專利名稱：制備比伐盧定的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及比伐盧定的新型的匯聚合成方法，比伐盧定是具有下式的20-mer肽H-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Glyi0-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OH(I)本發(fā)明還涉及一些作為比伐盧定合成中的中間體的受保護的肽。
背景技術(shù)：
由凝血酶介導(dǎo)的蛋白酶解處理是控制血液凝固的關(guān)鍵。水蛭素是潛在的臨床凝血酶肽抑制劑，其是由65個氨基酸組成。但是也有更短的肽片段已被證明對血栓形成(危及生命的病征)是有效的。US 5，196，404公開了比伐盧定，其是這些更短的多肽中的一種，并且是強效的凝血酶抑制劑。比伐盧定也被稱為水蛭肽-8 (hirulog-8)、BG-8967、Efludan、Angiomax
或者Hirulog 并具有在式I中給出的氨基酸序列。WO 98/50563描述了用于通過重組技術(shù)制備包括比伐盧定的各種肽的方法。所述方法包括表達作為融合蛋白一部分的肽，然后通過?；荏w使所述肽從所述融合蛋白釋放。Okayama 等.Chem. Pharm. Bull. 1996，44，1344-1350，禾口 Steinmetzer 等.Eur. J. Biochem. 1999，265, 598-605設(shè)計了在王氏樹脂上采用固相合成各種水蛭肽。所述王氏樹脂需要采用濃的三氟乙酸將所述肽從所述樹脂上裂解下來。在用于制備比伐盧定的類似的固相合成方法中，WO 91/02750公開了以下的連續(xù)方法將單個Boc-保護的氨基酸連接至 Boc-L-亮氨酸-ο-二乙烯苯樹脂，然后通過采用HF/對甲酚/乙基甲基硫酸鹽同時脫保護和脫除，并且隨后是冷凍干燥和純化。在兩種情況下，從所述樹脂上裂解所述肽需要強酸條件，而強酸條件可能會引起全部的脫保護并且可能導(dǎo)致不希望的氨基酸殘基的副反應(yīng)，因此負面影響了產(chǎn)品的純度。此外，在固相合成中通常由氨基酸的錯誤摻入、單個氨基酸的重復(fù)連接(double-hits)和/或外消旋化作用引起副反應(yīng)，并產(chǎn)生具有與所述目標(biāo)肽的結(jié)構(gòu)非常相似的結(jié)構(gòu)的副產(chǎn)物。因此純化方法變得艱巨并導(dǎo)致產(chǎn)率降低。尤其是更長的多肽在仍與固體載體連接時易于采取不規(guī)則的構(gòu)象，這使其更難于連接其它的氨基酸至所述增長的鏈。因此，該問題隨著所述肽的長度增加而變得更為嚴重。WO 2007/033383公開了基于固相合成或固相合成和溶液法合成的組合(混合方法)的用于制備比伐盧定的方法。在一實施方式中，在超酸不穩(wěn)定的樹脂上制備比伐盧定肽序列。在另一實施方式中，通過使側(cè)鏈保護的N-末端肽片段與側(cè)鏈保護的C-末端肽片段偶聯(lián)來制備比伐盧定，并且隨后采用強酸條件脫保護。在這種情況下，所述N-末端片段和所述C-末端片段的前體(即肽序列減去亮氨酸)均由固相合成制備。該策略的一個缺點是大量形成D-Tyr19--比伐盧定。該雜質(zhì)難以去除，因此需要額外的勞動、成本以及損失產(chǎn)量來獲得純化的產(chǎn)物。另外，在WO 2007/033383的實施例中得到的純化的比伐盧定的量僅在克的范圍內(nèi)，這表明該方法不適于大規(guī)模制備具有良好的純度的比伐盧定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供用于工業(yè)規(guī)模化生產(chǎn)的、可克服線性、固相合成的公知的缺點并且更有效合成比伐盧定的方法。已通過根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法、權(quán)利要求19所述的肽片段和權(quán)利要求四所述的這些肽片段的用途實現(xiàn)該目的。優(yōu)選的實施方式組成了從屬權(quán)利要求2-18和20-28的主題。本發(fā)明涉及遵循匯聚方法(即分別合成各片段然后在溶液相中偶聯(lián)以構(gòu)成目標(biāo)肽)的方法。匯聚合成的急待解決的問題是找到合適的片段以及它們的偶聯(lián)順序以克服匯聚合成的公知的缺點。這些缺點是在偶聯(lián)和分離期間的溶解度問題、與固相合成相比更低的反應(yīng)率以及在偶聯(lián)期間所述C-末端片段的更高的外消旋化風(fēng)險。比伐盧定由20個氨基酸殘基組成，以致于存在大量的可能的片段和偶聯(lián)順序。此外，比伐盧定包含有7個氨基酸殘基，即-Arg3-、-Asn9-, -Asp11-、-Glu13-, -Glu14-, -Glu17-和-Glu18-，所有這些氨基酸殘基都具有需要適當(dāng)?shù)谋Ｗo和脫保護的反應(yīng)性側(cè)鏈官能團。所述相同的問題適用于單個片段的 N-末端和C-末端的適當(dāng)?shù)谋Ｗo和脫保護，因此增加了尋找可實現(xiàn)本發(fā)明的目的的路線艱巨性。申請人:意外的發(fā)現(xiàn)通過采用如下文中所描述的[(1+ + (3+{4+5})]策略可方便地構(gòu)建式I的比伐盧定。數(shù)字1、2和5代表式V、VI和X的三個肽片段，數(shù)字3代表式XIII 的天冬氨酸衍生物以及數(shù)字4代表式XI的苯丙氨酸衍生物。本發(fā)明涉及用于在溶液相中制備式I的比伐盧定的方法，其包括以下步驟(a)使其中Pl為保護基團的式(V)的可選地側(cè)鏈保護的肽Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OH(SEQ ID NO 4) (V)，與其中P2為保護基團的式(VI)的可選地側(cè)鏈保護的肽H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2(SEQ ID NO 5) (VI)反應(yīng)，以制備其中Pl和P2為如上定義的式(VII)的可選地側(cè)鏈保護的肽Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2 (SEQ ID NO 2) (VII)，(b)除去在步驟(a)中制備的肽的P2，以制備其中Pl為如上定義的式(II)的可選地側(cè)鏈保護的肽Pl-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH(SEQ ID NO 2) (II)，(c)使其中P3為保護基團的式⑴的側(cè)鏈保護的肽H-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 8)(X)，與其中P4為保護基團的式(XI)的苯丙氨酸P4-Phe12-0H(XI)反應(yīng)，以制備其中P3和P4為如上定義的式(XII)的側(cè)鏈保護的肽P4-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 9) (XII)，(d)除去在步驟(c)中制備的肽的P4，以制備相應(yīng)的式(XII)的N-末端脫保護的側(cè)鏈保護的肽，(e)使在步驟(d)中制備的式XII的肽與其中P5為保護基團的式(XIII)的側(cè)鏈保護的天冬氨酸反應(yīng)P5-Aspn-0H(XIII),以制備其中P3和P5為如上定義的式(XIV)的側(cè)鏈保護的肽P5-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 3) (XIV)，(f)除去在步驟(e)中制備的肽的P5，以制備其中P3為如上定義的式(III)的側(cè)鏈保護的肽H-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 3) (III)，(g)使在步驟(b)中制備的式II的可選地側(cè)鏈保護的肽與在步驟(f)中制備的式 (III)的側(cè)鏈保護的肽反應(yīng)，以制備其中Pl和P3為如上定義的式(IV)的側(cè)鏈保護的肽Pl-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Glyi0-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID NO 1)(IV)，(h)除去在步驟(g)中制備的肽的PI、P3和側(cè)鏈保護基團，以制備式⑴的比伐盧定。本發(fā)明的方法可以通過匯聚片段合成而非常高效地合成比伐盧定，這可容易地適用于工業(yè)規(guī)模化生產(chǎn)。所述C-末端保護基團P2 (針對肽VI)和P3 (針對肽X)可以是與其它保護基團的正交性相一致的任意保護基團。適當(dāng)?shù)膶嵤├强赏ㄟ^皂化作用而除去的C-末端保護基團像甲基(Me)或乙基 t)，或者可通過催化氫化反應(yīng)而除去的C-末端保護基團。在本發(fā)明的方法的實施方式中，在步驟(a)中，保護基團Pl是對催化氫化反應(yīng)穩(wěn)定的保護基團，而保護基團P2是可通過催化氫化反應(yīng)除去并且與可選地側(cè)鏈保護基團正交的保護基團；在步驟(c)中，保護基團P3是可通過催化氫化反應(yīng)除去的保護基團，而保護基團P4是與式X的肽的側(cè)鏈保護基團正交的且與P3正交的保護基團；以及在步驟(e)中， 保護基團P5是與式XII和式XIII的肽/氨基酸的側(cè)鏈保護基團正交的保護基團或者與P3 正交的保護基團，提供包括以下步驟的溶液相方法(a)使其中Pl為對催化氫化反應(yīng)穩(wěn)定的保護基團的式(V)的可選地側(cè)鏈保護的肽Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OH(SEQ ID NO 4)(V)，與式(VI)的可選地側(cè)鏈保護的肽反應(yīng)H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2 (SEQ ID NO 5) (VI)，其中P2為可通過催化氫化反應(yīng)而除去的并且與可選的側(cè)鏈保護基團正交的保護基團，以制備其中Pl和P2為如上所述的式(VII)的可選地側(cè)鏈保護的肽Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2 (SEQ ID NO 2) (VII)，(b)除去步驟(a)中制備的肽的P2，以制備其中Pl為如上定義的式(II)的可選地側(cè)鏈保護的肽Pl-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH(SEQ ID NO 2)
(II)，(c)使其中P3為可通過催化氫化反應(yīng)除去的保護基團的式(X)的側(cè)鏈保護的肽H-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 8)(X)，與其中P4為與式X的肽的側(cè)鏈保護基團正交的以及與P3正交的保護基團的式
(XI)的苯丙氨酸P4-Phe12-0H(XI)反應(yīng)，以制備其中P3和P4為如上定義的式(XII)的側(cè)鏈保護的肽P4-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 9)
(XII)，(d)除去步驟(c)中制備的肽的P4，以制備相應(yīng)的N-末端脫保護的式(XII)的側(cè)鏈保護的肽，(e)使步驟(d)中制備的式XII的肽與式(XIII)的側(cè)鏈保護的天冬氨酸反應(yīng)P5-Aspn-0H(XIII),其中P5為與式XII和式XIII的肽/氨基酸的側(cè)鏈保護基團正交的以及與P3正交的保護基團，以制備其中P3和P5為如上定義的式(XIV)的側(cè)鏈保護的肽P5-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 3) (XIV)，(f)除去步驟(e)中制備的肽的P5，以制備其中P3為如上定義的式(III)的側(cè)鏈保護的肽H-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 3)
(III)，(g)使步驟(b)中制備的式II的可選地側(cè)鏈保護的肽與步驟(f)中制備的式 (III)的側(cè)鏈保護的肽反應(yīng)，以制備其中Pl和P3為如上定義的式(IV)的側(cè)鏈保護的肽Pl-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Cly-Cly-Cly-Asn-Clyi0-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15 -Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID NO 1)(IV)，(h)除去步驟(g)中制備的肽的PI、P3和側(cè)鏈保護基團，以制備式⑴的比伐盧
定H-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Glyi0-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-P ro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OH (SEQ ID NO 1)。在這里以及下文中，術(shù)語“正交”作為兩個不同的保護基團的行為的描述特征，應(yīng)被理解為是指一個保護基團可通過不會影響另一保護基團的某種方法裂解。例如，“與側(cè)鏈保護基團正交的保護基團”是指可通過不會影響所述側(cè)鏈保護基團的某種方法裂解的保護基團。該策略的優(yōu)點是其可在工業(yè)規(guī)模上應(yīng)用，因此可制備具有優(yōu)異純度的比伐盧定且每批的制備得到的比伐盧定的數(shù)量為千克級，并且不會形成像D-Phe12-比伐盧定、D-Tyr19-比伐盧定或者Asp9-比伐盧定的不需要的雜質(zhì)。例如，當(dāng)使保護的片段Asp-Phe12 與式X的保護的肽片段偶聯(lián)時，可形成5% D-Phe12-比伐盧定，而該形成可意外地通過本發(fā)明的方法而抑制。如在本發(fā)明的方法中所應(yīng)用的催化氫化反應(yīng)具有的優(yōu)點是不像其它脫保護方法，該催化氫化反應(yīng)是非常干凈的反應(yīng)方法，其不會誘導(dǎo)碳正離子的形成，因此不會形成不需要的從所述碳正離子和目標(biāo)肽之間的反應(yīng)產(chǎn)生的副產(chǎn)物。為了比較，在WO 2007/033383中公開的路線中是通過采用叔丁基(tBu ；如叔丁基醚或如叔丁基酯)實現(xiàn)保護，這是僅可通過酸水解(例如采用鹽酸或三氟乙酸)而裂解的保護基團。所述酸水解誘導(dǎo)副產(chǎn)物(例如叔丁酯化的酪氨酸)的形成，由于所述副產(chǎn)物與最終產(chǎn)物的物理化學(xué)性質(zhì)相似，在最終產(chǎn)物中難以除去所述副產(chǎn)物。酸水解的另一個缺點是處理大量的強酸(例如三氟乙酸)，會引發(fā)生產(chǎn)和環(huán)境的安全問題，尤其是在工業(yè)規(guī)模上的生產(chǎn)和環(huán)境的安全問題。為了進一步比較，如果可通過皂化反應(yīng)除去的C-末端保護基團(例如Et)被用作為用于式VI和式VII的肽的P2，其在堿性條件下的去除會誘導(dǎo)天冬酰胺殘基(-Asn9-)和精氨酸殘基(-Arg3-)大量裂解。即使皂化反應(yīng)不是采用酸或采用堿來完成的，而是采用更溫和的酶促反應(yīng)的方法(例如采用枯草桿菌蛋白酶進行皂化反應(yīng))來完成，也可觀察到由所述天冬酰胺殘基的裂解而引起Asp9-比伐盧定的大量形成。在本發(fā)明的各單個反應(yīng)步驟之前、期間和之后，所有的肽片段以及所有的偶聯(lián)產(chǎn)物可以本身的形式或以適當(dāng)?shù)柠}形式存在，這取決于所述分子的物理化學(xué)性質(zhì)和/或反應(yīng)條件。合適的鹽為例如與三乙胺(TEA)、二環(huán)己胺(DCHA)、鹽酸(HCl)和三氟乙酸(TFA)形成的鹽。在步驟(h)中，P1、P3和側(cè)鏈保護基團可在以后或者同時被除去。優(yōu)選地，在步驟(h)中，首先同時除去P3和側(cè)鏈保護基團，然后除去P1。通常，在進行下一步驟之前會將步驟(a)至(g)中的每一個步驟之后得到的肽片段進行分離。申請人意外的發(fā)現(xiàn)在步驟(h)中，在同時除去P3和側(cè)鏈保護基團后得到的肽的分離在除去Pl之前可以被免除，而得到相似的收率并且對純度不產(chǎn)生負面影響。這是令人驚訝的，因為正常情況下分離步驟是必不可少的以除去副產(chǎn)物，所述副產(chǎn)物可能也在下一步脫保護步驟反應(yīng)并因此降低目標(biāo)肽的純度。由于分離通常必然伴隨有產(chǎn)品的損失，因此這個發(fā)現(xiàn)對整個方法的成本和時間具有積極的影響，并且通常產(chǎn)生更高產(chǎn)量的pi-脫保護的肽。因此，在本發(fā)明所述的方法的更優(yōu)選的實施方式中，在步驟(h)中，在同時除去P3 和側(cè)鏈保護基團后得到的肽在除去Pl之前不進行分離。任意公知的對催化氫化反應(yīng)穩(wěn)定的保護基團可用作為P1。合適的實施例為叔丁氧基羰基(Boc)、2-( 二苯基-4-基)丙-2-基氧基羰基(Bpoc)、2_ (3，5-二甲氧基苯基) 丙-2-基氧基羰基(Ddz)、芴-9-基甲氧基羰基(Fmoc)、金剛烷-1-氧基羰基(Adc)、叔-戊基氧基羰基(Aoc)、二苯基氧膦基(Dpp)、2-(甲磺?；?乙氧基羰基(Msc)和鄰苯二甲?；?(Pht)。優(yōu)選地，Pl 為 Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc 或 Msc，更優(yōu)選地 Pl 為 Boc。任意分別與式II的片段(針對P4)、式XIII的氨基酸和式XIV的片段(針對P5) 的側(cè)鏈保護基團正交的以及與P3正交的公知的合適的保護基團可用作為保護基團P4和 P5。優(yōu)選地，P4和P5對催化氫化反應(yīng)穩(wěn)定并與側(cè)鏈保護基團正交以及與P3正交。例如， 合適的保護基團是 Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc、Adc、Aoc、Dpp、Msc 和 Pht。優(yōu)選地，P4 禾Π / 或 P5 是 Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc 或 Msc ；更優(yōu)選地 P4 和 / 或 P5 是 Boc。
在本發(fā)明所述的方法的一優(yōu)選實施方式中，P1、P4和P5中的至少一個是Boc、 Bpoc、Ddz、Fmoc或Msc ；優(yōu)選P1、P4和P5中的至少一個是Boc。任意可通過催化氫化反應(yīng)除去的公知的保護基團可用作為保護基團P3。合適的實施例是芐基(Bzl)、芐基氧基甲基(Bom)、苯甲?；?Pac)、4-硝基芐基(ONbz)、4_吡啶基甲基(Pic)以及4-磺酸基芐基。優(yōu)選地，P3是BzLBonKl^GONbLPic或4-磺酸基芐基，條件是如果P4或P5是Boc、Bpoc或Ddz，P3不是Bom。更優(yōu)選地，P3是Bzl。保護基團Bom 是對酸敏感的，而保護基團Boc、Bpoc和Ddz由酸裂解，即Bom與Boc、Bpoc或Ddz是不正交的。在這里和下文中，這個行為排除了同時采用Bom和保護基團B0C、Bp0C或Ddz中之一。任意可通過催化氫化反應(yīng)除去的——以及在側(cè)鏈保護的情況下，同時與側(cè)鏈保護基團正交的——公知的保護基團可用作為保護基團P2。合適的實施例是Bzl、Bom, Pac, ONbz、Pic和4-磺酸基芐基。優(yōu)選地，P2是Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic或4-磺酸基芐基；更優(yōu)選地，P2是Bzl。在一優(yōu)選實施方式中，P2和P3中的至少一個是Bz 1、Bom、I^ac、ONbz、Pic或4_磺酸基芐基，條件是，如果P4或P5是Boc、Bpoc或Ddz，P3不是Bom。優(yōu)選地，P2和P3中的至少一個是Bzl。在更優(yōu)選的實施方式中，P1、P4和P5中的至少一個是Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc或Msc ； 并且P2和P3中的至少一個是Bzl、Bom、Pac, ONbz、Pic或4-磺酸基芐基，條件是，如果P4 或P5是Boc、Bpoc或Ddz，那么P3不是Bom。優(yōu)選地，P1、P4和P5中的至少一個是Boc而 P2和P3中的至少一個是Bzl。優(yōu)選地，在本發(fā)明所述的方法中，采用選自Bzl、Bom、Pac, ONbz、Pic和4_磺酸基芐基的側(cè)鏈保護基團中的至少一種保護所述式III、IV、X和XII-XIV的側(cè)鏈保護的肽/氨基酸；條件是，如果P4或P5是Boc、Bpoc或Ddz，沒有一個所述側(cè)鏈保護基團是Bom。具體地，在本發(fā)明所述的方法中，采用至少一個Bzl作為側(cè)鏈保護基團保護式 III、IV、X和XII-XIV的側(cè)鏈保護的肽/氨基酸。通常式V的肽是采用諸如硝基的合適的側(cè)鏈保護基團在精氨酸殘基側(cè)鏈保護的， 以避免不需要的副反應(yīng)。通常，式VI的肽是采用合適的側(cè)鏈保護基團在天冬酰胺殘基側(cè)鏈保護的，特別是采用iconic對N-末端保護，以避免不需要的副反應(yīng)。合適的實施例是三苯甲基(Trt)，尤其是采用!^mc對N-末端保護的情況下。意外地，申請人發(fā)現(xiàn)對于式V和VI的肽，可以免除側(cè)鏈保護，這使得它們的組裝和它們的偶聯(lián)產(chǎn)物(式VII的肽)的C-末端脫保護變得更為容易。這個發(fā)現(xiàn)允許不考慮C 末端和側(cè)鏈保護之間的正交，因而使得所述路線更為簡單。另一個優(yōu)點是相應(yīng)的未保護的起始原料在購買時比保護的起始原料更便宜，這特別是對于大規(guī)模生產(chǎn)是重要的。優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法中，在步驟(a)中式V和VI的可選地側(cè)鏈保護的肽中的至少一種是側(cè)鏈未保護的。假如肽均是側(cè)鏈未保護的，在步驟(a)和(b)中得到的式VII 和II的肽也是側(cè)鏈未保護的。更優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法中，在步驟(a)中，式V和VI的肽都是側(cè)鏈未保護的；在步驟(C)中，采用選自Bzl、 Bom、Pac, ONbz、Pic和4_磺酸基芐基的側(cè)鏈保護基團中的至少一種保護式X的肽，優(yōu)選是 Bzl，條件是，如果P4和P5是Boc、Bpoc或Ddz，沒有一個所述側(cè)鏈保護基團是Bom ；以及
在步驟(e)中，采用選自BZl、BOm、I^C、0NbZ、PiC和4_磺酸基芐基的側(cè)鏈保護基團保護式XIII的天冬氨酸衍生物，優(yōu)選是Bzl，條件是，如果P4和P5是Boc、Bpoc或Ddz， 沒有一個所述側(cè)鏈保護基團是Bom。甚至更優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法中，在步驟(a)中，式V和VI的肽均是側(cè)鏈未保護的；并且在步驟(c)和(e)中，至少一個側(cè)鏈保護基團是Bzl。在本發(fā)明的方法的最優(yōu)選的實施方式中，在步驟(C)中，采用五個側(cè)鏈保護基團保護四個谷氨酸的側(cè)鏈和酪氨酸的側(cè)鏈來保護式X的肽，因此提供式(Xb)的肽H-Glu (0P6) -Glu (0P7) -Ile15-Pro-Glu (0P8) -Glu (0P9) -Tyr (PlO) -Leu20—0P3 (SEQ ID 8) (Xb),其中P3是可采用催化氫化反應(yīng)除去的保護基團，優(yōu)選地P3是BZl、Bom、I^C、0NbZ、 Pic或4-磺酸基芐基；更優(yōu)選地P3是Bzl ；以及P6至PlO中的每一個獨立地選自Bzl、Bom、Pac, ONbz、Pic和4-磺酸基芐基；優(yōu)選地P6至PlO中的每一個是Bzl ；以及在步驟(e)中式XIII的側(cè)鏈保護的天冬氨酸是P5-Asp (OP 11)η-0Η,其中P5是與式XII和XIII的肽/氨基酸的側(cè)鏈保護基團正交的以及與P3正交的保護基團；優(yōu)選地P5對催化氫化反應(yīng)穩(wěn)定，并且與所述側(cè)鏈保護基團正交以及與P3正交；更優(yōu)選地P5是Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc或Msc ；最優(yōu)選地P5是Boc ；以及Pll是選自俶1、 Bom、Pac、ONbz、Pic和4-磺酸基芐基；優(yōu)選地，Pll是俶1。這里以及下文中，對于C-末端和側(cè)鏈，縮寫“0P [編號]”表示酯(在所述側(cè)鏈和C 末端的羧酸都反應(yīng)后)，而縮寫“P[編號]”表示醚。例如，“OBzl”表示芐酯(在與側(cè)鏈或 C末端的羧基反應(yīng)后)，而縮寫“Bzl ”表示二甲苯醚(在與例如酪氨酸的酚羥基反應(yīng)后)。優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法中，P1、P4和 P5 是 Boc ；P2、P3、P6、P7、P8、P9、P10 和 Pll 是 Bzl ；更優(yōu)選地，PI、P4和 P5 是 Boc, P2、P3、P6、P7、P8、P9、PlO 和 Pll 是 Bzl，并且式 V 和VI的肽是側(cè)鏈未保護的，提供包括以下步驟的溶液相方法(a)使Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OH (SEQ ID NO 4)與H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzKSEQ ID NO 5)反應(yīng)以制備Boc-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzKSEQ ID NO 2)(b)除去步驟(a)中制備的肽的Bzl以制備Boc-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH (SEQ ID NO 2)，(c)使H-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Ile15-Pro-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu20-OBz 1(SEQ ID 8)與Boc-Phe12-OH反應(yīng)以制備
Boc-Phe-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Ile15-Pro-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) ~Tyr (Bzl) -Le U20-OBzl (SEQ ID NO 9)，(d)除去步驟(c)中制備的肽的Boc以制備相應(yīng)的N末端脫保護的肽，(e)使步驟(d)中制備的肽與Boc-Asp (OBzD11-OH反應(yīng)以制備Boc-Asp (OBzl) "-Phe-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Ile15-Pro-Glu (OBzl) -Glu (OBzl)-Tyr (Bzl)-Leu20-OBzl (SEQ ID NO 3)(f)除去步驟(e)中制備的肽的Boc以制備H-Asp (OBzl) "-Phe-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Ile15-Pro-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Ty r (Bzl)-Leu20-OBzl (SEQ ID NO 3)(g)使在步驟(b)中制備的肽與步驟(f)中制備的肽反應(yīng)以制備Boc-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp (OBzl) -Phe-Glu (0B zl) -Glu (OBzl) -Ile15-Pro-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl (SEQ ID NO 1)， 以及(h)除去在步驟(g)中制備的肽的Boc、C末端保護的Bzl和所有的側(cè)鏈保護的Bzl， 以制備式I的比伐盧定。該優(yōu)選的實施方式是非常簡單的并且不需要復(fù)雜的保護基團策略。優(yōu)選地，在步驟(h)中，首先同時除去C末端保護的Bzl和所有側(cè)鏈保護的Bzl，得到N末端Boc保護的比伐盧定Boc-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Glyi0-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile1 5-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OH(SEQ ID NO 1)，并且然后去除 Boc。優(yōu)選地，在同時除去C末端保護的Bzl和所有的側(cè)鏈保護的Bzl之后得到的N末端Boc保護的比伐盧定在除去Boc之前不需要分離。C末端保護的基團P2、P3以及P6至Pll的側(cè)鏈保護基團，在它們是可通過催化氫化反應(yīng)去除的情況下，可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任意催化氫化反應(yīng)的方法來去除。氫化反應(yīng)可通過采用氫元素或采用合適的供氫體(例如甲酸、甲酸銨、1，3_環(huán)己二烯、1，4_環(huán)己二烯或硼烷加合物(例如叔-BuNH2 · BH3))來完成。合適的氫化反應(yīng)催化劑為例如貴金屬基氫化反應(yīng)催化劑，尤其是被稱為鉬系金屬(即銠、釕、鈀、鋨、銥和鉬)的金屬。方便地， 所述氫化反應(yīng)催化劑是位于例如炭的載體上。根據(jù)所需要的活性，可以使所述氫化反應(yīng)催化劑“中毒”特別是硫化以降低其活性。可選地，可以添加合適的共催化劑以支持氫化反應(yīng)。所述共催化劑可以是釩或鉬化合物，例如五氧化二釩(V2O5)、偏釩酸銨(NH4VO3)或鉬酸鈉(Na2MoO4)t5在一優(yōu)選實施方式中，催化劑被回收，這對于生產(chǎn)成本和環(huán)境均具有積極的影響。 對于催化劑的回收，可采用任意適于回收催化劑的處理方法。優(yōu)選地，所述去除的步驟(b)和(h)中的至少一個是在溶劑中與氫氣和鈀/炭一起實施的。作為溶劑，可采用任意可溶解反應(yīng)物的惰性液體溶劑?？刹捎玫娜軇┌u代芳香烴(例如氯苯和三氟甲苯)；鹵代烴(例如二氯甲烷和二氯乙烯)；醇(例如甲醇、乙醇、2-丙醇、丁醇和苯甲醇)；鹵代醇(例如2，2，2_三氟乙醇)；羧酸(例如乙酸)；羧酸酯和內(nèi)酯(例如乙酸乙酯、乙酸甲酯和戊內(nèi)酯)；以及包含有雜原子的有機溶劑(例如N-甲基吡咯烷酮(NMP)或N，N-二甲基甲酰胺(DMF))。所述溶劑可以單獨、或者作為溶劑混合物或者作為與水的混合物來使用。根據(jù)肽片段的溶解度，甚至可以僅采用水作為溶劑。因此，在步驟(b)中的去除可以在僅采用水的溶劑中完成。優(yōu)選的溶劑選自DMF、丙酮、乙酸、丙酮和水的混合物以及乙酸和水的混合物。在一優(yōu)選實施方式中，所述去除的步驟(b)是在選自DMF、丙酮、水、丙酮和水的混合物的溶劑中進行；尤其是在DMF中進行的。更優(yōu)選地，所述去除的步驟(b)是在DMF中進行的。意外地，已發(fā)現(xiàn)在去除步驟 (b)中采用的溶劑對最終的比伐盧定的雜質(zhì)分布(impurity profile)有影響。已觀察到， 與例如丙酮和水的混合物相比較，DMF是有利的，以至于可以抑制在-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10- (SEQ ID NO 2)的雙摻入之后的雜質(zhì)的形成。在另一優(yōu)選實施方式中，所述去除步驟(h)在乙酸或乙酸和水的混合物中進行； 具體在乙酸和水的混合物中進行。所述去除步驟(b)和(h)的氫化方法可在大氣壓或超大氣壓下進行。通常的壓力為1至lOObar。有利地，采用1至70bar ；具體地采用2至lObar。所述去除步驟(b)和(h)的氫化反應(yīng)可在低溫或升高的溫度下進行。示例性的溫度為-20°C至70°C。優(yōu)選的溫度是0°C至60°C，而更優(yōu)選的溫度是10°C至40°C。本發(fā)明的方法的偶聯(lián)步驟(a)、(c)、(e)和(g)在溶液相中進行，并且在采用在肽合成領(lǐng)域中公知的反應(yīng)條件下進行。各個側(cè)鏈未保護的或保護的肽片段/氨基酸衍生物的偶聯(lián)可采用原位偶聯(lián)試劑可選地作為像鹽酸鹽一樣的鹽來完成，所述原位偶聯(lián)試劑例如為磷鐺(phoshonium)偶聯(lián)試劑或脲(uronium)偶聯(lián)試劑，例如苯并三唑基氧基-三(二甲基氨基)磷鐺六氟磷酸鹽(BOP)、苯并三唑-1-基氧基-三(吡咯烷基)磷鐺六氟磷酸鹽(PyBOP)、0-(苯并三唑-1-基)-1，1，3，3_四甲基脲六氟硼酸鹽(HBTU)、0-(6-氯苯并三唑-1-基)-1，1，3，3_四甲基脲六氟硼酸鹽(HCTU)、0-(6-氯苯并三唑-1-基)-1，1，3， 3-四甲基脲四氟硼酸鹽(TCTU)、0-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-1，1，3，3_四甲基脲六氟硼酸鹽(HATU)、0-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸鹽(TATU)、0_(苯并三唑-1-基)-1，1，3，3_四甲基脲四氟硼酸鹽(TBTU)以及0-[氰基-(乙氧基羰基)甲基氨基]-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸鹽(TOTU)、或碳二亞胺偶聯(lián)試劑，例如二異丙基碳二亞胺(DIC)、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和水溶的碳二亞胺(WS⑶I)例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)。其它的偶聯(lián)方法采用預(yù)先制備的活性酯(N-羥基丁二酰亞胺(HOSu)和對硝基苯酚(HONp)酯)、預(yù)先制備的對稱的酸酐、不對稱的酸酐例如N-羧酸酐(NCAs)和酰氯(例如酰氟或酰氯)。優(yōu)選的偶聯(lián)試劑是碳二亞胺偶聯(lián)試劑，最優(yōu)選的是 DIC或EDC，合適的作為EDC鹽例如EDC · HCl。所述偶聯(lián)步驟(a)、(c)、(e)和(g)的反應(yīng)混合物可有利地包含有堿，優(yōu)選叔胺堿， 其可以將羧基組分去質(zhì)子化并中和氨基組分的平衡離子，從而促進了所述原位反應(yīng)。合適的堿是例如三烷基胺(例如N，N-二異丙基乙胺(DIPEA)或三乙胺(TEA)) ；N，N-二烷基苯胺(例如N，N-二乙基苯胺)；2，4，6_三烷基吡啶(例如2，4，6_三甲基吡啶)；以及N-烷基嗎啉(例如N-甲基嗎啉)。特別是，所述反應(yīng)混合物有利地包含有作為堿的TEA或DIPEA。所述偶聯(lián)步驟(a)、(C)、(e)和(g)的反應(yīng)混合物還可包含有輔助的親和試劑作為添加劑，這是因為所述輔助的親和試劑在抑制不希望的副反應(yīng)方面有積極作用?？刹捎萌我夤妮o助親和試劑。合適的輔助的親和試劑的實施例是1-羥基苯并三唑(HOBt)、 N-羥基丁二酰亞胺(HOSu)、N-羥基-3，4-二氫-4-氧代-1，2，3-苯并三唑(HOOBt)和1-羥基-7-氮雜苯并三唑(HOAt)。優(yōu)選地，所述偶聯(lián)步驟的反應(yīng)混合物還包含有HOBt。在一優(yōu)選的具體實施方式
中，所述偶聯(lián)步驟(a)、(c)、(e)和(g)的偶聯(lián)混合物選自 DIC/HOBt/TEA、EDC/HOBt/DIPEA 和 EDC/HOBt/TEA。作為偶聯(lián)步驟(a)、(c)、(e)和(g)的溶劑，可采用可溶解反應(yīng)物的任意惰性液體溶劑。可采用的偶聯(lián)溶劑是水溶性溶劑(例如二甲亞砜(DMSO)、二氧六環(huán)、四氫呋喃(THF)、 1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、N, N- 二甲基甲酰胺(DMF)、N, N- 二甲基乙酰胺(DMA)或它們的任意混合物)；非水溶性溶劑(例如二氯甲烷(DCM)、乙酸乙酯或它們的任意混合物)；以及在水溶性溶劑和非水溶性溶劑之間的任意合適的混合物(包括與水的混合物)。優(yōu)選的溶劑是DMF或DMF和水的混合物。所述步驟(d)、(f)和(h)的N-末端脫保護可采用在肽合成領(lǐng)域中公知的反應(yīng)條件下并根據(jù)保護基團PI、P4和P5的性質(zhì)來進行。在保護基團為Boc的情況下，脫保護可適當(dāng)?shù)夭捎盟?優(yōu)選采用三氟乙酸)來完成，所述酸可單獨使用或者作為與惰性溶劑(例如甲苯、THF或者甲苯和THF的混合物)的混合物而使用。在保護基團是Fmoc的情況下， 可通過與堿(有利地與二級胺例如哌啶或二乙胺)反應(yīng)而實現(xiàn)N-末端的脫保護。通常， N-末端脫保護可在溶劑中進行，所述溶劑可以是不干擾反應(yīng)物的任意溶劑，例如氯代烴例如二氯甲烷；烷基化酰胺和內(nèi)酰胺例如二甲基甲酰胺或1-甲基-2-吡咯烷酮；芳香烴例如甲苯；醚例如THF或它們的任意混合物。優(yōu)選地，所述N-末端Boc基團的脫保護在甲苯或在苯酚、甲苯和THF的混合物中進行。在步驟(h)制備得到的粗品比伐盧定可采用常規(guī)的方法(例如制備級HPLC或反流分布法)來進行純化?？芍貜?fù)進行純化步驟。可對在步驟(a)至(g)之后得到的肽片段采用相同的方法?？筛鶕?jù)在肽化學(xué)中公知的分離方法(例如沉淀或冷凍干燥，冷凍干燥又稱為凍干法)分離式I的最終的比伐盧定。式V和VI的可選地側(cè)鏈保護的肽和式X的側(cè)鏈保護的肽可采用常規(guī)的肽合成方法來制備，所述常規(guī)的肽合成方法為例如溶液相合成(又名均相肽合成，縮寫為HPPS)、 固相肽合成(SPPQ或稱為混合合成的SPPS和HPPS的組合(又名混合相肽合成，縮寫為 MPPS)。在本發(fā)明所述的方法的一實施方式中，通過在前述的方法中采用溶液相合成方法制備式V的可選地側(cè)鏈保護的肽、式VI的可選地側(cè)鏈保護的肽和式X的側(cè)鏈保護的肽中的至少一種。優(yōu)選地，這些肽以相應(yīng)的二肽(即序列模式-D-Phe1-Pr0^-Arg3-Pr0-A-Gly5-Gl y-、-Gly7-Gly-、-Asn9-Gly-、-Glu13-Glu-、-Ile15-Pro-、-GIu17-GIu-或-Tyr19-Leu-)為起始進行組裝。所述N-末端保護基團、C-末端保護基團和側(cè)鏈保護基團以及反應(yīng)條件可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，優(yōu)選為與上述相同或者相似。具體地，用于在溶液相中制備式(V)的可選地側(cè)鏈保護的肽的方法Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OH(SEQ ID NO 4) (V)，優(yōu)選為側(cè)鏈未保護的肽Va，其中
Pl是保護基團，優(yōu)選Pl是對催化氫化反應(yīng)穩(wěn)定的保護基團，更優(yōu)選地Pl是Boc、 Bpoc、Ddz、Fmoc 或 Msc，最優(yōu)選地 Pl 是 Boc ；所述方法包括以下步驟(a)除去式(XVI)的可選地側(cè)鏈保護的二肽的P12P12-Arg-Pro4-0P13(XVI),優(yōu)選為側(cè)鏈未保護的二肽XVIa，其中P12是保護基團，優(yōu)選P12是與側(cè)鏈保護基團正交的和與P13正交的保護基團，更優(yōu)選地P12是對催化氫化反應(yīng)穩(wěn)定的并且與側(cè)鏈保護基團正交的和與P13正交的保護基團，甚至更優(yōu)選地？12是800、8 0(；、0(^、？1110(；或1^(；，最優(yōu)選地？12是80(；;以及P13是例如為Bzl、甲基(Me)或乙基(Et)的保護基團；優(yōu)選地P13是可通過催化氫化反應(yīng)除去的并且與側(cè)鏈保護基團正交的保護基團，更優(yōu)選地P13是Bzl、Bom、Pac, ONbz, Pic和4-磺酸基芐基，最優(yōu)選地P13是Bzl ；條件是如果P12是B0C、Bp0C或Ddz，那P13不是Bom;(b)使在步驟(a)中制備的 N-末端脫保護的、可選地側(cè)鏈保護的二肽，優(yōu)選相應(yīng)的側(cè)鏈未保護的二肽，與式(XVII)的可選地側(cè)鏈保護的二肽反應(yīng)Pl-D-Phe1-Pro-Off(XVII),優(yōu)選與側(cè)鏈未保護的二肽XVIIa反應(yīng)，其中Pl為如上定義，且W是氫或預(yù)活化的基團例如五氟苯基(Pfp),以制備式(XV)的可選地側(cè)鏈保護的肽Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-0P13(SEQ ID NO 4) (XV),優(yōu)選所述側(cè)鏈未保護的肽XVa，其中Pl和P13為如上定義，以及(c)除去在步驟(b)中制備的式XV的可選地側(cè)鏈保護的肽的P13，優(yōu)選側(cè)鏈未保護的肽XVa，以制備式V的可選地側(cè)鏈保護的肽；優(yōu)選制備側(cè)鏈未保護的肽Va。還具體地，用于在溶液相中制備式(VI)的可選地側(cè)鏈保護的肽優(yōu)選為側(cè)鏈未保護的肽VIa的方法H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2(SEQ ID NO 5) (VI),其中P2是保護基團，優(yōu)選P2是可通過催化氫化反應(yīng)除去的并且與可選的側(cè)鏈保護基團正交的保護基團，更優(yōu)選地P2是Bz 1、Bom、I^c、ONbz、Pic或4-磺酸基芐基，最優(yōu)選地P2 是 Bzl ；所述方法包括以下步驟(a)除去式(XVIII)的可選地側(cè)鏈保護的二肽優(yōu)選為側(cè)鏈未保護的二肽XVIIIa的 P14P14-Asn-Gly10-OP2(XVIII),
其中P14是保護基團，優(yōu)選P14是與側(cè)鏈保護基團正交的和與P2正交的保護基團，更優(yōu)選地P14是對催化氫化反應(yīng)穩(wěn)定的并且與側(cè)鏈保護基團正交的和與P2正交的保護基團，甚至更優(yōu)選地P14是Boc、Bpoc, Ddz, Fmoc或Msc，最優(yōu)選地P14是Boc ；以及P2為如上定義；條件是，如果？14是徹(、8 0(3或0(12，那么P2不是Bom ；(b)使在步驟(a)中制備的N-末端脫保護的、可選地側(cè)鏈保護的二肽，優(yōu)選側(cè)鏈未保護的二肽，與式(IXX)的四甘氨酸反應(yīng)P15-Gly5-Gly-Gly-Gly-0H (SEQ ID NO 10)(IXX)，其中P15是保護基團，優(yōu)選地P15是與式XX的肽的側(cè)鏈保護基團正交的保護基團，更優(yōu)選地P15是對催化氫化反應(yīng)穩(wěn)定的并且與式XX的肽的側(cè)鏈保護基團正交的保護基團，甚至更優(yōu)選地P15是Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc或Msc，最優(yōu)選地P15是Boc ；以制備式(XX)的可選地側(cè)鏈保護的肽P15-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2(SEQ ID NO 5) (XX)，優(yōu)選所述側(cè)鏈未保護的肽XXa，其中P2和P15為如上定義，條件是，如果？15是800、8 0(；或0(^，那么P2不是Bom以及(c)除去在步驟(b)中制備的式XX的可選地側(cè)鏈保護的肽優(yōu)選側(cè)鏈未保護的肽 XXa的P15，以制備式VI的可選地側(cè)鏈保護的肽；優(yōu)選制備側(cè)鏈未保護的肽Via。進一步具體地，用于在溶液相中制備式(X)的側(cè)鏈保護的肽的方法H-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 8)(X),優(yōu)選為式0(b)的肽H-Glu (0P6) -Glu (0P7) -Ile15-Pro-Glu (0P8) -Glu (0P9) -Tyr (PlO) —Leu20-OP3 (SEQ ID 8) (Xb),其中P3是保護基團，優(yōu)選P3是可通過催化氫化反應(yīng)除去的保護基團，更優(yōu)選地P3是 Bzl.Bom, Pac, ONbz、Pic或4_磺酸基芐基，最優(yōu)選地P3是，和P6至PlO中的每一個獨立地選自^l、Bom、Pac、ONbz、Pic和4_磺酸基芐基，優(yōu)選地P6至PlO的每一個是俶1，所述方法包括以下步驟(a)除去式(VIII)的側(cè)鏈保護的肽的P16P16-Glu-Glu-Ty-Leu20-OP3(SEQ ID NO 6)(VIII),優(yōu)選為式(Vinb)的肽的P16P16-Glu(0P8)-Glu (0P9)-Tyr (PlO)-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 6)(VIIIb),
其中P3和P8至PlO為如上定義，以及P16是保護基團，優(yōu)選P16是與側(cè)鏈保護基團正交的和與P3正交的保護基團，更優(yōu)選地P16是對催化氫化反應(yīng)穩(wěn)定的并且與側(cè)鏈保護基團正交的和與P3正交的保護基團，甚至更優(yōu)選地？16是徹(；、8 0(；、0(^、？1110(；或1^(；，最優(yōu)選地？16是800 ；條件是，如果P16是Boc、Bpoc或Ddz，那么P3不是Bom ；(b)使在步驟(a)中制備的式VIII的N-末端脫保護的、側(cè)鏈保護的二肽，優(yōu)選相應(yīng)的肽Vlllb，與式(IX)的側(cè)鏈保護的肽反應(yīng)P17-Glu-Glu-IIe15-Pro-OH(SEQ ID NO 7)(IX)，優(yōu)選為P17-Glu(0P6)-Glu (0P7)-IIe15-Pro-OH(SEQ ID NO 7) (IXb)，其中P6和P7為如上定義，以及P17是保護基團，優(yōu)選地P17是與側(cè)鏈保護基團正交的保護基團，更優(yōu)選地P17是對催化氫化反應(yīng)穩(wěn)定的并且與側(cè)鏈保護基團正交的保護基團，甚至更優(yōu)選地P17是Boc、 Bpoc、Ddz、Fmoc 或 Msc，最優(yōu)選地 P17 是 Boc ；以制備式(XXI)的側(cè)鏈保護的肽P17-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID NO 8)(XXI)，優(yōu)選為式(XXrt)的肽P17-Glu (0P6) -Glu (0P7) -Ile15-Pro-Glu (0P8) -Glu (0P9) -Tyr (PlO) -Leu20-OP3 (S EQ ID 8) (XXIb),其中P3、P6至PlO和P17為如上定義，條件是，如果P17是Boc、Bpoc或Ddz，那么P3或P6至PlO中的任一個不是Bom， 以及(c)除去在步驟(b)中制備的式XXI的側(cè)鏈保護的肽優(yōu)選為相應(yīng)的肽XXrt的P17， 以制備式X的側(cè)鏈保護的肽；優(yōu)選制備肽脅。在本發(fā)明所述的方法的另一實施方式中，所述肽中的至少一種選自式V的可選地側(cè)鏈保護的肽、式VI的可選地側(cè)鏈保護的肽和式X的側(cè)鏈保護的肽，其是通過在前述的方法中采用溶液相合成方法制備。因此，可采用包括公知的SPPS構(gòu)建塊和SPPS條件的任意公知SPPS方法?？刹捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知的并且可用于制備保護的肽的所有的樹脂。 這里，應(yīng)以寬的方式解釋樹脂。因此，術(shù)語“樹脂”應(yīng)理解為是指例如單獨的固體載體或直接連接至連接子的固體載體，可選地在兩者之間選擇。樹脂可以是不可溶解的或可溶解的。 可溶解的聚合物聚乙二醇(可溶解的PEG聚合物)是可溶解的樹脂固體載體的示例，因此在組裝所述各單個構(gòu)建塊之后形成可溶解的肽-樹脂。優(yōu)選的樹脂是具有三苯甲基或溴二苯甲基的聚苯乙烯基樹脂。三苯甲基樹脂的示例是2-氯三苯甲基氯化物樹脂(CTC樹脂)、 三苯甲基氯化物樹脂、4-甲基三苯甲基氯化物樹脂和4-甲氧基三苯甲基氯化物樹脂。優(yōu)選地，所述CTC樹脂用于合成所述肽片段。
本發(fā)明的另一個目的是提供作為本發(fā)明所述的方法中的中間體的有用的肽。具體地，這些肽中的一種是選自以下的肽(i)式(V)的可選地側(cè)鏈保護的肽Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OH(SEQ ID NO 4)(V)，其中Pl是保護基團，優(yōu)選地Pl是對催化氫化反應(yīng)穩(wěn)定的保護基團，更優(yōu)選地Pl 是80(；、8 0(；、0(^、？1110(；或1^(；，最優(yōu)選地？1是80(；;以及所述肽是采用例如硝基的合適的側(cè)鏈保護基團在精氨酸殘基上可選地側(cè)鏈保護的；(ii)式(VI)的可選地側(cè)鏈保護的肽H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2 (SEQ ID NO 5) (VI)，其中P2是保護基團，優(yōu)選地P2是可通過催化氫化反應(yīng)除去的并且與可選地側(cè)鏈保護基團正交的保護基團，更優(yōu)選地P2是BZl、Bom、I^C、0NbZ、PiC和4-磺酸基芐基，最優(yōu)選地P2是Bzl ；以及所述肽是采用例如三苯甲基(Trt)的合適的側(cè)鏈保護基團在天冬酰胺殘基上可選地側(cè)鏈保護的；(iii)式(VII)的可選地側(cè)鏈保護的肽Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2 (SEQ ID NO 2) (VII)，其中P1、P2和可選的側(cè)鏈保護基團以及P1、P2和可選的側(cè)鏈保護基團的優(yōu)選定義為如上定義；(iv)式(IIa)的側(cè)鏈保護的肽Pl-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH(SEQ ID NO 2) (IIa)，其中Pl和側(cè)鏈保護基團以及Pl和可選的側(cè)鏈保護基團的優(yōu)選定義為如上定義，除了 Boc-D-Phel-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)--Gly1c1-OH 中 Pbf是五甲基二氫苯并呋喃磺酰基以及Trt是三苯甲基外。所述肽已在WO 2007/033383中公開作為在CTC樹脂進行固相合成的產(chǎn)物。與之相反，本發(fā)明所述的式IIa的側(cè)鏈保護的肽可通過不同的方法合成，即通過溶液相合成方法合成；(ν)式(IIb)的側(cè)鏈未保護的肽Pl-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH(SEQ ID NO 2) (lib),其中Pl和Pl的優(yōu)選定義為如上定義；(vi)式⑴的側(cè)鏈保護的肽H-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 8)(X),其中P3是保護基團，優(yōu)選地P3是可通過催化氫化反應(yīng)除去的保護基團，更優(yōu)選地 P3是俶1、Bom、Pac, ONbz, Pic或4-磺酸基芐基，最優(yōu)選地P3是；以及(各)所述側(cè)鏈保護基團是至少一種合適的側(cè)鏈保護基團，優(yōu)選地選自Bzl、Bom、 Pac, ONbz, Pic和4-磺酸基芐基，更優(yōu)選地為Bzl ；(vii)式(XII)的側(cè)鏈保護的肽
P4-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID NO 9)
(XII)，其中P3和側(cè)鏈保護基團以及P3和可選地側(cè)鏈保護基團的優(yōu)選定義為如上所定義；以及P4是保護基團，優(yōu)選地P4是與式X的肽的側(cè)鏈保護基團正交的和與P3正交的保護基團，更優(yōu)選地P4是Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc或Msc，最優(yōu)選地P4是Boc，條件是，如果P4是 Boc、Bpoc 或 Ddz，那么 P3 不是 Bom ；或P4 是氫；(viii)式(XIV)的側(cè)鏈保護的肽P5-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 3) (XIV)，其中P3和側(cè)鏈保護基團以及P3和可選地側(cè)鏈保護基團的優(yōu)選定義為如上所定義；以及P5是保護基團，優(yōu)選地P5是與式XII和式XIII的肽/氨基酸的側(cè)鏈保護基團正交的和與P3正交的保護基團，更優(yōu)選地P5是Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc或Msc，最優(yōu)選地P5是 Boc，條件是，如果P5是Boc、Bpoc或Ddz，那么P3不是Bom，除了 Fmoc-Asp (OtBu) -Phe-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ile15-Pro-Glu (OtBu) -Glu (Ot Bu) -Tyr (tBu) -Leu20-OtBu中tBu是叔丁基以外。所述肽已在WO 2007/033383中公開作為在前體肽(即肽序列減去Leu)和H-Leu-OtBu之間的反應(yīng)的產(chǎn)物。如在W02007/033383中公開的所述前體肽已在前述步驟中通過在CTC樹脂上固相合成而形成。在與H-Leu-OtBu 反應(yīng)后，所述公開的肽在繼續(xù)進行下一步驟之前不進行分離。與之相反，本發(fā)明所述的式 XIV的側(cè)鏈保護的肽可通過不同的方法合成，即通過溶液相合成方法合成，并且在其合成之后進行對其分離；(ix)式(III)的側(cè)鏈保護的肽H-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 3) (III)，其中P3和側(cè)鏈保護基團以及P3和可選地側(cè)鏈保護基團的優(yōu)選定義為如上所定義，除了H-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile15-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu20-OtBu 以夕卜。所述肽已在 WO 2007/033383中被公開。其是上述的N-末端脫保護的肽。因此，如上所述，它的合成的方法與本發(fā)明的式III的側(cè)鏈保護的肽不同；以及(χ)式(IV)的側(cè)鏈保護的肽Pl-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Glyi0-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15 -Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID NO 1)(IV)，
其中P1、P3和側(cè)鏈保護基團以及P1、P3和可選地側(cè)鏈保護基團的優(yōu)選定義為如上所定義，除了 Boc-D-Phe1-Pro-Arg (Pbf) -Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn (Trt) -Gly10-Asp (O tBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile15-Pro--Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu20-OtBu 以外。所述肽已在 WO 2007/033383 中被公開為在 Boc-D-Phe1-Pro-Arg (Pbf) -Pro—Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn (Trt) -Gly10-OH 和 H -Asp (OtBu) -Phe—Glu (OtBu) -Glu (OtBu)-Ile15-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Le U2tl-OtBU (它們均已在上文有描述)偶聯(lián)后得到的產(chǎn)物。因此，它的偶聯(lián)產(chǎn)物的合成方法與本發(fā)明的式IV的側(cè)鏈保護的肽的合成方法不同。在一優(yōu)選實施方式中，式V的肽是側(cè)鏈未保護的并且具有下式Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OH (SEQ ID NO 4)，其包括比伐盧定的位置1-4的氨基酸序列。在另一優(yōu)選實施方式中，式VI的肽是側(cè)鏈未保護的并且具有下式H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzKSEQ ID NO 5)，其包括比伐盧定的位置5-10的氨基酸序列。在另一優(yōu)選實施方式中，式VII的肽是側(cè)鏈未保護的并且具有下式Boc-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzKSEQ ID NO 2)，其包括比伐盧定的位置1-10的氨基酸序列。在另一優(yōu)選實施方式中，式IIb的側(cè)鏈未保護的肽是Boc-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH (SEQ ID NO 2)，其包括比伐盧定的位置1-10的氨基酸序列。在另一優(yōu)選實施方式中，式X的側(cè)鏈保護的肽是H-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Ile15-Pro-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu20-OBz 1 (SEQ ID NO 8)，其包括比伐盧定的位置13-20的氨基酸序列。在另一優(yōu)選實施方式中，式XII的側(cè)鏈保護的肽是Boc-Phe-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Ile15-Pro-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Tyr (Bzl) -Le U20-OBzl (SEQ ID NO 9)，或H-Phe-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Ile15-Pro-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu20 -OBzl(SEQ ID NO 9)，其均包括比伐盧定的位置12-20的氨基酸序列。在另一優(yōu)選實施方式中，式XIV的側(cè)鏈保護的肽是Boc-Asp (OBzl) -Phe-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Ile15-Pro-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -T yr (Bzl)-Leu20-OBzKSEQ ID NO 3)，其包括比伐盧定的位置11-20的氨基酸序列。在另一優(yōu)選實施方式中，式III的側(cè)鏈保護的肽是H-Asp (OBzl) -Phe-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Ile15-Pro-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Tyr (Bzl)-Leu20-OBzKSEQ ID NO 3)，其包括比伐盧定的位置11-20的氨基酸序列。
在另一優(yōu)選實施方式中，式IV的側(cè)鏈保護的肽是Boc-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp (OBzl) -Phe-Glu (0B zl) -Glu (OBzl) -Ile15-Pro-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl (SEQ ID NO 1)，其包括比伐盧定的位置1-20的氨基酸序列。在另一方面，本發(fā)明涉及選自以下組的肽(i)式(V)的可選地側(cè)鏈保護的肽Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OH(SEQ ID NO 4) (V)，其中Pl是保護基團，優(yōu)選地Pl是對催化氫化反應(yīng)穩(wěn)定的保護基團，更優(yōu)選地Pl 是Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc或Msc ；最優(yōu)選地Pl是Boc ；以及所述肽是采用例如硝基的合適的側(cè)鏈保護基團在精氨酸殘基上可選地側(cè)鏈保護的；優(yōu)選地，所述肽V是側(cè)鏈未保護的并且具有下式Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OH (SEQ ID NO 4)；(ii)式(VI)的可選地側(cè)鏈保護的肽H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2(SEQ ID NO 5) (VI),其中P2是保護基團，優(yōu)選地P2是可通過催化氫化反應(yīng)除去的并且與可選的側(cè)鏈保護基團正交的保護基團，更優(yōu)選地P2是BZl、Bom、I^C、0NbZ、PiC或4-磺酸基芐基，最優(yōu)選地P2是Bzl ；以及所述肽是采用例如三苯甲基(Trt)的合適的側(cè)鏈保護基團在天冬酰胺殘基上可選地側(cè)鏈保護的；優(yōu)選地，所述肽VI是側(cè)鏈未保護的并且具有下式H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzKSEQ ID NO 5)；(iii)式(VII)的可選地側(cè)鏈保護的肽Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2 (SEQ ID NO 2) (VII)，其中P1、P2和側(cè)鏈保護基團以及P1、P2和可選地側(cè)鏈保護基團的優(yōu)選定義為如上所定義；優(yōu)選地，所述肽VII是側(cè)鏈未保護的并且具有下式Boc-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzKSEQ ID NO 2)；(iv)式(IIa)的側(cè)鏈保護的肽Pl-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH(SEQ ID NO 2) (IIa)，其中Pl和側(cè)鏈保護基團以及Pl和可選地側(cè)鏈保護基團的優(yōu)選定義為如上所定義，除了 Boc-D-Phel-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)--Gly1c1-OH 以外，其中Pbf是五甲基二氫苯并呋喃磺酰基和Trt是三苯甲基。所述肽已在WO 2007/033383 中公開作為在CTC樹脂進行固相合成的產(chǎn)物。與之相反，本發(fā)明所述的式IIa的側(cè)鏈保護的肽可通過不同的方法合成，即通過溶液相合成方法合成；(ν)式(IIb)的側(cè)鏈未保護的肽
Pl-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH(SEQ ID NO 2) (lib),其中Pl以及Pl的優(yōu)選定義為如上所定義；優(yōu)選地，式IIb的側(cè)鏈未保護的肽是Boc-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH (SEQ ID NO 2)；(vi)式⑴的側(cè)鏈保護的肽H-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 8)(X)，其中P3是保護基團，優(yōu)選地P3是可通過催化氫化反應(yīng)除去的保護基團，更優(yōu)選地 P3是俶1、Bom、Pac, ONbz, Pic或4-磺酸基芐基，最優(yōu)選地P3是；以及所述(各)側(cè)鏈保護基團優(yōu)選地選自BZl、BOm、I^C、0NbZ、PiC和4_磺酸基芐基， 更優(yōu)選地為Bzl ；優(yōu)選地，式X的側(cè)鏈保護的肽是H-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Ile15-Pro-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu20-OBz 1 (SEQ ID NO 8)；(vii)式(XII)的側(cè)鏈保護的肽P4-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 9) (XII)，其中P3和側(cè)鏈保護基團以及P3和可選地側(cè)鏈保護基團的優(yōu)選定義為如上所定義；以及P4是保護基團，優(yōu)選地P4是與式X的肽的側(cè)鏈保護基團正交的和與P3正交的保護基團，更優(yōu)選地P4是Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc或Msc，最優(yōu)選地P4是Boc，條件是，如果P4是Boc、Bpoc或Ddz，那么P3不是Bom ；或P4 是氫；優(yōu)選地，式XII的側(cè)鏈保護的肽是Boc-Phe-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Ile15-Pro-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) ~Tyr (Bzl) -Le U20-OBzl (SEQ ID NO 9)，或H-Phe-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Ile15-Pro-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu20 -OBzl(SEQ ID NO 9)；(viii)式(XIV)的側(cè)鏈保護的肽P5-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 3) (XIV)，其中P3和側(cè)鏈保護基團以及P3和可選地側(cè)鏈保護基團的優(yōu)選定義為如上所定義；以及P5是保護基團，優(yōu)選地P5是與式XII和式XIII的肽/氨基酸的側(cè)鏈保護基團正交的和與P3正交的保護基團，更優(yōu)選地P5是Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc或Msc，最優(yōu)選地P5是 Boc，條件是，如果P5是Boc、Bpoc或Ddz，那么P3不是Bom，
除了 Fmoc-Asp (OtBu) -Phe-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ile15-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtB u) -Tyr (tBu) -Leu20-OtBu中tBu是叔丁基以外。所述肽已在WO 2007/033383中公開作為前體肽(即肽序列減去Leu)和H-Leu-OtBu之間的反應(yīng)的產(chǎn)物。如在WO 2007/033383中公開的所述前體肽已在前述步驟中通過在CTC樹脂上固相合成而形成。在與H-Leu-OtBu的反應(yīng)后，所述公開的肽在繼續(xù)進行下一步之前不進行分離。在與H-Leu-OtBu反應(yīng)后，所述公開的肽在繼續(xù)進行下一步驟之前不進行分離。與之相反，本發(fā)明所述的式XIV的側(cè)鏈保護的肽可通過不同的方法合成，即通過溶液相合成方法形成，并且在其形成之后對其進行分離；優(yōu)選地，式XIV的側(cè)鏈保護的肽是Boc-Asp (OBzl) -Phe-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Ile15-Pro-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -T yr (Bzl)-Leu20-OBzKSEQ ID NO 3)；(ix)式(III)的側(cè)鏈保護的肽H-Asp-Phe-Glu-Glu-I le15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 3)其中P3和側(cè)鏈保護基團以及P3和可選地側(cè)鏈保護基團的優(yōu)選定義為如上所定義，除了 H-Asp (OtBu) -Phe-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ile15-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu)-Leu2tl-OtBu以外。所述肽已在WO 2007/033383中公開。它是上述的N-末端脫保護的肽。因此，如上所述，它的合成的方法與本發(fā)明的式III的側(cè)鏈保護的肽不同；優(yōu)選地，式III的側(cè)鏈保護的肽是H-Asp (OBzl) -Phe-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Ile15-Pro-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Tyr (Bzl)-Leu20-OBzl (SEQ ID NO 3)；以及(χ)式(IV)的側(cè)鏈保護的肽Pl-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Glyi0-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 1) (IV)，其中P1、P3和側(cè)鏈保護基團以及P1、P3和可選地側(cè)鏈保護基團的優(yōu)選定義為如上所定義，除了 Boc-D-Phe1-Pro-Arg (Pbf) -Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn (Trt) -Gly10-Asp (0 tBu) -Phe-Glu (OtBu) -Glu (OtBu)-Ile15-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu20-OtB u 以外。所述肽已在 WO 2007/033383 中公開為在 Boc-D-Phe1-Pro-Arg (Pbf)-Pro--Gly5-Gl y-Gly-Gly-Asn (Trt) -Gly10-OH 和 H-Asp (OtBu) -Phe—Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ile15-Pro-Gl u (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu20-OtBu (它們均已在上文有描述)偶聯(lián)后得到的產(chǎn)物。 因此，它的偶聯(lián)產(chǎn)物的合成方法與本發(fā)明的式IV的側(cè)鏈保護的肽的合成方法不同；優(yōu)選地，式IV的側(cè)鏈保護的肽是Boc-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp (OBzl) -Phe-Glu (0B zl) -Glu (OBzl) -Ile15-Pro-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl (SEQ ID NO 1)；作為合成式⑴的比伐盧定的中間體的應(yīng)用H-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Glyi0-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-P ro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OH(SEQ ID NO 1) (I)。本發(fā)明還涉及用于制備式I的比伐盧定的方法，所述方法包括以下步驟
(a)使其中Pl為保護基團的式(IIc)的肽Pl-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH(SEQ ID NO 2) (IIc)，與其中P3和P6至Pll中的每一個是Bzl的式(IIIc)的肽反應(yīng)H-Asp (OPll) -Phe-Glu (0P6) -Glu (0P7) -Ile15-Pro-Glu (0P8) -Glu (0P9) -Tyr (PlO) -Leu20-OP3 (SEQ ID NO 3)(IIIc)，以制備得到其中PI、P3和P6至Pll為如上定義的式(IVc)的肽Pl-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp (OPll) -Phe-Glu (0P6) -Glu (0P7) -Ile15-Pro-Glu (0P8) -Glu (0P9) -Tyr (PlO) -Leu20-OP3 (SEQ ID NO 1) (IVc)；(b)除去步驟(a)中制備的肽的側(cè)鏈和C-末端的保護基團P3和P6至Pll ；以及(c)除去步驟(b)中制備的肽的N-末端保護基團Pl以制備得到式I的比伐盧定。本發(fā)明的方法可以通過匯聚片段合成方法高效合成比伐盧定，其易于適用于工業(yè)化生產(chǎn)。而且，該用于制備比伐盧定的路線是非常簡單的并且不需要采用復(fù)雜的保護基團策略。此外，可選擇各種構(gòu)建塊(片段)以避免或減少在組裝期間的外消旋化作用。在本發(fā)明的各單個反應(yīng)之前、期間和之后，所有的片段以及所有的偶聯(lián)產(chǎn)物可以本身的形式或以適當(dāng)?shù)柠}形式存在，這取決于所述分子的物理化學(xué)性質(zhì)和/或反應(yīng)條件。 合適的平衡離子為例如與三乙胺(TEA)、二環(huán)己胺(DCHA)、鹽酸(HCl)和三氟乙酸(TFA)的鹽形式。可采用任意的對催化氫化反應(yīng)穩(wěn)定的保護基團作為保護基團P1，所述任意的對催化氫化反應(yīng)穩(wěn)定的保護基團例如為叔丁氧基羰基(Boc)、芴-9-基甲氧基羰基(Fmoc)、 2-(3，5-二甲氧基苯基)丙烷-2-基氧基羰基(Ddz)、金剛烷基-1-氧基羰基(Adc) (adamantly-1-oxycarbonyl)、叔-戊基氧基羰基(Aoc)、二苯基氧膦基(Dpp)、2_(甲磺酰基)乙氧基羰基(Msc)和鄰苯二甲?；?Wit)。優(yōu)選地，保護基團Pl為BoC、FmoC或Ddz。優(yōu)選地，保護基團P3和P6至Pll是芐基(Bzl)。這里以及下文中，縮寫“OBzl”表示芐酯(在與側(cè)鏈或C末端的羧基反應(yīng)后)，而縮寫“Bzl”表示二甲苯醚(在與例如酪氨酸的酚羥基反應(yīng)后)?？刹捎迷陔暮铣深I(lǐng)域中公知的標(biāo)準反應(yīng)條件進行步驟(a)至(C)。優(yōu)選在溶液中進行偶聯(lián)和脫保護步驟(a)、(b)和(C)。針對偶聯(lián)步驟(a)，優(yōu)選采用DMF作為溶劑。第一個脫保護步驟(b)優(yōu)選在乙酸和 /或水中進行，而第二個脫保護步驟(c)優(yōu)選在甲苯中進行。在一優(yōu)選實施方式中，采用HOBt、EDC · HCl和TEA的組合完成偶聯(lián)步驟(a)。在一優(yōu)選實施方式中，采用氫氣和鈀/炭進行所述第一個脫保護步驟(b)。在一優(yōu)選實施方式中，采用TFA進行所述第二個脫保護步驟(C)。在步驟(c)后得到的粗制的產(chǎn)物可通過常規(guī)方法(例如制備級HPLC、反流分布法或等效的方法)進行純化。如果步驟(a)和(b)后得到的中間體需要純化，可采用相同的方法進行純化?？刹捎贸Ｒ?guī)的肽合成方法(例如溶液相合成法(HPPQ或固相合成法(SPPQ)制備保護的肽片段IIc和IIIc。在SPPS的情況下，可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的并可用于制備保護的肽的所有的樹脂。在本文中，應(yīng)以寬的方式解釋樹脂。因此，術(shù)語“樹脂”應(yīng)理解為是指例如單獨的固體載體或直接連接至連接分子的固體載體，可選地在兩者之間進行選擇。樹脂可以是不可溶解的或可溶解的。所述可溶解的聚合物聚乙二醇是可溶解的樹脂固體載體的示例。優(yōu)選的樹脂是具有三苯甲基或溴二苯甲基的聚苯乙烯基樹脂。三苯甲基樹脂的示例是2-氯三苯甲基氯化物樹脂(CTC樹脂)、三苯甲基氯化物樹脂、4-甲基三苯甲基氯化物樹脂和4-甲氧基三苯甲基氯化物樹脂。優(yōu)選地，所述CTC樹脂用于合成包含有游離羧基官能團的片段。在一優(yōu)選實施方式中，采用溶液相合成法制備所述保護的肽片段IIc和IIIc。本發(fā)明的另一個目的是提供作為本發(fā)明所述的方法中的中間體的有用的肽。具體地，這些肽中的一種是式IVc的保護的肽，其中Pl是保護基團；優(yōu)選地Pl是Boc或H ；以及 P3禾口 P6至Pll是俶1。作為本發(fā)明的方法中的中間體的特別有用的另一個肽是式IIc的N-末端保護的肽，其中Pl是保護基團，優(yōu)選Pl是Boc。在另一方面，本發(fā)明還涉及用于制備其中Pl為Boc的式(IIc)的N-末端保護的肽的方法Pl-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH(SEQ ID NO 2) (IIc)，其包括(a)除去式(Vc)的肽的C-末端保護基團Pl-D-Phel-Pro-Arg-Pro-OPlS (SEQ ID NO 4) (Vc),其中Pl是Boc而P13是諸如Bzl、甲基(Me)或乙基(Et)的保護基團；優(yōu)選地P13 是 Bzl ；以得到其中P13是H的式Vc的N-末端保護的、C-末端未保護的肽；(b)除去其中P15是Boc的式(VIc)的肽的N-末端保護基團P15-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-0Bzl(SEQ ID NO 5)(VIc)，得到其中P15為H的式VIc的C-末端保護的、N-末端未保護的肽；(c)使在步驟(a)中制備的其中P13是H的式Vc的肽與在步驟(b)中制備的其中 P15是H的式VIc的肽反應(yīng)，得到其中Pl是Boc的式(VIIc)的肽Pl-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl (SEQ ID NO 2) (VIIc)；以及(d)除去在步驟(C)中制備的肽的C-末端保護基團，以得到式IIc的N-末端保護的肽?？刹捎秒暮铣深I(lǐng)域中公知的標(biāo)準反應(yīng)條件進行步驟(a)至(d)。優(yōu)選在溶液中進行偶聯(lián)和脫保護步驟(a)、(b)、(c)和(d)。針對偶聯(lián)步驟(c)，優(yōu)選采用DMF作為溶劑。第一個脫保護步驟(a)優(yōu)選在丙酮中進行，而第二個脫保護步驟(b)優(yōu)選在甲苯和/或THF中進行。第三個脫保護步驟(d)優(yōu)選在選自DMF、丙酮、水、丙酮和水的混合物的溶劑中進行。
在一優(yōu)選實施方式中，采用氫氣和鈀/炭進行第一個脫保護步驟(a)。在一優(yōu)選實施方式中，采用TFA進行第二個脫保護步驟(b)。在一優(yōu)選實施方式中，采用HOBt、DIC和TEA的組合來完成偶聯(lián)步驟(c)。在一優(yōu)選實施方式中，采用氫氣和鈀/炭進行第三個脫保護步驟(d)。在步驟(d)后得到的粗制的產(chǎn)物可通過常規(guī)方法(例如制備級HPLC、反流分布法或等效的方法)進行純化。如果步驟(a)、(b)和(c)后得到的中間體需要純化，可采用相同的方法進行純化?？刹捎贸Ｒ?guī)的肽合成方法(例如溶液相合成法(HPPQ或固相合成法(SPPQ)制備保護的肽片段Vc和Vic。在SPPS的情況下，可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的并可用于制備保護的肽的所有的樹脂。在本文中，應(yīng)以寬的方式解釋樹脂。因此，術(shù)語“樹脂”應(yīng)理解為是指例如單獨的固體載體或直接連接至連接分子的固體載體，可選地在兩者之間進行選擇。樹脂可以是不可溶解的或可溶解的。所述可溶解的聚合物聚乙二醇是可溶解的樹脂固體載體的示例，因此生成可溶解的肽-樹脂的結(jié)合物。優(yōu)選的樹脂是具有三苯甲基或溴二苯甲基的聚苯乙烯基樹脂。三苯甲基樹脂的示例是2-氯三苯甲基氯化物樹脂(CTC樹脂)、 三苯甲基氯化物樹脂、4-甲基三苯甲基氯化物樹脂和4-甲氧基三苯甲基氯化物樹脂。優(yōu)選地，所述CTC樹脂用于合成包含有游離羧基官能團的片段。在一優(yōu)選實施方式中，采用溶液相合成法制備所述保護的肽片段Vc和Vic。本發(fā)明的另一個目的是提供作為用于制備式IIc的N-末端保護的肽的本發(fā)明所述的方法中的中間體的有用的保護的肽。具體地，這些肽中的一種是式Vc的C-末端和 N-末端保護的肽，其中P13是保護基團，優(yōu)選是Bzl ；這些肽中的另一種是具有游離C-末端的式Vc的N-末端保護的肽。作為本發(fā)明所述的方法中的中間體的特別有用的另一種肽，是式VIc的C-末端保護的肽，其中P15是Boc ；或P15是H。作為用于制備比伐盧定的方法中的中間體的特別有用的另一種肽是式IIIc的保護的肽，其中P3和P6至Pll是Bzl。在另一方面，本發(fā)明還涉及用于制備其中P3和P6至Pll是Bzl的式(IIIc)的保護的肽H-Asp (OPll) -Phe-Glu (0P6) -Glu (0P7) -Ile15-Pro-Glu (0P8) -Glu (0P9) -Tyr (P10 )-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 3) (IIIc)，其包括(a)除去式(VlIIc)的肽的N-末端保護基團P16-Glu(0P8)-Glu (0P9)-Tyr (PlO)-Leu2CI-0P3 (SEQ ID NO 6)(VIIIc),其中P3和P8至？10是俶1且P16是Boc，以得到其中P16是H的式VIIIc的C-末端保護的、N-末端未保護的肽；(b)使在步驟(a)中制備的其中P16是H而P3和P8至PlO是Bzl的式VIIIc的肽與其中P17是Boc而P6和P7是Bzl的式(IXc)的肽反應(yīng)P17_Glu(0P6)-Glu (0P7)-IIe15-Pro-OH(SEQ ID NO 7)(IXc)，
以得到其中P17是Boc而P3和P6至PlO是Bzl的式(Xe)的肽P17-Glu (0P6) -Glu (0P7) -Ile15-Pro-Glu (0P8) -Glu (0P9) -Tyr (PlO) -Leu20-OP3 (S EQ ID NO 8)(Xe)；(c)除去在步驟(b)中制備的式k的肽的N-末端保護基團，其中P3和P6至PlO 是 Bzl ；而 P17 是 Boc，以得到其中P3和P6至PlO是Bzl而P17是H的式的C-末端保護的、N-末端未保護的肽；(d)使在步驟(c)中制備的其中P17是H而P3和P6至PlO是Bzl的式的肽與式(XI)的保護的氨基酸反應(yīng)Boc-Phe12-OH(XI)，以得到其中P3和P6至PlO是Bzl而P4是Boc的式(XIIc)的肽P4-Phe-Glu (0P6) -Glu (0P7) -Ile15-Pro-Glu (0P8) -Glu (0P9) -Tyr (PlO) -Leu20-OP 3 (SEQ ID NO 9)(XIIc)，(e)除去在步驟(d)中制備的式XIIc的肽的N-末端保護基團，其中P3和？6至 PlO 是 Bzl 而 P4 是 Boc，以得到其中P3和P6至PlO是Bzl而P4是H的式XIIc的C-末端保護的、N-末端未保護的肽；(f)使在步驟(e)中制備的其中P4是H而P3和P6至PlO是Bzl的式XIIc的肽與其中Pll是Bzl的式(XlIIc)的保護的氨基酸Boc-Asp (OPll) n-0H(XIIIc),反應(yīng)以得到其中P3和P6至Pll是Bzl的式(XIVc)的肽Boc-Asp (OPll) -Phe-Glu (0P6) -Glu (0P7) -Ile15-Pro-Glu (0P8) -Glu (0P9) -Tyr (P 10)-Leu2CI-0P3(SEQ ID NO 3)；以及(g)除去在步驟(f)中制備的肽的N-末端保護基團，以得到式IIIc的C-末端保護的肽。采用肽合成領(lǐng)域中公知的標(biāo)準反應(yīng)條件進行步驟(a)至(g)。優(yōu)選在溶液中進行偶聯(lián)和脫保護步驟(a)至(g)。針對偶聯(lián)步驟(b)、(d)和(f)，優(yōu)選采用DMF作為溶劑。優(yōu)選在作為溶劑的甲苯和THF的混合物中進行脫保護步驟(a)、(c)、(e)和(g)。在優(yōu)選的實施方式中，采用H0Bt、EDC 'HCl的組合完成偶聯(lián)步驟(b)、(d)和⑴， 而步驟(b)采用堿TEA，步驟(d)和(f)分別采用DIPEA。在另一優(yōu)選的實施方式中，采用 TFA和苯酚進行脫保護步驟(a)、(c)、(e)和(g)。在步驟(g)后得到的粗制的產(chǎn)物可通過常規(guī)方法(例如制備級HPLC、反流分布法或等效的方法)進行純化。如果步驟(a)至(f)后得到的中間體需要純化，可采用相同的方法進行純化?？刹捎贸Ｒ?guī)的肽合成方法(例如溶液相合成法(HPPQ或固相合成法(SPPQ)制備保護的肽片段VIIIC、IXC、XI和XIIIc。在SPPS的情況下，可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的并可用于制備保護的肽的所有的樹脂。在本文中，應(yīng)以寬的方式解釋樹脂。因此，術(shù)語“樹脂”應(yīng)理解為是指例如單獨的固體載體或直接連接至連接分子的固體載體，可選地在兩者之間進行選擇。樹脂可以是不可溶解的或可溶解的。所述可溶解的聚合物聚乙二醇是可溶解的樹脂固體載體的示例。優(yōu)選的樹脂是具有三苯甲基或溴二苯甲基的聚苯乙烯基樹脂。 三苯甲基樹脂的示例是2-氯三苯甲基氯化物樹脂(CTC樹脂)、三苯甲基氯化物樹脂、4-甲基三苯甲基氯化物樹脂和4-甲氧基三苯甲基氯化物樹脂。優(yōu)選地，所述CTC樹脂用于合成包含有游離羧基官能團的片段。在一優(yōu)選實施方式中，采用溶液相合成法制備所述保護的肽片段VIIIc、IXc, XI 和 XIIIc。本發(fā)明的另一個目的是提供保護的肽，所述保護的肽可用作為用于制備式IIIc 的C-末端保護的肽的本發(fā)明所述的方法中的中間體。具體地，這些肽中的一種是式XIVc 的保護的肽，其中P3和P6至Pll是Bzl?？商貏e用作為本發(fā)明的方法中的中間體的另一種肽是式XIIc的側(cè)鏈保護的肽， 其中P3和P6至PlO是Bzl，而P4是Boc保護基團，或P4是H?？商貏e用作為本發(fā)明的方法中的中間體的另一種肽是式k的保護的肽，其中P3 和P6至PlO是俶1，而P17是Boc保護基團，或P17是H?？商貏e用作為本發(fā)明的方法中的中間體的另一種肽是式Mc的保護的肽，其中P6 和P7是Bzl，而優(yōu)選P17是Boc0可特別用作為本發(fā)明的方法中的中間體的另一種肽是式VIIIc的保護的肽，其中 P3和P8至PlO是俶1，而P16是Boc保護基團，或P16是H。在另一方面，本發(fā)明還涉及任意上述作為合成比伐盧定中的中間體的肽的應(yīng)用。
具體實施例方式以下的非限制的實施例將對本發(fā)明的代表性具體實施方式
進行詳細描述。縮寫
權(quán)利要求
1.用于在溶液相中制備式(I)的比伐盧定的方法H-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Glyl0-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OH (SEQ ID NO 1)⑴，其包括以下步驟(a)使其中Pl是對催化氫化反應(yīng)穩(wěn)定的保護基團的式(V)的可選地側(cè)鏈保護的肽 Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OH (SEQ ID NO 4) (V)，與式(VI)的可選地側(cè)鏈保護的肽反應(yīng) H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2(SEQ ID NO 5) (VI)，其中P2是可通過催化氫化反應(yīng)除去的并且與所述可選的側(cè)鏈保護基團正交的保護基團，以制備其中Pl和P2為如上定義的式(VII)的可選地側(cè)鏈保護的肽 Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2 (SEQ ID NO 2) (VII)，(b)除去在步驟(a)中制備的肽的P2，以制備其中Pl為如上所述的式(II)的可選地側(cè)鏈保護的肽Pl-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH (SEQ ID NO 2) (II)，(c)使其中P3是可通過催化氫化反應(yīng)除去的保護基團的式(X)的側(cè)鏈保護的肽 H-Glu-Glu-I le15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 8)(X),與式(XI)的苯丙氨酸反應(yīng)P4-Phe12-0H(XI)，其中P4是與式X的肽的側(cè)鏈保護基團正交的以及與P3正交的保護基團， 以制備其中P3和P4為如上定義的式(XII)的側(cè)鏈保護的肽P4-Phe-Glu-Glu-IIe15-Prο-Glu-GIu-TyT-Leu20-OP3(SEQ ID NO 9) (XII)，(d)除去在步驟(c)中制備的肽的P4，以制備相應(yīng)的式(XII)的N-末端脫保護的側(cè)鏈保護的肽，(e)使在步驟(d)中制備的式XII的肽與式(XIII)的側(cè)鏈保護的天冬氨酸反應(yīng) P5-Aspn-0H(XIII),其中P5是與式XII和XIII的肽/氨基酸的側(cè)鏈保護基團正交的以及與P3正交的保護基團，以制備其中P3和P5為如上定義的式(XIV)的側(cè)鏈保護的肽P5-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 3) (XIV)，(f)除去在步驟(e)中制備的肽的P5，以制備其中P3為如上定義的式(III)的側(cè)鏈保護的肽H-Asp-Phe-Glu-Glu-I Ie 15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 3)(III)，(g)使在步驟(b)中制備的式II的可選地側(cè)鏈保護的肽與在步驟(f)中制備的式 (III)的側(cè)鏈保護的肽反應(yīng)，以制備其中Pl和P3為如上定義的式(IV)的側(cè)鏈保護的肽Pl-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Glyl0-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro -Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 1)(IV)，(h)除去在步驟(g)中制備的肽的P1、P3和側(cè)鏈保護基團，以制備式I的比伐盧定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中P1、P4和P5中的至少一個是叔丁氧基羰基(Boc)、 2-( 二苯基-4-基)丙烷-2-基氧基羰基(Bpoc)、2_ (3，5-二甲氧基苯基)丙烷_2_基氧基羰基(Ddz)、芴-9-基甲氧基羰基(Fmoc)或2_(甲磺酰基)乙氧基羰基(Msc)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中P1、P4和P5中的至少一個是Boc。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中的任一項所述的方法，其中P2和P3中的至少一個是芐基 (Bzl)、芐基氧基甲基(Bom)、苯甲?；?Pac)、4_硝基芐基(ONbz)、4_吡啶基甲基(Pic)或 4-磺酸基芐基，條件是，如果P4或P5是Boc、Bpoc或Ddz，P3不是Bom。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中P2和P3中的至少一個是Bzl。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中的任一項所述的方法，其中采用選自芐基(Bzl)、芐基氧基甲基(Bom)、苯甲?；?Pac)、4_硝基芐基(ONbz)、4_吡啶基甲基(Pic)和4-磺酸基芐基的側(cè)鏈保護基團中的至少一種保護式III、IV、X和XII-XIV的側(cè)鏈保護的肽/氨基酸；條件是，如果P4或P5是Boc、Bpoc或Ddz，沒有一個所述側(cè)鏈保護基團是Bom。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中采用至少一個Bzl保護式III、IV、X和XII-XIV 的側(cè)鏈保護的肽/氨基酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中的任一項所述的方法，其中在步驟(a)中式V和VI的可選地側(cè)鏈保護的肽中的至少一種是側(cè)鏈未保護的。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中的任一項所述的方法，其中在步驟(c)中的式X的肽是下式 (Xb)的肽H-Glu (0P6) -Glu (0P7) -Ile15-Pro-Glu (0P8) -Glu (0P9) -Tyr (PlO) -Leu20-OP3 (SEQ ID 8)(Xb)，其中P3是可采用催化氫化反應(yīng)除去的保護基團；以及P6至PlO中的每一個獨立地選自^l、Bom、Pac、ONbz、Pic和4-磺酸基芐基；以及在步驟(e)中式XIII的側(cè)鏈保護的天冬氨酸是P5-Asp (0Ρ11)η-0Η,其中P5是與式XII和XIII的肽/氨基酸的側(cè)鏈保護基團正交的以及與P3正交的保護基團；以及Pll 選自 ^l、Bom、Pac、ONbz、Pic 和 4-磺酸基芐基。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中P3是Bzl、Bom、Pac,ONbz, Pic或4-磺酸基芐基；P6至PlO中的每一個獨立地是俶1、Bom、Pac、ONbz, Pic或4-磺酸基芐基；P5是Boc、 Bpoc、Ddz、Fmoc 或 Msc ；以及 Pll 是 Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic 或 4-磺酸基芐基。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中P3是Bzl，P6至PlO中的每一個是Bzl，P5是 Boc,以及 Pll ^Bzl0
12.根據(jù)權(quán)利要求9至11中的任一項所述的方法，其中Pl、P4和P5是Boc；以及P2、 P3、P6、P7、P8、P9、P10 和 Pll 是 Bzl。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中的任一項所述的方法，其中在步驟(h)中，首先同時除去 P3和側(cè)鏈保護基團，然后除去Pl。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中在同時除去P3和側(cè)鏈保護基團后得到的所述肽在除去Pl之前不需要進行分離。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至14中的任一項所述的方法，其中在溶劑中與氫氣和鈀/炭進行所述除去步驟(b)和(h)的至少一個。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中溶劑選自N，N-二甲基甲酰胺、丙酮、丙酮和水的混合物、乙酸以及乙酸和水的混合物。
17.根據(jù)權(quán)利要求1至16中的任一項所述的方法，其中通過在前述的方法中采用溶液相合成方法制備選自式V的可選地側(cè)鏈保護的肽、式VI的可選地側(cè)鏈保護的肽和式X的側(cè)鏈保護的肽中的至少一種。
18.根據(jù)權(quán)利要求1至16中的任一項所述的方法，其中通過在前述的方法中采用固相合成方法制備選自式V的可選地側(cè)鏈保護的肽、式VI的可選地側(cè)鏈保護的肽和式X的側(cè)鏈保護的肽中的至少一種。
19.選自以下的組的肽(i)式(V)的可選地側(cè)鏈保護的肽Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OH (SEQ ID NO 4)(V)，其中Pl是對催化氫化反應(yīng)穩(wěn)定的保護基團； ( )式(VI)的可選地側(cè)鏈保護的肽H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2(SEQ ID NO 5) (VI)，其中P2是可通過催化氫化反應(yīng)除去的并且與可選的側(cè)鏈保護基團正交的保護基團；(iii)式(VII)的可選地側(cè)鏈保護的肽Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2 (SEQ ID NO 2) (VII)，其中Pl和P2為如上定義；(iv)式(IIa)的側(cè)鏈保護的肽Pl-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH (SEQ ID NO 2) (IIa)，其中 Pl 為如上定義，除了 Boc-D-Phel-Pro-Arg(Pbf)-Pro--Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn (Tr t)-Gly10-OH 以外；(ν)式(IIb)的側(cè)鏈未保護的肽Pl-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH (SEQ ID NO 2) (lib),其中Pl為如上定義； (vi)式⑴的側(cè)鏈保護的肽H-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 8)⑴，其中P3是可通過催化氫化反應(yīng)除去的保護基團；(vii)式(XII)的側(cè)鏈保護的肽P4-Phe-Glu-Glu-IIe15-Prο-Glu-GIu-TyT-Leu20-OP3(SEQ ID NO 9) (XII)，其中P3為如上定義；以及P4是與式X的肽的側(cè)鏈保護基團正交的和與P3正交的保護基團；或P4是氫；(viii)式(XIV)的側(cè)鏈保護的肽P5-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 3) (XIV)，其中P5是與式XII和XIII的肽/氨基酸的側(cè)鏈保護基團正交的和與P3正交的保護基團；以及 P3 為如上定義；除了 Riioc-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile15-Pro--Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu20-OtBu 以外。(ix)式(III)的側(cè)鏈保護的肽H-Asp-Phe-Glu-Glu-I Ie 15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 3) (III)，其中 P3 為如上定義，除了 H-Asp (OtBu) -Phe-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ile15-Pro-Glu (0 tBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu20-OtBu 以外；以及(x)式(IV)的側(cè)鏈保護的肽Pl-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Glyi0-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile15-Pro -Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID NO 1)(IV)，其中 Pl 和 P3 為如上定義；除了 Boc-D-Phel-Pro-Arg(Pbf)--Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-A sn (Trt) -Gly10-Asp (OtBu) -Phe—Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ile15-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu)--Tyr (tBu) -Leu20-OtBu 以外。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的肽，其中式V的可選地側(cè)鏈保護的肽是 Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OH (SEQ ID NO 4)。
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的肽，其中式VI的可選地側(cè)鏈保護的肽是H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBz 1 (SEQ ID NO 5)。
22.根據(jù)權(quán)利要求19所述的肽，其中式VII的可選地側(cè)鏈保護的肽是Boc-D-Phe1-Pro -Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzKSEQ ID NO 2)。
23.根據(jù)權(quán)利要求19所述的肽，其中式nb的側(cè)鏈未保護的肽是Boc-D-Phe1-Pro-Arg -Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH (SEQ ID NO 2)。
24.根據(jù)權(quán)利要求19所述的肽，其中式X的側(cè)鏈保護的肽是H-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Ile15-Pro-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl (SE Q ID NO 8)。
25.根據(jù)權(quán)利要求19所述的肽，其中式XII的側(cè)鏈保護的肽是Boc-Phe-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Ile15-Pro-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu20-O Bzl (SEQ ID NO 9)，或H-Phe-Glu (Cffizl)—Glu (Cffizl)-Ile15-ftx)-Glu (Cffizl)-Glu (Cffizl)-Tyr (Bzl)-Leu20-OBzl (SEQ ID NO 9)。
26.根據(jù)權(quán)利要求19所述的肽，其中式XIV的側(cè)鏈保護的肽是Boc-Asp (OBzl) -Phe-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Ile15-Pro-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Tyr (B zl)-Leu20-OBzl (SEQ ID NO 3)。
27.根據(jù)權(quán)利要求19所述的肽，其中式III的側(cè)鏈保護的肽是H-Asp (OBzl) -Phe-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Ile15-Pro-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Tyr (Bzl )-Leu20-OBzl (SEQ ID NO 3)。
28.根據(jù)權(quán)利要求19所述的肽，其中式IV的側(cè)鏈保護的肽是Boc-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp (OBzl) -Phe-Glu (OBzl)-Glu (OBzl) -Ile15-Pro-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl (SEQ ID NO 1)。
29.根據(jù)權(quán)利要求19至28的任一項所述的任意的肽的作為合成比伐盧定的中間體的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于通過匯聚五個片段的合成方法制備具有下式的20-mer肽的比伐盧定的方法，以及涉及一些它的肽中間體。H-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp-Phe--Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OH(I)。
文檔編號C07K5/10GK102264757SQ200980152943
公開日2011年11月30日 申請日期2009年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月29日
發(fā)明者盧西亞諾·弗尼, 杰弗里·蘇門 申請人:隆薩布萊納公司