分子的純化，由聚合物如經(jīng)增溶的或可溶的聚合物，通過沉淀機制從未經(jīng)澄清的細胞培養(yǎng)液中捕捉期望的生物分子，然后將其進一步純化。
背景技術(shù)：
用于制備生物分子如蛋白、抗體、抗體片段、肽、多肽等，特別是重組蛋白的一般方法，通常包括兩個步驟(1)蛋白在宿主細胞中的表達，隨后的( 生物分子的純化。第一步包括使期望的宿主細胞在生物反應(yīng)器和發(fā)酵罐中生長以實現(xiàn)蛋白的表達。用于此目的的細胞系的一些例子包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、骨髓瘤(NSO)細菌細胞如大腸桿菌和昆蟲細胞。一旦蛋白表達至期望的水平，將生物分子從宿主細胞中移除并收獲。在一些系統(tǒng)中生物分子從細胞表達并處于培養(yǎng)液中。在另外的系統(tǒng)中，生物分子是未表達的并留在細胞內(nèi)，或者事實上是細胞的一部分因而該細胞需要被胞溶以及在一些情況中需要被進一步加工從而能夠回收生物分子。懸浮的粒子如細胞、細胞碎片、脂質(zhì)和其它可溶的物質(zhì)通常通過過濾或離心而從含有生物分子的液體中去除，得到澄清的液體，其在溶液中含有感興趣的生物分子以及其它可溶的雜質(zhì)和較小的粒子。第二個步驟包括收獲的生物分子的純化以去除該方法中固有的雜質(zhì)。雜質(zhì)的例子包括宿主細胞蛋白(HCP，期望的蛋白或靶蛋白之外的蛋白)、核酸、內(nèi)毒素、病毒、生物分子變體和生物分子聚集體。這種純化通常包括若干層析的步驟，其可包括親和、離子交換疏水相互作用等在固體基質(zhì)上(如多孔瓊脂糖、聚合物或玻璃)的層析。用于純化蛋白的層析方法隊列的例子包括蛋白-A親和層析，隨后的陽離子交換層析，以及隨后的陰離子交換層析。蛋白-A柱通過親和機制捕捉感興趣的蛋白或靶蛋白而大量的雜質(zhì)穿過該柱而被棄去。然后通過從柱洗脫來回收蛋白。由于大部分的感興趣蛋白具有位于堿性范圍(8-9)的等電點(PI)并因而在正常加工和條件下帶正電(pH值低于該蛋白的PI)，因此它們在第二個柱中結(jié)合至陽離子交換樹脂。其它帶正電的雜質(zhì)也結(jié)合至此樹脂。繼而在蛋白被洗脫但雜質(zhì)仍舊結(jié)合至該樹脂的條件下(pH、鹽濃度)，通過洗脫從此柱回收感興趣的蛋白。陰離子交換柱通常以流通模式操作，從而使任何帶負電的雜質(zhì)結(jié)合至樹脂而使帶正電的感興趣蛋白從流通流中回收。此方法導致了高度純化并且濃縮的蛋白溶液。近年來已研究了其它可選擇的用于純化蛋白的方法；一種此類方法涉及絮凝技術(shù)。在此技術(shù)中，將可溶的聚電解質(zhì)加入到未澄清的細胞培養(yǎng)液以捕捉懸浮的粒子而可溶的雜質(zhì)由此形成絮凝物。隨后通過過濾或離心將后者從含有生物分子的溶液中去除，得到在溶液中含有感興趣蛋白以及其它可溶雜質(zhì)和一些較小粒子的澄清的液體。
或者，將可溶的聚電解質(zhì)加入到澄清的細胞培養(yǎng)液中以捕捉感興趣的生物分子， 由此形成絮凝物，使該絮凝物沉降并且隨后能夠?qū)⑵渑c溶液的其它成分分離。通過洗滌沉淀以去除松散附著的雜質(zhì)。之后，溶液中條件的改變(pH或離子強度)使得絮凝物解離并隨后洗脫靶生物分子。此絮凝技術(shù)的主要缺點在于其需要以去除雜質(zhì)或捕捉感興趣生物分子所需的確切量來加入聚電解質(zhì)。如果加入了太少的絮凝劑，雜質(zhì)或部分的靶蛋白將留在溶液中。另一方面，如果加入了太多的絮凝劑，則需要從所得的溶液中去除過量的聚電解質(zhì)。雜質(zhì)的確切水平極其難以預(yù)計，這是由于該方法中相對較大的可變度(批次和批次之間)以及產(chǎn)生不同生物分子的方法之間巨大的差異。去除過量的聚電解質(zhì)實際上不太可能，因為其是可溶的材料因而整個過程中一直帶有這種不期望的雜質(zhì)。在2007年12月20日提交的共同待審理申請USSN 12/004，314中，一種在特定條件(如溫度、光、鹽水平和/或PH)可溶的聚合物，在其處于可溶狀態(tài)時被用于結(jié)合雜質(zhì)，并繼而經(jīng)過改變條件(pH或溫度等)而被沉淀出來以去除與其一起的雜質(zhì)。然后用傳統(tǒng)的層析或膜吸附器等來進一步處理感興趣的生物分子。在2007年12月20日提交的共同待審理申請USSN 12/004，319中，其建議由上述申請的澄清化方法和化學過程來提供澄清的原料，然后用2007年12月20日提交的USSN 12/004, 319中的不同的化學過程和方法來純化感興趣的生物分子。上面討論的所有的蛋白純化技術(shù)具有共同的方案，此方案是首先去除懸浮的粒子并在第二步中將感興趣的生物分子與該方法中固有的可溶性雜質(zhì)分離。用衍生化的磁顆粒原位回收產(chǎn)物是可以將感興趣的生物分子直接從未澄清的細胞培養(yǎng)液中純化出來的蛋白純化技術(shù)的一個例子。在此技術(shù)中，包囊了磁珠的聚合物殼被搜尋并結(jié)合靶蛋白的親和性配體所功能化。然后施加磁場以收集珠-蛋白復合物，留下可溶的雜質(zhì)和不可溶的粒子。此技術(shù)的缺點在于其需要投入可觀的資本用于高梯度磁分離器的設(shè)計、構(gòu)建和審批。并且，此技術(shù)不能用于一次性的應(yīng)用，而一次性應(yīng)用已經(jīng)要成為生物加工產(chǎn)業(yè)中用于蛋白純化的標準規(guī)范。在本日提交的共同待審理申請中，已建議將2007年12月20日提交的USSN 12/004, 314和2007年12月20日提交的USSN 12/004, 319中的刺激物改變聚合物 (stimulus changing polymer)用于未澄清的培養(yǎng)液或液體并在處于溶液中時結(jié)合雜質(zhì)， 而在該聚合物從溶液中沉淀出來時結(jié)合或帶走感興趣的生物分子。然后將沉淀物從其它材料中分離，任選經(jīng)洗滌并且以純化的形式回收期望的生物分子(如通過選擇性洗脫)而留下該聚合物及任何雜質(zhì)。此發(fā)明的主要缺點在于仍舊需要刺激以使聚合物沉淀并捕捉生物分子用于進一步的加工和純化。已發(fā)現(xiàn)新的雙模式(bimodal)聚合物可用于未澄清的原料，并能以純化的形式回收感興趣的生物分子且無需經(jīng)歷刺激的改變以沉淀，由此提供了另一種新的方法用于簡易地并以比傳統(tǒng)方法少的步驟來回收生物分子。發(fā)明概述本發(fā)明涉及雙模式聚合物如可溶性聚合物，其能夠在含有未澄清的生物材料的流(stream)中不可逆地結(jié)合不可溶的粒子以及可溶性雜質(zhì)的亞集，并且還能可逆地結(jié)合一或多種期望的生物分子；以及涉及使用此種材料來從此種流中純化一或多種期望的生物分子而無需預(yù)先澄清的方法。此種聚合物包含帶電側(cè)基的域如伯胺、仲胺、叔胺或季胺，例如季銨化的胺、吡啶、 咪唑和三嗪(第一模式)，并且僅僅在與足以形成聚集體的量的帶相反電荷的固體粒子和部分可溶雜質(zhì)復合后，變得不可溶并從溶液中沉淀出來，其中所述聚集體不能繼續(xù)被維持在溶液中。該聚合物還包含其它的側(cè)基，所述側(cè)基是帶電或不帶電的、親水的或疏水的、或者具有配體，所述配體依賴于過程中的條件如PH、離子強度、鹽等而對于感興趣的生物分子是選擇性的(第二模式)。當以一種形式存在時，例如不帶電的形式，所述側(cè)基能夠結(jié)合未澄清的細胞培養(yǎng)液中的所述流內(nèi)的一或多種期望的生物分子(蛋白、多肽等)。繼而可將沉淀從所述流中去除，如通過從所述流的殘余物中過濾出來，并回收期望的生物分子，如通過選擇性洗脫。可將含有聚合物、雜質(zhì)和靶生物分子的沉淀洗滌一或多次，以確保去除液體中的任何雜質(zhì)或者被俘獲至該聚合物內(nèi)或其上的任何雜質(zhì)?？苫厥崭信d趣的生物分子，如通過將靶分子從沉淀中選擇性洗脫而雜質(zhì)包括可溶的和不可溶的材料保持與沉淀的聚合物復合，所述選擇性洗脫是通過改變?nèi)芤旱碾x子強度和/或PH條件。純化的靶生物分子被回收至洗脫池，而沉淀的聚合物-雜質(zhì)復合物則被棄去。本發(fā)明的目的是提供可溶的聚合物，其包含永久帶電的側(cè)基和可逆地帶電的側(cè)基的混合，并且當與可溶的和不可溶的雜質(zhì)及期望的生物分子復合時，其變得不可溶并形成沉淀。本發(fā)明的目的是提供雙模式聚合物，其能夠在特定條件下選擇性地可溶于一種液體，并且在與可溶的和不可溶的雜質(zhì)及期望的生物分子復合時，其能夠變得不可溶并從溶液中沉淀出來。目的是使用一或多種聚合物或共聚物，如聚乙烯胺、聚烯丙基、聚(二烯丙基二甲基氯化銨)、聚(甲基丙烯酰丙基三甲基氯化銨)、聚(N-乙烯基己內(nèi)酰胺)、聚(N-丙烯?；哙?、聚(N-乙烯基異丁酰胺)、聚(N-取代丙烯酰胺)包括[聚(N-異丙基丙烯酰胺)、 聚(N，N-二乙基丙烯酰胺)、和聚(N-丙烯?；?N-烷基哌嗪)]、羥烷基纖維素、丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物、2或4-乙烯基吡啶的聚合物、含有2或4-乙烯基吡啶以及至少一個額外的單體和殼聚糖的聚合物；其附著有配體或官能團，用來選擇性的捕捉并可逆地結(jié)合期望的生物分子以將生物分子從含有該生物分子連同一或多種雜質(zhì)或其它實體的流中純化。目的是使用一或多種季銨化的N-乙烯胺、N-乙烯基吡啶、或N-乙烯咪唑的聚合物或共聚物；其附著有配體或官能團，用來選擇性的捕捉并可逆地結(jié)合期望的生物分子以將生物分子從含有該生物分子連同一或多種雜質(zhì)或其它實體的流中純化。本發(fā)明的目的是提供選自聚(N-烷基2或4-乙炔基吡啶鹽)、聚(N-烷基乙炔基咪唑鹽)、聚(N-烷基乙炔基三嗪鹽)、聚季銨化的胺、和聚季銨化的環(huán)胺的共聚物，其包括可變比率的N-乙烯基吡啶、N-丙烯?；哙ぁ-乙烯基異丁酰胺或N-取代丙烯酰胺。本發(fā)明的另外目的是提供選自聚(N-烷基2或4-乙炔基吡啶鹽)、聚(N-烷基乙炔基咪唑鹽、聚(N-烷基乙炔基三嗪鹽、聚季銨化的胺、和聚季銨化的環(huán)胺的聚合物，其中所述聚合物具有附著至該聚合物的選擇性地結(jié)合感興趣生物分子的配體，如巰基乙基吡啶(MEP)、巰基乙基吡嗪、MEB、2-氨基苯并咪唑(ABI)、AMBI、2-巰基-苯甲酸(MBA)、4_氨基-苯甲酸(ABA)、2_巰基-苯并咪唑(MBI)、蛋白A或G等。本發(fā)明的另外目的是提供用于將選定的生物分子從含有生物分子的未澄清的流中純化的方法，該方法是通過使所述流處于給定的條件下或者更改所述流至給定的條件， 并加入在該給定條件下可溶于所述流中的雙模式聚合物，使被增溶的雙模式聚合物循環(huán)遍及所述流，從而第一模式可以結(jié)合一或多種粒子如細胞成分和可溶雜質(zhì)，而第二模式可以可逆地結(jié)合期望的生物分子，形成沉淀并變得不溶于所述流，將所述流與沉淀的聚合物分離并進一步加工聚合物以通過洗脫回收期望的生物分子，而使聚合物與其捕捉的雜質(zhì)保持其沉淀(固態(tài))形式。本發(fā)明另外的目的是提供基于聚合物的方法，所述聚合物基于選自溫度、鹽、溫度和鹽含量或PH的條件是可溶的。本發(fā)明的另一個目標是提供選自如下的聚合物聚0或4_乙烯基吡啶)聚0或 4-乙烯基吡啶-co-苯乙烯)、聚0或4_乙烯基吡啶-co-甲基丙烯酸甲酯)、聚0或4_乙烯基吡啶-co-甲基丙烯酸丁酯)、聚O或4-乙烯基吡啶)接枝的羥烷基纖維素、聚O或 4-乙烯基吡啶-C0-N-異丙基丙烯酰胺)、和聚(甲基丙烯酸-co-甲基丙烯酸甲酯)。本發(fā)明的另外的目的是通過選自如下的聚合物聚0或4_乙烯基吡啶)、聚O 或4-乙烯基吡啶-co-苯乙烯)、聚(2或4-乙烯基吡啶-co-甲基丙烯酸甲酯)、聚0或 4-乙烯基吡啶-co-甲基丙烯酸丁酯)、聚O或4-乙烯基吡啶)接枝的羥烷基纖維素、聚 (2或4-乙烯基吡啶-C0-N-異丙基丙烯酰胺)、和聚(甲基丙烯酸-co-甲基丙烯酸甲酯)， 且其中所述聚合物具有官能團如羧基或吡啶基，或者配體如蛋白A，附著于所述聚合物，其選擇性的結(jié)合感興趣的生物分子。本發(fā)明的另外的目的是提供靜態(tài)混合器用于使所述混合物和經(jīng)增溶的聚合物混合以允許該聚合物結(jié)合一或多種實體。本發(fā)明的里一個目的是提供所述一或多種實體是混合物中的生物分子的情況。本發(fā)明另外的目的是提供用于在單一的步驟中純化生物學組分的混合物的方法。本發(fā)明的另一個目的是提供用于純化生物學組分的混合物的方法，其中所述生物學組分選自蛋白、多肽、單克隆抗體、人源化的、嵌合的或動物單克隆抗體多克隆抗體、抗體片段、多特異性抗體、免疫粘附素、和含有CH2/CH3區(qū)域的蛋白。本發(fā)明的另外的目的是提供一種方法，使含有生物分子的混合物處于一組范圍的條件下，引起一或多種選擇的聚合物進入溶液，將一或多種聚合物加入以及使一或多種聚合物進入溶液引起所述聚合物的第一模式結(jié)合粒子和其它雜質(zhì)而允許第二模式可逆地結(jié)合感興趣的生物分子，引起該一或多種聚合物與雜質(zhì)和感興趣的生物分子從溶液中沉淀出來，然后將沉淀與混合物的剩余物分離而保留混合物的一或多種實體至沉淀中用于進一步的加工。本發(fā)明的另外的目的是提供從未澄清的混合物中回收感興趣的生物分子的方法， 其中所述混合物得自其被制備的發(fā)酵罐或生物反應(yīng)器。本發(fā)明的另外的目的是提供過濾的步驟以將沉淀從混合物的剩余物中分離。本發(fā)明的另一個目的是提供常態(tài)流過濾步驟以將沉淀從混合物的剩余物中分離。本發(fā)明另外的目的是提供切向流過濾步驟以將沉淀從混合物的剩余物中分離。
本發(fā)明另外的目的是提供離心步驟以將沉淀從混合物的剩余物中分離。本發(fā)明的另一個目的是提供傾析的步驟以將沉淀從混合物的剩余物中分離。本發(fā)明另外的目的是提供另外的步驟以在保持聚合物處于其沉淀形式的條件下通過洗脫而將混合物的一或多種生物分子從沉淀的聚合物分離。本發(fā)明另外的目的是給感興趣的生物分子提供額外的加工。本發(fā)明另外的目的是另外的步驟將生物分子配制到藥物可接受的載體中并將其用于各種診斷、治療或其它的此生物分子已知的用途。本發(fā)明的目的是在一個步驟中直接于生物反應(yīng)器中或生物反應(yīng)器外提供純化的生物分子。本發(fā)明另外的目的是使用UF步驟以在由沉淀技術(shù)將生物分子純化和回收后對其進行濃縮。本發(fā)明另外的目的是由使用增強的UF(帶電UF)方法的額外的加工來實現(xiàn)生物分子的純化和回收。附圖簡述

圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明的第一個方法的方框示意圖。發(fā)明詳述本發(fā)明是使用一或多種液相或經(jīng)增溶的雙模式聚合物(即使沉淀時也具有如親和性或電荷或疏水性等的性能)，以其第一模式來結(jié)合粒子和雜質(zhì)并以其第二模式來選擇性地和可逆地結(jié)合一或多種感興趣的生物分子。優(yōu)選的聚合物具有靜電的和疏水的性能。 繼而將感興趣的生物分子從所述聚合物洗脫(優(yōu)選在該聚合物保持處于其固體或沉淀形式的時候)，并回收用于進一步的加工。更具體地，此構(gòu)思涉及使用可溶于一種液相的一或多種聚合物的方法，在液體中使用所述聚合物的第一模式結(jié)合粒子和雜質(zhì)并通過其第二模式選擇性地結(jié)合溶液中的一或多種期望的生物分子，以形成沉淀并從沉淀中回收該生物分子。例如，此構(gòu)思在蛋白純化的背景下可得到最好的描述，盡管其可用于從復合的混合物中純化任何溶質(zhì)，只要所述移除的機理適用于此特定的感興趣的溶質(zhì)。一些聚合物，如聚(N-乙烯基己內(nèi)酰胺)、聚(N-丙烯?；哙?、聚(N-乙烯基異丁酰胺)、聚(N-取代丙烯酰胺)包括[聚(N-異丙基丙烯酰胺)、聚(N，N- 二乙基丙烯酰胺)、和聚(N-丙烯?；?N-烷基哌嗪)]以及羥烷基纖維素是因溫度變化而展現(xiàn)出可溶性變化的聚合物的例子。另外的聚合物，如丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物、2或4-乙烯基吡啶的聚合物和共聚物以及殼聚糖因PH或鹽的變化而展現(xiàn)出可溶性的變化。一些聚合物，如聚 (N-烷基2或4-乙炔基吡啶鹽)、聚(N-烷基乙炔基咪唑鹽)、聚(N-烷基乙炔基三嗪鹽)、 聚季銨化的胺、和聚季銨化的環(huán)胺是可溶于水成溶液并能夠與帶相反電荷的雜質(zhì)復合的聚合物的例子。由于某些此類聚合物可能不具有固有的第二模式的性能以選擇性地結(jié)合或洗脫期望的感興趣生物分子，需要用配體或化學基團來修飾它們，所述配體或化學基團會與期望的分子復合并將其保持在復合物中并在適當?shù)南疵摋l件下釋放該期望的分子。適宜的化學基團可包括但不限于羧基和胺基，如形成該聚合物的一部分或附著于該聚合物的吡啶基?？墒褂玫呐潴w如親和性配體的化學模擬物。此類配體包括但不限于天然配體或合成配體如巰基乙基吡啶(MEP)、巰基乙基吡嗪、MEB、2-氨基苯并咪唑(ABI)、AMBI、2_巰基-苯甲酸(MBA)、4_氨基-苯甲酸(ABA)、2_巰基-苯并咪唑(MBI)等。取決于所使用的聚合物，所述方法可以變化。與先前的發(fā)明不同，在本發(fā)明中可使用含有感興趣的生物分子連同細胞、細胞碎片、宿主細胞蛋白、DNA、病毒等的未澄清的細胞培養(yǎng)液。此外，所述方法可對收獲的細胞培養(yǎng)液(未澄清的細胞培養(yǎng)液，如從生物反應(yīng)器中收獲的)執(zhí)行，或者若需要的話可以在生物反應(yīng)器本身內(nèi)執(zhí)行。所述液體可預(yù)先設(shè)置為期望的pH、溫度或其它條件特征以使所述聚合物進入溶液并使兩個模式均執(zhí)行其功能，或者可在加入所述聚合物后設(shè)置液體的條件，或者可將所述聚合物加入到適當?shù)卦O(shè)置為所需參數(shù)條件的載液中使得該聚合物在液體中增溶并且有活性。使聚合物循環(huán)遍及所述液體并結(jié)合雜質(zhì)和期望的生物分子以形成會沉淀出溶液的聚集物。將聚合物、雜質(zhì)和期望的生物分子與所述液體的其余部分分離并任選地洗滌一或多次以去除任何截留的或松散結(jié)合的污染物。繼而將期望的生物分子從聚合物中回收，例如通過洗脫等。優(yōu)選地，洗脫在一組條件下完成從而聚合物在期望的生物分子洗脫期間保持其固體(沉淀)形式，雖然二者在新液體如水和緩沖的溶液中均可被增溶，并通過某方式回收生物分子，如親和、離子交換、疏水作用、或一些其它類型的層析，所述層析對所述生物分子具有超過聚合物或雜質(zhì)的偏好和選擇性。然后回收洗脫的生物分子并在需要時進行另外的加工步驟。具有雙模式特性的聚合物包括但不限于季銨化的聚乙烯基吡啶(QPVP)。特別是， 優(yōu)選季銨化為50%或更低的QPVP。其它聚合物可包括聚乙烯胺、聚烯丙基胺、聚(二烯丙基二甲基氯化銨)、聚(甲基丙烯酰丙基三甲基氯化銨)、季銨化的聚乙烯基咪唑、季銨化的聚乙烯基三嗪、季銨化的聚胺和季銨化的聚環(huán)胺。這些具有親水和/或疏水的第一模式。它們具有可以是化學的如官能團的第二模式機制，所述官能團如羧基或吡啶基如季銨化的胺基，或者其可以是配體如蛋白A、蛋白G、蛋白A的合成模擬物如MEP或MAB。所述方法通常包括使混合物的液體的一或多個條件處于正確的pH、溫度或鹽濃度或者其它條件用于使聚合物變得可溶并執(zhí)行其雙模式的功能，以及繼而將聚合物直接加入至混合物或者將已在載液中增溶的聚合物加入至混合物，所述載液如水或緩沖的溶液。在某些情況下，所述混合物會處于適當?shù)臈l件下以允許簡單地將聚合物加入至該混合物。在另外的情況中，可能需要將混合物設(shè)置為或者修改為處于期望的條件。此種修改或設(shè)置可通過首先修改混合物然后加入聚合物，或者可以將聚合物加入到設(shè)置為期望的狀態(tài)的載液中并簡單地將其加入到混合物中從而所述載液即足以使混合物達到該條件，或者兩種方式都進行。所述聚合物的第一和第二模式結(jié)合其選擇性的靶標并形成聚集物，其使得該聚合物變得不可溶并從溶液中沉淀出來成為分散的固體懸浮物而無需刺激的改變。分離沉淀，如通過離心或過濾或重力和時間(液體部分被傾析)。將回收的聚合物/期望的生物分子沉淀洗滌一或多次以去除任何殘留的雜質(zhì)或污染物，繼而在使得所述生物分子實體選擇性地從聚合物釋放的條件下將該生物分子從聚合物洗脫，從而可以將其回收并進行進一步的加工。優(yōu)選地，洗脫條件使得聚合物保持其固體或沉淀形式并也保留著雜質(zhì)。通過允許生物分子通過卻將聚合物保留在上游的簡單的過濾而將洗脫的生物分子與聚合物分離。本發(fā)明中可使用一種聚合物或者摻和的多種聚合物，并且下文無論使用術(shù)語聚合物、多種聚合物或者一或多種聚合物均應(yīng)當涵蓋上述的兩種實施方案。如上文所述，可以將聚合物按原樣直接加入到混合物中，或者可以是經(jīng)設(shè)置的狀態(tài)以在加入時增強聚合物第一和第二模式的可溶性和結(jié)合性能?；蛘?，可將其加入其可溶的載液中，且該載體優(yōu)選也與混合物相容。一種此載液是水，用酸或堿調(diào)節(jié)至特定PH的水， 另一種是基于水的溶液如鹽水、生理緩沖液或者摻和了有機溶劑的水如水/乙醇摻和物。 載液的選擇取決于其要加入的混合物以及要偏好和耐受什么。聚合物所要加入其中的載液可以是已經(jīng)設(shè)置好條件的(如調(diào)節(jié)了 PH、或者加熱至期望的溫度、或者加熱至期望的溫度并加入一或多種鹽、或者冷卻至期望的溫度且有或沒有一或多種鹽)，或者可以將聚合物加入然后將載液設(shè)置為使聚合物在該載液中增溶的條件。然后將載體/可溶的聚合物的摻和物加入到混合物中?？蓪⒒旌衔锶菁{在混合容器中，如錐形底的金屬(優(yōu)選不銹鋼更優(yōu)選304或 306L不銹鋼)或玻璃或塑料的袋、缸(vat)、或槽(tank)?；蛘?，特別是對于細胞培養(yǎng)物或微生物或酵母培養(yǎng)物，可以是所述細胞在其中生長的生物反應(yīng)器或發(fā)酵罐。也可以是一次性的生物反應(yīng)器或發(fā)酵罐或者一次性的混合袋如可得自Millipore Corporation of BilleridMassachusetts的塑料袋。通過混合的操作使所述混合物與聚合物密切接觸，所述混合操作可由以下方式來進行，磁攪拌棒、磁力混合器如可得自Millipore Corporation of Billerica, Massachusetts 的 NovAs印tic 混合器、閃電型混合器(Lightning-type mixer)、回流泵、或搖擺型閉合混合袋或生物反應(yīng)器或發(fā)酵罐，如2005/0063259A1和US 7，377，686所示的，或者空氣推升混合器或反應(yīng)器(其中液體中升起的氣泡使得形成循環(huán)的模式)?；蛘撸旌衔锖途酆衔?獨自或者于載液中)可以處于分離的容器中并在靜態(tài)混合器中流線混合。然后摻和物可進入容器中或離心機中或者過濾器中，在其中將沉淀的聚合物及其結(jié)合的一或多種生物分子實體與混合物的剩余物分離并進行進一步的加工。在另一個實施方案中，將混合物和聚合物(獨自或者于載液中)在容納所示混合物的容器中摻和到一起，然后在靜態(tài)混合器中流線混合。然后摻和物可進入容器或者離心機或者過濾器中，在其中將沉淀的聚合物及其結(jié)合的一或多種實體與混合物的剩余物分離。然后進一步加工沉淀的聚合物以回收感興趣的生物分子。利用離心，可容易且快捷地將沉淀的聚合物與液體混合物的剩余物分離。在離心后，上清，通常是混合物的剩余物被提出。沉淀的聚合物被進一步加工以回收生物分子。如果需要的話，可對上清進行一或多次額外的聚合物沉淀步驟以回收更多的期望的生物分子。需要的話也可使用簡單的傾析?？梢远喾N方式來完成過濾。取決于聚合物沉淀時的大小，可使用不同大小和非對稱性的一或多種過濾器。過濾器類型和大小的選擇取決于要捕捉的沉淀的體積。本發(fā)明可使用基于膜的過濾器，優(yōu)選微孔膜。此類過濾器通常其性質(zhì)是聚合物并可由聚合物制成，例如但不限于烯烴如聚乙烯包括超高分子量的聚乙烯、聚丙烯、EVA共聚物和α烯烴、茂金屬烯烴聚合物、PFA、MFA、PTFE、聚碳酸酯、乙烯基共聚物如PVC、聚酰胺如尼龍、聚酯、纖維素、醋酸纖維素、再生纖維素、纖維素合成物、聚砜、聚醚砜、聚芳砜、聚苯砜、聚丙烯腈、聚偏氟乙烯(PVDF)、和其摻和物。所選擇的膜取決于應(yīng)用、期望的過濾特性、 要過濾的顆粒類型和大小以及期望的流。優(yōu)選的基于膜的過濾器包括可得自Millipore Corporation of Billerica Massachusetts ^ DURAPORE PVDF nj g Millipore Corporation of Billerica Massachusetts 的 MILLIPORE EXPRESS 禾口 MILLIPORE EXPRESS PLUS或者SH PES膜。這些實施方案中也可使用預(yù)濾器、厚度過濾器等如可得自 Millipore Corporation of Billerica Massachusetts 白勺Polygard 預(yù)(Polygard CE 預(yù)濾器)和厚度過濾器(Polygard CR厚度過濾器)。取決于混合物、聚合物和生物分子的性質(zhì)，過濾器可以使親水的或疏水的。優(yōu)選的過濾器是親水的并且是低蛋白結(jié)合的。所述過濾器(膜的或其它的)的孔大小可以在其整個厚度上是對稱的，如可得自 Millipore Corporation of Billerica Massachusetts 的 DURAPORE PVDF 膜；或者其孔大小可以在其整個厚度上是非對稱的如可得自Millipore Corporation of Billerica Massachusetts 的 MILLIPORE EXPRESS 和 MILLIPORE EXPRESS PLUS 或者 SH PES 膜。如果需要其可含有預(yù)過濾器層，作為分離的上游層或者作為整合的所述膜的上游部分。所述過濾器、預(yù)過濾器或厚度過濾器可以有非膜材料形成，如連續(xù)纏繞纖維、纖維墊(Millistak+ 襯墊)和/或非針織材料如Tyvek 塑料紙。膜的孔大小可以根據(jù)所選擇的聚合物和混合物而改變。通常其具有平均孔大小從約0. 05微米至5微米，優(yōu)選從約0. 05微米至約1微米，更優(yōu)選從約0. 05至約0. 65微米。預(yù)過濾器和厚度過濾器常常不以孔大小而是以其程度(extent)來評定，它們可以具有從約0. 22微米至約10微米的孔大小。所述過濾器(膜的或其它的)能以閉合端(deadend)或常態(tài)流(NF)形式或者切向流(TFF)形式來運行。該選擇取決于多個因素，首要的是用戶的偏好或者所裝配的過濾設(shè)備對本發(fā)明有效。當需要回收大量的聚合物和分子時，優(yōu)選TFF方法和設(shè)備，因為TFF比起NF方法更少遭受堵塞和污垢。圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明的第一個方法的方框示意圖。在第一個步驟2中，未澄清的混合物被設(shè)置為正確的條件從而將所選擇的捕捉聚合物保持在溶液中并允許兩個模式在加入時發(fā)揮功能，或者如果所述混合物的條件可以使聚合物在該混合物中變得可溶且具有雙功能，則不再需要對條件進行設(shè)置?；蛘?，可將作為固體的聚合物加入到未經(jīng)條件設(shè)置的混合物中，然后可以對含有所述固體聚合物的混合物進行條件設(shè)置以達到正確的參數(shù)來將所述聚合物溶解到該混合物中，并使得其雙模式的功能可以發(fā)生。類似地，可將聚合物加入到載液中并在正確的條件下加入到混合物中。所述混合物本身也可預(yù)先設(shè)置條件或者可在引入載體后依賴于載體而進行條件設(shè)置。在第二個步驟4中，將聚合物與混合物在流中混合理想長度的時間以建立適宜的分布使得其可以與混合物的所有組分實現(xiàn)緊密接觸。在第三個步驟6中，聚合物形成聚集物且在保留結(jié)合的雜質(zhì)和生物分子的同時從溶液中沉淀出來成為分散的固體懸浮物。然后在第四個步驟8中將混合物的其余組分和沉淀的聚合物彼此分離。如上所述，可通過離心、傾析、或過濾來分離沉淀和余留的混合物。任選地，如本領(lǐng)域所熟知的那樣，可進一步用水、緩沖液或中間產(chǎn)物洗滌溶液將沉淀物洗滌一或多次，以從沉淀中去除雜質(zhì)或者從沉淀中去除任何非特異性結(jié)合的雜質(zhì)。
然后回收期望的生物分子。優(yōu)選地，其從所述聚合物洗脫，例如通過在某pH值(酸性或堿性，取決于該分子和所使用的聚合物)加入緩沖液，并且該溶液的鹽濃度和溫度被改變以使得在步驟10中可以回收無所述聚合物的期望的分子。優(yōu)選地，洗脫的條件可以使得聚合物保持其固體(沉淀)的形式并保留其結(jié)合的雜質(zhì)，盡管期望或者需要時可以使其再度可溶，繼而可以使從聚合物中解絡(luò)的生物分子和所述聚合物沉淀，從而使第一模式發(fā)揮作用并去除雜質(zhì)，但是第二模式不運作從而使生物分子與液體保持在一起。由于生物分子與沉淀一起回收，任何過量的聚合物被留在從沉淀分離的液體中， 由此減少了是否有殘余的聚合物保留在液體流中的問題。如果期望的話，可將額外的聚合物加入到余留的液體中以確保盡可能多的生物分子被回收。感興趣的生物分子在被回收后，可以進行一或多個已知的額外加工步驟如層析步驟，例如但不限于離子交換、疏水相互作用或親和層析，各種過濾步驟如微濾、超濾、有或沒有帶電UF膜的高效切向流過濾(HPTFF)，病毒去除/失活步驟，最終的過濾步驟等?；蛘撸?洗脫的感興趣的生物分子可無需進一步的純化步驟而被使用。感興趣的生物分子還可以經(jīng)過無需層析步驟的進一步純化。在另外的實施方案中，排除了細胞收獲物通過親和層析的處理步驟。在此實施方案中的生物學方法將由如下組成通過基于聚合物的純化步驟直接從未澄清的混合物中捕捉生物分子，將生物分子與聚合物以及混合物的剩余物分離，2個或更多個步驟的病毒去除或失活例如通過病毒過濾器去除或者通過用熱、化學物質(zhì)或光的處理而失活，調(diào)配步驟達到正確的配制，以及在將經(jīng)調(diào)配的生物分子裝入其最終容器(小瓶、注射器等)待用之前最后的過濾步驟。在本發(fā)明的任何實施方案中，經(jīng)如此回收的生物分子可以被配制到藥物可接受的載體中，并用于各種診斷、治療或其它此分子已知的用途。作為所述方法中起始材料的所述混合物會發(fā)生改變，這取決于其所生長的細胞系以及生長和收獲的條件。例如在大部分的CHO細胞的方法中，該分子在細胞壁外表達并進入培養(yǎng)基。在收獲期間會嘗試避免使細胞破裂以減少混合物中雜質(zhì)的量。然而，某些細胞在生長和收獲期間會因為切力或其它操作條件而破裂或者死亡或溶解，將其內(nèi)含物溢出至混合物中。在細菌細胞系統(tǒng)中，生物分子常被保持在細胞壁中或者其本身就可以是細胞壁的一部分(蛋白A)。在這些系統(tǒng)中，需要破壞或溶解細胞壁以回收感興趣的生物分子。要純化的靶分子可以是任何生物分子，優(yōu)選是蛋白，特別是，任何宿主細胞產(chǎn)生的重組蛋白，包括但不限于，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、可得自荷蘭Crucell的Per. C6 細胞系、骨髓瘤細胞如NSO細胞、其它動物細胞如小鼠細胞、昆蟲細胞、或微生物細胞如大腸桿菌或酵母。此外，所述混合物可以是源自動物的液體，所述動物經(jīng)改造以產(chǎn)生含有感興趣生物分子的轉(zhuǎn)基因液體如奶或者血液。較佳的靶蛋白是抗體、免疫粘附素和其它抗體樣分子， 如包括Ch2/Ch3區(qū)域的融合蛋白。特別是，此產(chǎn)物和方法可用于從有條件地收獲的細胞培養(yǎng)液(HCCF)中純化重組的人源化單克隆抗體如(MmMAb)，所述細胞培養(yǎng)液是由表達IihuMAb 的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞培養(yǎng)的。本發(fā)明范圍內(nèi)的抗體包括但不限于抗-HER2抗體包括曲妥珠單抗 (Trastuzumab, HERCEPTIN ) (Carter et al.，Proc. Natl. Acad. Sci.USA,89 4285-4289(1992)，U. S. Pat. No. 5，725，856)；抗-CD20 抗體如嵌合的抗-CD20 〃 C2B8"如 U. S. Pat. No. 5，736，137(RITUXAN. )中的，2H7抗體的嵌合或人源化的變體如U. S. Pat. No. 5, 721, 108，Bl 中的，或者托西莫單抗(Tositumomab, BEXXAR. )；抗-IL_8(St John et al.，Chest，103 :932 (1993)，和國際公開 No. WO 95/23865)；抗-VEGF 抗體包括人源化的和/或親和力成熟的抗-VEGF抗體如人源化的抗-VEGF抗體huA4. 6. 1 AVASTIN . (Kim et al. Growth Factors，7 :53-64 (1992)，國際公開 No. WO 96/30046，和 WO 98/45331，發(fā)表于1998年10月15日)；抗-PSCA抗體(W001/40309)；抗-CD40抗體，包括S2C6及其人源化的變體(W000/75348)；抗-CDlIa(U. S. Pat. No. 5，622，700，WO 98/23761，Steppe et al. Transplant Intl. 4 :3-7 (1991), 禾口 Hourmant et al.Transplantation 58: 377-380(1994))；抗-IgE (Presta et al.，J Immunol. 151 J623-2632 (1993)，和國際公開 No. WO 95/19181)；抗-CD18 (U. S. Pat. No. 5，622，700，1997 年 4 月 22 日發(fā)表，或者在 1997 年7月31日發(fā)表的WO 97/26912中)；抗-IgE(包括E25、E^和E27 ； 1998年2月3日發(fā)表的 U. S. Pat. No. 5，714，338，或者 1992 年 2 月 25 日發(fā)表的 U. S. Pat. No. 5，091，313，1993 年3月4日發(fā)表的WO 93/04173，或1998年6月30日提交的國際申請No. PCT/US98/13410， U. S. Pat. No. 5, 714, 338)；抗-Apo_2 受體抗體(1998 年 11 月 19 日發(fā)表的 WO 98/51793)； 抗-TNF- α 抗體包括 cA2 (REMICADE )，CDP571 和 MAK-195 (參見 1997 年 9 月 30 日發(fā)表的 U. S. Pat. No. 5，672，347，Lorenz et al. J. Immunol. 156 (4) 1646-1653 (1996),和 Dhainaut et al. Crit. Care Med. 23 (9) :1461-1469(1995))；抗-組織因子(TF) (1994 年 11 月 9 日授權(quán)的 European Patent No. 0420937B1)；抗-人 α4β7 整聯(lián)蛋白(W0 98/06248 published Feb. 19,1998)；抗-EGFR(嵌合的或人源化的225抗體如WO 96/40210published Dec. 19，1996 中的)；抗-CD3 抗體如 0KT3 (U. S. Pat. No. 4，515，893issued May 7， 1985)；抗-CD25 或抗-tac 抗體如 CHI-621 (SIMULECT )和(ZENAPAX )(參見 U. S. Pat. No. 5，693，762issued Dec. 2，1997)；抗-CD4 抗體如 cM-7412 抗體(Choy et al. Arthritis Rheum 39(1) :52-56(1996))；抗-CD52 抗體如 CAMPATH-1H(Riechmann et al. Nature 332 :323-337 (1988))；抗-Fe 受體抗體如針對 Fc y RI 的 Μ22 抗體如 Graziano et al. J. Immunol. 155(10) :4996-5002(1995)中的；抗-癌胚抗原(CEA)抗體如 hMN-14(Sharkey et al. Cancer Res. 55 (23Suppl) :5935s_5945s (1995)；針對乳腺上皮細胞的抗體包括 huBrE-3、hu-Mc3 和 CHL6(Ceriani et al. Cancer Res. 55(23) 5852s-5856s(1995)；和 Richman et al. Cancer Res. 55 (23Supp) :5916s-5920s (1995))；結(jié)合結(jié)腸癌細胞的抗體如 C242 (Litton et al. Eur J. Immunol. 26(1) :1-9(1996))；抗-CD38 抗體，例如 AT 13/5(Ellis et al. J Immunol. 155(2) :925-937 (1995))；抗-CD33 抗體如 HuM195(Jurcic et al. Cancer Res 55(23Suppl) :5908s_5910s(1995)和 CMA-676 或 CDP771 ；抗-CD22 抗體如 LL2 或 LymphoCide (Juweid et al. Cancer Res 55(23Suppl) 5899s-5907s (1995))；抗-EpCAM 抗體如 17-1A (PAN0REX .)；抗-GpIIb/IIIa 抗體如阿昔單抗(abciximab)或 c7E3Fab (RE0PR0 )；抗-RSV 抗體如 MEDI-493 (SYNAGIS )；抗-CMV 抗體如PR0T0VIR ；抗-HIV抗體如PR0M2 ；抗-肝炎抗體如抗-H印B抗體0STAVIR ；抗-CA 125抗體OvaRex ；抗-個體基因型⑶3表位抗體BEC2 ；抗-α ν β 3抗體VITAXIN .；抗-人腎細胞癌抗體如ch-G250 ；ING-I ；抗-人17-1A抗體(3622W94)；抗-人結(jié)腸直腸腫瘤抗體(A33)；抗-人黑色素瘤抗體RM針對⑶3神經(jīng)節(jié)苷脂；抗-人鱗狀細胞癌(SF-25)；和抗-人白細胞抗原(HLA)抗體如Smart IDlO和抗-HLA DR抗體Oncolym(Lym-I)。本文抗體的優(yōu)選的靶抗原是HER2受體、VEGF、IgE、CD20、CDllaJP CD40。除了上述具體說明的抗體之外，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠產(chǎn)生針對感興趣抗原的抗體，例如用下面描述的技術(shù)。本文的抗體是針對感興趣的抗原。優(yōu)選地，該抗原是生物學上重要的多肽，并且將所述抗體施用給患有疾病或病癥的動物時可導致在該動物中的治療性益處。然而，針對非多肽抗原的抗體(如腫瘤相關(guān)糖脂質(zhì)抗原，參見U. S. Pat. No. 5，091，178)也被涵蓋。當抗原是多肽時，其可以是跨膜分子(例如受體)或配體如生長因子。示例性的抗原包括下文第 (3)節(jié)描述的那些蛋白。本發(fā)明涵蓋的示例性的抗體的分子靶標包括CD蛋白如CD3、CD4、 CD8、CD19、CD20、CD22、CD;34、CD40 ；ErbB 受體家族的成員如 EGF 受體，HER2，HER3 或 HER4 受體；細胞粘附分子如LFA-I，Macl，pl50，95，VLA-4，ICAM-1，VCAM和α ν/β 3整聯(lián)蛋白包括其α或β亞單位(例如抗-⑶11a，抗-⑶18或抗-⑶lib抗體)；生長因子如VEGF ;IgE ； 血型抗原；flk2/flt3受體；肥胖癥(OB)受體；mpl受體；CTLA-4 ；蛋白C，或者本文提及的任何其它抗原。上述所列舉的抗體所結(jié)合的抗原明確地包括在本文范圍之內(nèi)?？扇芸乖蚱淦?任選綴合至其它分子的)可被用作免疫原以產(chǎn)生抗體。對于跨膜分子如受體、其片段(例如受體的胞外結(jié)構(gòu)域)，可被用作免疫原?；蛘?，表達跨膜分子的細胞可被用作免疫原。此類細胞可源自天然來源(例如癌細胞系)或者是經(jīng)重組技術(shù)轉(zhuǎn)化以表達跨膜分子的細胞?？捎糜谥苽淇贵w的其它抗原及其形式對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯見的。本發(fā)明中也可以純化多克隆抗體。多克隆抗體優(yōu)選通過相關(guān)抗原和佐劑的多次皮下(SC)或腹膜內(nèi)(ip)注射而在動物中產(chǎn)生。將抗原綴合至在要免疫的物種中具有免疫原性的蛋白會有用，例如匙孔血藍蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白、或大豆胰蛋白酶抑制劑，所述綴合使用雙功能性的或衍生化的制劑，例如馬來酰亞胺苯甲酰基磺基琥珀酰亞胺酯(通過半胱氨酸殘基綴合)、N-羥基琥珀酰亞胺(通過賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、 SOCl2、或者R1N-C-NR1,其中R和R1是不同的烷基。將動物針對抗原、免疫原性綴合物、或衍生物進行免疫，其中將例如100μ g或 5yg的蛋白或綴合物(分別對于兔和小數(shù))與3體積的弗氏完全佐劑組合并將該溶液皮內(nèi)注射至多個位點。1個月后用抗原或綴合物原始量的1/5或1/10(于弗氏完全佐劑中)通過在多個位點皮下注射來對動物進行加強免疫。7至14天后，對動物取血并測定血清的抗體效價。對動物進行加強免疫直至效價達到平臺期。優(yōu)選地，用綴合至不同蛋白和/或通過不同交聯(lián)劑綴合的相同抗原的綴合物來對動物進行加強免疫。綴合物也可在重組細胞的培養(yǎng)中制備成蛋白融合物。此外，聚集劑如明礬也適宜被用來增強免疫應(yīng)答。本發(fā)明也對單克隆抗體有興趣，其可通過最早由Kohler et al. , Nature, 256 495(1975)描述的雜交瘤方法來制備，或者可以通過重組DNA方法來制備(U. S. Pat. No. 4，816，567)。在雜交瘤方法中，如上文所述那樣對小鼠或其它適當?shù)乃拗鲃游锶鐐}鼠或獼猴進行免疫，以引發(fā)產(chǎn)生或能夠產(chǎn)生抗體(其特異性地結(jié)合用于免疫的蛋白)的淋巴細胞?；蛘呖梢泽w外免疫淋巴細胞。繼而用適宜的融合劑將淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，所述適宜的融合劑如聚乙二醇，從而形成雜交瘤細胞(Goding，Monoclonal Antibodies principlesand Practice, pp.59-103(Academic Press,1986))。將如此制備的雜交瘤細胞接種于適宜的培養(yǎng)基并使其生長，所述培養(yǎng)基優(yōu)選含有對未融合的親代骨髓瘤細胞的生長或存活進行抑制的一或多種物質(zhì)。例如，如果親代骨髓瘤細胞缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，則用于雜交瘤的培養(yǎng)基通常要含有次黃嘌呤、氨基蝶呤、和胸苷(HAT培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)阻止HGPRT缺陷型細胞的生長。優(yōu)選的骨髓瘤細胞是那些有效融合的，支持通過選定的抗體表達細胞而穩(wěn)定地高水平地表達抗體的，并且對培養(yǎng)基如HAT培養(yǎng)基敏感的。其中，優(yōu)選的骨髓瘤細胞系是鼠骨髓瘤細胞系，如源自M0PC-2和MPC-I小鼠腫瘤的(可得自SaIk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. USA)，和 SP-2 或 X63_Ag8_653 細胞(可得自 American Type Culture Collection, Rockville，Md. USA)。骨髓瘤細胞和小鼠-人異源骨髓瘤細胞系也被描述用于生產(chǎn)人單克隆抗體(Kozbor，J. Immunol. ,133 =3001(1984)； Brodeur et al. , Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63(Marcel Dekker, Inc., New York,1987))。對雜交瘤細胞在其中生長的培養(yǎng)基進行測定，測定其中針對抗原的單克隆抗體的生產(chǎn)。優(yōu)選地，雜交瘤細胞所產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性通過免疫沉淀或者通過體外結(jié)合測定來確定，如放射性免疫測定(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)。在鑒定出雜交瘤細胞產(chǎn)生具有期望的特異性、親和性、和/或活性的抗體之后， 可通過有限稀釋過程對該克隆進行亞克隆并通過標準方法培養(yǎng)(Goding，Monoclonal Antibodies :Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986))。適宜此目的的培養(yǎng)基包括，例如D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。此外，可將雜交瘤細胞作為腹水瘤而在動物體內(nèi)生長。通過常規(guī)的免疫球蛋白純化過程將亞克隆所分泌的單克隆抗體適當?shù)貜呐囵B(yǎng)基、 腹水液、或血清中分離，所述純化過程例如可得自Millipore Corporation of Billerica, Massachusetts的ftO-kp Protein A培養(yǎng)基、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析、或親和層析。優(yōu)選使用本文所述的蛋白A層析過程。通過常規(guī)過程輕易地分離并測序了編碼單克隆抗體的DNA(例如通過使用能夠特異性地結(jié)合編碼單克隆抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。雜交瘤細胞是優(yōu)選的此類DNA的來源。一旦被分離，可將所述DNA置于表達載體內(nèi)，繼而將該載體轉(zhuǎn)染至宿主細胞內(nèi)，如大腸桿菌細胞、猿COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、或骨髓瘤細胞(這些不另外產(chǎn)生免疫球蛋白)，以獲得單克隆抗體在這些重組宿主細胞內(nèi)的合成。也可對所述DNA進行修飾，例如通過用人重鏈和輕鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的編碼序列取代同源的小鼠序列(U. S. Pat. No. 4, 816, 567 ；Morrison, et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 :6851 (1984))，或者通過將免疫球蛋白編碼序列與部分或全部的非免疫球蛋白多肽的編碼序列連接起來。通常此種非免疫球蛋白多肽被抗體的恒定結(jié)構(gòu)域取代，或者它們被抗體的一個抗原結(jié)合位點的可變結(jié)構(gòu)域所取代，以創(chuàng)建嵌合的二價抗體，其含有對抗原有特異性的一個抗原結(jié)合位點和對不同的抗原有特異性的另一個抗原結(jié)合位點。在另外的實施方案中，可以從抗體噬菌體文庫中分離單克隆抗體，所述文庫用McCafferty et al.，Nature，348 :552-554 (1990)中所描述的技術(shù)產(chǎn)生。Clackson et al.， Nature，352 :624-6 (1991)和 Marks et al.，J. MoI. Biol.，222 :581-597 (1991)中分別描述了用噬菌體文庫分離鼠和人抗體。下述的文獻描述了通過鏈改組來產(chǎn)生高親和性O(shè)iM 范圍的)人抗體(Marks et al.，Bio/Technology, 10 :779-783 (1992))，以及組合感染和體內(nèi)重組作為構(gòu)建非常大的噬菌體文庫的策略(Waterhouse et al.，Nuc. Acids. Res. ,21 2265-2^6(1993))。因此，對于單克隆抗體的分離來說，這些技術(shù)是傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)的可行替代。人源化的抗體具有一或多個來自非人來源的氨基酸殘基被引入其中。這些非人氨基酸殘基常被稱作“輸入”殘基，其通常取自“輸入”的可變結(jié)構(gòu)域。人源化可基本上根據(jù)下述文獻的方法進行(Jones et al.，Nature, 321 :522-525(1986) ；Riechmann et al.， Nature, 332 :323-327(1988) ；Verhoeyen et al.，Science，239 1534-1536 (1988))，通過用嚙齒動物的CDR序列取代人抗體的相應(yīng)序列。因此，此種“人源化”的抗體是嵌合抗體 (U. S. Pat. No. 4，816，567)，其中基本上少于完整的人可變結(jié)構(gòu)域已經(jīng)被來自非人物種的相應(yīng)序列所取代。在實踐中，人源化的抗體通常是人抗體，其中某些CDR殘基和可能地某些FR 殘基被來自嚙齒動物抗體同源位點的殘基所取代。用于制備人源化抗體的人可變結(jié)構(gòu)域(輕鏈和重鏈)的選擇對于降低抗原性是非常重要的。根據(jù)所謂的“最佳配適”法，將嚙齒動物抗體的可變結(jié)構(gòu)域的序列針對已知人可變結(jié)構(gòu)域序列的整個文庫進行篩選。與嚙齒動物的序列最接近的人序列被接受作為用于人源化抗體的人FR(Sims et al.，J. Immunol.，151 :2四6(1993))。另一個方法使用源自特定亞組的輕鏈或重鏈的所有人抗體的共有序列的特定的框架。相同的框架可用于若干不同的人源化抗體(Carter et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 :4285(1992) ；Presta et al.， J.Immunol.，151 :2623 (1993))。還很重要的是經(jīng)人源化的抗體保留其對抗原的高親和性和其它有用的性質(zhì)。為實現(xiàn)此目的，根據(jù)優(yōu)選的方法，通過如下方法制備人源化的抗體，即用親代序列和人源化序列的三維模型來分析親代序列和各種概念上的人源化的產(chǎn)物。三維免疫球蛋白模型通?？傻貌⑶沂潜绢I(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的。說明和演示選定的候選免疫球蛋白序列可能的三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計算機程序也是可得的。對這些演示的研究使得可以分析殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中所發(fā)揮的作用，也就是對影響候選免疫球蛋白結(jié)合其抗原能力的氨基酸的分析。以此種方式，可從受體和輸入序列選出并組合FR殘基，從而可以實現(xiàn)期望的抗體特性， 如提高的針對靶抗原的親和性。通常，CDR殘基直接地并最實質(zhì)地涉及對抗原結(jié)合的影響?；蛘?，現(xiàn)在可以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)，其能夠于免疫后，在不產(chǎn)生內(nèi)源免疫球蛋白的情況下，產(chǎn)生全套抗體庫的人抗體。例如，有報道表明在嵌合和種系突變體小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(Jh)基因的純合子缺失導致內(nèi)源抗體產(chǎn)生的完全抑制。將人種系免疫球蛋白基因列轉(zhuǎn)移至此種系突變體小鼠中會導致在抗原攻擊后產(chǎn)生人抗體。參見例如 Jakobovits et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 :2551 (1993) Jakobovits et al., Nature,362 :255-258(1993) ；Bruggermann et al. , Year In Immuno. ,7 :33(1993)；禾口 Duchosal et al. Nature 355:258(1992)。人抗體也可以源自噬菌體文庫(Hoogenboom et al.，J. MoI. Biol.，227 :381 (1991) ；Marks et al.，J. MoI. Biol.，222 :581-597(1991)； Vaughan et al. Nature Biotech 14:309(1996))。
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已開發(fā)出各種技術(shù)用于產(chǎn)生抗體片段。傳統(tǒng)上，這些片段是通過對完整抗體的蛋白水解消化而衍生出來的(參見例如·，Morimoto et al.，Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107—117(1992)和 Brennan et al.，Science，229 :81 (1985))。 然而，現(xiàn)在這些片段可以直接從重組宿主細胞中產(chǎn)生。例如，抗體片段可分離自上述的抗體噬菌體文庫。或者，F(xiàn)ab' -SH片段可直接從大腸桿菌回收并化學偶聯(lián)以形成F(ab' )2片段(Carter et al. ,Bio/Technology 10:163-167(1992))。根據(jù)另一途徑，F(xiàn) (ab' )2 片段可直接從重組宿主細胞培養(yǎng)物中分離。其它的產(chǎn)生抗體片段的技術(shù)對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯見的。在另外的實施方案中，選擇的抗體是單鏈Fv片段(scFv)。參見WO 93/16185。多特異性抗體具有對至少兩個不同抗原的結(jié)合特異性。雖然此類分子一般僅結(jié)合兩種抗原(即雙特異性抗體BsAb)，但是在本文中此表述涵蓋了具有額外的特異性例如三特異性的抗體。制備雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域公知的。全長雙特異性抗體的傳統(tǒng)生產(chǎn)是基于共表達兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對，其中所述兩個鏈具有不同的特異性(Millstein et al.，Nature, 305 :537-539 (1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機編配，這些雜交瘤 (四源雜交瘤，quadroma)產(chǎn)生10種不同抗體分子的可能的混合物，其中僅有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。該正確分子的純化，通常由親和層析的步驟來完成，相當?shù)穆闊┎⑶耶a(chǎn)量低。類似的過程在 WO 93/088 中以及 Traunecker et al. ,EMBO J.，10 :3655-3659 (1991) 中有公開。根據(jù)W096/27011中描述的另一個途徑，可以將一對抗體分子間界面改造以使從重組細胞培養(yǎng)物中回收的異源二聚體的百分比最大化。優(yōu)選的界面包含抗體恒定結(jié)構(gòu)域的至少一部分的Ch3結(jié)構(gòu)域。在此方法中，來自第一個抗體分子的界面的一或多個小氨基酸側(cè)鏈被較大的側(cè)鏈(例如酪氨酸或色氨酸)所替換。與大側(cè)鏈具有相同或類似大小的補償性“空腔”，是通過用較小側(cè)鏈(例如丙氨酸或蘇氨酸)替換大氨基酸側(cè)鏈而在第二個抗體分子的界面上創(chuàng)建出來的。這提供了一種機制，用于提高異源二聚體相對于其它不期望的終產(chǎn)物如同源二聚體的產(chǎn)量。雙特異性抗體包括交聯(lián)的或者“異源綴合的”抗體。例如，可將異源綴合物中的一個抗體偶合至抗生物素蛋白，另一個偶合至生物素。此類抗體例如已被認為是將免疫系統(tǒng)細胞導向不希望的細胞(U. S. Pat. No. 4，676，980)，以及用于治療HIV感染(W0 91/00360、 WO 92/200373 JPEP 03089)。異源綴合抗體可以使用任何常規(guī)的交聯(lián)方法制備。適宜的交聯(lián)劑是本領(lǐng)域已知的，其與許多交聯(lián)技術(shù)一起在U. S. Pat. No. 4，676，980中公開。文獻中也描述了從抗體片段產(chǎn)生雙特異性抗體的技術(shù)。例如，可用化學連接來制備雙特異性抗體。Brennan et al. ,Science, 229 =81(1985)描述了蛋白水解剪切完整的抗體以產(chǎn)生F(ab' )2片段的過程。這些片段在二硫醇復合劑亞砷酸鈉存在時被還原以穩(wěn)定鄰近的二硫醇并阻止分子間二硫鍵的形成。所產(chǎn)生的F(ab' )2片段繼而被轉(zhuǎn)變?yōu)榱虼趸郊姿狨?TNB)衍生物。繼而將Fab' -TNB衍生物之一通過用巰基乙胺還原而再轉(zhuǎn)變?yōu)?Fab' -thiol，并與等摩爾量的其它Fab' -TNB衍生物混合以形成雙特異性抗體。所產(chǎn)生的雙特異性抗體可被用作酶的選擇性免疫制劑。近來的進展促進了 Fab' -SH片段從大腸桿菌的直接回收，該片段可被化學偶合以形成雙特異性抗體。Shalaby et al.，J Exp. Med, 175 :217-225(1992)描述了完全人源化的雙特異性抗體F(ab' )2分子的產(chǎn)生。每個Fab'片段單獨從大腸桿菌分泌并接受體外的定向化學偶合以形成雙特異性抗體。如此形成的雙特異性抗體能夠結(jié)合過表達ErbB2 受體的細胞和正常人T細胞，以及觸發(fā)針對人乳腺腫瘤靶標的人細胞毒淋巴細胞的胞溶活性。用于直接從重組細胞培養(yǎng)物中制備和分離雙特異性抗體片段的各種技術(shù)也有報道。例如，已用亮氨酸拉鏈產(chǎn)生了雙特異性抗體。Kostelny et al. , J. Immunol. , 148 (5) 1547-1553(1992)。將來自Fos和Jim蛋白的亮氨酸拉鏈肽通過基因融合而連接至兩種不同抗體的Fab'部分?？贵w同源二聚體在鉸鏈區(qū)被還原以形成單體，繼而有再被氧化以形成抗體異源二聚體。Hollinger et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 :6444-6448 (1993)描述的“雙抗體”技術(shù)已提供了制備雙特異性抗體片段的可選機制。所述片段含有通過接頭連接至輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(Vh)，所述接頭太短以至于不允許同一個鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域之間的配對。因此一個片段的\和Vh結(jié)構(gòu)域被迫使與另一個片段的互補的八和Vh結(jié)構(gòu)域配對，由此形成了兩個抗原結(jié)合位點。另一種使用單鏈Fv (sFv) 二聚體制備雙特異性抗體的策略也被報道。參見Gruber et al.，J. Immunol.，152 :5368 (1994)。或者，所述抗體可以是“線性抗體”，如 Zapata et al. Protein Eng. 8(10) :1057-1062(1995) 中所述。簡短來說，這些抗體包含一對前后串聯(lián)的Fd區(qū)段(VH-ChI-Vh-ChI),其形成一對抗原結(jié)合區(qū)域。線性抗體可以是雙特異性的或者單特異性的。設(shè)想了具有超過二價的抗體。例如可以制備三特異性抗體。Tutt et al. J. Immunol. 147 :60(1991)免疫粘附素最簡單直接的設(shè)計將粘附素的結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如受體的胞外結(jié)構(gòu)域 (ECD))與免疫球蛋白重鏈的鉸鏈和Fc區(qū)組合。一般在制備本發(fā)明的免疫粘附素時，會將編碼粘附素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核酸融合至編碼免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域序列N-端核酸的C端，而N 端融合也是可以的。通常，在此類融合中，被編碼的嵌合多肽將至少保留功能上具有活性的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。也有融合被連至恒定區(qū)Fc部分的C-末端、或者緊接著重鏈的ChI的N-末端或輕鏈相應(yīng)區(qū)域的N-末端。進行融合的確切位點并不重要，具體的位點是公知的并且可以進行選擇以優(yōu)化免疫粘附素的生物學活性、分泌、或結(jié)合特性。在優(yōu)選的實施方案中，將粘附素序列融合至免疫球蛋白G1(IgG1)的Fc結(jié)構(gòu)域的 N-末端?？梢詫⒄麄€重鏈恒定區(qū)融合至粘附素序列。然而，更優(yōu)選地是，在所述融合中使用鉸鏈區(qū)中恰好從木瓜蛋白酶剪切位點(其從化學上定義了 IgG Fe，即216位殘基，其中以重鏈恒定區(qū)的第一個殘基為114位)、或者免疫球蛋白的其它類似位點的上游開始的序列。 在特別優(yōu)選的實施方案中，粘附素氨基酸序列被融合至(a)鉸鏈區(qū)和^^與^^或者(b)IgG 重鏈的ChI、鉸鏈、Ch2與Ch3結(jié)構(gòu)域。對于雙特異性免疫粘附素，該免疫粘附素被組裝為多聚體，特別是異二聚體或異四聚體。通常，這些組裝的免疫球蛋白會具有已知的單位結(jié)構(gòu)IgG、IgDjn IgE所存在的形式是基本的四鏈結(jié)構(gòu)單位。在較高分子量的免疫球蛋白中四鏈單位被重復；IgM通常是作為通過二硫鍵保持在一起的4個基本單位的五聚體而存在的。IgA球蛋白和偶爾有時候的 IgG球蛋白也可以在血清中以多聚體形式而存在。在多聚體的情況中，4個單位的每一個可以是相同的或不同的。
本文范圍內(nèi)的各種示例性組裝的免疫粘附素如下所示(a) ACl-ACl ；(b) ACh- (ACh, ACl-ACh, ACl-VhCh,或 VlCl-ACh)； (c) ACl-ACh- (ACl-ACh, ACl-VhCh, VlCl-ACh,或 VlCl-VhCH)(d) ACl-VhCh- (ACh,或 ACl-VhCh,或 VlCl-ACh)；(e) VlCl-ACh-(ACl_VhCh、或 VlCl-ACh)；和(f) (A-Y)n-(VlCl-VhCh)2,其中每個A代表相同或不同的粘附素氨基酸序列；Vl是免疫球蛋白輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；Vh是免疫球蛋白重鏈可變結(jié)構(gòu)域；Cl是免疫球蛋白輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域；Ch是免疫球蛋白重鏈恒定結(jié)構(gòu)域；η是大于等于1的整數(shù)；Y表示共價交聯(lián)劑的殘基?；诤喍痰哪康模笆龅慕Y(jié)構(gòu)僅僅顯示出關(guān)鍵的特征；其并未表示出免疫球蛋白的連接(J)結(jié)構(gòu)域或其它結(jié)構(gòu)域，二硫鍵也未示出。然而，此類結(jié)構(gòu)域是結(jié)合活性所需要的，它們應(yīng)被構(gòu)建而出現(xiàn)在其在免疫球蛋白分子中所占據(jù)的平常位置?；蛘?，可將粘附素序列插入到免疫球蛋白重鏈和輕鏈序列之間，從而獲得含有嵌合重鏈的免疫球蛋白。在此實施方案中，粘附素序列被融合至免疫球蛋白每個臂中免疫球蛋白重鏈的3'末端，在鉸鏈和Ch2結(jié)構(gòu)域之間或者在CH2*CH3結(jié)構(gòu)域之間。類似的構(gòu)建物在 Hoogenboom，et al.，Mol. Immunol. 28 :1027-1037(1991)中已有報道盡管在本發(fā)明的免疫粘附素中不要求存在免疫球蛋白的輕鏈，但是免疫球蛋白的輕鏈可以通過共價連接至粘附素-免疫球蛋白重鏈融合多肽或者直接融合至粘附素而存在。在前一種情況中，編碼免疫球蛋白輕鏈的DNA通常與編碼粘附素-免疫球蛋白重鏈融合蛋白的DNA共表達。在分泌后，雜合重鏈和輕鏈將共價連接以提供包含兩個二硫鍵連接的免疫球蛋白重鏈輕鏈對的免疫球蛋白樣的結(jié)構(gòu)。適用于制備此結(jié)構(gòu)的方法在例如1989 年3月28日發(fā)表的U. S. Pat. No. 4，816，567中有公開。免疫粘附素的構(gòu)建最方便是通過將編碼粘附素部分的cDNA序列符合讀框地融合至免疫球蛋白cDNA序列。然而，也可使用對基因組免疫球蛋白片段的融合(參見例如 Aruffo et al.，Cell 61 :1303-1313(1990)；和 Mamenkovic et al.，Cell 66 1133-1144(1991))。后者這種類型的融合需要Ig調(diào)節(jié)序列的存在用于表達?？苫谠醋云⒒蛲庵苎馨图毎腸DNA文庫的公開的序列，通過雜交或聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)來分離編碼IgG重鏈恒定區(qū)的cDNA。將編碼“粘附素”和免疫粘附素的免疫球蛋白部分的cDNA 前后串聯(lián)地插入到在選定的宿主細胞中指引有效表達的質(zhì)粒載體中。在其另外的實施方案中，要純化的蛋白是融合了或者綴合了 Ch2/Ch3區(qū)域的蛋白。 可產(chǎn)生此種融合蛋白以提高蛋白的血清半衰期?？梢酝ㄟ^此方式綴合的生物學上重要的蛋白的例子包括凝乳酶；生長激素，包括人生長激素和牛生長激素；生長激素釋放因子； 甲狀旁腺激素；促甲狀腺激素；脂蛋白；α -1-抗胰蛋白酶；胰島素A-鏈；胰島素B-鏈；胰島素原；促卵泡激素；降鈣素；促黃體激素；胰高血糖素；凝血因子如因子VIIIC ；因子IX ；組織因子，和馮維勒布蘭德因子；抗凝血因子如蛋白C ；心鈉素；肺表面活性物質(zhì)；纖溶酶原活化劑如尿激酶或人類尿液或組織型纖溶酶原活化劑(t-PA)；鈴蟾肽；凝血酶；造血生長因子；腫瘤壞死因子-α和-β ；腦啡肽酶；RANTES(受激活調(diào)節(jié)正常T細胞表達和分泌的)；人巨噬細胞炎性蛋白(MIP-Ia)；血清白蛋白如人血清白蛋白；Muellerian-抑制物質(zhì)；松弛素A-鏈；松弛素B-鏈；松弛素原；小鼠促性腺素關(guān)聯(lián)肽；微生物蛋白如β -內(nèi)酰胺酶；DNase ;IgE、細胞毒T淋巴細胞關(guān)聯(lián)抗原(CTLA)如CTLA-4 ；抑制素；活化素；血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)；激素或生長因子的受體；蛋白A或D ；類風濕因子；神經(jīng)營養(yǎng)因子如骨衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3、-4、-5、或-6(NT-3、NT_4、NT-5、或 NT-6)，神經(jīng)生長因子如NGF-β ；血小板衍生生長因子(PDGF)；成纖維細胞生長因子如aFGF 和bFGF;表皮生長因子(EGF)；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β 1、 TGF-β 2、TGF-β 3、TGF-β 4、或 TGF-β 5 ；胰島素樣生長因子-I 和-II(IGF-I 和 IGF-II)； des(l-3)-IGF-I(腦IGF-I)，胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(IGFBP) ；CD蛋白如CD3、CD4、 ⑶8、⑶19、⑶20、⑶34、和⑶40 ；促紅細胞生成素；骨誘導因子；免疫毒素；骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)；干擾素如干擾素- α、-β、和-γ ；集落刺激因子(CSF)例如M-CSF、GM-CSFjP G-CSF ；白介素例如IL-I至IL-10 ；超氧化物歧化酶；T-細胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒抗原如例如AIDS包膜的一部分；運輸?shù)鞍祝粴w巢受體；地址素；調(diào)節(jié)蛋白；整聯(lián)蛋白如 CDlla、CDllb、CDllc、CD18，ICAM ；VLA-4 和 VCAM ；腫瘤相關(guān)抗原如 HER2、HER3、或 HER4 受體；及任何上面所列多肽的片段下面的實施例是以舉例說明的方式來提供的，而并非以限制性的方式。說明書中所有引用的文獻均援引加入本文。
實施例實施例1.未澄清的細胞培養(yǎng)液的pH調(diào)節(jié)使衍生自非表達中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系的細胞在生物反應(yīng)器(New Brunswick Scientific)中生長至IOL培養(yǎng)基中2xl06細胞/ml的密度并在64%生存力時收獲。IgG 峰值是0.8g/L的濃度并且宿主細胞(HCP)的濃度是4075ng/m。該液體的pH是7. 2。在純化過程開始前，用0. 5ml的1. OM HCI將未澄清的細胞培養(yǎng)液的pH調(diào)至4. 5。實施例2.此實施例說明了從聚乙烯基吡啶)去除殘留的4-乙烯基吡啶單體。將得自Scientific Polymer Products, Inc.的線性聚(4-乙烯基吡啶)，(PVP)MW 200，000，均勻地散布到玻璃皿上并置于真空烘箱中。用氬將烘箱內(nèi)的氣體清除若干次5分鐘以去除氧氣。用機械真空泵將烘箱中的壓力降低到0. Iin汞柱，隨后將溫度升至120°C。 使聚合物處于這些條件下共M小時。在此期間，用氬將烘箱內(nèi)的氣體清除若干次5分鐘。 在加熱階段結(jié)束時，將烘箱的溫度降低至室溫，并在打開門之前用氬將烘箱內(nèi)的氣體清除若干次。所得的聚合物不具有可注意得到的氣味，而未經(jīng)處理的聚合物具有明顯的4-乙烯基吡啶單體的氣味。經(jīng)處理的聚合物中所存在的殘留4-乙烯基吡啶單體的量用凝膠滲透層析檢測不到，而未經(jīng)處理的聚合物具有0.05% (w/w)的殘留4-乙烯基吡啶單體。實施例3.此實施例說明了季銨化的的聚乙烯基吡啶)，QPVP的合成。如實施例2所述純化PVP。碘乙烷、二甲基甲酰胺和甲苯得自并且隨到隨用。在氮氣下將5g(基于單體重復單位為0. 047mol)的PVP的溶液、30ml DMF中的2. 6g(0. 016mol)的碘乙烷在T = 80°C保持12hr。在冷卻至室溫后，在200ml甲苯中將該聚合物沉淀。所得的固體進一步用IOOml甲苯洗滌并繼而于烘箱中在70°C干燥Mhr，其產(chǎn)率為95%。反應(yīng)物的摩爾比率經(jīng)過選擇從而使產(chǎn)物含有35mol %的季銨化的吡啶環(huán)。實施例4.此實施例說明了 QVPV溶液的制備。通過將IOg來自實施例3的純化的QPVP溶于70g蒸餾水和20g甲醇，并在室溫連續(xù)的攪拌20分鐘而制備10% (w/w)的QPVP溶液。所得的粘稠溶液的顏色是棕褐色 (brown) 0實施例5.此實施例說明了用QPVP從未澄清的細胞培養(yǎng)液捕捉IgG。一水高氯酸鈉和鹽酸(1. 0M)得自Fisher Scientific。將0. 3g的來自實施例4的QPVP溶液加入到IOml的來自實施例1的未澄清的細胞培養(yǎng)液中。聚合物與不可溶的雜質(zhì)(細胞和細胞碎片)、可溶雜質(zhì)(HCP和DNA)以及IgG 復合的結(jié)果是立即形成分散的固體懸浮形式的沉淀。將所得的溶液在加入0. 75g的高氯酸鈉后連續(xù)混合10以增強IgG與聚合物的結(jié)合。通過離心GOOOrpm Imin)收集沉淀并用磷酸緩沖液(50mM，0.2M高氯酸鈉，pH 7.5)洗滌以去除松散結(jié)合的雜質(zhì)。在細胞、細胞碎片和部分的可溶雜質(zhì)被沉淀結(jié)合時，在PH 4.0 (IOmM醋酸鈉，0. 1M)將IgG從沉淀的選擇性洗脫，隨后通過0. 2 μ Durapore⑧過濾器來過濾。在這些條件下，95%的原始液體中存在的 IgG被結(jié)合至聚合物并且通過洗脫回收的IgG為85wt%。
權(quán)利要求
1.一種用于從含有雜質(zhì)的未澄清的混合物中純化生物分子的方法，包括a.在一組條件下提供該混合物，b.加入一或多種聚合物，該聚合物在該組條件下于所述混合物中可溶并且具有結(jié)合一或多種所述混合物中雜質(zhì)的第一模式和能夠可逆地及選擇性地結(jié)合所述生物分子的第二模式，c.將所述一或多種經(jīng)增溶的一或多種聚合物混合至遍及所述混合物，d.將所述一或多種聚合物、一或多種雜質(zhì)和被結(jié)合的生物分子從所述混合物的溶液中沉淀出來，以及e.從所述混合物分離所述沉淀的聚合物和被結(jié)合的生物分子。
2.權(quán)利要求1的方法，其中在步驟b中，將所述聚合物在一種溶液內(nèi)的一組條件下加入到該溶液中，并將含有經(jīng)增溶的聚合物的該溶液加入到所述混合物中。
3.權(quán)利要求1的方法，進一步包括步驟(f)，其中從所述聚合物回收所述生物分子。
4.權(quán)利要求1的方法，其中在一種條件下對所述一或多種聚合物進行增溶，所述條件選自由以下組成的組pH、溫度、鹽濃度、光、電荷及其組合。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述聚合物的第一模式選自帶電側(cè)基的域所組成的組，以及所述聚合物的第二模式選自由以下組成的組帶電側(cè)基、不帶電側(cè)基、親水側(cè)基、疏水側(cè)基、和對感興趣的生物分子是選擇性的配體。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述聚合物的第一模式選自由伯胺、仲胺、叔胺或季胺組成的組，以及第二模式選自由以下組成的組帶電側(cè)基、不帶電側(cè)基、親水側(cè)基、疏水側(cè)基、和對感興趣的生物分子是選擇性的配體。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述聚合物選自由以下組成的組聚O或4-乙烯基吡啶)、 聚O或4-乙烯基吡啶-co-苯乙烯)、聚(2或4-乙烯基吡啶-co-甲基丙烯酸甲酯)、聚 (2或4-乙烯基吡啶-co-甲基丙烯酸丁酯)、聚O或4-乙烯基吡啶)接枝的羥烷基纖維素、聚O或4-乙烯基吡啶-C0-N-異丙基丙烯酰胺)、和聚(甲基丙烯酸-co-甲基丙烯酸甲酯)，并且其中所述聚合物的第二模式選自由官能團和配體組成的組。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述生物分子選自由以下組成的組蛋白、重組蛋白、抗體、 單克隆抗體、重組單克隆抗體、多克隆抗體、人源化的抗體、和抗體片段。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述生物分子是抗體片段，其選自由以下組成的組Fab、 Fab'、f(ab' )2和Fv片段、單鏈抗體分子雙抗體、線性抗體、由抗體片段形成的雙特異性抗體和多特異性抗體。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述生物分子是特異性地結(jié)合抗原的抗體，所述抗原選自由以下組成的組CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD34、CD40、EGF 受體、HER2、HER3、HER4 受體、 LFA-I、Macl、pl50，95、VLA-4、ICAM-U VCAM、av/b3 整聯(lián)蛋白、CDlla、CD18、CDllb、VEGF, IgE、flk2/flt3受體、肥胖癥(OB)受體、mpl受體、CTLA-4和多肽C。
11.權(quán)利要求1的方法，其中生物分子選自由以下組成的組抗-HER2；抗-⑶20 ； 抗-IL-8 ；抗-VEGF ；抗-PSCA ；抗-CD Ila ；抗-IgE ；抗-Apo-2 受體；抗-TNF- α、抗-組織因子(TF)；抗-CD3 ；抗-CD25 ；抗-CD34 ；抗-CD40 ；抗 _tac ；抗-CD4 ；抗-CD52 ；抗-Fc 受體； 抗-癌胚抗原(CEA)抗體；針對乳腺上皮細胞的抗體；結(jié)合直腸癌細胞的抗體；抗-CD33 ； 抗-CD22 ；抗-EpCAM ；抗-GpIIb/IIIa ；抗-RSV ；抗-CMV ；抗-HIV ；抗-肝炎；抗- α νβ 3 ；抗-人腎細胞癌；抗-人17-1A ；抗-人結(jié)腸直腸腫瘤；抗-人黑色素瘤；抗-人鱗狀細胞癌；和抗-人白細胞抗原(HLA)抗體。
12.權(quán)利要求1的方法，其中生物分子是選自由以下組成的組的抗體抗-HER2受體、 抗-VEGF、抗-Ig、抗-⑶20、抗-⑶11a、和抗-⑶40抗體。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述生物分子選自由免疫粘附素和抗體樣分子組成的組。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述生物分子是抗體樣分子，且所述抗體樣分子是融合了或綴合TCH2/CH3區(qū)域的蛋白。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述生物分子是抗體樣分子，且所述抗體樣分子是融合了或綴合了 CH2/Ch3區(qū)域的蛋白，并且所述蛋白選自由以下組成的組凝乳酶；生長激素；生長激素釋放因子；甲狀旁腺激素；促甲狀腺激素；脂蛋白；α -1-抗胰蛋白酶；胰島素A-鏈； 胰島素B-鏈；胰島素原；促卵泡激素；降鈣素；促黃體激素；胰高血糖素；因子VIIIC ；因子 IX ；組織因子；馮維勒布蘭德因子；蛋白C ；心鈉素；肺表面活性物質(zhì)；尿激酶；人類尿液和組織型纖溶酶原活化劑(t-PA)；鈴蟾肽；凝血酶；造血生長因子；腫瘤壞死因子-α和-β ； 腦啡肽酶；RANTES ；人巨噬細胞炎性蛋白(ΜΙΡ-1 α )；血清白蛋白；Muellerian-抑制物質(zhì)； 松弛素A-鏈；松弛素B-鏈；松弛素原；小鼠促性腺素關(guān)聯(lián)肽；β -內(nèi)酰胺酶；DNase ； IgE, 細胞毒T淋巴細胞關(guān)聯(lián)抗原(CTLA)；抑制素；活化素；血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)；激素或生長因子的受體；蛋白A或D ；類風濕因子；骨衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)；神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3、-4、-5、和-6(ΝΤ-3、ΝΤ-4、ΝΤ-5、和ΝΤ-6)，神經(jīng)生長因子；血小板衍生生長因子 (PDGF)；成纖維細胞生長因子；表皮生長因子(EGF)；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)；胰島素樣生長因子-I和-II (IGF-UPIGF-II) ；des (1-3)-IGF-I (腦IGF-I)胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白 (IGFBP) ；CD蛋白；促紅細胞生成素；骨誘導因子；免疫毒素；骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)；干擾素- α、-β、和-Y ；集落刺激因子(CSF)；白介素IL-I至IL-10 ；超氧化物歧化酶；T-細胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒抗原；運輸?shù)鞍祝粴w巢受體；地址素；調(diào)節(jié)蛋白；整聯(lián)蛋白；腫瘤相關(guān)抗原；及其片段。
16.權(quán)利要求1的方法，進一步包括將回收的生物分子摻入藥物配制物的步驟。
17.權(quán)利要求1的方法，其中所述一或多種聚合物通過第一模式與帶相反電荷的固體粒子以及部分的可溶雜質(zhì)復合而沉淀，其量足以形成不能再維持在溶液中的聚集物。
18.權(quán)利要求1的方法，其中所述一或多種聚合物選自由以下組成的組聚乙烯基吡啶、乙烯基吡啶的共聚物、含伯胺的聚合物、含仲胺的聚合物和含叔胺的聚合物。
19.權(quán)利要求1的方法，進一步包括在使所述一或多種聚合物進入溶液的條件下將所述一或多種聚合物加入到載液中，并將該載液和溶液中的一或多種聚合物通過靜態(tài)混合器而加入到所述混合物中。
20.權(quán)利要求1的方法，進一步包括將回收的生物分子配制到藥物可接受的載體中。
21.權(quán)利要求1的方法，進一步包括將回收的生物分子配制到藥物可接受的載體中以用于選自由研究、診斷和治療目的組成的組的目的。
22.權(quán)利要求1的方法，進一步包括從所述聚合物回收所述生物分子并且所回收的生物分子相對于初始混合物其雜質(zhì)具有至少ILRV的下降。
23.權(quán)利要求1的方法，其中通過在引起所述聚合物保持其沉淀狀態(tài)而未結(jié)合所述生物分子的條件下洗脫所述生物分子并將沉淀的聚合物與所述生物分子分離，來將該生物分子從所述聚合物回收，。
24.權(quán)利要求1的方法，其中所述聚合物是季銨化的聚乙烯基吡啶，其中所述季銨化是 50%或更低，第一模式選自親水和疏水的部分組成的組，并且第二模式選自羧基、吡啶基和配體組成的組。
25.權(quán)利要求1的方法，其中所述聚合物選自季銨化的聚乙烯基吡唆、聚乙烯胺、聚烯丙基胺、聚(二烯丙基二甲基氯化銨)和聚(甲基丙烯酰丙基三甲基氯化銨)組成的組，第一模式選自親水和疏水的部分組成的組，并且第二模式選自羧基、吡啶基和配體組成的組。
26.權(quán)利要求1的方法，其中所述聚合物選自季銨化的聚乙烯基吡啶、聚乙烯胺、聚烯丙基胺、聚(二烯丙基二甲基氯化銨)和聚(甲基丙烯酰丙基三甲基氯化銨)組成的組，第一模式選自親水和疏水的部分組成的組，并且第二模式選自羧基、吡啶基和配體組成的組， 所述配體選自由蛋白A、蛋白G、MEP和MAB組成的組。
全文摘要
本發(fā)明涉及雙模式(bimolar)聚合物如可溶性聚合物，其能夠在含有未澄清的生物材料的流(stream)中不可逆地結(jié)合不可溶的粒子以及可溶性雜質(zhì)的亞集，并且還能可逆地結(jié)合一或多種期望的生物分子；以及涉及使用此種材料來從此種流中純化一或多種期望的生物分子而無需預(yù)先澄清的方法。此種聚合物包含帶電側(cè)基的域如伯胺、仲胺、叔胺或季胺，例如季銨化的胺、吡啶、咪唑和三嗪(第一模式)，并且僅僅在與足以形成聚集體的量的帶相反電荷的固體粒子和部分可溶雜質(zhì)復合后，變得不可溶并從溶液中沉淀出來，其中所述聚集體不能繼續(xù)被維持在溶液中。該聚合物還包含其它的側(cè)基，所述側(cè)基是帶電或不帶電的、親水的或疏水的、或者具有配體，所述配體依賴于過程中的條件如pH、離子強度、鹽等而對于感興趣的生物分子是選擇性的(第二模式)。當以一種形式存在時，例如不帶電的形式，所述側(cè)基能夠結(jié)合未澄清的細胞培養(yǎng)液中的所述流內(nèi)的一或多種期望的生物分子(蛋白、多肽等)。繼而可將沉淀從所述流中去除，如通過從所述流的殘余物中過濾出來，并回收期望的生物分子，如通過選擇性洗脫。
文檔編號C07K1/32GK102256993SQ200980150821
公開日2011年11月23日 申請日期2009年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月16日
發(fā)明者J·賈比爾, W·莫亞 申請人:米利波爾公司