專利名稱：硫化劑及其用于寡核苷酸合成的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及硫代磷酸酯寡核苷酸、其使用新硫化劑的制備、所述硫化劑及其制備。
背景技術(shù)：
寡核苷酸屬于一類生物藥劑，具有非常大的治療不同疾病的潛力，這些疾病列舉幾個包括癌癥、病毒感染、以及炎性疾病。推動寡核苷酸作為療法的一個重要途徑涉及對該寡聚物主鏈的修飾以提供除其他之外的代謝抗性、化學(xué)穩(wěn)定性并且以改進至作用部位的體內(nèi)運輸。修飾的主鏈化學(xué)物的例子包括肽核酸類(PNA)(參見Nielsen，Methods Mol. Biol.，208 :3- ，2002)，鎖核酸類(LNA)(參見 Petersen & Wengel，Trends Biotechnol.， 21(2) :74-81，2003)，硫代磷酸酯類(參見Eckstein，Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 10(2) :117-21,2000),甲基膦酸酯類(參見 Thiviyanathan 等人，Biochemistry,41 (3) 827-38,2002)，氨基磷酸酯類(參見 Gryaznov，Biochem. Biophys. Acta, 1489 (1) 131-40， 1999 ;Pruzan 等人，Nucleic Acids Res. ,30(2) :559_68，2002)，硫代氨基磷酸酯類(參見 Gryaznov 等人，Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids,20(4-7) :401-10,2001 ； Herbert等人，Oncogene, 21 (4) =638-42, 2002) 0硫代磷酸酯的形成屬于最有用的修飾，因為用P = S部分取代P = O使得寡核苷酸耐受核酸裂解降解而同時在大多數(shù)情況下保持了天然寡聚物的生物特性。硫代磷酸酯可以通過氧化硫化作用而形成(Oligonucleotide synthesis, methods and applications,P. Herdewij η Methods in Molecular Biology,volume 288, Chapter 4,51-63).主要存在兩種制造硫代磷酸酯的方法，取決于對于這個反應(yīng)所使用的磷酯(phosphorous esters)的性質(zhì)以及所預(yù)期的產(chǎn)物。其中之一涉及將未取代的硫原子引入到磷中，例如通過元素硫、二苯?；牧蚧?、3-Η-1，2-苯并二硫-3-酮-1，1- 二氧化物(還稱為 Beaucage 試劑，(Iyer 等人，J. Org. Chem. 55，4693-4699 (1990))，二硫化四乙基秋蘭姆(TETD)、二硫化二甲基秋蘭姆(DTD)、苯乙炔二硫化物(PADS)以及雙(0，0-二異丙氧基硫膦基)二硫化物(稱為Stec’ s試劑)。這些反應(yīng)主要用于通過亞磷酰胺法在固體載體上的寡核苷酸的自動合成中并且包括在寡聚物的延長反應(yīng)過程中所形成的磷三酯的氧化硫化作用。制造寡聚硫代磷酸酯的第二種方法是與H-膦酸酯法一起使用的并且涉及H-膦酸酯二酯與硫轉(zhuǎn)移試劑之間的反應(yīng)，其中帶有脂肪族或芳香族取代基的硫原子被轉(zhuǎn)移到磷上。在硫上的輔助取代基在該合成操作中起到了保護基團的作用并且通常在寡核苷酸制備的最后階段被切除。這種方法特別適合于在溶液中合成寡核苷酸。相比對于將未取代的硫原子引入到磷酯中可得的試劑的大量選擇，允許H-膦酸酯與受保護的硫進行硫化作用的基團的范圍是有限的(例如，Dreef等人，Synlett,481-483,1990, US 6，506，894)。在實施中，僅氰基乙基硫化物基團在寡核苷酸的溶液合成過程中被廣泛地用在這種反應(yīng)中，其中在每一步驟都進行色譜純化。寡核苷酸溶液合成的一個關(guān)鍵問題涉及在每個合成步驟中獲得高的底物轉(zhuǎn)化率與優(yōu)異特異性的必要性從而給出高純度的、處于有助于簡單純化之形式的產(chǎn)品，特別是避免了色譜法。鑒于缺少用于允許經(jīng)濟的溶液相合成的方法，這種溶液相技術(shù)目前似乎并未被用于商業(yè)規(guī)模的寡核苷酸合成。現(xiàn)在本發(fā)明披露了新的硫化劑，用于制造它們的方法以及它們在硫代磷酸酯寡核苷酸的經(jīng)濟并且合適的合成以及純化中(特別是在溶液中)的用途。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明具體地涉及在所附的權(quán)利要求中所描述的發(fā)明。本發(fā)明還涉及在本發(fā)明的說明書、特別是在實施例中實質(zhì)性描述的方法以及試劑。本發(fā)明具有許多超過P-S連鍵(linkage)形成的現(xiàn)有方法的優(yōu)點，特別是在所進行的寡核苷酸的合成中，優(yōu)選地通過H-膦酸酯法。例如，使用這種新試劑轉(zhuǎn)移到例如寡核苷酸上的殘基R可以有助于寡核苷酸的結(jié)晶或沉淀，從而允許使用最小量的或不使用色譜法而簡單地純化這些產(chǎn)品。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用這種方法制造的、具有從兩個到至少十六個核苷酸單元的寡核苷酸直到對所要求的寡核苷酸進行最終脫保護之后才有必要通過色譜法進行純化。中間體寡聚物可以足夠純地獲得以用于任選地在5’ -和3’ -位置上的脫保護作用以及(若希望的話)這些粗制脫保護材料與更高級的寡核苷酸的連接。在另一個優(yōu)點中，所披露的方法提供了使用多種硫化劑的途徑，這些硫化劑在使簡單的、無色譜法的純化的效率最大化的方面可以被用來修飾所形成的寡核苷酸的特性。根據(jù)本發(fā)明方法的又一個優(yōu)點在于例如硫保護的酰氧基亞甲基RC(O)-OCH2的簡單切除可以在溫和的條件下，例如使用伯胺或仲胺或受阻胺(例如正丙胺或叔丁胺)容易地完成。當(dāng)使用胺任選地處理時， 發(fā)生了自發(fā)切除，包括硫-亞甲基鍵，由此允許P = S鍵的干凈的形成。這些切除產(chǎn)物可以很容易地通過溶劑或水的洗滌而去除。例如酰氧基亞甲基基團的穩(wěn)定性特征(例如在堿性的非親核條件下)允許沿著合成路徑的選擇性脫保護反應(yīng)并且由此允許合成方案的更大的靈活性，例如通過阻止核堿基保護基團的切除。開發(fā)一種用于合成寡核苷酸(尤其是在溶液中)的經(jīng)濟方法的重要因素是在寡核苷酸鏈延長過程的每個步驟的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的純度。盡管根據(jù)本發(fā)明的方法確保了高的產(chǎn)物產(chǎn)率以及純度，每個延長周期總體上包括三個步驟并且有利的是除去即使少量的雜質(zhì)，否則這些雜質(zhì)將會沿著路徑而累積。由于有眾多的步驟，因此在每個步驟中使用色譜法在實際的大規(guī)模寡核苷酸合成中可能不是經(jīng)濟上可行的。因此，我們還披露了用于純化鏈延長過程中所形成的寡核苷酸的無色譜法的方法。本發(fā)明的一個第一具體目的是提供寡核苷酸，這些寡核苷酸包括至少一個包含 P-S-R鍵的核苷酸間連鍵以及至少兩個核苷，其中R符合以下化學(xué)式(I)
權(quán)利要求
1.一種寡核苷酸，該寡核苷酸包括至少一個包含P-S-R鍵的核苷酸間連鍵以及至少兩個核苷，其中R符合以下化學(xué)式(I)
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的寡核苷酸，其中R選自亞甲基酰氧基基團、亞甲基碳酸酯基團以及亞甲基氨基甲酸酯基團。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2中任一項所述的寡核苷酸，其中R符合化學(xué)式-CH2-O-C(O)-Rtl, 其中Rtl是C1-C20的、飽和的、不飽和的、雜環(huán)的或芳香族的烴殘基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2中任一項所述的寡核苷酸，其中R符合具有化學(xué)式-CH2-O-C(O)-NRxRy的亞甲基氨基甲酸酯基團，其中民和Ry獨立地選自烷基或(雜)芳基，優(yōu)選地Rx和Ry是烷基或者民和Ry —起形成3至8元環(huán)，任選地包含選自0、N和S的附加的環(huán)雜原子。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2中任一項所述的寡核苷酸，其中R符合具有化學(xué)式-CH2-O-C(O) ORx的亞甲基碳酸酯基團，其中民選自任選取代的烷基、環(huán)烷基以及(雜)芳基基團。
6.根據(jù)權(quán)利要求2至5中任一項所述的寡核苷酸，其中民選自低級烷基或環(huán)烷基 (C1-C7)，苯基，包括取代苯基，以及萘基團。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項所述的寡核苷酸，該寡核苷酸包括2至30個核苷酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項所述的寡核苷酸，該寡核苷酸包括選自以下各項的核苷核糖核苷、2’ -脫氧核糖核苷、2’ -取代的核糖核苷、2’ _4’ -鎖-核糖核苷、3’ -氨基-核糖核苷、3’ -氨基_2’ -脫氧核糖核苷。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項所述的寡核苷酸，作為藥物前體。
10.一種用于生產(chǎn)具有至少一個硫代磷酸酯連鍵的第二寡核苷酸的方法，該方法包括 (a)提供根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項所述的第一寡核苷酸并且(b)從所述第一寡核苷酸切除至少一個R基團以生產(chǎn)所述具有至少一個硫代磷酸酯連鍵的第二寡核苷酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中該R基團是通過使該第一寡核苷酸與堿在溶液中進行反應(yīng)而切除的，該堿優(yōu)選地選自烷基、環(huán)烷基以及芳香胺，更優(yōu)選地選自伯或仲烷基胺，最優(yōu)選地選自正丙基以及叔丁基胺。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中該堿是受阻的伯胺。
13.根據(jù)權(quán)利要求10至12中任一項所述的方法，其中該切除是在空間受阻的堿以及激活劑的存在下進行的，該激活劑總體上是N-雜芳香族的堿。
14.根據(jù)權(quán)利要求M所述的方法，其中該第一堿是烷基伯胺，其中烷基基團具有選自 Cl至C20直鏈或支鏈烷基的多個相同或不同的取代基。根據(jù)權(quán)利要求M所述的方法，其中該第一堿是芳基伯胺，其中芳基基團在2和/或6位上包括直鏈或支鏈的烷基或芳基基團。
15.根據(jù)權(quán)利要求M或25所述的方法，其中該激活劑是1，2，4_三唑或其他三唑以及四唑衍生物。
16.一種用于將根據(jù)權(quán)利要求對至沈中任一項所述的寡核苷酸進行脫保護的方法，其中該空間受阻的堿是叔丁基胺。
17.根據(jù)權(quán)利要求9至16中任一項所述的方法，進一步包括將所述具有至少一個硫代磷酸酯連鍵的第二寡核苷酸進行純化。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，該方法包括至少使該第二寡核苷酸進行沉淀。
19.根據(jù)權(quán)利要求17或18所述的方法，進一步包括將該第二寡核苷酸用溶劑進行萃取。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19中任一項所述的方法，該方法包括將該第二寡核苷酸溶解在極性有機溶劑中，該溶劑優(yōu)先選自二氯甲烷、氯仿、乙腈、丙酮以及吡啶。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所使用的溶劑體積的范圍是約0.5(n+l)mL至約 2. 0(n+l)mL，優(yōu)選為約1. 0(n+l)mL，其中η是硫代磷酸酯三酯連鍵的毫摩爾數(shù)。
22.根據(jù)權(quán)利要求20或21所述的方法，其中將該第二寡核苷酸的溶液使用非極性有機溶劑進行處理直至該溶液變渾濁，該溶劑優(yōu)先選自烴類、醚溶劑以及它們的混合物。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所使用的溶劑體積的范圍是約l(n+l)mL至約 4(n+l)mL，優(yōu)選為約2. 0 (n+l)mL，其中η是硫代磷酸酯三酯連鍵的毫摩爾數(shù)。
24.根據(jù)權(quán)利要求22或23所述的方法，其中將該渾濁的溶液使用沉淀助劑進行處理。
25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中該沉淀助劑是選自多種惰性多孔固體，這些固體優(yōu)先選自硅藻土、木炭、木纖維素、以及色譜固定相例如硅膠或氧化鋁。
26.根據(jù)權(quán)利要求M或25所述的方法，其中該沉淀助劑所使用的量值范圍是約 0. 25 (n+1) g至約1. 5 (n+1) g，優(yōu)選為約0. 75 (n+1) g，其中η是硫代磷酸酯三酯連鍵的毫摩爾數(shù)。
27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中，加入該沉淀助劑之后，將該混合物使用第二部分的非極性有機溶劑進行處理，其中所述部分的體積的范圍總體上是約l(n+l)mL至約 4(n+l)mL，優(yōu)選為約2. 0 (n+l)mL，其中η是硫代磷酸酯三酯連鍵的毫摩爾數(shù)。
28.根據(jù)權(quán)利要求對至27中任一項所述的方法，其中將在該沉淀步驟中獲得的固體材料過濾掉并且洗滌。
29.根據(jù)權(quán)利要求18至觀中任一項所述的方法，其中使用溶劑從含寡核苷酸的所述沉淀中萃取該寡核苷酸。
30.根據(jù)權(quán)利要求四所述的方法，其中該溶劑包括極性有機溶劑與水性介質(zhì)的混合物，該極性有機溶劑優(yōu)先選自乙腈、丙酮、THF、DMF、DMS0以及吡啶，該水性介質(zhì)優(yōu)選為水，并且其中極性有機溶劑/水性介質(zhì)的體積比優(yōu)選是約0. 5至約1. 5，更優(yōu)選約0. 7。
31.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中該R基團在人體或動物體內(nèi)被切除，該R基團優(yōu)先選自亞甲基酰氧基基團、亞甲基氨基甲酸酯基團或亞甲基碳酸酯基團。
32.—種具有化學(xué)式R”-S-R的硫化劑，其中R符合以下化學(xué)式(I)
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的硫化劑，其中R是選自亞甲基酰氧基基團、亞甲基氨基甲 酸酯基團、或亞甲基碳酸酯基團，并且R”是離去基團。
34.根據(jù)權(quán)利要求32或33中任一項所述的硫化劑，其中R是如權(quán)利要求1至6中任一 項中所描述的。
35.根據(jù)權(quán)利要求32至34中任一項所述的硫化劑，該硫化劑符合以下化學(xué)式(II)
36.根據(jù)權(quán)利要求32至35中任一項所述的硫化劑，其中R”是磺酰胺基團，優(yōu)選N-取 代的N烷基磺?；?。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的硫化劑，該硫化劑符合以下化學(xué)式(III)
38.根據(jù)權(quán)利要求32至35中任一項所述的硫化劑，其中R”是二羧基酰胺。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的硫化劑，該硫化劑符合以下化學(xué)式(IV)
40.一種用于合成寡核苷酸的方法，該方法包括使用根據(jù)權(quán)利要求32至39中任一項所 述的硫化劑來硫化所述寡核苷酸的前體的至少一個磷核苷酸間連鍵。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中該磷核苷酸間連鍵是H-膦酸酯二酯鍵。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，該方法進一步包括通過將H-膦酸酯單酯鹽與具有游 離羥基的受保護的核苷或寡核苷酸相偶聯(lián)以形成該H-膦酸酯二酯鍵。
43.根據(jù)權(quán)利要求41或42所述的方法，其中該偶聯(lián)是在溶液相中進行的。
44.一種用于合成根據(jù)權(quán)利要求32至37中任一項所述的硫化劑的方法，該方法包括 (a)使磺酰鹵素，優(yōu)選磺酰氯，與具有化學(xué)式R-S-C(O)-I的硫縮醛進行反應(yīng)，其中R是如在 權(quán)利要求1至6中所述的，并且&是有機殘基，該有機殘基優(yōu)先選自C1-C20的、任選地不飽 和的或芳香族的烴殘基，以產(chǎn)生具有化學(xué)式R-S-W的中間產(chǎn)物，其中W是鹵素，優(yōu)選Cl ；并 且(b)使所述中間產(chǎn)物與N-磺?；衔锘騈-?；衔镞M行反應(yīng)。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中該硫縮醛具有化學(xué)式 R1-C (0) -O-CH2-S-C (0) -R2，其中隊和&獨立地是C1-C20的、任選地不飽和的或芳香族的烴殘基，并且使所述硫縮醛與磺酰氯進行反應(yīng)以產(chǎn)生具有化學(xué)式R1-C(O)-O-CH2-S-Cl的中間產(chǎn)物，其中R1獨立地是C1-C20的、任選地不飽和的或芳香族的烴殘基。
46.根據(jù)權(quán)利要求44或45所述的方法，其中在步驟(b)中使該中間產(chǎn)物與具有化學(xué)式 R3-S (0) 2-NH-R4的N-磺?；衔镞M行反應(yīng)，其中民和R4獨立地是有機殘基，優(yōu)選C1-C20 的、任選地不飽和的或芳香族的烴殘基。
47.根據(jù)權(quán)利要求44或45所述的方法，其中在步驟(b)中使該中間產(chǎn)物與具有化學(xué)式…'}的N-酰基化合物進行反應(yīng)，其中Z是選自下組的基團，該組為-CH2-CH-、-CH =CH-、-CH2-O-CH2-,^jf^j 優(yōu)選地 Z 是基團。
48.根據(jù)權(quán)利要求45至47中任一項所述的方法，其中R1是選自低級烷基或環(huán)烷基 (C1-C7)，苯基，包括取代苯基，以及萘基團，更優(yōu)選乙基基團。
49.根據(jù)權(quán)利要求44至47中任一項所述的方法，其中&、民和R4是選自低級烷基或環(huán)烷基(C1-C7)，苯基，包括取代苯基，以及萘基團，更優(yōu)選甲基基團。
全文摘要
一種寡核苷酸，該寡核苷酸包括至少一個包含P-S-R鍵的核苷酸間連鍵以及至少兩個核苷，其中R符合化學(xué)式(I)，其中A是成對取代的亞烷基基團，優(yōu)選CH2，X和Y獨立地選自S和O，并且R0是選自下組，該組由以下各項組成任選地取代的、碳鍵合的有機殘基，例如特別是任選地取代的烷基或芳基、SRx、ORx和NRxRy，其中Rx和/或Ry是選自H以及有機殘基并且至少Rx是一個非H的取代基。本發(fā)明的另一個目的是可用于寡核苷酸制造的硫化劑及其制造。
文檔編號C07D207/48GK102307889SQ200980155288
公開日2012年1月4日 申請日期2009年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月23日
發(fā)明者何義剛, 維克托·索羅金, 維斯瓦夫·亞當(dāng)·馬祖爾 申請人:集潤德斯股份公司