專利名稱：有效的綴合物和親水性連接體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的連接體，所述新的連接體以連接體有助于增加藥物活性的方式將藥物(例如細胞毒劑)連接至細胞結(jié)合劑(例如抗體)。具體來講，本發(fā)明涉及新型的親水性連接體的用途，其中此類連接體在多種癌細胞類型中使細胞結(jié)合劑-藥物綴合物的效價或效能增強若干倍，所述癌細胞類型包括在細胞表面表達低數(shù)量抗原的癌細胞或?qū)χ委熡锌剐缘陌┌Y。本發(fā)明還涉及用于制備美登木素生物堿的方法，所述美登木素生物堿帶有硫醚部分和允許將所述美登木素生物堿連接至細胞結(jié)合劑的反應(yīng)性基團。
背景技術(shù)：
細胞毒性藥物的抗體綴合物正在被開發(fā)為靶標特異性治療劑。針對各種癌細胞表面抗原的抗體已與抑制各種主要細胞靶標的不同細胞毒劑綴合，所述細胞靶標如微管(美登木素生物堿、阿里他汀類(auristatins)、紫杉烷美國專利第5，208，020號；第 5，416，064 號；第 6，333，410 號；第 6，441，163 號；第 6，340，701 號；第 6，372，738 號；第 6，436，931 號；第 6，596，757 號；第 7，276. 497 號)、DNA(加利車霉素、阿霉素、CC-1065 類似物；美國專利第5，475，092號；第5，585，499號；第5，846，545號；第6，534，660號； 第6，756，397號；第6，630，579號)。與這些細胞毒性藥物中的一些的抗體綴合物正在臨床中積極地研究用于癌癥治療(Richart, A. D.和 Tolcher, A. W. , 2007, Nature Clinical Practice,4,245-255)。抗體-細胞毒劑綴合物通常通過對抗體上的反應(yīng)性部分(如賴氨酸氨基或半胱氨酸基團(通過還原天然二硫鍵產(chǎn)生或通過使用分子生物學方法將其它非天然半胱氨酸殘基構(gòu)造到抗體上產(chǎn)生))的初始修飾來制備。因此，首先用異雙功能連接體試劑(如前述的那些，示例為SPDB、SMCC和SIAB (美國專利第6，913，758號和美國專利公布第20050169933 號))修飾抗體以并入具有反應(yīng)性基團(如混合的吡啶基二硫、馬來酰亞胺或鹵代乙酰胺) 的連接體。在抗體中并入的反應(yīng)性連接體基團隨后與含有反應(yīng)性部分(如硫羥基)的細胞毒劑綴合。另一種綴合途徑是通過含有硫羥反應(yīng)性基團(如鹵代乙酰胺或馬來酰亞胺) 的細胞毒劑衍生物與細胞結(jié)合劑上的硫羥基的反應(yīng)。通過還原天然二硫殘基(R. Singh等人，Anal. Biochem.，2002，304，147-156)，或還原并入的二硫部分(經(jīng)由SPDP、琥珀酰亞胺基3-(2-批唳基二硫)丙酸酯)，隨后用二硫蘇糖醇還原(D. G. Gilliland等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA.，1980，77，4539-4543)，或通過并入其它非天然半胱氨酸殘基(J. B. Stimmel 等人，J. Biol. Chem.，2000，275，30445-30450)，將硫羥基團并入細胞結(jié)合劑(如抗體)，或通過與2-亞氨基四氫噻吩(R. Jue等人,Biochemistry, 1978,17, 5399-5406)或3-巰基丙亞胺酸甲酯(T. P. King等人，Biochemistry, 1978,17,1499-1506)反應(yīng)并入硫輕基。
為了在癌細胞內(nèi)遞送活性細胞毒劑，具有二硫鍵或硫醚鍵的抗體-細胞毒劑綴合物在細胞內(nèi)(大概在溶酶體中)裂解(H. K. Erickson等人,2006, Cancer Research, 66, 4626-4433)。除了殺滅靶細胞之外，具有可還原二硫鍵的抗體-細胞毒劑綴合物還殺滅在體外抗原陰性和抗原陽性細胞混合種群中和體內(nèi)異種移植模型中的鄰近的抗原陰性細胞， 這顯示靶細胞釋放的細胞毒劑提高對具有異源抗原表達的腫瘤中的鄰近非抗原表達細胞功效中的作用(Y. V. Kovtun 等人，Cancer Research，2006，66，3214-3221)。雖然抗體-細胞毒性藥物綴合物顯示體外細胞殺滅活性和體內(nèi)抗腫瘤活性，但是其效價在許多情況下降低，特別是當在靶癌細胞上的抗原表達低時，或當靶細胞對治療有抗性時。這在臨床情形中是很常見的情況，導(dǎo)致在患者中產(chǎn)生低至中度抗腫瘤活性。試圖克服抗性的可能方法是合成帶有親水性或疏脂性功能的新藥(參見G. Szokacs等人，Nature Reviews, 5 ;219_235，2006)。然而，這種方法是繁雜的且必須合成若干類似物，并且藥物結(jié)構(gòu)的修飾經(jīng)常引起生物活性的損失。因此需要一種不同的方法。本領(lǐng)域所述的用于制備細胞結(jié)合劑和藥物經(jīng)由不可裂解的連接體的細胞毒性綴合物的方法需要兩個反應(yīng)步驟(美國專利5，208，020和美國公布第2005/0169933號)。首先，用與細胞結(jié)合劑的反應(yīng)性基團(如賴氨酸殘基上的氨基或半胱氨酸殘基上的巰基)反應(yīng)的雙功能交聯(lián)劑修飾細胞結(jié)合劑(如抗體)以形成共價化學鍵。修飾細胞結(jié)合劑之后，純化產(chǎn)物以從未反應(yīng)的交聯(lián)劑分離所需的修飾的細胞結(jié)合劑。在第兩步驟(稱為綴合步驟) 中，將反應(yīng)性藥物衍生物(如含有硫羥的美登木素生物堿)加入修飾的細胞結(jié)合劑以與修飾的細胞結(jié)合劑反應(yīng)。這個反應(yīng)之后，需要再純化以從最終綴合物除去任何未反應(yīng)的藥物種類和其它副產(chǎn)物。所述多重反應(yīng)和純化步驟導(dǎo)致最終綴合物的低產(chǎn)率并且當考慮大規(guī)模地實現(xiàn)這些步驟時可能是昂貴和繁雜的。這些方法的其它缺點是當未反應(yīng)的交聯(lián)劑保持與未連接藥物的細胞結(jié)合劑連接時引入的綴合物異質(zhì)性。未反應(yīng)的交聯(lián)劑隨后可能進行其它副反應(yīng)(如水解和分子內(nèi)或分子間反應(yīng))。因此，需要可以在基本上一個反應(yīng)步驟中經(jīng)由不可裂解的鍵共價連接至細胞結(jié)合劑(如抗體)的功能化的反應(yīng)性藥物衍生物(如美登木素生物堿)。發(fā)明概述本發(fā)明通過設(shè)計以連接體有助于增加藥物活性的方式將藥物連接至細胞結(jié)合劑的新的連接體來解決抗性問題。因此，本發(fā)明改善藥物與細胞結(jié)合劑連接的方式，以致連接體設(shè)計提供對廣譜的腫瘤(特別是在低抗原表達或抗藥性腫瘤中)有活性的綴合物。本發(fā)明基于以下新發(fā)現(xiàn)當傳統(tǒng)的連接體(例如描述于美國專利公布第 20050169933號中的SMCC、SIAB等)通過并入聚乙二醇[PEGn，(-CH2CH2O) J間隔物而被修飾為親水性連接體時，細胞結(jié)合劑-藥物綴合物在多種癌細胞類型中的效價或效能意外地增加若干倍，所述癌細胞類型包括在細胞表面表達低數(shù)量抗原的癌細胞。此外，與前述的綴合物相比，這些含有PEG的綴合物對于對治療有抗性的細胞系出乎意料地更有效。此外，在抗體綴合物的情況下，親水性連接體的并入允許每個抗體分子綴合最多 15個藥物分子，產(chǎn)率高并且沒有聚集或沉淀。具有每個抗體分子連接最多15分子藥物的親水性連接體的這些綴合物高親合力地與靶抗原(類似于未修飾的抗體)結(jié)合。本發(fā)明還公開了對細胞結(jié)合劑的氨基或硫羥基有反應(yīng)性的新型的美登木素生物堿，以致與細胞結(jié)合劑的硫醚連接的美登木素生物堿綴合物可以在基本上一個反應(yīng)步驟中制備，而不用進行細胞結(jié)合劑的先前化學修飾。本發(fā)明公開了用于合成帶有硫醚部分和反應(yīng)性基團的新型的美登木素生物堿衍生物的方法。這些新型的美登木素生物堿可用于在基本上一個反應(yīng)步驟中制備與細胞結(jié)合劑的硫醚連接的綴合物。還公開了使用這些新型的反應(yīng)性美登木素生物堿制備細胞結(jié)合劑綴合物的方法。因此，本發(fā)明提供式(I)化合物或式(Γ )的特定化合物Z-X，_ (_CH2_CH2_0_)n_Yp_D (I)D_Yp_(_CH2_CH2_0_)n_Xi_Z (I，)其中Z表示可與細胞結(jié)合劑形成酰胺鍵或硫醚鍵的反應(yīng)性官能團；D表示藥物；X表示經(jīng)由硫醚鍵、酰胺鍵、氨基甲酸酯鍵或醚鍵與所述細胞結(jié)合劑連接的脂族基、芳基或雜環(huán)基團；Y表示經(jīng)由選自由硫醚鍵、酰胺鍵、氨基甲酸酯鍵、醚鍵、胺鍵、碳-碳鍵和腙鍵組成的組的共價鍵與所述藥物連接的脂族基、芳基或雜環(huán)基團；I 是 O 或 I ;P是O或I ;以及η是I至2000的整數(shù)。本發(fā)明的另一個方面是式(2)的細胞結(jié)合劑藥物綴合物或式(2’ )的特定化合物CB- [XK-CH2-CH2-O-) n-Yp-D] m (2)[D-Yp-(-CH2-CH2-O-) J1-Xjm-CB (2，)其中，CB表示細胞結(jié)合劑；D表示藥物；X表示經(jīng)由硫醚鍵、酰胺鍵、氨基甲酸酯鍵或醚鍵與所述細胞結(jié)合劑連接的脂族基、芳基或雜環(huán)基團；Y表示經(jīng)由選自由硫醚鍵、酰胺鍵、氨基甲酸酯鍵、醚鍵、胺鍵、碳-碳鍵和腙鍵組成的組的共價鍵與所述藥物連接的脂族基、芳基或雜環(huán)基團；I 是 O 或 I ;P 是 O 或 I ;m是2至15的整數(shù)；以及η是I至2000的整數(shù)。本發(fā)明的另一個方面是式(3)化合物或式(3’ )的特定化合物Z-X, _ (-CHg-CH2O-) n_Y_D (3)D-Y-(-CH2-CH2O-) n-Xi_Z (3，)其中Z表示可與細胞結(jié)合劑形成酰胺鍵或硫醚鍵的反應(yīng)性官能團；D表示藥物；
X表示經(jīng)由硫醚鍵、酰胺鍵、氨基甲酸酯鍵或醚鍵與所述細胞結(jié)合劑連接的脂族基、芳基或雜環(huán)基團；Y表示經(jīng)由二硫鍵與所述藥物連接的脂族基、非芳族雜環(huán)基或芳族雜環(huán)基團；I是O或I ;以及η是I至14的整數(shù)。本發(fā)明的另一個方面是式(4)的細胞結(jié)合劑藥物綴合物或式(4’ )的特定化合物CB- (Xi- (-CH2-CH2O-) n-Y~D) m (4)[D_Y_ (-CH2-CH2O-) n_X, ]m-CB (4，)其中，CB表示細胞結(jié)合劑；D表示藥物；X表示經(jīng)由硫醚鍵、酰胺鍵、氨基甲酸酯鍵或醚鍵與所述細胞結(jié)合劑連接的脂族基、芳基或雜環(huán)基團；Y表示經(jīng)由二硫鍵與所述藥物連接的脂族基、芳基或雜環(huán)基團；I是O或I ;以及m是3至8的整數(shù)；以及η是I至14的整數(shù)。本發(fā)明的再一個方面是用于治療對用所述方法的治療敏感的癌癥的方法，所述方法包括對有需要的患者腸胃外施用有效劑量的包含式(2)或(4)的綴合物的組合物。在本發(fā)明的又一個方面中，提供了具有帶有反應(yīng)性基團且由式(5)所示的硫醚部分的新型的美登木素生物堿D，-Y’ -V-Q-W-Z，(5)其中D’表示帶有巰基的美登木素生物堿，如Ν2’ -去乙?；?Ν2’ -(3-巰基_1_氧代丙基)_美登素(DMl)或Ν2’-去乙酰基-Ν2’-(4-巰基-4-甲基-I-氧代戊基)美登素(DM4)；Y’表示硫醚鍵V是具有I至10個碳原子的任選的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基或炔基；Q表示任選的芳族或雜環(huán)部分；W是具有I至10個碳原子的任選的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基或炔基；以及V表示胺或巰基反應(yīng)性基團。帶有硫醚部分的反應(yīng)性美登木素生物堿衍生物由帶有巰基的美登木素生物堿 (如DMl和DM4)和異雙功能交聯(lián)劑制備。反應(yīng)由以下化學方程式表示D，+V-V-Q-W-Z，— D，-Y，-V-Q-W-Zj其中D’表示帶有巰基的美登木素生物堿，如Ν2’ -去乙?；?Ν2’ - (3-巰基-I-氧代丙基)_美登素(DMl)或Ν2’-去乙酰基-Ν2’-(4-巰基-4-甲基-I-氧代戊基)美登素(DM4)；V是具有I至10個碳原子的任選的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基或炔基；Q表示任選的芳族或雜環(huán)部分；W是具有I至10個碳原子的任選的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基或炔基；
V是胺或巰基反應(yīng)性基團；Y"表示巰基反應(yīng)性部分；以及Y’表示介于帶有巰基的美登木素生物堿和交聯(lián)劑之間的硫醚鍵。本發(fā)明還公開了用于制備經(jīng)由不可裂解的鍵連接的美登木素生物堿和細胞結(jié)合劑的細胞毒性綴合物(式10)的方法，所述方法包括使細胞結(jié)合劑與式Z’ -W-Q-V-Y’ -D’ 化合物反應(yīng)以提供式CB-(Z" -W-Q-V-Y’ -D’ )m的細胞結(jié)合劑綴合物，其中，V表示胺或巰基反應(yīng)性基團；W是具有I至10個碳原子的任選的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基或炔基；Q表示任選的芳族或雜環(huán)部分；V是具有I至10個碳原子的任選的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基或炔基；Y’表示硫醚鍵；D’表示帶有巰基的美登木素生物堿，如N2’ -去乙酰基-N2’ -(3-巰基_1_氧代丙基)_美登素(DMl)或N2’-去乙?；?N2’-(4-巰基-4-甲基-I-氧代戊基)美登素(DM4)；CB表示細胞結(jié)合劑；I"表示酰胺鍵；以及m是2至8的整數(shù)。所述細胞結(jié)合劑美登木素生物堿綴合物可進一步純化。附圖簡述圖I示出本發(fā)明的代表性的含有PEG的硫代琥珀酰亞胺基連接的綴合物的結(jié)構(gòu)示意圖(mAb =單克隆抗體)。圖2示出本發(fā)明的代表性的含有PEG的硫代乙酰氨基連接的綴合物的結(jié)構(gòu)示意圖。圖3示出本發(fā)明的代表性的含有PEG的二硫連接的化合物的結(jié)構(gòu)示意圖。圖4示出本發(fā)明的含有PEG的硫代琥珀酰亞胺基連接的綴合物的合成方案。圖5示出本發(fā)明的含有PEG的硫代乙酰氨基連接的綴合物的合成方案。圖6示出本發(fā)明的含有PEG的二硫連接的化合物的合成方案a.)用于與細胞結(jié)合劑一步綴合的含有PEG的二硫連接的化合物的合成；和b.)異雙功能的含有PEG的二硫連接的交聯(lián)化合物的合成。圖7示出本發(fā)明的含有PEG的硫代琥珀酰亞胺基連接的綴合物的綴合過程(一步綴合)。圖8示出本發(fā)明的含有PEG的硫代琥珀酰亞胺基連接的綴合物的綴合過程(兩步綴合)。圖9示出本發(fā)明的含有PEG的硫醚連接的(硫代乙酰氨基連接的)綴合物的綴合過程(一步綴合)。

圖10示出本發(fā)明的含有PEG的硫醚連接的(硫代乙酰氨基連接的)綴合物的綴合過程(兩步綴合)。圖11示出本發(fā)明的含有PEG的二硫連接的綴合物的綴合過程(一步綴合)。
圖12示出本發(fā)明的含有PEG的二硫連接的綴合物的綴合過程(兩步綴合)。圖13示出本發(fā)明的含有PEG的巰基反應(yīng)性硫代琥珀酰亞胺基連接的化合物的合成方案。圖14示出本發(fā)明的含有PEG的硫代琥珀酰亞胺基連接的綴合物的綴合過程(一步綴合)。圖15示出本發(fā)明的含有PEG的硫代琥珀酰亞胺基連接的綴合物的綴合過程(兩步綴合)。圖16示出本發(fā)明的含有PEG的巰基反應(yīng)性硫代乙酰氨基連接的化合物的合成方案；a.)用于一步綴合的含有PEG的巰基反應(yīng)性硫代乙酰胺連接的化合物的合成；和b.)用于兩步綴合的異雙功能的含有PEG的巰基反應(yīng)性交聯(lián)化合物的合成。圖17示出本發(fā)明的含有PEG的硫代乙酰氨基連接的綴合物的綴合過程(一步綴合)。圖18示出本發(fā)明的含有PEG的硫代乙酰氨基連接的綴合物的綴合過程(兩步綴合)。圖19示出本發(fā)明的含有PEG的巰基反應(yīng)性硫醚連接的化合物的合成方案a.)用于一步綴合的含有PEG的巰基反應(yīng)性硫代乙酰氨基連接的化合物的合成；和b.)用于兩步綴合的同雙功能的含有PEG的巰基反應(yīng)性交聯(lián)化合物的合成。圖20示出本發(fā)明的含有PEG的硫代乙酰氨基連接的綴合物的綴合過程(一步綴合)。圖21示出本發(fā)明的含有PEG的硫代乙酰氨基連接的綴合物的綴合過程(兩步綴合)。
(MS)。
(SEC)。圖24示出HuAb-PEG4Mal-DMl綴合物(10. 7美登木素生物堿/抗體)的FACS結(jié)合類似于與未修飾的抗體的結(jié)合。圖25示出抗EpCAM抗體-美登木素生物堿綴合物對抗多藥物性C0L0205-MDR細胞的細胞毒性。圖26示出抗CanAg抗體-美登木素生物堿綴合物對抗多藥物性C0L0205-MDR細胞的細胞毒性。
圖22示出去糖基化HuAb-PEG4MaI-DMl綴合物(10. 7DM1/AL·,平均值)的質(zhì)譜23示出HuAb-PEG4MaI-DMl綴合物(10. 7DM1/AL·,平均值)的尺寸排阻層析法圖
細胞毒性。圖活性。圖
腫瘤活性。
27示出抗CD56抗體-美登木素生物堿綴合物對Molp-8多發(fā)性骨髓瘤細胞的
28示出抗EpCAM抗體-美登木素生物堿綴合物對HCT15細胞的細胞毒性。
29示出抗EpCAM抗體-美登木素生物堿綴合物對C0L0205mdr細胞的細胞毒性。 30示出抗EpCAM抗體美登木素生物堿綴合物對HCT15異種移植的體內(nèi)抗腫瘤
31示出抗EpCAM抗體美登木素生物堿綴合物對C0L0205mdr異種移植的體內(nèi)抗
120123]圖32示出抗EpCAM抗體美登木素生物堿綴合物對C0L0205異種移植的體內(nèi)抗腫
瘤活性。
0124]圖33示出抗CanAg抗體美登木素生物堿綴合物對C0L0205mdr異種移植的體內(nèi)抗腫瘤活性。
0125]圖34示出具有最多17個D/A的抗CanAg抗體(huC242) _PEG24_Mal_DMl綴合物的結(jié)合。
0126]圖35示出具有4至17個D/A的抗CanAg抗體(huC242) _PEG24_MaI_DMl綴合物對COLO 205細胞的體外效價。
0127]圖36示出具有4至17個D/A的抗CanAg抗體(huC242) _PEG24_MaI_DMl綴合物對抗多藥物性(pgp+) C0L0205-MDR細胞的體外效價。
0128]圖37示出抗EGFR抗體-美登木素生物堿綴合物對U0-31細胞的細胞毒性。
0129]圖38示出抗體-PEG4-Mal-DM1的血漿藥代動力學。
0130]圖39示出本發(fā)明的硫代琥珀酰亞胺基連接的綴合物的結(jié)構(gòu)示意圖(mAb =抗體， =2-8)。
0131]圖40示出本發(fā)明的硫代乙酰氨基連接的綴合物的結(jié)構(gòu)示意圖(mAb =抗體，m = 2-8)。
0132]圖41示出用本發(fā)明的化合物制備的硫代琥珀酰亞胺基連接的綴合物的綴合過程 mAb =抗體,m = 2-8)。
0133]圖42示出用本發(fā)明的化合物制備的硫代乙酰氨基連接的綴合物的綴合過程(mAb =抗體，m = 2-8) ο
0134]圖43示出本發(fā)明的胺反應(yīng)性硫代琥珀酰亞胺基連接的化合物的合成方案。
0135]圖44示出制備在馬來酰亞胺和NHS酯之間含有直鏈烴的胺反應(yīng)性硫代琥珀酰亞胺基連接的化合物的合成方案。
0136]圖45示出用本發(fā)明的化合物制備的去糖基化mAb-SMCC-DMl綴合物(3. 42DM1/ mAb，平均值)的質(zhì)譜圖(MS)。
0137]圖46示出在馬來酰亞胺和NHS酯之間含有環(huán)烷基的胺反應(yīng)性硫代琥珀酰亞胺基連接的化合物的兩步制備法的合成方案。
0138]圖47示出在馬來酰亞胺和NHS酯之間含有環(huán)烷基的胺反應(yīng)性不可裂解的硫代琥珀酰亞胺基連接的化合物的兩步制備法的合成方案。
0139]
0140]
0141]
_8)。
0142] mAb =
0143]案。
圖48示出制備本發(fā)明的硫代乙酰氨基連接的化合物的合成方案。
圖49示出本發(fā)明的硫代乙酰氨基連接的化合物的兩步制備法的合成方案。
圖50示出本發(fā)明的硫代琥拍酰亞胺基連接的綴合物的結(jié)構(gòu)(mAb =抗體，m =
圖51示出用本發(fā)明的化合物制備的硫代琥珀酰亞胺基連接的綴合物的綴合過程 :抗體，m = 2-8) ο
圖52示出制備本發(fā)明的巰基反應(yīng)性硫代琥珀酰亞胺基連接的化合物的合成方圖 53 示出具有 3. 8 或 D/A 的抗 CanAg (huC242)-Mal-(CH2)6-Mal-DMl 綴合物與抗
原陽性C0L205細胞結(jié)合。
圖54 示出具有 3. 8D/A 的抗 CanAg 抗體(huC242) -Mal-(CH2) 6_Mal_DM I 綴合物對抗原陽性C0L0205細胞有效但比對抗原陰性Namalwa細胞的有效性低。發(fā)明詳述本發(fā)明公開了以下新發(fā)現(xiàn)通過聚乙二醇或聚環(huán)氧乙烷連接體((-CH2CH2O)n)與藥物(例如細胞毒劑)連接的細胞結(jié)合劑(如抗體)的綴合物顯示對靶癌細胞的細胞毒性比基于與具有典型的脂肪族連接體和類似藥物負載的傳統(tǒng)細胞結(jié)合劑藥物綴合物比較所預(yù)期的大若干倍。重要的是，本發(fā)明所述的綴合物對抗多藥物性(mdr)癌細胞(其對用細胞毒性藥物的治療敏感性差)是非常有力或有效的。癌癥治療造成解決用不同化學治療劑進行多輪治療之后經(jīng)常遇到的抗藥性機制的障礙。在癌細胞中觀察到的一種稱為抗多藥物性的此類機制是由ATP結(jié)合盒(ABC)轉(zhuǎn)運蛋白的藥物輸出增加所引起(C.Drumond， B. I. Sikic, J Clin. Oncology,1999,17,1061-1070, G, Szokacs 等，Nature Reviews,5 ； 219-234,2006)。解決這些抗藥性機制的治療(如通過癌細胞干擾或解決藥物的這種流出) 將是非常有用的。將細胞結(jié)合劑和細胞毒性藥物的PEG連接的綴合物對于抗多藥物性癌細胞的細胞毒性進行評估以檢測PEG連接體是否賦予針對這些抗性細胞的任何優(yōu)勢。在針對 mdr細胞的這些分析中，與衍生自常規(guī)的連接體的非常低效的綴合物相比，細胞結(jié)合劑和細胞毒性藥物的PEG連接的綴合物顯示對mdr細胞出乎意料地有效的細胞殺滅。此外，本發(fā)明的綴合物還在用抗多藥物性腫瘤細胞建立的動物模型中顯示顯著更高的抗腫瘤活性。使用親水性聚乙二醇或聚環(huán)氧乙烷連接體(PEG或PEO ； (-CH2CH2O) n)還允許每個細胞結(jié)合劑分子并入相對大量的藥物，在大于治療使用所希望的lmg/ml濃度下具有大于 90%的高蛋白單體水平。此外，具有一定范圍的細胞毒性藥物負載(每個細胞結(jié)合劑連接的從較小值2到較大數(shù)(例如15個藥物))的細胞結(jié)合劑的聚乙二醇(PEG)連接的綴合物對靶癌細胞顯示的細胞毒性比基于綴合物增加的藥物負載而在藥物遞送的化學計量增加所預(yù)期的大大增加。在本發(fā)明中描述了細胞結(jié)合劑和具有PEG間隔物的藥物的綴合物，與具有類似藥物負載的傳統(tǒng)制備的綴合物相比，其顯示對靶癌細胞的細胞毒性的超化學計量增加到多達260-650倍的效價增強(參見，例如圖29)。因此，在本發(fā)明的一個方面中，描述了帶有具有聚乙二醇間隔物(_0120120)11和能夠與細胞結(jié)合劑反應(yīng)的反應(yīng)性基團的連接體的藥物。在這方面中具體考慮的是式(I)的修飾的化合物或式(Γ )的特定化合物 Z-X，_ (_CH2_CH2_0_) n_Yp_D (i)D_Yp_(_CH2_CH2_0_)n_Xi_Z (I，)其中Z表示可與細胞結(jié)合劑形成酰胺鍵或硫醚鍵的反應(yīng)性官能團；D表示藥物；X表示經(jīng)由硫醚鍵、酰胺鍵、氨基甲酸酯鍵或醚鍵與所述細胞結(jié)合劑連接的脂族基、芳基或雜環(huán)基團；Y表示經(jīng)由選自由硫醚鍵、酰胺鍵、氨基甲酸酯鍵、醚鍵、胺鍵、碳-碳鍵和腙鍵組成的組的共價鍵與所述藥物連接的脂族基、芳基或雜環(huán)基團；I 是O或 I;P是O或I;以及
η是I至2000的整數(shù)。
優(yōu)選地，將Y連接至藥物的共價鍵是硫醚鍵或酰胺鍵。
優(yōu)選地，η是I至100的整數(shù)。更優(yōu)選地，η是I至14的整數(shù)。在最優(yōu)選的方面中，η是I至4的整數(shù)。
在本發(fā)明的第二方面中，描述了具有聚乙二醇連接體(-CH2CH2O) 的細胞結(jié)合劑和藥物的新型的綴合物。這些綴合物比具有傳統(tǒng)連接體和等同藥物負載的綴合物對癌細胞更有效。
在一個優(yōu)選方面中具體考慮的是細胞結(jié)合劑與式(2)的藥物的綴合物或式(2’ )的特定化合物
CB- [X，- (-CH2-CH2-O-) n-Yp-D] m (2)
[D-Yp- (-CH2-CH2O-) n-X , ] m-CB (T)
其中
CB表示細胞結(jié)合劑；
D表示藥物；
X表示經(jīng)由硫醚鍵、酰胺鍵、氨基甲酸酯鍵或醚鍵與所述細胞結(jié)合劑連接的脂族基、芳基或雜環(huán)基團；
Y表示經(jīng)由選自由硫醚鍵、酰胺鍵、氨基甲酸酯鍵、醚鍵、胺鍵、碳-碳鍵和腙鍵組成的組的共價鍵與所述藥物連接的脂族基、芳基或雜環(huán)基團；
I是O或I ;
P是O或I;以及
m是2至15的整數(shù)；以及
η是I至2000的整數(shù)。
優(yōu)選地，所述共價鍵是硫醚鍵或酰胺鍵。
優(yōu)選地，m是3至8的整數(shù)。
優(yōu)選地，η是I至100的整數(shù)。更優(yōu)選地，η是I至14的整數(shù)。在最優(yōu)選的方面中，η是I至4的整數(shù)。
本發(fā)明還基于以下新發(fā)現(xiàn)在抗體綴合物的情況下，其中抗體經(jīng)由二硫鍵連接至
細胞毒性藥物，在免疫綴合物效價或效能的增強中，在連接的藥物數(shù)目和聚乙二醇間隔物長度之間有重要的相關(guān)性。這種連接體設(shè)計的其它益處是抗體-藥物綴合物的希望的高單體比例和極少的聚集。因此，在一個方面中，本發(fā)明基于以下重要發(fā)現(xiàn)當用于二硫連接的綴合物的聚乙二醇間隔物由2和8個之間的乙烯氧基團組成并且連接的藥物數(shù)目在3至8 范圍內(nèi)時，其給予抗體-藥物綴合物最高的生物學效價或效能并且還給予希望的高單體含量。在一個優(yōu)選方面中，描述了經(jīng)由二硫基(-S-S-)連接的細胞毒性藥物，其具有帶有能夠與細胞結(jié)合劑反應(yīng)的官能團的短聚乙二醇間隔物((CH2CH2O)n = 1_14)。在這方面中具體考慮的是式(3)的修飾的細胞毒性化合物或式(3’ )的特定化合物Z-XH-CH2-CH2O-) n-Y-D (3)D-Y-(-CHg-CH2O-) n_X, _Z (3，)
其中Z表示可與細胞結(jié)合劑形成酰胺鍵或硫醚鍵的反應(yīng)性官能團；D表示藥物；X表示經(jīng)由硫醚鍵、酰胺鍵、氨基甲酸酯鍵或醚鍵與所述細胞結(jié)合劑連接的脂族基、芳基或雜環(huán)基團；Y表示經(jīng)由二硫鍵與所述藥物連接的脂族基、非芳族雜環(huán)基或芳族雜環(huán)基團；I是O或I;以及η是I至14的整數(shù)。優(yōu)選地，η是2至8的整數(shù)。在另一個優(yōu)選方面中，描述了經(jīng)由二硫基(-S-S-)連接的細胞結(jié)合劑和藥物的綴合物，其具有帶有窄范圍的3-8個藥物負載的聚乙二醇間隔物((CH2CH2O)η =卜14)，其顯示對癌細胞相對高效力的生物學活性并且具有高綴合產(chǎn)率和高單體比以及極少的蛋白質(zhì)聚集的希望的生化性質(zhì)。在這方面中具體考慮的是式(4)的細胞結(jié)合劑藥物綴合物或式(4’ )的特定化合物CB- (XK-^H2-CH2O-V-Y-D) ln (4)[D_Y_ (-CH2-CH2O-) n_X, ]m-CB (4，)其中CB表示細胞結(jié)合劑；D表示藥物；X表示經(jīng)由硫醚鍵、酰胺鍵、氨基甲酸酯鍵或醚鍵與所述細胞結(jié)合劑連接的脂族基、芳基或雜環(huán)基團；Y表示經(jīng)由二硫鍵與所述藥物連接的脂族基、芳基或雜環(huán)基團；I 是O或 I;m是3至8的整數(shù)；以及η是I至14的整數(shù)。優(yōu)選地，m是3至6的整數(shù)。此外，優(yōu)選地，η是2至8的整數(shù)。在本發(fā)明中，藥物是親脂性分子，當其與細胞結(jié)合劑(如抗體)綴合時經(jīng)常由于蛋白質(zhì)聚集或沉淀而引起產(chǎn)率的損失。增加每個細胞結(jié)合劑的藥物的數(shù)目通常導(dǎo)致更嚴重的蛋白質(zhì)聚集和沉淀，并且進而導(dǎo)致差的單體百分率和低的產(chǎn)率。與具有常規(guī)的連接體的典型綴合物性質(zhì)相比，PEG連接體引起細胞結(jié)合劑與藥物的綴合物在可用于治療應(yīng)用的Img/ ml或更高的高濃度下的單體百分率(> 90%單體)和產(chǎn)率(> 70% )的希望的改善。此外，這些綴合物在40°C下延期儲存是穩(wěn)定的。在本發(fā)明中，公開了具有帶有反應(yīng)性基團的硫醚部分的新型的美登木素生物堿， 如由式(5)表示的那些化合物D，-Y’ -V-Q-W-Z，(5)其中V是優(yōu)選具有I至10個碳原子的任選的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基或炔基；更優(yōu)選地是具有1-5個碳原子的直鏈烷基，并且更優(yōu)選地，V是一碳烷基(CH2)；W是具有I至10個碳原子的任選的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基或炔基；更優(yōu)選具有2-8個碳原子，更優(yōu)選地，W是環(huán)己基；D’表示帶有巰基的美登木素生物堿，并且更優(yōu)選地，其選自DM1、DM3和DM4 ；Y’表示硫醚鍵；Q表示任選的芳族或雜環(huán)部分，并且優(yōu)選Q不存在；Z’表示選自(但不限于)以下的胺反應(yīng)性基團或硫羥反應(yīng)性基團N-羥基琥珀酰亞胺酯、N-輕基磺基琥拍酰亞胺酯(N-hydroxysulfosuccinimide ester)、對硝基苯酯或鄰硝基苯酯、二硝基苯酯、五氟苯酯和磺基四氟苯酯；馬來酰亞胺或齒代乙酰胺，更優(yōu)選地，Z 是N-羥基琥珀酰亞胺、N-羥基磺基琥珀酰亞胺酯或馬來酰亞胺。在另一個實施方案中，帶有硫醚部分的反應(yīng)性美登木素生物堿衍生物由帶有巰基的美登木素生物堿(如DMl和DM4)和異雙功能交聯(lián)劑制備。反應(yīng)順序由式(6)所示D’ + Y " -V-Q-W-Zj — D，-Y，-V-Q-W-Z，(6)其中V是優(yōu)選具有I至10個碳原子的任選的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基或炔基；更優(yōu)選是具有1-5個碳原子的直鏈烷基，并且更優(yōu)選地，V是一碳烷基(CH2)；W是具有I至10個碳原子的任選的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基或炔基；更優(yōu)選具有2-8個碳原子，更優(yōu)選地，W是環(huán)己基；Y"表示選自馬來酰亞胺或鹵代乙酰胺的硫羥反應(yīng)性基團，優(yōu)選是馬來酰亞胺；D’表示帶有巰基的美登木素生物堿，并且更優(yōu)選地，其選自DM1、DM3和DM4 ；Y’表示硫醚鍵；Q表示任選的芳族或雜環(huán)部分，并且優(yōu)選Q不存在；V表示選自但不限于以下的胺反應(yīng)性基團或硫羥反應(yīng)性基團N-羥基琥珀酰亞胺酯、N-羥基磺基琥珀酰亞胺酯、對硝基苯酯或鄰硝基苯酯、二硝基苯酯、五氟苯酯和磺基四氟苯酯；馬來酰亞胺或鹵代乙酰胺，更優(yōu)選地，Z是N-羥基琥珀酰亞胺酯、N-羥基磺基琥珀酰亞胺酯或馬來酰亞胺。Y’表示硫醚鍵。本發(fā)明還提供一種用于制備經(jīng)由不可裂解的鍵連接的美登木素生物堿和細胞結(jié)合劑的細胞毒性綴合物的方法，所述方法包括使細胞結(jié)合劑與式Z’ -W-Q-V-Y’ -D’化合物反應(yīng)以提供式CB_(Z" -W-Q-V-Y’ -D’ )m的細胞結(jié)合劑綴合物，其中W是具有I至10個碳原子的任選的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基或炔基；更優(yōu)選具有2-8個碳原子，更優(yōu)選地，W是環(huán)己基；Q表示任選的芳族或雜環(huán)部分，并且優(yōu)選Q不存在；V是優(yōu)選具有I至10個碳原子的任選的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基或炔基；更優(yōu)選是具有1-5個碳原子的直鏈烷基，并且更優(yōu)選地，V是一碳烷基(CH2)；Y’表示硫醚鍵；D’表示帶有巰基的美登木素生物堿，并且更優(yōu)選地，其選自DM1、DM3和DM4 ；CB表示選自以下的細胞結(jié)合劑抗體、單鏈抗體、抗體片段、肽、生長因子、激素、維生素或錨蛋白重復(fù)蛋白(DARPins),所述細胞結(jié)合劑優(yōu)選是抗體或抗體片段或Darpin ；V表示選自但不限于以下的胺反應(yīng)性基團或硫羥反應(yīng)性基團N-羥基琥珀酰亞胺酯、N-羥基磺基琥珀酰亞胺酯、對硝基苯酯或鄰硝基苯酯、二硝基苯酯、五氟苯酯和磺基四氟苯酯；馬來酰亞胺或鹵代乙酰胺，更優(yōu)選地，Z是N-羥基琥珀酰亞胺酯、N-羥基磺基琥珀酰亞胺酯或馬來酰亞胺；Z "表示硫醚鍵或酰胺鍵；所述方法可通過使細胞結(jié)合劑(如抗體)在緩沖水溶液(任選含有最多20% 有機溶劑)中的溶液與在有機溶劑或有機溶劑和緩沖水溶液或水的混合物中的式
V-W-Q-V-Y’ -D ’化合物混合并使反應(yīng)進行5min至72小時來進行。所述綴合物可通過色譜法、滲析法、切向流過濾法或這些的組合進一步純化在所有方面中，“脂肪族基團”定義為烷基、烯基或炔基。烷基是可為直鏈或支鏈的脂肪族烴基，優(yōu)選在鏈或環(huán)中具有I至20個碳原子，優(yōu)選具有3至10個碳原子。更優(yōu)選的烷基在鏈中具有I至12個碳原子?！爸ф湣北硎具B接至直鏈烷基鏈的一個或多個低級烷基 (如甲基、乙基或丙基)。不例性燒基包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、正戍基、3-戊基、辛基、壬基、癸基、環(huán)戊基和環(huán)己基。烯基是含有碳-碳雙鍵的脂肪族烴基并且其可以是直鏈或支鏈的，優(yōu)選在鏈中具有2至15個碳原子。更優(yōu)選的烯基在鏈中具有2至12個碳原子；并且更優(yōu)選在鏈中具有約2至4個碳原子。示例性烯基包括乙烯基、丙烯基、正丁烯基、異丁烯基、3-甲基丁-2-烯基、正戊烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基。炔基是含有碳-碳三鍵的脂肪族烴基并且其可以是直鏈或支鏈的，優(yōu)選在鏈中具有2至15個碳原子。更優(yōu)選的炔基在鏈中具有2至12個碳原子；并且更優(yōu)選在鏈中具有 2至4個碳原子。示例性炔基包括乙炔基、丙炔基、正丁炔基、2- 丁炔基、3-甲基丁炔基、正戊炔基、庚炔基、辛炔基和癸炔基。如本文所用，術(shù)語“芳基”表示由具有6至14個碳原子(優(yōu)選具有6至10個碳原子)的芳族單環(huán)或多環(huán)烴環(huán)系統(tǒng)組成的取代或未取代的芳基。示例性芳基包括苯基和萘基。取代基包括(但不限于)燒基、齒素、硝基、氣基、輕基和燒氧基。鹵素包括氟、氯、溴和碘原子。氟和氯原子是優(yōu)選的。如本文所用，術(shù)語“雜環(huán)基團”是指飽和的、部分不飽和的或不飽和的、非芳香族穩(wěn)定的3至14元(優(yōu)選5至10元)單、雙或多環(huán)，其中環(huán)的至少一元是雜原子，或具有至少一個雜原子的芳香族(優(yōu)選5至10元)單、二或多環(huán)。通常雜原子包括(但不限于)氧、 氮、硫、硒和磷原子。優(yōu)選的雜原子是氧、氮和硫。優(yōu)選的雜環(huán)基團包括(但不限于)吡咯烷基、吡唑烷基、咪唑烷基、環(huán)氧乙烷基、四氫!咲喃基、~■氧戍環(huán)基、四氧批喃基、~■卩惡燒基、_■氧戍環(huán)基、喊唳基、喊嚷基、嗎琳基、批喃基、咪唑啉基、吡咯啉基、吡唑啉基、噻唑烷基、四氫噻喃基、二噻烷基、硫代嗎啉基、二氫吡喃基、四氫吡喃基、二氫吡喃基、四氫吡啶基、二氫吡啶基、四氫嘧啶基、二氫硫代吡喃基、氮雜環(huán)庚烷基、吡咯基、吡啶基、吡唑基、噻吩基、嘧啶基、吡嗪基、四唑基、吲哚基、喹啉基、嘌呤基、咪唑基、噻吩基、噻唑基、苯并噻唑基、呋喃基、苯并呋喃基、1，2，4-噻二唑基、異噻唑基、三唑基、四唑基、異喹啉基、苯并噻吩基、異苯并呋喃基、吡唑基、咔唑基、苯并咪唑基和異噁唑基、吡啶基-N-氧化物以及與苯基縮合所得的稠合系統(tǒng)。由X和Y表不的脂族基、芳基和雜環(huán)基團還可具有帶電荷的取代基。帶電荷的取代基可以是選自(但不限于)羧酸根、磺酸根和磷酸根的帶負電荷的取代基，或選自叔氨基或季氨基的帶正電的取代基。如本文所用，表達“連接至細胞結(jié)合劑”是指經(jīng)由合適的連接基團或其前體與細胞結(jié)合劑連接的包含至少一種藥物衍生物的綴合物分子。優(yōu)選的連接基團是硫羥鍵或二硫鍵或其前體。如本文所用，給定基團的“前體”是指可通過任何去保護、化學修飾或偶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生該基團的任何基團。例如，前體可以是適當保護的官能團，示例為硫酯或硫醚為硫羥的前體。如本文所用，術(shù)語“反應(yīng)性官能團”是指胺、硫羥或羥基反應(yīng)性官能團。換言之，反應(yīng)性官能團可與存在于細胞結(jié)合劑上的胺、巰基(硫羥)或羥基反應(yīng)。例如，對于胺反應(yīng)性官能團，所述官能團可以是反應(yīng)性羧酸酯(包括N-琥珀酰亞胺基酯、N-磺基琥珀酰亞胺基酯、N-苯鄰二甲酰亞胺基酯、N-磺基苯鄰二甲酰亞胺基酯、2-硝基苯基酯、4-硝基苯基酯、 2,4- 二硝基苯基酯、3-磺基-4-硝基苯基酯、3-羧基-4-硝基苯基酯、四氟苯基酯)、反應(yīng)性磺酸衍生物或反應(yīng)性硫酯以得到酰胺鍵；對于硫羥反應(yīng)性官能團，所述官能團可以是馬來酰亞胺、鹵代乙酰胺或乙烯基砜以得到硫醚鍵；以及，對于羥基反應(yīng)性官能團，所述官能團可以是反應(yīng)性羧酸酯以得到酯鍵。A.具有親水性連接體的修飾的藥物和修飾的細胞結(jié)合劑連接體是能夠以穩(wěn)定的共價方式將藥物(如美登木素生物堿)連接至細胞結(jié)合劑的任何化學部分。在藥物或細胞結(jié)合劑保持活性的條件下，連接體可易于進行酸誘導(dǎo)的裂解、光誘導(dǎo)的裂解、肽酶誘導(dǎo)的裂解、酯酶誘導(dǎo)的裂解和二硫鍵裂解，或?qū)λ鼈兓旧嫌锌剐浴D1、2和3示例性地提供本發(fā)明的綴合物的結(jié)構(gòu)示意圖。在藥物和細胞結(jié)合劑之間形成連接體的包含親水性PEG鏈的合適的交聯(lián)劑在本領(lǐng)域是熟知的或可商購的(例如來自Quanta Biodesign, Powell, Ohio)。也可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標準合成化學技術(shù)由本身可商購的PEG來合成合適的含有PEG的交聯(lián)劑。通過本文所述的方法，藥物可與雙功能的含有PEG的交聯(lián)劑反應(yīng)以得到式(I)的化合物 Z-Xi-(-CH2-CH2-O-)n-Yp-D。例如，含有硫羥的美登木素生物堿藥物可與具有PEG間隔物的雙馬來酰亞胺交聯(lián)劑反應(yīng)以得到經(jīng)由硫醚鍵與PEG間隔物結(jié)合的美登木素生物堿藥物(參見例如圖13)。隨后這個具有PEG間隔物和末端馬來酰亞胺基團的修飾的美登木素生物堿可與細胞結(jié)合劑反應(yīng)(例如如圖14所示)以提供本發(fā)明的式(2)的細胞結(jié)合劑-藥物綴合物?；蛘?，細胞結(jié)合劑可首先在帶有胺反應(yīng)性基團(如N-羥基琥珀酰亞胺酯)的雙功能的含有PEG的交聯(lián)劑的一端進行反應(yīng)，以得到通過酰胺鍵與連接體共價結(jié)合的修飾的細胞結(jié)合劑(參見例如圖15)。在下一步中，美登木素生物堿與PEG間隔物的另一端上的馬來酰亞胺取代基進行反應(yīng)，以得到本發(fā)明的細胞結(jié)合劑-藥物綴合物。圖16和17通過舉例示出PEG交聯(lián)劑的合成及其通過硫代乙酰胺鍵與美登木素生物堿的反應(yīng)。隨后將馬來酰亞胺取代基并入PEG以使經(jīng)由硫醚鍵與細胞結(jié)合劑的反應(yīng)能夠進行?；蛘撸鐖D18所示，首先通過硫醚鍵將細胞結(jié)合劑連接至PEG交聯(lián)劑。隨后使修飾的細胞結(jié)合劑與美登木素生物堿藥物反應(yīng)以得到綴合物。同雙功能PEG交聯(lián)劑的合成示于例如在圖19中，其中PEG間隔物的兩端均含有碘代乙酰胺基部分，碘代乙酰胺基部分能夠使細胞毒性藥物和細胞結(jié)合劑經(jīng)由硫醚鍵連接以得到含有親水性PEG間隔物的綴合物。提供本發(fā)明的綴合物的綴合過程示于例如在圖20和21中。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到可容易地通過本文所述的方法合成帶有各種反應(yīng)性基團的其它含有PEG的交聯(lián)劑。例如，帶有羥基的藥物(如19-去甲基美登木素生物堿(美國專利第4，361，650號))可在堿(如碳酸鉀)存在下與碘代乙?；鵓EG連接體(圖5) 反應(yīng)以經(jīng)由醚鍵連接美登木素生物堿。類似地，含有胺的美登木素生物堿(如美國專利第 7，301,019號所述合成)可在堿(如吡啶或三乙胺)存在下與碘代乙?；鵓EG(在圖5中示出)反應(yīng)以提供經(jīng)由胺鍵連接至PEG的美登木素生物堿。為了經(jīng)由酰胺鍵將藥物連接至 PEG，可使羧基PEG(在圖5中示出)在縮合劑(如二環(huán)己基碳二亞胺)存在下與含有胺的美登木素生物堿反應(yīng)以提供酰胺結(jié)合的PEG-美登木素生物堿。為了經(jīng)由氨基甲酸酯鍵將藥物連接至PEG間隔物，首先使PEG與雙光氣反應(yīng)以提供PEG氯甲酸酯，其隨后可在堿(如三乙胺)存在下與含有胺的美登木素生物堿反應(yīng)以得到氨基甲酸酯連接的PEG-美登木素生物堿。合適的連接體的實例包括具有用于與細胞結(jié)合劑反應(yīng)的N-琥珀酰亞胺基酯或 N-磺基琥珀酰亞胺基酯部分以及用于與藥物反應(yīng)的基于馬來酰亞胺基或鹵代乙?；糠值倪B接體。PEG間隔物可通過本文所述的方法并入本領(lǐng)域已知的任何交聯(lián)劑?？膳cPEG間隔物合并的包含基于馬來酰亞胺基部分的交聯(lián)劑包括(但不限于)N-琥珀酰亞胺基4-(馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷羧酸酯(SMCC)、N-琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來酰亞胺基甲基)-環(huán)己烷-I-羧基-(6-酰胺基己酸酯)(其是SMCC的“長鏈”類似物(LC-SMCC))、κ -馬來酰亞胺基i^一烷酸N-琥珀酰亞胺基酯(KMUA)、Y-馬來酰亞胺基丁酸N-琥珀酰亞胺基酯(GMBS)、 ε -馬來酰亞胺基己酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(EMCS)、間-馬來酰亞胺基苯甲?；?N-羥基琥珀酰亞胺酯(MBS)、Ν-( α -馬來酰亞胺基乙酰氧基)-琥珀酰亞胺酯(AMAS)、琥珀酰亞胺基-6- ( β -馬來酰亞胺基丙酰胺基)己酸酯(SMPH)、Ν-琥珀酰亞胺基4-(對-馬來酰亞胺基苯基)-丁酸酯(SMPB)和N-(對-馬來酰亞胺基苯基)異氰酸酯(PMPI)。包含基于鹵代乙?；糠值慕宦?lián)劑包括N-琥珀酰亞胺基-4-(碘代乙?；?-氨基苯甲酸酯(SIAB)、Ν-琥珀酰亞胺基碘乙酸酯(SIA)、Ν-琥珀酰亞胺基溴乙酸酯(SBA)和N-琥珀酰亞胺基3-(溴乙酰胺基)丙酸酯(SBAP)。在本發(fā)明的方法中還可使用不含硫原子的其它交聯(lián)劑。此類連接體可衍生自基于二羧酸的部分。合適的基于二羧酸的部分包括(但不限于)以下通式所示的α，ω-二羧酸HOOC-A ’ ρ_Ε ’ q- (CH2CH2O) nG ’ r_C00H其中A’是具有2至20個碳原子的任選的直鏈或支鏈烷基、烯基或炔基，E’是具有3至10個碳原子的任選的環(huán)烷基或環(huán)烯基，G’是帶有6至10個碳原子的任選取代或未取代的芳基，或取代或未取代的雜環(huán)基團，其中雜原子選自N、O或S，并且其中P、q和r各為O或1，條件是P、q和r不同時為零，η是I至2000的整數(shù)。本文中公開的許多連接體詳細描述于美國專利公布第20050169933號。在本發(fā)明的另一個方面中，通過使雙功能交聯(lián)劑與細胞結(jié)合劑反應(yīng)來修飾細胞結(jié)合劑，從而產(chǎn)生連接體分子與細胞結(jié)合劑的共價連接。如本文所用，“雙功能交聯(lián)劑”是將細胞結(jié)合劑共價連接至藥物(如本文所述的藥物)的任何化學部分。在本發(fā)明的優(yōu)選方面中，連接部分的一部分由藥物提供。在這方面，藥物包含用于將細胞結(jié)合劑連接至藥物的較大連接體分子的一部分的連接部分。例如，為了形成美登木素生物堿DM1，在美登素的C-3 羥基的側(cè)鏈被修飾為具有游離的巰基(SH)。美登素的這種硫羥化形式可與修飾的細胞結(jié)合劑反應(yīng)以形成綴合物。因此，最終連接體是由兩個部分組裝，其中之一是由交聯(lián)劑提供，而另一個是由DMl的側(cè)鏈提供。在本發(fā)明的另一個方面中，藥物通過二硫鍵連接至細胞結(jié)合劑。連接體分子包含可與細胞結(jié)合劑反應(yīng)的反應(yīng)性化學基團。用于與細胞結(jié)合劑反應(yīng)的優(yōu)選反應(yīng)性化學基團是 N-琥珀酰亞胺基酯和N-磺基琥珀酰亞胺基酯。此外連接體分子包含反應(yīng)性化學基團，優(yōu)選是可與藥物反應(yīng)形式二硫鍵的二硫代吡啶基。特別優(yōu)選的連接體分子包括例如N-琥珀酰亞胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(參見，例如Carlsson等人，Biochem. J. 173 723-737(1978))、N-琥珀酰亞胺基4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(STOB)(參見，例如美國專利第4，563，304號)、N-琥珀酰亞胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)(參見，例如 CAS登記號341498-08-6)和其它反應(yīng)性交聯(lián)劑(如描述于美國專利第6，913，748號中的那些)，所述美國專利以引用方式整體并入本文?；蛘?，如在美國專利第6，441，163B1號中公開的，可首先修飾藥物以引入適于與細胞結(jié)合劑反應(yīng)的反應(yīng)性酯。這些含有活化的連接體部分的藥物與細胞結(jié)合劑的反應(yīng)提供另一種制造細胞結(jié)合劑藥物綴合物的方法。為了連接siRNA’ s，可通過常用于修飾寡核苷酸的方法將siRNAs連接至本發(fā)明的交聯(lián)劑(參見，例如美國專利公布20050107325和 20070213292)。因此3’ -亞磷酰胺形式或5’ -亞磷酰胺形式的siRNA與帶有羥基官能團的交聯(lián)劑的一端反應(yīng)以在siRNA和交聯(lián)劑之間得到酯鍵。類似地，siRNA亞磷酰胺與帶有末端氨基的交聯(lián)劑的反應(yīng)使交聯(lián)劑與siRNA通過胺連接。B.細胞結(jié)合劑本發(fā)明中使用的細胞結(jié)合劑是與癌細胞上的靶抗原特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)(例如免疫球蛋白蛋白質(zhì)和非免疫球蛋白蛋白質(zhì))。這些細胞結(jié)合劑包括以下-抗體，包括-表面重塑抗體(美國專利第5,639, 641號)；-人源化或完全人抗體(人源化或完全人抗體選自(但不限于)huMy9_6、huB4、 huC242、huN901、DS6、CD38、IGF-IR、CNTO 95、B-B4、曲妥珠單抗、比伐珠單抗、西羅珠單抗、帕妥珠單抗和利妥昔單抗(參見，例如美國專利第5，639，641號、第5，665，357號和第 7，342，110號；美國臨時專利申請第60/424，332號、國際專利申請WO 02/16，401、美國專利公布第20060045877號、美國專利公布第20060127407號、美國專利公布第20050118183 號;Pedersen等人,(1994) J MoI. Biol. 235,959-973 ;Roguska等人,(1994)Proceedings of the National Academy of Sciences,第 91 卷，969-973 ;Colomer 等人，Cancer Invest., 19 :49-56(2001) ;Heider 等人，Eur. J. Cancer，31A :2385-2391 (1995) ;Welt 等人，J Clin. Oncol, 12 :1193-1203(1994)和 Maloney 等人，Blood，90 :2188-2195(1997));以及-抗體的表位結(jié)合片段，如sFv、Fab、Fab，和 F(ab，) 2 (Parham, J Tmmunol. 131 2895-2902(1983) ；Spring 等人，J Immunol. 113 :470-478(1974) ；Nisonoff 等人，Arch.Biochem. Biophys. 89 :230-244(1960))。其它細胞結(jié)合劑包括其它細胞結(jié)合蛋白和多肽，其示例為但不限于-錨蛋白重復(fù)蛋白(DARPins;Zahnd 等人，J Biol. Chem.，281，46，35167-35175， (2006) ；Binz, H.K., Amstutz, P. &Pluckthun, A. (2005)Nature Biotechnology,23, 1257-1268)或錨蛋白樣重復(fù)蛋白或合成肽，其描述于例如美國專利公布第20070238667 號；美國專利第 7, 101，675 號；W0/2007/147213 和 W0/2007/062466 中)；-干擾素(例如α、β、Y)-淋巴因子(如IL-2、IL-3、IL-4、IL-6)；-激素(如胰島素、TRH(促甲狀腺素釋放激素)、MSH(促黑素細胞激素)、甾體激素(如雄激素和雌激素))；以及-生長因子和集落-刺激因子如EGF、TGF-α、IGF-I,G-CSF, M-CSF和 GM-CSF(Burgess, Immunology Today 5:155-158(1984))。細胞結(jié)合劑是抗體時，其與是多肽并且可能是跨膜分子(例如受體)或配體(如生長因子)的抗原結(jié)合。示例性抗原包括分子(如腎素)；生長激素(包括人生長激素和牛生長激素)；生長激素釋放因子；甲狀旁腺激素；促甲狀腺激素；脂蛋白； α -I-抗胰蛋白酶；胰島素A鏈；胰島素B鏈；胰島素原；促卵泡激素；降鈣素；促黃體素； 胰聞血糖素；凝血因子(如因子vmc、因子IX、組織因子(TF)和血管性血友病因子(von Willebrands factor));抗凝血因子,如蛋白質(zhì)C ;心房利鈉因子；肺表面活性劑；纖溶酶原激活物(如尿激酶或人尿或組織型纖溶酶原激活物(t-PA));蛙皮素；凝血酶；造血生長因子；腫瘤壞死因子-α和;腦啡肽酶；RANTES(對通常T細胞表達和分泌活化的調(diào)節(jié))；人巨噬細胞炎性蛋白(MIP-1-α);血清白蛋白(如人血清白蛋白)；苗勒抑制物質(zhì) (Muellerian-inhibiting substance);松弛素A鏈；松弛素B鏈;前松弛素；鼠促性腺激素相關(guān)肽；微生物蛋白質(zhì)(如β內(nèi)酰胺酶)；DNase ;IgE ;細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原 (CTLA)，如CTLA-4;抑制素；激活蛋白；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF);激素或生長因子受體； 蛋白質(zhì)A或D ;類風濕因子；神經(jīng)營養(yǎng)因子(如骨衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3、-4、-5或-6 (NT-3、NT4、NT-5或NT-6))，或神經(jīng)生長因子(如NGF- β );血小板衍生生長因子O3DGF);成纖維細胞生長因子(如aFGF和bFGF);表皮生長因子(EGF);轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)，如 TGF- α 和 TGF- β，包括 TGF- β I、TGF- β 2、TGF- β 3、TGF- β 4 或 TGF- β 5 ； 胰島素樣生長因子-I和-II (IGF-1和IGF-II) ；des (1-3)-IGF-I (腦IGF-I)、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白、EpCAM、⑶3、FLT3、PSMA, PSCA, MUC1、MUC16、STEAP, CEA、TENB2、EphA 受體、EphB受體、葉酸受體、F0LR1、間皮素、cripto、av06、整聯(lián)蛋白、VEGF, VEGFR、運鐵蛋白受體、IRTAl、IRTA2、IRTA3、IRTA4、IRTA5 ;CD 蛋白，如 CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD8、CD11、 CD14、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD26、CD28、CD30、CD33、CD36、CD37、CD38、CD40、 CD44、CD52、CD55、CD56、CD59、CD70、CD79、CD80、CD81、CD103、CD105、CD134、CD137、CD138、 CD152;促紅細胞生成素；骨誘導(dǎo)因子；免疫毒素；骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP);干擾素，如干擾素-α、-β和-γ ;集落刺激因子(CSF)(例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF);白細胞介素(IL)， 例如IL-I至IL-10 ;超氧化物歧化酶；Τ細胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒抗原， 例如HIV包膜的一部分；轉(zhuǎn)運蛋白；歸巢受體；地址素；調(diào)節(jié)蛋白；整聯(lián)蛋白，如⑶I IaXDl lb、CDl Ic、CD18、ICAM、VLA-4 和 VCAM ;腫瘤相關(guān)抗原，如 HER2、HER3 或 HER4 受體；以及任何以上列出的多肽的片段、抗體擬似物Adnectins (US申請20070082365)，或公開于美國公布第20080171040號或美國公布第20080305044號的結(jié)合一種或多種腫瘤相關(guān)抗原或細胞表面受體的抗體，所述美國公布以弓I用方式整體并入本文。此外，與骨髓細胞結(jié)合的GM-CSF可用作來自急性骨髓性白血病的患病細胞的細胞結(jié)合劑。與活化的T細胞結(jié)合的IL-2可用于預(yù)防移植體移植排斥，用于治療和預(yù)防移植物抗寄主疾病以及用于治療急性T細胞白血病。與黑素細胞結(jié)合的MSH可用于治療黑素瘤。 葉酸可用于靶向在卵巢腫瘤和其它腫瘤上表達的葉酸受體。表皮生長因子可用于靶向鱗狀細胞癌(如肺及頭和頸鱗狀細胞癌)。促生長素抑制素可用于靶向成神經(jīng)細胞瘤和其它腫瘤類型。可分別用雌激素(或雌激素類似物)或雄激素(或雄激素類似物)作為細胞結(jié)合劑成功地靶向乳腺癌和睪丸癌。本發(fā)明包括的用于抗體的優(yōu)選抗原包括⑶蛋白，如⑶2、⑶3、⑶4、⑶5、⑶6、⑶8、 CD11、CD14、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD26、CD27、CD28、CD30、CD33、CD36、CD37、 CD38、CD40、CD44、CD52、CD55、CD56、CD70、CD79、CD80、CD81、CD103、CD105、CD134、CD137、 CD138和CD152 ；ErbB受體家族的成員，如EGF受體、HER2、HER3或HER4受體；細胞粘附分子，如 LFA-I、Macl、pi50. 95、VLA_4、ICAM-I、VCAM、EpCAM、α 4/β 7 整聯(lián)蛋白和 α ν/β 3 整聯(lián)蛋白，包括其α或β亞類(例如抗⑶I la、抗⑶18或抗⑶I Ib抗體)；生長因子，如 VEGF ;組織因子(TF) JGF-β ；α干擾素(a-IFN);白細胞介素，如IL-8 ;IgE ;血型抗原 Apo2、死亡受體；flk2/flt3受體；肥胖(OB)受體；mpl受體;CTLA_4 ;蛋白質(zhì)C等。本文中最優(yōu)選的靶標是 IGF-IR、CanAg, EphA2、MUCl、MUCl 6、VEGF、TF、CD19、CD20、CD22、CD27、 CD33、CD37、CD38、CD40、CD44、CD56、CD138、CA6、Her2/neu、EpCAM、CRIPTO (在大部分人乳腺癌細胞中高水平產(chǎn)生的蛋白質(zhì))、darpins、αν/β3整聯(lián)蛋白、αν/β5整聯(lián)蛋白、α ν/β 6 整聯(lián)蛋白、TGF-β、CD1 Ia、CD18、Apo2和C242或公開于美國公布第20080171040號或美國公布第20080305044號的與一種或多種腫瘤相關(guān)抗原或細胞表面受體結(jié)合的抗體，所述美國公布以引用方式整體并入本文。本發(fā)明包括的用于抗體的優(yōu)選抗原還包括⑶蛋白，如⑶3、⑶4、⑶8、⑶19、⑶20、 CD27、CD34、CD37、CD38、CD46、CD56、CD70 和 CD 138 ；ErbB 受體家族的成員，如 EGF 受體、 HER2、HER3 或 HER4 受體；細胞粘附分子如 LFA-I、Macl、pl50. 95、VLA-4, ICAM-I, VCAM、 EpCAM、α4/β7整聯(lián)蛋白和αν/β3·聯(lián)蛋白，包括其α或β亞類(例如抗⑶11a、抗⑶18 或抗⑶IIb抗體)；生長因子，如VEGF ;組織因子(TF) JGF-β ；α干擾素(a-IFN);白細胞介素，如IL-8 ；IgE ;血型抗原Apo2、死亡受體；flk2/flt3受體；肥胖(OB)受體；mpl受體；CTLA-4 ;蛋白質(zhì)C等。本文中最優(yōu)選的靶標是IGF-IR、CanAg、EGF-R、EGF-RvIII、EphA2、 MUC1、MUC16、VEGF、TF、CD19、CD20、CD22、CD27、CD33、CD37、CD38、CD40、CD44、CD56、CD70、 CD138、CA6、Her2/neu、CRIPT0 (在大部分人乳腺癌細胞中高水平產(chǎn)生的蛋白質(zhì))、α ν/ β 3整聯(lián)蛋白、αν/β5 整聯(lián)蛋白、TGF-β、CD1 la、CD18、Apo2、EpCAM 和 C242。單克隆抗體技術(shù)允許以單克隆抗體形式生產(chǎn)特異性細胞結(jié)合劑。本領(lǐng)域特別熟知的是用于制造通過用研究中的抗原(如完整靶細胞、從靶細胞分離的抗原、全病毒、減毒全病毒和病毒蛋白質(zhì)(如病毒外殼蛋白))免疫小鼠、大鼠、倉鼠或任何其它哺乳動物生產(chǎn)單克隆抗體的技術(shù)。也可使用敏化人細胞。另一種制造單克隆抗體的方法是使用sFv (單鏈可變區(qū))，特別是人sFv的噬菌體庫(參見，例如Griffiths等人，美國專利第5，885，793號； McCafferty 等人，WO 92/01047 ；Liming 等人，WO 99/06587)。適當?shù)募毎Y(jié)合劑的選擇是取決于要靶向的特定細胞群體的選擇事項，但一般來講，單克隆抗體和其表位結(jié)合片段是優(yōu)選的(如果有適當?shù)目捎?。例如，單克隆抗體My9是鼠IgG2a抗體，其對急性骨髓性白血病(AML)細胞上發(fā)現(xiàn)的CD33抗原有特異性(Roy等人，Blood 77 :2404-2412(1991))并且可用于治療AML患者。類似地，單克隆抗體抗B4是鼠IgGi，其與B細胞上的⑶19抗原結(jié)合(Nadler等人，J Immunol. 131 :244-250 (1983))，并且如果靶細胞是B細胞或在諸如非霍奇金淋巴瘤或慢性淋巴母細胞白血病中表達該抗原的患病細胞，則可以使用所述抗體。抗體N901是鼠單克隆 IgGi抗體，其與在小細胞肺癌細胞和其它神經(jīng)內(nèi)分泌起源的腫瘤細胞上發(fā)現(xiàn)的CD56結(jié)合 (Roy 等人，J Nat. Cancer Inst. 88 :1136-1145 (1996)) ;huC242 是與 CanAg 抗原結(jié)合的抗體；曲妥珠單抗是與HER2/neu結(jié)合的抗體；以及抗EGF受體抗體與EGF受體結(jié)合。C.藥物在本發(fā)明中使用的藥物是能夠連接至細胞結(jié)合劑的細胞毒性藥物。合適的藥物的實例包括美登木素生物堿、DNA結(jié)合藥物(如CC-1065和其類似物)、加利車霉素、阿霉素及其類似物、長春花生物堿、念珠藻環(huán)肽(cryptophycins)、多拉司他汀(dolastatin)、阿里他汀(auristatin)及其類似物、tubulysin、埃博霉素(epothilones)、紫杉燒和siRNA。優(yōu)選的美登木素生物堿是描述于美國專利第5，208, 020號；第5，416, 064號；第 6，333，410 號；第6，441，163 號；第 6，716，821 號；第1 39，151 號和第 7，276，497 號的那些。 優(yōu)選的CC-1065類似物是描述于美國專利第5，475，092號；第5，595，499號；第5，846，545 號；第6，534，660號 ’第6，586，618號；第6，756，397號和第7，049，316號的那些。優(yōu)選的阿霉素及其類似物是描述于美國專利第6，630, 579號的那些。優(yōu)選的紫杉烷是描述于美國專利第 6，340，701 號；第 6，372，738 號；第 6. 436，931 號；第 6，596，757 號；第 6，706，708 號；第7，008，942號；第7，217，819號和第7，276，499號的那些。加利車霉素描述于美國專利第5，714，586號和第5739，116號。長春花生物堿化合物、多拉司他汀化合物和念珠藻環(huán)肽化合物在W001/24763中詳細描述。阿里他汀包括阿里他汀E、阿里他汀EB(AEB)、阿里他汀EFP(AEFP)、單甲基阿里他汀 E(MMAE)并且描述于美國專利第 5，635，483 號、Int. J. Oncol. 15 :367-72(1999)； Molecular Cancer Therapeutics,第 3 卷，第 8 期，921-932 頁(2004);美國申請第 11/134826號，美國專利公布第20060074008號、第2006022925號。Tubulysin化合物描述于美國專利公布第20050249740號。念珠藻環(huán)肽化合物描述于美國專利第6，680, 311號和第6，747，021號。埃博霉素描述于美國專利第6，956，036號和第6，989，450號。SiRNA在以下編號的美國專利公布中詳細描述20070275465、20070213292、 20070185050、20070161595、20070054279、20060287260、20060035254、20060008822、 20050288244,20050176667ο類似物和衍生物細胞毒劑領(lǐng)域的技術(shù)人員將容易理解本文中描述的每一種細胞毒劑可以以所得化合物仍然保持起始化合物的特異性和/或活性的方式進行修飾。本領(lǐng)域技術(shù)人員還將理解許多這些化合物可用來代替本文所述的細胞毒劑。因此，本發(fā)明的細胞毒劑包括本文所述的化合物的類似物和衍生物。細胞結(jié)合劑可通過前述的方法(美國專利第6，013，748號；第6，441，1631號和第 6，716，821號；美國專利公布第20050169933號和W02006/034488 A2)與細胞毒性藥物綴
口 OD.治療用途本發(fā)明的細胞結(jié)合劑藥物綴合物(例如免疫綴合物)還可與化學治療劑組合使用。此類化學治療劑描述于美國專利第7，303, 749號。本發(fā)明的細胞結(jié)合劑藥物綴合物(例如免疫綴合物)可以體外、體內(nèi)和/或離體施用，以治療患者和/或調(diào)節(jié)選擇的細胞群體的生長，所述細胞群體包括例如，肺癌、血癌、 血漿癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、腎癌、胰腺癌、腦癌、骨癌、卵巢癌、睪丸癌和淋巴器官癌；自身免疫疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕性關(guān)節(jié)炎和多發(fā)性硬化；移植排斥，如腎移植排斥、肝移植排斥、肺移植排斥、心臟移植排斥和骨髓移植排斥；移植物抗宿主??；病毒感染，如CMV感染、HIV感染和AIDS ；以及寄生蟲感染，如賈第蟲病、阿米巴病、血吸蟲病等。 優(yōu)選地，體外、體內(nèi)和/或離體施用本發(fā)明的免疫綴合物和化學治療劑以治療患者的癌癥和/或調(diào)節(jié)癌細胞的生長，所述癌細胞包括例如，血癌、血漿癌、肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、腎癌、胰腺癌、腦癌、骨癌、卵巢癌、睪丸癌和淋巴器官癌；更優(yōu)選的是肺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌(colon prostrate)、血漿癌、血癌或結(jié)腸癌。在最優(yōu)選的方面中，所述癌癥是多發(fā)性骨髓瘤?！罢{(diào)節(jié)選擇的細胞群體的生長”包括抑制選擇的細胞群體(例如多發(fā)性骨髓瘤細胞群體，如M0LP-8細胞、0PM2細胞、細胞等)的增殖防止分裂產(chǎn)生更多細胞；例如與未經(jīng)治療的細胞相比降低細胞分裂的增長速度；殺滅選擇的細胞群體；和/或防止選擇的細胞群體(如癌細胞)轉(zhuǎn)移。選擇的細胞群體的生長可以體外、體內(nèi)或離體調(diào)節(jié)。在本發(fā)明的方法中，可以體外、體內(nèi)或離體施用細胞結(jié)合劑藥物綴合物(例如免疫綴合物)。細胞結(jié)合劑藥物綴合物(例如免疫綴合物)可以與合適的藥學上可接受的載體、稀釋劑和/或賦形劑(其是眾所周知的)一起使用并且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員按照臨床表現(xiàn)根據(jù)確定。合適的載體、稀釋劑和/或賦形劑的實例包括(I)PH值約6. 5的 Dulbecco磷酸鹽緩沖鹽水，其可含有約lmg/mL至25mg/mL人血清白蛋白，0)0. 9%鹽水 (0.9% w/ν NaCl)，以及(3)5% (w/v)葡萄糖。本文所述的化合物和組合物可以適當?shù)男问绞┯?，?yōu)選腸胃外施用，更優(yōu)選靜脈注射施用。對于腸胃外施用，所述化合物或組合物可以是含水或無水無菌溶液、混懸液或乳濁液。丙二醇、植物油和可注射的有機酯(如油酸乙酯)可以用作溶劑或媒介物。所述組合物還可以含有佐劑、乳化劑或分散劑。所述組合物還可以是可溶解或分散在無菌水或任何其它可注射的無菌介質(zhì)的無菌固體組合物形式。本文所述的細胞結(jié)合劑藥物綴合物(例如免疫綴合物)的“治療有效量”是指用于調(diào)節(jié)選擇的細胞群體的生長和/或治療患者疾病的給藥方案，并且根據(jù)多種因素選擇， 這些因素包括患者的年齡、體重、性別、飲食和醫(yī)療條件、疾病的嚴重程度、施用途徑和藥理學考慮因素(如使用的特定化合物的活性、效能、藥代動力學和毒理學曲線)?！爸委熡行Я俊边€可以通過參考標準醫(yī)學書(如Physicians Desk Reference 2004)確定?；颊邇?yōu)選是動物，更優(yōu)選是哺乳動物，最優(yōu)選是人?；颊呖梢允悄行曰蚺?，并且可以是嬰兒、兒童或成人。細胞結(jié)合劑藥物綴合物(例如免疫綴合物)的合適的給藥方案的實例如下?？梢悦刻焓┯镁Y合物持續(xù)約5天，或者每天單次靜脈注射(i. v.)進行約5天，或者持續(xù)輸液約 5天?；蛘撸擅恐芤淮问┯镁Y合物持續(xù)6周或更長。作為另一種選擇，可每兩周或三周施用一次綴合物。單次劑量在約50至約400mL生理鹽水中給予，其中可向生理鹽水中添加約5至約IOmL人血清白蛋白。持續(xù)輸液以每M小時期間在約250至約500mL生理鹽水中給予，其中可向生理鹽水中添加約25至約50mL人血清白蛋白。劑量將是約IOpg至約 1000mg/kg每人，靜脈注射(約IOOng至約100mg/kg的范圍)。在治療之后的約一至約四周，患者可以接受第二療程。關(guān)于施用途徑、賦形劑、稀釋劑、劑量和時間的具體臨床方案可由本領(lǐng)域技術(shù)人員按照臨床表現(xiàn)根據(jù)來確定。所述化合物和綴合物(例如免疫綴合物)還可以用于制造對治療或減輕病癥(如以細胞的異常生長為特征的病癥(例如癌癥))的嚴重程度有用的藥物。本發(fā)明還提供藥物試劑盒，其包含一個或多個裝有本發(fā)明的藥物化合物和/或組合物一種或多種成分(包括一種或多種免疫綴合物和一種或多種化學治療劑)。此類試劑盒還可包括(例如)其它化合物和/或組合物，用于施用化合物和/或組合物的裝置和由管制藥物或生物制品的制造、使用或銷售的政府機構(gòu)規(guī)定的形式的書面說明書。癌癥治療及其劑量、施用途徑和推薦的用法在本領(lǐng)域是已知的并且已描述于文獻(如Wiysician，s Desk Reference (PDR))中。PDR公開了在各種癌癥治療中使用的藥劑的劑量。治療有效的這些上述化學治療藥物的給藥方案和劑量將取決于所治療的特定癌癥、疾病的程度和本領(lǐng)域醫(yī)師熟知的其它因素并且可以由醫(yī)師決定。例如，2006版的 Physician's Desk Reference公開了泰索帝(Taxotere，參見四47頁)是微管蛋白解聚的抑制劑；阿霉素(參見786頁)、鹽酸阿霉素脂質(zhì)體(Doxi 1，參見3302頁)和奧沙利鉬(參見四08頁)是DNA相互作用劑，伊立替康(Irinotecal，參見沈02頁)是拓撲異構(gòu)酶I抑制劑，愛必妥(Erbitux，參見937頁)和特羅凱(Tarceva，參見M70頁)與表皮生長因子受體相互作用。PDR的內(nèi)容以引用方式整體明確地并入本文。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用一種或多種以下參數(shù)查閱PDR以確定可以根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)使用的化學治療劑和綴合物的給藥方案和劑量。這些參數(shù)包括1.綜合索引a)通過制造商b)產(chǎn)品(通過公司名稱或商標藥物名稱)c)分類索引(例如“抗組胺劑”、“DNA烷化劑”、紫杉烷等)d)總索引/化學索引(無商標的普通藥物的名稱)2.藥物的彩色圖像3.產(chǎn)品信息，與FDA標簽一致a)化學信息b)功能/作用c)適應(yīng)癥和禁忌癥
d)試驗研究、副作用、警告上述參考文獻、專利申請和專利每一篇的內(nèi)容(非限制性地包括說明書、權(quán)利要求書和摘要以及其任何圖、表或附圖)均以全文引用方式整體明確地并入本文。E.具有帶有反應(yīng)性基團的硫醚部分的美登木素生物堿的合成具有帶有反應(yīng)性基團的不可裂解的硫醚部分的新型的美登木素生物堿是式(5) D’ -Y’ -V-Q-W-Z'的化合物。用于與細胞結(jié)合劑反應(yīng)的化學基團Z’包括但不限于N-琥珀酰亞胺基酯、N-磺基琥珀酰亞胺基酯、五氟苯酯、四氟磺基苯基和硝基苯酯。在本文中描述了制備這些化合物的方法。帶有巰基的美登木素生物堿經(jīng)由不可裂解的硫醚鍵與帶有反應(yīng)性基團的異雙功能交聯(lián)劑共價連接并且在與細胞結(jié)合劑綴合之前分離。不可裂解的連接體是能夠以穩(wěn)定、共價方式將細胞毒性藥物連接至細胞結(jié)合劑的任何化學部分。不可裂解的連接體實質(zhì)上對酸誘導(dǎo)的裂解、光誘導(dǎo)的裂解、肽酶誘導(dǎo)的裂解、酯酶誘導(dǎo)的裂解和二硫鍵裂解有抗性。不可裂解的連接體的實例包括具有用于與美登木素生物堿反應(yīng)的N-琥珀酰亞胺基酯或N-磺基琥珀酰亞胺基酯部分和基于馬來酰亞胺基或鹵代乙酰基的部分的連接體。包含基于馬來酰亞胺基的部分的交聯(lián)劑包括N-琥珀酰亞胺基4-(馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷甲酸酯(SMCC)、N-琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來酰亞胺基甲基)-環(huán)己烷-1-羧基-(6-酰胺基己酸酯)(其是SMCC的“長鏈”類似物(LC-SMCC))、 κ -馬來酰亞胺基十一烷酸N-琥珀酰亞胺基酯(KMUA)、γ -馬來酰亞胺基丁酸N-琥珀酰亞胺基酯(GMBS)、ε -馬來酰亞胺基己酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(EMCS)、間-馬來酰亞胺基苯甲?；?N-羥基琥珀酰亞胺酯(MBS)、N- ( α -馬來酰亞胺基乙酰氧基)-琥珀酰亞胺酯(AMAS)、琥珀酰亞胺基-6-( β-馬來酰亞胺基丙酰胺基)己酸酯(SMPH)、Ν-琥珀酰亞胺基4-(對-馬來酰亞胺基苯基)-丁酸酯(SMPB)和N-(對-馬來酰亞胺基苯基)異氰酸酯 (PMPI)。包含基于鹵代乙?；牟糠值慕宦?lián)劑包括N-琥珀酰亞胺基-4-(碘代乙?；?-氨基苯甲酸酯(SIAB)、N-琥珀酰亞胺基碘乙酸酯(SIA)、N-琥珀酰亞胺基溴乙酸酯(SBA)和 N-琥珀酰亞胺基3-(溴乙酰胺基)丙酸酯(SBAP)。可在本發(fā)明中用以制造帶有可共價連接至細胞結(jié)合劑的硫醚部分的反應(yīng)性美登木素生物堿衍生物的美登木素生物堿在本領(lǐng)域是熟知的并且可根據(jù)已知方法從天然來源分離或根據(jù)已知方法合成制備。具有帶有反應(yīng)性基團的硫醚部分的美登木素生物堿的合成可參考圖1-4所述，其中制備了帶有反應(yīng)性基團的帶有硫醚的美登木素生物堿。本發(fā)明的代表性化合物由含有硫羥的美登木素生物堿制備DM1，稱為N2’-去乙?；?N2’ - (3-巰基-1-氧代丙基)-美登素，由結(jié)構(gòu)式⑴表示；和DM4，稱為N2’ -去乙?；?N2’-(4-巰基-4-甲基-1-氧代戊基)美登素，由以下所示的結(jié)構(gòu)式(2)表示
權(quán)利要求
1.一種式⑴或⑴的化合物Z-X,-(-CH2-CH2-O-)n_Yp-D (I)D-Yp- (-CH2-CH2-O-) n-Xi-Z (V)其中Z表示可與細胞結(jié)合劑形成酰胺鍵或硫醚鍵的反應(yīng)性官能團；D表示藥物；X表示經(jīng)由硫醚鍵、酰胺鍵、氨基甲酸酯鍵或醚鍵與所述細胞結(jié)合劑連接的脂族基、芳基或雜環(huán)基團；Y表示經(jīng)由選自由硫醚鍵、酰胺鍵、氨基甲酸酯鍵、醚鍵、胺鍵、碳-碳鍵和腙鍵組成的組的共價鍵與所述藥物連接的脂族基、芳基或雜環(huán)基團；I為O或I ;P為O或I ;以及 η為I至2000的整數(shù)。
2.—種式(2)或(2’)的細胞結(jié)合劑細胞毒性藥物綴合物CB- [X，- (-CH2-CH2-O) n-Yp-D] m (2)[D-Yp-C-CH2-CH2-O-V-XJln-CB (T)其中CB表示細胞結(jié)合劑；D表示藥物；X表示經(jīng)由硫醚鍵、酰胺鍵、氨基甲酸酯鍵或醚鍵與所述細胞結(jié)合劑連接的脂族基、芳基或雜環(huán)基團；Y表示經(jīng)由選自由硫醚鍵、酰胺鍵、氨基甲酸酯鍵、醚鍵、胺鍵、碳-碳鍵和腙鍵組成的組的共價鍵與所述藥物連接的脂族基、芳基或雜環(huán)基團；I為O或I ;P為O或I ;以及 m為2至15的整數(shù)；以及 η為I至2000的整數(shù)。
3.一種式(3)或(3’)化合物Z-XK-CH2-CH2O-V-Y-D (3)D-Y- (-CH2-CH2O-) n-Xi-Z (3，)其中Z表示可與細胞結(jié)合劑形成酰胺或硫醚鍵的反應(yīng)性官能團；D表示藥物；X表示經(jīng)由硫醚鍵、酰胺鍵、氨基甲酸酯鍵或醚鍵與所述細胞結(jié)合劑連接的脂族基、芳基或雜環(huán)基團；Y表示經(jīng)由二硫鍵與所述藥物連接的脂族基、非芳族雜環(huán)基或芳族雜環(huán)基團；I為O或I ;以及 η為I至14的整數(shù)。
4.一種式(4)或(4’ )的細胞結(jié)合劑細胞毒性藥物綴合物
5.根據(jù)權(quán)利要求2或4所述的綴合物，其中所述細胞結(jié)合劑是抗體、單鏈抗體、優(yōu)先與靶細胞結(jié)合的抗體片段、單克隆抗體、單鏈單克隆抗體、單克隆抗體、雙特異性抗體、與靶細胞特異性結(jié)合的片段、抗體模擬物adnectins、DARPins、淋巴因子、細胞因子、激素、生長因子、酶或營養(yǎng)轉(zhuǎn)運分子。
6.根據(jù)權(quán)利要求2或4所述的綴合物，其中所述細胞結(jié)合劑是表面重塑單克隆抗體、表面重塑單鏈單克隆抗體或優(yōu)先與靶細胞結(jié)合的表面重塑單克隆抗體片段。
7.根據(jù)權(quán)利要求2或4所述的綴合物，其中所述細胞結(jié)合劑是人源化單克隆抗體、人源化單鏈單克隆抗體或優(yōu)先與靶細胞結(jié)合的人源化單克隆抗體片段。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的綴合物，其中所述抗體是嵌合抗體、嵌合抗體片段、結(jié)構(gòu)域抗體或其結(jié)構(gòu)域抗體片段。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的綴合物，其中所述抗體是MY9、抗B4、EpCAM,⑶2、⑶3、⑶4、 CD5、CD6、CDlI、CD19、CD20、CD22、CD26、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD44、CD56、CD79、 CD105、CD138、EphA 受體、EphB 受體、EGFR、EGFRvIII、HER2、HER3、間皮素、cripto、α νβ 3 整聯(lián)蛋白、ανβ5整聯(lián)蛋白、ανβ6整聯(lián)蛋白或C242。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的綴合物，其中所述抗體是選自My9-6、B4、C242、N901、DS6、 EphA2受體、⑶38、IGF-IR, CNTO 95、B-B4、曲妥珠單抗、帕妥珠單抗、比伐珠單抗、西羅珠單抗或利妥昔單抗的人源化抗體、人抗體或表面重塑抗體。
11.根據(jù)權(quán)利要求2或4所述的綴合物，其中所述細胞結(jié)合劑與選自以下的靶細胞結(jié)合腫瘤細胞；病毒感染的細胞、微生物感染的細胞、寄生蟲感染的細胞、自身免疫細胞、活化細胞、骨髓細胞、活化T-細胞、B細胞或黑素細胞；表達16 -11 、0&1^846 1 、1^(1、1^(16、 VEGF、TF、MY9、抗 B4, EpCAM, CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CDlI、CDlla、CD18、CD19、CD20、CD22、 CD26、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD44、CD56、CD70、CD79、CD 105、CD 138、EphA 受體、FphB 受體、EGFRvIII、HER2/neu、HER3、間皮素、cripto、ανβ3 整聯(lián)蛋白、ανβ5 整聯(lián)蛋白、ανβ6 整聯(lián)蛋白、Αρο2和C242抗原的一種或多種的細胞；或表達胰島素生長因子受體、表皮生長因子受體和葉酸受體的細胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的綴合物，其中所述腫瘤細胞選自乳腺癌細胞、前列腺癌細胞、卵巢癌細胞、結(jié)腸直腸癌細胞、胃癌細胞、鱗狀細胞癌細胞、小細胞肺癌細胞和睪丸癌細胞。
13.一種藥物組合物，其包含有效量的根據(jù)權(quán)利要求2或4所述的藥物-細胞結(jié)合劑綴合物、其藥學上可接受的鹽或溶劑化物和藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
14.一種用于治療對用所述方法的治療敏感的疾病的方法，所述方法包括對有需要的患者腸胃外施用有效劑量的根據(jù)權(quán)利要求2或4所述的綴合物。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述疾病選自腫瘤、自身免疫疾病、移植排斥、 移植物抗宿主疾病、病毒感染和寄生蟲感染。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述腫瘤選自肺癌、血癌、血漿癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、腎癌、胰腺癌、腦癌、骨癌、卵巢癌、睪丸癌和淋巴器官癌的一種或多種。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述腫瘤表達以下的一種或多種IGF-IR、 FOLRl、CanAg, EGFR、EphA2、MUC1、MUC16、VEGF、TF、MY9、抗 B4、EpCAM、CD2、CD3、CD4、CD5、 CD6、CD11、CDlla、CD18、CD19、CD20、CD22、CD26、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD44、CD56、 CD70、CD79、CD105、CD138、EphA, EphB, EGFRvIII、HER2/neu，HER3、間皮素、cripto、ανβ3 整聯(lián)蛋白、ανβ5整聯(lián)蛋白、ανβ6整聯(lián)蛋白、Αρο2和C242抗原。
18.一種具有帶有由式(5)所示的反應(yīng)性基團的硫醚部分的美登木素生物堿D， -Y， -V-Q-W-Z， (5)其中D’表示帶有巰基的美登木素生物堿；V是具有I至10個碳原子的任選的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基或炔基；W是具有I至10個碳原子的任選的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基或炔基；Y’表示硫醚鍵；Q表示任選的芳族或雜環(huán)部分；以及V表示胺或巰基反應(yīng)性基團。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的美登木素生物堿，其中所述帶有巰基的美登木素生物堿是 #’-去乙?；?#’-(3-巰基-1-氧代丙基)-美登素(DMl)或Ν2’-去乙酰基-Ν2’-(4-巰基-4-甲基-I-氧代戊基)美登素(DM4)。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的美登木素生物堿，其由以下結(jié)構(gòu)式表示
21.根據(jù)權(quán)利要求18所述的美登木素生物堿，其由以下結(jié)構(gòu)式表示
22.根據(jù)權(quán)利要求18所述的美登木素生物堿，其由以下結(jié)構(gòu)式7a或7b表示
23.一種用于制備根據(jù)權(quán)利要求18所述的美登木素生物堿的方法，其包括使含有硫羥的美登木素生物堿與異雙功能交聯(lián)劑反應(yīng)，所述反應(yīng)由以下化學方程式表示
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述帶有巰基的美登木素生物堿是N2’-去乙酰基-N2’ -(3-巰基-I-氧代丙基)_美登素(DMl)或N2’ -去乙?；?N2’ -(4-巰基-4-甲基_1_氧代戍基)美登素(DM4)。
25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中Y"是馬來酰亞胺或鹵代乙酰胺。
26.一種用于制備經(jīng)由不可裂解的鍵連接的美登木素生物堿和細胞結(jié)合劑的細胞毒性綴合物的方法，所述方法包括使細胞結(jié)合劑與式Z’ -W-Q-V-Y’ -D’化合物反應(yīng)以提供式 CB-(Z" -W-Q-V-Y’ -D’ )m的細胞結(jié)合劑綴合物，其中，V表示胺或巰基反應(yīng)性基團；W是具有I至10個碳原子的任選的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基或炔基；Q表示任選的芳族或雜環(huán)部分；V是具有I至10個碳原子的任選的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基、烯基或炔基；Y’表示硫醚鍵；D’表示帶有巰基的美登木素生物堿；CB表示細胞結(jié)合劑；Z"表示硫醚鍵或酰胺鍵；以及m是2至8的整數(shù)。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述帶有巰基的美登木素生物堿是N2’-去乙?；?N2’ -(3-巰基-I-氧代丙基)_美登素(DMl)或N2’ -去乙?；?N2’ -(4-巰基-4-甲基_1_氧代戍基)美登素(DM4)。
28.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中CB是抗體、單鏈抗體或抗體的抗原結(jié)合片段。
29.根據(jù)權(quán)利要求26至28中任一項所述的方法，其中式CB-(Z"-W-Q-V-Y’ _D，)m的所述細胞結(jié)合劑綴合物是純化的。
30.根據(jù)權(quán)利要求26至29中任一項所述的方法，其中所述細胞結(jié)合劑和式V-W-Q-V-Y’ -D’的所述化合物通過使所述細胞結(jié)合劑在任選含有最多20%有機溶劑的緩沖水溶液中的溶液與式V -W-Q-V-Y’ -D’的化合物在有機溶劑或有機溶劑和緩沖水溶液或水的混合物中的溶液混合并使反應(yīng)進行5分鐘至72小時來反應(yīng)。
31.根據(jù)權(quán)利要求26至29中任一項所述的方法，其中所述綴合物通過色譜法、滲析法、 切向流過濾法或所述方法的組合來純化。
32.—種由以下結(jié)構(gòu)式表示的化合物
33. 一種由以下結(jié)構(gòu)式表示的化合物
全文摘要
用于將藥物與細胞結(jié)合劑結(jié)合的連接體通過并入聚乙二醇間隔物而被修飾為親水性連接體。所述細胞結(jié)合劑-藥物綴合物在各種癌細胞類型中的效價或效能意外地增加若干倍，所述癌細胞類型包括在細胞表面表達低數(shù)量抗原的癌細胞或?qū)χ委熡锌剐缘陌┘毎１景l(fā)明還提供了一種用于制備美登木素生物堿的方法，所述美登木素生物堿帶有硫醚部分和允許將所述美登木素生物堿在基本上單個步驟中連接至細胞結(jié)合劑的反應(yīng)性基團。
文檔編號C07D267/22GK102596922SQ200980162373
公開日2012年7月18日 申請日期2009年10月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月6日
發(fā)明者R·V·J·查理, R·辛, S·D·威爾豪姆 申請人:免疫基因公司