專利名稱：可溶性的橋粒芯糖蛋白i蛋白物質(zhì)用于篩選抗衰老活性劑的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可溶性肽復(fù)合物或非復(fù)合物的應(yīng)用，該肽至少部分地衍生于橋粒芯糖 蛋白I，其對(duì)出現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)皮膚衰老征兆的表皮表現(xiàn)出了潛在活性劑作用。
背景技術(shù)：
上皮是一種組織，該組織中的細(xì)胞相互結(jié)合并連結(jié)于基膜上。該細(xì)胞可以形成一 種外膜，如在皮膚表面、或者表皮、或在粘膜表面形成內(nèi)膜，也可形成腺。更具體地，該上皮是一種內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的組織，其內(nèi)穩(wěn)定環(huán)境源于在細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移 與分化的所有階段都實(shí)現(xiàn)了一套調(diào)整完好的細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞外信號(hào)，并且該上皮組織還是各 種不同細(xì)胞外基質(zhì)成分的綜合體。這些信號(hào)特別地源于角質(zhì)形成細(xì)胞所產(chǎn)生的因子的運(yùn) 動(dòng)。保持正確的上皮生理功能涉及，特別地是上皮細(xì)胞終末分化和/或蛋白多糖合 成。至于更優(yōu)選地表皮是一種上皮，通常分為角質(zhì)形成細(xì)胞基底層、“刺狀”層、“粒 狀”層和角質(zhì)層。該角質(zhì)形成細(xì)胞基底層作為表皮生發(fā)層的成分，包含特別地皮膚干細(xì)胞， “刺狀”層是由許多基底層上的多面形細(xì)胞層組成的，“粒狀”層包含一個(gè)或三個(gè)以前所知 的扁平細(xì)胞層，該扁平細(xì)胞層包含不同的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含物和角質(zhì)透明蛋白粒，最后是一組上 層細(xì)胞，稱為角質(zhì)層(或者角質(zhì)層)，該角質(zhì)層是由處于分化終末階段的角質(zhì)形成細(xì)胞(即 comeocytes)構(gòu)成。角質(zhì)層是皮膚的最外層，其作用是作為屏障、將皮膚組織與外界環(huán)境隔離開(kāi)，毛干 是毛囊的突出部分，其毛囊組成了濃濃的頭發(fā)，角質(zhì)層與毛干都代表了角質(zhì)形成細(xì)胞分化 過(guò)程的結(jié)果?；讓拥慕琴|(zhì)形成細(xì)胞在成熟過(guò)程中分化并轉(zhuǎn)移后，表皮出現(xiàn)分化，從而形成 comeocytes,該角質(zhì)細(xì)胞是一種徹底的角質(zhì)化死細(xì)胞。這種分化是完全協(xié)調(diào)現(xiàn)象的產(chǎn)物，該 現(xiàn)象形成了保持不變的表皮厚度，從而確保表皮內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。許多皮膚病或病理學(xué)條件起因于表皮內(nèi)穩(wěn)定環(huán)境的紊亂。至于衰老皮膚，其紊亂一般會(huì)通過(guò)皺紋(小皺紋和深層皺紋)的出現(xiàn)、彈性的喪 失、粗糙感和干燥來(lái)顯現(xiàn)。從組織學(xué)的角度看，會(huì)發(fā)現(xiàn)真皮表皮連接處變扁及真皮與表皮的 厚度變薄。膠原和葡萄糖胺聚糖含量減少。皮膚的屏障作用受到損壞。所有這些現(xiàn)象都會(huì) 由于太陽(yáng)下的慢性暴曬而增多。同樣地，這種紊亂在更年期婦女身上可能會(huì)更加厲害?，F(xiàn)在，眾所周知的是，這些紊亂現(xiàn)象可能會(huì)特別地與角質(zhì)層中某些蛋白的表達(dá)和/ 或其生物活性的不同調(diào)節(jié)有關(guān)。特別地是橋粒芯糖蛋白I的情況。作為一種跨膜糖蛋白，橋粒芯糖蛋白1(也稱作DGI)以其前蛋白原的形式存在，并 包含1049種氨基酸，其分子量約為114Kda至150Kda，具體取決于該蛋白是否糖基化。蛋白 序列在天冬酰胺殘基上的糖基化位點(diǎn)是36、110和180位置，除此之外，該蛋白序列也包含鈣結(jié)合部位。該蛋白與鈣粘素相關(guān)，并屬于包括橋粒芯糖蛋白II和III的蛋白家族。DGI只以 橋粒的形式存在，橋粒是DGI主要的結(jié)構(gòu)元素之一。專利文件US 2004/0142335報(bào)道了 通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析，與年輕人相比，年長(zhǎng)的人皮 膚上的mRNA(信使核糖核酸)表達(dá)有所增加，該mRNA(信使核糖核酸)編碼橋粒芯糖蛋白 I蛋白。該專利沒(méi)有公開(kāi)任何的可溶性橋粒芯糖蛋白I。發(fā)明專利內(nèi)容近來(lái)，本發(fā)明人指出了在表皮自然老化過(guò)程中，角質(zhì)層上的橋粒芯糖蛋白I表達(dá) 明顯增加，并且得到了積累。所以，橋粒芯糖蛋白I在角質(zhì)層上的表達(dá)水平成為一種用以描 述皮膚、優(yōu)選地衰老皮膚的生理?xiàng)l件特征的有效指標(biāo)。就發(fā)明本身而言，本發(fā)明源于本發(fā)明人對(duì)人體角質(zhì)層上可溶性肽的特征描述，該 角質(zhì)層經(jīng)過(guò)了脫屑性治療，并且該可溶性肽不同于、但卻衍生于橋粒芯糖蛋白I。人們可認(rèn) 為本發(fā)明人所述肽衍生于或至少部分衍生于橋粒芯糖蛋白I的蛋白水解作用。特別是，不同于全序列橋粒芯糖蛋白I，命名為SEQ ID N02的可溶性蛋白。如下文 所述，憑借特殊的ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)法的研制，優(yōu)選以下實(shí)施例1中所述的方法， 本發(fā)明人描述了該蛋白的可溶性肽復(fù)合物或非復(fù)合物的特征。因此，人們發(fā)現(xiàn)這些可溶性 物質(zhì)是一種特別有益的工具，可以用來(lái)篩選抗衰老活性劑，或者甚至描述預(yù)防和/或治療 皮膚衰老的治療效果，特別地通過(guò)一種活動(dòng)，或許是對(duì)皮膚衰老過(guò)程中角質(zhì)層上所積累的 橋粒芯糖蛋白I的降解活動(dòng)。在這兩種情況中，活性劑的作用或本發(fā)明所述的治療效果通過(guò)增加至少一種，或 更多種本發(fā)明所述可溶性物質(zhì)的釋放得以驗(yàn)證。所以，一方面，本發(fā)明涉及至少一種可溶性肽復(fù)合物或非復(fù)合物的使用，該肽衍生 于或至少部分衍生于包含一種氨基酸序列的多肽，編碼該氨基酸序列的核酸序列是由全部 或部分SEQ ID No. 1、或其類似物來(lái)表示的，該氨基酸序列可用作一種篩選工具，篩選能預(yù) 防和/或治療皮膚衰老的活性劑。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，適用于本發(fā)明的可溶性蛋白不是由SEQ ID N02序列表 征的。這些可溶性肽數(shù)量的增加是抗衰老治療效果的指標(biāo)。特別地，檢測(cè)上述肽的存在或其含量增加是活性劑的一種指標(biāo)，表示該活性劑具 有能預(yù)防和/或治療皮膚衰老的特性。本發(fā)明還涉及一種活性劑，優(yōu)選地抗衰老活性劑的篩選方法，包括至少以下步 驟a)適合上述可溶性肽釋放的條件下，能將至少一種細(xì)胞類型與至少一種試驗(yàn)抗衰 老活性劑相接觸，該細(xì)胞類型能釋放至少一種本發(fā)明所述可溶性物質(zhì)，b)確定上述可溶性肽的數(shù)量，以及c)用上述可溶性物質(zhì)的數(shù)量比較步驟b)所確定的數(shù)量，該可溶性物質(zhì)的數(shù)量是 在沒(méi)有試驗(yàn)用化學(xué)化合物或生物化合物的情況下確定的。優(yōu)選地，在步驟C)的最后也可進(jìn)行選擇活性劑的步驟，可溶性物質(zhì)數(shù)量的增加是 為了選擇活性劑。
另一方面，本發(fā)明還涉及一種非侵入性、優(yōu)選地美容方法，該方法用于描述對(duì)個(gè)體 美容或治療的效果特征，該美容或治療是為了預(yù)防和/或治療與人體自然老化有關(guān)的皮膚 衰老征兆，如皺紋和細(xì)紋，并且包含至少定性或定量的表征(characterization)，描述本發(fā) 明所述的橋粒芯糖蛋白I的至少一種可溶性肽的特征。特別地，按照本發(fā)明所述方法，檢測(cè)或描述上述肽的存在或其含量增加的特征能 反映上述活性劑的作用或上述治療的效果。在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，上述其中一種方法也可包含至少一個(gè)附加步驟，該 附加步驟在橋粒芯糖蛋白I的至少一種可溶性肽的特征描述步驟的最后，即將一種護(hù)理、 優(yōu)選地美容組合物施于個(gè)體上，該組合物是由上述可溶性物質(zhì)中所獲得的信息得以確定 或選擇的。優(yōu)選地，上述附加步驟與特征描述步驟可以是連續(xù)的。在本發(fā)明的一種實(shí)施方 案中，這種組合物可從一系列組合物中進(jìn)行選擇，該系列組合物均適合特征描述步驟最后 所獲得的信息類型。所以，本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于提出了一種簡(jiǎn)單而迅速的方法，首先，該方法能描述上皮 以及優(yōu)選地皮膚表皮的生理狀態(tài)的特征，其次，該方法能相應(yīng)地調(diào)整上述上皮或表皮的治療。所述術(shù)語(yǔ)“皮膚衰老征兆”是指由于自然老化，皮膚出現(xiàn)的任何外觀變化，例如皺 紋和細(xì)紋、皮膚干枯、皮膚失去彈性和/或緊張性、真皮變薄和/或膠原纖維降解，從而導(dǎo)致 皮膚出現(xiàn)松弛和皺紋。更優(yōu)選地，上述非治療方法的目的是描述治療效果的特征，該治療能預(yù)防和/或 治療個(gè)體皮膚衰老征兆，包含至少以下步驟i提供至少第一個(gè)代表上述個(gè)體的皮膚表面樣品，ii.在上述樣品中，特別地通過(guò)ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)法，優(yōu)選地通過(guò)以下實(shí) 施例1所述的方法對(duì)本發(fā)明所述的至少一種可溶性肽定量，iii對(duì)代表上述個(gè)體的第二個(gè)皮膚表面樣品重復(fù)進(jìn)行步驟i和ii，以及iv比較步驟ii和iii最后所得結(jié)果，優(yōu)選地由此推導(dǎo)出與至少一個(gè)治療效果、與 不同治療階段相對(duì)應(yīng)的上述第一和第二個(gè)皮膚表面樣品有關(guān)的信息。步驟ii的參考值或數(shù)據(jù)是在開(kāi)始上述治療前從代表個(gè)體的上皮、優(yōu)選地表皮中 獲得的數(shù)據(jù)，該個(gè)體是治療受試者。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一個(gè)樣品代表治療前的狀態(tài)，第二個(gè)樣品 代表治療期間或治療后的狀態(tài)。在步驟iv中，檢測(cè)上述可溶性肽的數(shù)量和增量能反映上述治療效果。 在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明所述方法可進(jìn)一步包括對(duì)上述個(gè)體進(jìn)行上述治療的 調(diào)節(jié)步驟，通過(guò)使用一種美容護(hù)理組合物進(jìn)行該治療，通過(guò)步驟iv最后所得信息確定或選 擇該組合物。另一方面，本發(fā)明還涉及使用至少一種本發(fā)明所述可溶性肽作為篩選工具，篩選 能與橋粒芯糖蛋白I反應(yīng)，優(yōu)選地使其降解的生物化合物或化學(xué)化合物，從而引起并促使 橋粒芯糖蛋白I的可溶性物質(zhì)得到釋放?？扇苄晕镔|(zhì)的特征描述對(duì)確定表皮狀態(tài)的診斷也是有用的。所以，本發(fā)明涉及一種本發(fā)明所述可溶性肽的使用，該可溶性肽可用作一種工具以描述上皮自然老化狀態(tài)的體內(nèi)和體外特征，檢測(cè)上述肽的含量或減量是上皮組織自然 老化狀態(tài)的指標(biāo)。另一方面，本發(fā)明涉及一種非侵入性、尤其是美容性的體內(nèi)或體外表征表皮自然 狀態(tài)的方法，包括對(duì)本發(fā)明所述橋粒芯糖蛋白I的可溶性肽進(jìn)行至少定性或定量表征。上皮狀態(tài)的特征描述方法包含至少以下步驟a)特別地通過(guò)ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)法，確定該上皮的表面樣品中至少一種 本發(fā)明所述可溶性肽的數(shù)量，以及b)用參考值比較步驟a)所確定的上述數(shù)量。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)與至少上皮、優(yōu)選地表皮中獲得的參考數(shù)據(jù) 段或值相比較，所得數(shù)據(jù)段或值能夠得到評(píng)估，該數(shù)據(jù)段或值不同于特征描述的主題，并且 具有已知狀態(tài)。本發(fā)明所述方法可在體外或體內(nèi)進(jìn)行。按照以下所述描述，本發(fā)明所述方法在實(shí)施方面具有優(yōu)選的優(yōu)勢(shì)，即不需要侵入 性操作。這是因?yàn)楸景l(fā)明人在角質(zhì)層上定位了這些新的生物標(biāo)記，從而使得通過(guò)簡(jiǎn)單的局 部取樣便能對(duì)上述標(biāo)記進(jìn)行定性或定量的特征描述。優(yōu)選地，可以通過(guò)簡(jiǎn)單的剝離對(duì)本發(fā)明的個(gè)體的角質(zhì)層取樣。取樣方法可以是如 剝離法，即將一部分膠帶置于當(dāng)前上皮組織上，如表皮。當(dāng)拿開(kāi)膠帶時(shí)，會(huì)有一部分上皮如 表皮部分得到剝離。提取蛋白后，可通過(guò)本發(fā)明所述ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)法分析上 述剝離部分。另一方面，本發(fā)明涉及一種本發(fā)明所述可溶性肽有效量的使用，用于制備和/或 改進(jìn)多層的細(xì)胞模型，優(yōu)選地再造皮膚模型。為達(dá)到本發(fā)明的目的，所述術(shù)語(yǔ)“有效量”是指獲得預(yù)期效果所需的最小量。另一方面，本發(fā)明涉及一種分離的再造皮膚的制備方法，該方法包含至少一個(gè)步 驟，該步驟能將至少一種本發(fā)明所述可溶性肽與細(xì)胞相接觸，其細(xì)胞能產(chǎn)生分離的再造皮 膚，及優(yōu)選地角質(zhì)形成細(xì)胞。橋粒芯糖蛋白I的“可溶性”的定義為達(dá)到本發(fā)明的目的，所述術(shù)語(yǔ)“可溶性”是指本發(fā)明所述的肽復(fù)合物或非復(fù)合 物不需要蛋白變性物質(zhì)便能在水或水介質(zhì)中溶解，如促溶劑或離子型去垢劑，而天然的橋 粒芯糖蛋白I與之相反，該蛋白只能在這種劑存在的情況下才能提取。為達(dá)到本發(fā)明的目的，所述術(shù)語(yǔ)“復(fù)合物“是指本發(fā)明所述的其中一種肽與不同于 橋粒芯糖蛋白I的蛋白或其蛋白片段、或另一種可溶性橋粒芯糖蛋白I蛋白或其衍生物的 可溶性結(jié)合。為達(dá)到本發(fā)明的目的，所述術(shù)語(yǔ)“橋粒芯糖蛋白I蛋白的衍生物“是指該蛋白的片 段或類似物，如下文所述。這些可溶性復(fù)合物可以是橋粒芯糖蛋白I蛋白或其片段與第二種蛋白相結(jié)合的 產(chǎn)物，第二種蛋白也稱作靶蛋白。通過(guò)解釋這些能與橋粒芯糖蛋白I和/或其片段相互反應(yīng)的蛋白，可特別提及的 有橋粒芯膠蛋白2a (Dsc 2)，斑珠蛋白(Plakophilins) 1、2和3，盤狀球蛋白，激肽釋放酶5，生長(zhǎng)激素1 (GHl)，SSSCAl (27KD著絲粒自身抗原)，RuvB-Iike 1，C3orfl0蛋白及VRK3 (牛 痘相關(guān)激酶3)。如先前所述用途，本發(fā)明所述的可溶性物質(zhì)衍生于、至少部分衍生于包含一種氨 基酸序列的多肽，編碼該氨基酸序列的核酸序列是由全部或部分SEQ ID No. 1、或其類似物 來(lái)表示的。為達(dá)到本發(fā)明的目的，所述術(shù)語(yǔ)“核酸序列片段“是指能對(duì)多肽進(jìn)行部分編碼的核 酸序列，及優(yōu)選地用SEQ ID No. 1或其類似物表示的核酸序列。本發(fā)明所述可溶性物質(zhì)或 其類似物衍生于該多肽。所述術(shù)語(yǔ)“核酸序列的類似物“是指任選地產(chǎn)生于核酸編碼的簡(jiǎn)并及對(duì)可溶性物 質(zhì)進(jìn)行部分編碼的任意核酸序列，該可溶性物質(zhì)所含序列等于或類似于上述核酸序列部分 編碼的可溶性物質(zhì)。該核酸序列可以來(lái)自所有可能來(lái)源，即動(dòng)物、優(yōu)選地哺乳動(dòng)物、或者甚至更優(yōu)選 地人類、或植物、或微生物(病毒、噬菌體、細(xì)菌及其他)或者真菌，而無(wú)需事先判斷該序列 是否天然存在于上述有機(jī)體來(lái)源中。按照本發(fā)明的另一種實(shí)施方案，本發(fā)明所述可溶性物質(zhì)衍生于、至少部分衍生于 包含一種氨基酸序列的多肽的蛋白水解作用，該氨基酸序列用SEQ ID No. 2、或其類似物來(lái)表不。為達(dá)到本發(fā)明的目的，除非特別說(shuō)明，所述術(shù)語(yǔ)“橋粒芯糖蛋白I”通常是指經(jīng)過(guò)或 沒(méi)有經(jīng)過(guò)在天冬酰胺殘基的36，110或180位置上N-乙酰糖基化翻譯后修飾的蛋白質(zhì)序列 (SEQ ID No. 2)，并能修飾其表觀分子量或等電點(diǎn)。此外，眾所周知地是多肽的基本序列，即一系列氨基酸，確定了由蛋白酶特別識(shí) 別的位置，如胰蛋白酶，一旦這些位置的識(shí)別生效，該基本序列將通過(guò)蛋白水解作用引起多 肽分解。該蛋白水解作用會(huì)產(chǎn)生各種不同的肽、或者蛋白水解片段，當(dāng)這些肽或片段呈可溶 性時(shí)，則可代表本發(fā)明所述橋粒芯糖蛋白I的可溶性肽。所以，按照本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明所述的可溶性物質(zhì)衍生于包含 一種氨基酸序列的多肽，該氨基酸序列選自SEQ ID No. 3，SEQ ID No. 4，SEQ ID No. 5，SEQ ID No. 6，SEQ ID No. 7，SEQ ID No. 8，SEQ ID No. 9，SEQ ID No. 10，SEQ ID No. 11，SEQ ID No. 12，SEQ ID No. 13，SEQ ID No. 14，SEQ ID No. 15，SEQ ID No. 16，SEQ IDNo. 17，SEQ ID No. 18，SEQI ID No. 19，SEQ ID No. 20，SEQ ID No. 21，SEQ ID No. 22，SEQID No. 23，SEQ ID No. 24，SEQ ID No. 25，SEQ ID No. 26，SEQ ID No. 27，SEQ ID No. 28，SEQ ID No. 29，SEQ ID No. 30，SEQ ID No. 31，SEQ ID No. 32，SEQ ID No. 33，SEQ ID No. 34，SEQ ID No. 35，SEQ ID No. 36，SEQ ID No. 37, SEQ ID No. 38，SEQ ID No. 39，SEQ IDNo. 40, SEQ ID No. 41, SEQ ID No. 42，SEQ ID No. 43，SEQ ID No. 44，SEQ ID No. 45，SEQID No. 46，SEQ ID No. 47，SEQ ID No. 48，SEQ ID No. 49，SEQ ID No. 50，SEQ ID No. 51，SEQ ID No. 52，SEQIDNo. 53，SEQ ID No. 54，SEQ ID No. 55，SEQIDNo. 56，SEQ ID No. 57，SEQ ID No. 58，SEQ ID No. 59，SEQ ID No. 60，SEQ ID No. 61，SEQ ID No. 62，SEQ IDNo. 63，SEQ ID No. 64，SEQ ID No. 65，SEQ ID No. 66，SEQ ID No. 67，SEQ ID No. 68，SEQID No. 69，SEQ ID No. 70, SEQ ID No. 71，SEQ ID No. 72，SEQ ID No. 73，SEQ ID No. 74，SEQ ID No. 75，SEQ ID No. 76，SEQ ID No. 77，SEQ ID No. 78，SEQ ID No. 79，SEQ ID No. 80，SEQ ID No. 81，SEQ ID No. 82，SEQ ID No. 83，SEQ IDNo. 84和SEQ ID No. 85，及其混合物。所述術(shù)語(yǔ)“多肽類似物“是指任何顯示序列同源性、優(yōu)選地上述多肽的其中一個(gè)特 征序列的多肽，和任何顯示相同性質(zhì)的生物活性的多肽。這種類似物可能是一種肽類似物。同源性可以至少為85%，如至少90%，以及如至少95%。該同源性可通過(guò)目測(cè) 比較或者本領(lǐng)域內(nèi)通常使用的任何計(jì)算機(jī)工具得到確定，如與缺省參數(shù)聯(lián)用的BLAST程序 (www, ncbi. nlm. nih. gov 上有該禾呈序)。序列同源性可能衍生于一種修飾作用，該修飾作用源自本發(fā)明所述肽的序列突變 或變異，該突變或變異產(chǎn)生于在本發(fā)明所述多肽的特征序列中刪除、插入或替換一種或多 種氨基酸。為達(dá)到本發(fā)明的目的，所述術(shù)語(yǔ)“片段“是指任何肽部分，該肽部分包含至少4個(gè)、 至少6個(gè)、優(yōu)選地至少8個(gè)、及更優(yōu)選地至少12個(gè)橋粒芯糖蛋白I的連續(xù)氨基酸，并且該肽 部分實(shí)質(zhì)上具有相似的的生物活性。一般地，多肽類似物包括天然氨基酸序列的保存性置 換。許多這種修飾可以進(jìn)行合并。通過(guò)本發(fā)明所述的突變例子，可提及的是用包含相似水療指數(shù)的氨基酸殘基替 代一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，但這實(shí)質(zhì)上并沒(méi)有影響橋粒芯糖蛋白I的天然生物特性。水療指數(shù)是指根據(jù)氨基酸的疏水性和電荷(Kyte et al. (1982)，J. Mol. Biol.， 157:105)分配得到的指數(shù)。本發(fā)明所涉及的可溶性物質(zhì)可以衍生于經(jīng)過(guò)一種或多種翻譯后修飾的多肽。所述術(shù)語(yǔ)“翻譯后修飾”是指一種肽或蛋白在細(xì)胞內(nèi)合成的最后所能進(jìn)行的所有 修飾，例如一種或多種磷酸化、一種或多種硫醇化、一種或多種乙酰化、一種或多種糖基化、 一種或多種脂化，如法尼基化或棕櫚?；?、結(jié)構(gòu)重排如二硫橋的形成或肽序列的裂解。此外，該類似物實(shí)質(zhì)上具有與天然多肽相似的生物活性。 按照本發(fā)明的一種實(shí)施方案，適合于實(shí)施本發(fā)明的可溶性物質(zhì)也可以是天然或合 成的多肽，通過(guò)天然橋粒芯糖蛋白I的酶裂解或化學(xué)溶胞后、或者化學(xué)或生物合成或者生 物組織的提取獲得該可溶性物質(zhì)，例如自然表達(dá)這些可溶性物質(zhì)的皮膚、及其各種不同的 翻譯后形式。按照本發(fā)明的一種實(shí)施方案，本發(fā)明所述的復(fù)合可溶性物質(zhì)可以衍生于橋粒芯糖 蛋白I或其片段與另外一種橋粒芯糖蛋白I蛋白或其片段、或靶蛋白的結(jié)合。靶蛋白優(yōu)選地選自橋粒芯膠蛋白2a(Dsc 2)，親斑蛋白質(zhì)1、2和3，盤狀球蛋白，激 肽釋放酶5，生長(zhǎng)激素1 (GHl)，SSSCAl (27KD著絲粒自身抗原)，RuvB-likel, C3orfl0蛋白 及VRK3(牛痘相關(guān)激酶3)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過(guò)以重組DNA技術(shù)為基礎(chǔ)的方法獲得本發(fā)明所述可溶性 物質(zhì)，例如“分子克隆-實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”(第2版)Sambrook et al. , 1989, Vol. I-III, ColdspringHarbor Laboratory,按照本發(fā)明的另一種實(shí)施方案，適合于實(shí)施本發(fā)明的可溶性物質(zhì)也可以是一種與 不同于上述定義的另一種多肽相融合的形式，親水或疏水靶向劑、生物轉(zhuǎn)化前驅(qū)物、或者 發(fā)光、放射性的或比色標(biāo)定劑。從非限制性方面看，可提及的熒光蛋白如“綠色熒光蛋白”，熒光化學(xué)化合物如若(g)
丹明、熒光素或德克薩斯紅，磷光化合物，放射性元素如3H、14C、35S、121I或1251，或者比色標(biāo)
定劑如發(fā)色底物，該發(fā)色底物對(duì)半乳糖苷酶、過(guò)氧物酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、熒光素酶或堿 性磷酸酯酶的作用敏感。該熒光蛋白是一個(gè)能與本發(fā)明所述可溶性物質(zhì)相耦合的化合物例 子。隨著與本發(fā)明所述可溶性物質(zhì)相耦合的化合物性質(zhì)的不同，可以通過(guò)化學(xué)方法、 優(yōu)選地化學(xué)反應(yīng)作用、或者本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的分子生物學(xué)方法進(jìn)行該耦合。通過(guò) 多肽的檢測(cè)方法，可提及的有蛋白質(zhì)印法，狹線印跡法，點(diǎn)漬法，單重或多重ELISA(酶聯(lián)免 疫吸附測(cè)定)法，蛋白組學(xué)或糖組學(xué)法，在聚丙烯酰胺凝膠中用銀基染料、考馬斯藍(lán)或者 SYPRO染料進(jìn)行的多肽染色法，免疫熒光法，紫外吸收法，常規(guī)、電子或共聚焦顯微鏡下的 免疫組織化學(xué)法，F(xiàn)RET (熒光共振能量轉(zhuǎn)移)法，TR-FRET (時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移) 法，F(xiàn)LIM(熒光壽命顯微成像)法，F(xiàn)SPIM(熒光光譜顯微成像)法，F(xiàn)RAP(熒光漂白恢復(fù)) 法，報(bào)道基因法，AFM(原子力顯微鏡)法，表面等離子共振法，微量量熱法，流式細(xì)胞法，生 物傳感器法，放射性免疫測(cè)定(RIA)法，等電聚焦法和酶分析法，使用肽芯片、糖芯片、抗體 芯片的方法，質(zhì)譜分析法、和SELDI-T0F(表面增強(qiáng)激光解吸電離-飛行時(shí)間光譜測(cè)定)法 (Ciphergen) 0按照上述所述用途，優(yōu)選地通過(guò)ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)法、及更優(yōu)選地通過(guò) 以下實(shí)施例1所述的方法描述本發(fā)明所述可溶性物質(zhì)的特征。使用本發(fā)明所述可溶性物質(zhì)的目的是篩選抗衰老活性劑和/或描述對(duì)皮膚衰老 征兆進(jìn)行治療的效果特征。按照以上所述用途，一方面，本發(fā)明涉及一種非侵入性方法，該方法用來(lái)描述、特 別地從體外方面描述抗衰老活性劑或美容或治療效果的特征，通過(guò)定性或定量分析本發(fā)明 所述可溶性物質(zhì)來(lái)描述該治療效果的特征。這些方法在其實(shí)施方面具有優(yōu)選的有利性，即無(wú)需借助外科技術(shù)便可實(shí)施該方 法，從而進(jìn)行該特征描述。如以下所述用途，本發(fā)明所述方法可在樣品上進(jìn)行，例如取自個(gè)體身上的上皮的、 和優(yōu)選地表皮的分離樣品。本發(fā)明所述方法也可以在上皮樣品，及優(yōu)選地表皮樣品上進(jìn)行從而確定其狀態(tài)， 該樣品取自上皮細(xì)胞、及優(yōu)選地表皮模型或再造的分離皮膚。所以，通過(guò)簡(jiǎn)單的剝離便可以進(jìn)行表皮提取，并且可以通過(guò)以下實(shí)施例1所述的 ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)法對(duì)所提取的表皮直接進(jìn)行分析。剝離技術(shù)是將粘性表面應(yīng)用于表皮表面，如3M公司生產(chǎn)的Blenderm 、 D' Squam(CUDERM公司生產(chǎn)的商用膠粘劑)、或氰基丙烯酸酯粘合劑。通過(guò)這種剝離，可以 對(duì)附著的角質(zhì)細(xì)胞及其細(xì)胞間隙的數(shù)量進(jìn)行取樣，然后提取該樣品，從而獲得提取物中的 蛋白質(zhì)含量。合適的取樣方法也可以更直接地通過(guò)“清洗”皮膚表面來(lái)進(jìn)行，采用例如葉式水輪 機(jī)的配件或者與流體電路相結(jié)合的螺旋細(xì)胞(專利文件FR2 667 778中有所描述)、或者直 接在皮膚表面加入/除去一滴緩沖液來(lái)“清洗”皮膚表面。通過(guò)適合實(shí)施本發(fā)明的其他取樣方法的指導(dǎo)，可提及的方法是以刮取角質(zhì)層上部 分為基礎(chǔ)的方法，該角質(zhì)層的上部分可通過(guò)雙葉片系統(tǒng)或刮取活組織檢查法進(jìn)行刮取。這種方法能夠收集鱗屑，并且可以通過(guò)各種不同的方法直接分析所收集的鱗屑，從而確定無(wú) 機(jī)物、氨基酸或脂類的數(shù)量。在取樣最后，通過(guò)以下實(shí)施例1所述的ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)法描述該樣品 的特征。該方法的基礎(chǔ)優(yōu)選地是抗體的使用，該抗體適用于檢測(cè)本發(fā)明所述可溶性物質(zhì)?？贵w可用作一種工具，用以評(píng)估表皮的狀態(tài)。通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的任 何方法可以獲得該抗體，具體在“抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”，Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, N. Y. (1990)中有所描述。優(yōu)選地，所用抗體是重組抗體，如 Antibodies-by-design(AbD)公司研制的重組抗體。如以下實(shí)施例1所述用途，橋粒芯糖蛋白I的可溶性物質(zhì)的檢測(cè)方法需要優(yōu)選地 使用兩種抗體，即采用HuCAL技術(shù)(AbD克隆AbyD03984)研制的捕獲抗體(人組合抗體 庫(kù))與MSD指標(biāo)所要求的帶有“sulpho-tag”標(biāo)簽的檢測(cè)抗體(單克隆抗體，克隆129204， R&D系統(tǒng))。生物化合物或化學(xué)化合物的篩選本發(fā)明涉及一種篩選生物或化學(xué)化合物、或者甚至抗衰老活性劑、或物化因子的 方法，該方法能在橋粒芯糖蛋白I上反應(yīng)，并且最終影響本發(fā)明所述可溶性物質(zhì)的釋放，該 方法包含至少以下步驟a)在適合上述可溶性肽釋放的條件下，將至少一種細(xì)胞類型與至少一種試驗(yàn)化學(xué) 或生物化合物相接觸，該細(xì)胞類型能釋放至少一種本發(fā)明所述可溶性肽，b)確定上述可溶性肽的數(shù)量，以及c)用上述可溶性物質(zhì)的數(shù)量比較步驟b)所確定的數(shù)量，該可溶性物質(zhì)的數(shù)量是 在沒(méi)有試驗(yàn)化學(xué)或生物化合物的情況下確定的。優(yōu)選地，在步驟C)最后也可進(jìn)行選擇活性劑的步驟，增加可溶性物質(zhì)數(shù)量是為了 選擇活性劑。步驟c)所做的比較能推導(dǎo)出修飾橋粒芯糖蛋白I的該實(shí)驗(yàn)化合物的特性信息，并 且該特性能影響本發(fā)明所述可溶性物質(zhì)的釋放。在這方面，對(duì)橋粒芯糖蛋白I產(chǎn)生作用的化合物能引起本發(fā)明所述橋粒芯糖蛋白 I的可溶性物質(zhì)的釋放，該橋粒芯糖蛋白I會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)積累在角質(zhì)層上。檢測(cè)上述可 溶性肽的存在或其含量增加可以作為化學(xué)或生物化合物的指標(biāo)，該化合物能在橋粒芯糖蛋 白I上反應(yīng)。更優(yōu)選地，治療效果的特征描述方法可包含至少以下步驟，該治療能預(yù)防和/或 治療個(gè)體皮膚老化的信號(hào)i.提供至少第一個(gè)代表上述個(gè)體的皮膚表面樣品，ii.優(yōu)選地通過(guò)ELISA (酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)法對(duì)上述樣品中至少一種本發(fā)明所述 的可溶性肽定量，iii.對(duì)代表上述個(gè)體的第二個(gè)皮膚表面樣品重復(fù)進(jìn)行步驟i和ii，以及iv.比較步驟ii和iii最后所得結(jié)果，優(yōu)選地由此推導(dǎo)出與至少一個(gè)治療效果、與 不同治療階段相對(duì)應(yīng)的上述第一和第二個(gè)皮膚表面樣品有關(guān)的信息。如果在使用生物化合物或化學(xué)化合物、或者甚至抗衰老活性劑、或者供實(shí)驗(yàn)的物化因子之前測(cè)定了參考值，那么本發(fā)明所述方法也能適當(dāng)?shù)卦u(píng)估上述化合物的潛在效果。本發(fā)明所述可溶性物質(zhì)的釋放可能不會(huì)受到上述化合物的影響，或者換言之，不 會(huì)受到刺激影響。如果出現(xiàn)了刺激效應(yīng)，那么該實(shí)驗(yàn)化合物便可以用作如一種抗衰老活性劑。本發(fā)明所述方法能在分離的細(xì)胞樣品上進(jìn)行。通過(guò)特定地ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)法可以確定本發(fā)明所述可溶性物質(zhì)的數(shù) 量，該方法在以下實(shí)施例1中有所描述。本發(fā)明還涉及一種本發(fā)明所述可溶性物質(zhì)的有效量的使用，用于制備和/或改進(jìn) 多層的細(xì)胞模型，優(yōu)選地表皮或粘膜細(xì)胞模型，及優(yōu)選地再造皮膚模型。為達(dá)到本發(fā)明的目的，所述術(shù)語(yǔ)“再造皮膚模型”是指各種不同的細(xì)胞類型相結(jié)合 的模型，該細(xì)胞類型如，優(yōu)選地皮膚的天然成分，例如角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、朗格漢斯 細(xì)胞和黑素細(xì)胞。成纖維細(xì)胞可以或沒(méi)有受到輻射。該模型及其制備為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。所以，本發(fā)明還涉及一種分離的再造皮膚的制備方法，該方法包括至少一個(gè)步驟， 該步驟能將至少一個(gè)本發(fā)明所述可溶性物質(zhì)與細(xì)胞相接觸，其細(xì)胞能產(chǎn)生分離的再造皮 膚，及優(yōu)選地角質(zhì)形成細(xì)胞。為達(dá)到本發(fā)明的目的，另一方面，上述橋粒芯糖蛋白I的可溶性物質(zhì)可以用于一 種美容或治療組合物中。眾所周知的是本發(fā)明所述的所有美容或治療組合物都采用了一種生理上可接受 的介質(zhì)。為達(dá)到本發(fā)明的目的，所述術(shù)語(yǔ)“生理上可接受的介質(zhì)”是指能將一種組合物應(yīng)用 于上皮或角蛋白材料上的合適介質(zhì)，該角蛋白材料如皮膚、頭皮、嘴唇、粘膜和角蛋白纖維 如頭發(fā)、指甲與體毛，或者適當(dāng)?shù)赝ㄟ^(guò)口服或腸外應(yīng)用該組合物。按照本發(fā)明的一種優(yōu)選的 實(shí)施方案，本發(fā)明可以是一種美容或治療組合物。除了可溶性物質(zhì)，本發(fā)明所述的組合物可以包含至少一種美容和/或治療的活性 劑。在本發(fā)明所述的活性劑的例子中，可提及的有美容油，如硅油、甘油三酯植物油、 羥基油如Parleam油和脂肪酸酯及脂肪醇酯。也可使用其他能改善皮膚條件的活性劑，如保濕活性劑或能改善天然類脂屏障的 活性劑，如神經(jīng)酰胺、膽固醇硫酸鹽和/或脂肪酸、及其混合物。也可使用在皮膚上有活性的酶，如蛋白酶、脂肪酶、葡萄糖苷酶、酰胺酶、腦甙酶和 /^melanases酶、及其混合物。一般地，本發(fā)明所述任何組合物都可以應(yīng)用于皮膚(在身體的任何皮膚部位)或 粘膜(口腔、顴骨、牙齦、生殖器、結(jié)膜等)上。眾所周知地，一種美容組合物也可包含該領(lǐng)域常用的輔助劑，如親水或親脂膠凝 齊U、親水或親脂添加劑、防腐劑、抗氧化劑、溶劑、芳香劑、填充劑、遮蔽劑、吸味劑和染料。本發(fā)明所述組合物中各種成分的含量是本領(lǐng)域的常規(guī)用量。另一方面，本發(fā)明涉及一種美容治療皮膚衰老征兆的方法，該方法包含至少一個(gè)
12步驟，該步驟將至少一種本發(fā)明所述化妝品組合物應(yīng)用于至少部分皮膚、粘膜和/或角蛋 白纖維上。另一方面，本發(fā)明還涉及使用、優(yōu)選地美容和/或治療性使用橋粒芯糖蛋白I的可 溶性肽、或其類似物、或者多肽的活性、表達(dá)和/或穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)劑，從而特別地阻止皮膚 衰老征兆、優(yōu)選地預(yù)防和/或治療衰老皮膚。按照本發(fā)明的另一種實(shí)施方案，本發(fā)明涉及一種調(diào)節(jié)劑的使用，該調(diào)節(jié)劑能調(diào)節(jié) 本發(fā)明所述可溶性物質(zhì)。為達(dá)到本發(fā)明的目的，所述術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)”是指從指定效果的角度出發(fā)，能夠刺激或 抑制該指定效果的活動(dòng)。為達(dá)到本發(fā)明的目的，所述術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)劑或能調(diào)節(jié)生物活性和/或表達(dá)的化學(xué)或 生物化合物”是指任何能直接或間接對(duì)本發(fā)明所述可溶性物質(zhì)產(chǎn)生反應(yīng)的化合物，或者對(duì) 可溶性物質(zhì)進(jìn)行部分編碼的核酸序列，或者直接或間接對(duì)胞內(nèi)或胞外信號(hào)途徑元件產(chǎn)生反 應(yīng)的化合物，或者對(duì)涉及上述可溶性物質(zhì)的代謝途徑元件產(chǎn)生反應(yīng)的化合物，或者對(duì)核酸 序列的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯及上述可溶性物質(zhì)的穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)元件產(chǎn)生反應(yīng)的化合物，該核酸 序列能編碼上述可溶性物質(zhì)。該調(diào)節(jié)劑可以抑制或激活本發(fā)明所述可溶性物質(zhì)的表達(dá)，或者調(diào)節(jié)上述可溶性物 質(zhì)的穩(wěn)定性。更優(yōu)選地，該調(diào)節(jié)劑可以是本發(fā)明所述的可溶性物質(zhì)表達(dá)的活性劑。按照本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方案，通過(guò)抑制其蛋白水解性降解作用，該調(diào)節(jié)劑 可以促進(jìn)本發(fā)明所述可溶性物質(zhì)的穩(wěn)定性。以下所示實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了非限制性說(shuō)明。


圖1 該圖說(shuō)明了通過(guò)本發(fā)明所述的高靈敏度ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)法監(jiān)測(cè) 活性劑的效果，該活性劑能作用于橋粒芯糖蛋白I的降解作用上。圖2 該圖說(shuō)明了血清對(duì)本發(fā)明所述可溶性肽的數(shù)量的作用，該血清是由10%的 bifidiobiotiC(CLR復(fù)合物)及0. 002%的植物鞘氨醇-SLC ( “G”處理)組成的。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 研制高靈敏度的ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)法是為了檢測(cè)本發(fā)明所述橋粒芯糖 蛋白I的可溶性采用MesoScale Discovery(MSD)公司的技術(shù)研制開(kāi)發(fā)了“橋粒芯糖蛋白”-特定 的96-孔板。通過(guò)采用HuCAL (人組合抗體庫(kù))技術(shù)(公司=Antibodies by Design)、并借助于 重組橋粒芯糖蛋白所進(jìn)行的篩選研制開(kāi)發(fā)了重組捕獲抗體(克隆AbyD03984)，該捕獲抗體 可用于抑制橋粒芯糖蛋白的胞外域。在200 μ g/ml的濃度條件下，該捕獲抗體滴在標(biāo)準(zhǔn)96-微孔板上。利用重組橋粒芯糖蛋白可以確定參考曲線(400至6ng/ml)。在室溫條件下，用一種封閉液(MesoScale)封閉每塊孔板1小時(shí)。各取三份樣品與標(biāo)準(zhǔn)品，每份各25μ 1，然后 放在室溫下攪拌培養(yǎng)1小時(shí)。然后用三羥甲基氨基甲烷緩沖液(MesoScale)沖洗該孔板4 次。在室溫條件下，用25 μ 1的檢測(cè)抗體(單克隆抗體，克隆129204，R&D系統(tǒng))、通過(guò)攪拌 培養(yǎng)該孔板1小時(shí)，該檢測(cè)抗體的濃度為1 μ g/ml，并帶有MSD指標(biāo)所要求的“sulpho-tag” 標(biāo)簽。在加入150 μ 1的IX read buffer T(MesoScale)之前，先用三羥甲基氨基甲烷緩沖 液(MesoScale)清洗該孔板4次。用〃 Sector Imager 6000"讀取該孔板。用Bradford 試劑盒(Bio-Rad)測(cè)定ng/yg(每ng橋粒芯糖蛋白在每μ g總蛋白的含量)，并對(duì)該數(shù)據(jù) 進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。實(shí)施例2 使用高靈敏度ELISA (酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)法篩選活性劑，該活性劑能作用于橋粒 芯糖蛋白I的降解作用上。將6mg碾細(xì)的角質(zhì)層(PSC)分散在96-多孔板篩選0. 22 μ m過(guò)濾系統(tǒng)(Millipore) 的每個(gè)孔內(nèi)。每種測(cè)定進(jìn)行三次。將100 μ IEDTA(濃度為0.2和2%)加入到ρΗ值為8的0. IM氨基丁三醇中，然后 再將該混合物加入到PSC中。在室溫條件下培養(yǎng)該孔板10分鐘，然后過(guò)濾該孔板，用200 μ 1 的PBS緩沖液清洗孔5次。然后再將200 μ 1的0. IM三羥甲基氨基甲烷(ρΗ值為8)加入 到每個(gè)孔中。在30°C下，通過(guò)攪拌，培養(yǎng)該孔板2小時(shí)，然后將該孔板過(guò)濾到接收板中，從而 收集到每種反應(yīng)介質(zhì)。在Mesoscale MA6000DB016板上檢測(cè)橋粒芯糖蛋白I肽，之前已描述過(guò)該板的研 制。每次測(cè)定都直接用25μ 1的反應(yīng)介質(zhì)進(jìn)行。在相同條件下，用重組橋粒芯糖蛋白 (R&D系統(tǒng))制備標(biāo)準(zhǔn)量程。結(jié)果可用AU (任意單位=在“sector imagerOOO”上獲得的信 號(hào))或者用ng/yg(每ng橋粒芯糖蛋白I在每μ g總蛋白的含量)來(lái)表示。圖1能實(shí)際測(cè)定橋粒芯糖蛋白I的可溶性物質(zhì)的釋放，該釋放是由如EDTA家族的 螯合劑的治療引起的，這種治療能促使角質(zhì)橋粒降解。所以，該檢測(cè)適用于評(píng)估橋粒芯糖蛋白I的降解-刺激效應(yīng)，通過(guò)測(cè)定體外所釋放 的可溶性物質(zhì)進(jìn)行該評(píng)估。所以，該測(cè)定能監(jiān)測(cè)分子或美容組合物、優(yōu)選地抗衰老活性劑的效果，從而補(bǔ)償橋 粒芯糖蛋白I在衰老的角質(zhì)層中出現(xiàn)的異常積累。實(shí)施例3 通丄寸錄去,描述各種不同樣品立芯ι通過(guò)實(shí)施例1所述的ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)法進(jìn)行該特征描述。用前臂上所取樣品進(jìn)行產(chǎn)品研究，該研究持續(xù)超過(guò)56天，即2個(gè)月(1組中有24 位擁有白種人皮膚且年齡在40-45歲的女性)。該產(chǎn)品是一種血清，該血清是由10%的Bifidiobiotic (CLR復(fù)合物)及0.002% 的植物鞘氨醇_SLC( “G”處理)組成的。CLR復(fù)合物與一種溶胞產(chǎn)物相關(guān)，該溶胞產(chǎn)物所注冊(cè)的INCI名稱為比菲德氏菌、 EINECS名稱為長(zhǎng)雙歧桿菌，EINECS編號(hào)為306-168-4及其CAS號(hào)為96507-89-0。該溶胞 產(chǎn)物特別地是由K. Richter GmbH公司以R印air Complex CLR 名稱出售的。
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植物鞘氨醇-水楊酸的衍生物是由Evonick Goldschmidt公司以植物鞘氨醇-SLC 名稱出售的。在該研究中，從前臂(后面)提取了 D-squame樣品。a)從D-squame角質(zhì)盤中提取蛋白質(zhì)將角質(zhì)盤置于2ml的埃彭道夫管中，并將粘性表面向內(nèi)放置。在該管中加入 550 μ 1的“Native+”抽提緩沖液(TBS，1 %聚乙二醇辛基苯基醚，IM氯化鈉)及一個(gè)不銹鋼 管。然后將該管放在MM400振動(dòng)磨(Retsch)的架體上。通過(guò)振動(dòng)磨以每圈2分鐘(30Hz) 的速度進(jìn)行該提取。然后回收介質(zhì)，并通過(guò)0.45μπι的Millipore Ultrafree柱對(duì)所回收 的介質(zhì)進(jìn)行過(guò)濾，然后在5000g、4°C條件下，對(duì)過(guò)濾后的介質(zhì)進(jìn)行離心分離5分鐘。最后將 待分析的上清液儲(chǔ)存在_20°C條件下。
0171]b)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
0172]從處理效應(yīng)出發(fā)，用變量分析的混合模型分析成對(duì)的活性劑-空白差異，其中時(shí) 間因素為固定效應(yīng)和主體因素為隨機(jī)效應(yīng)。
0173]通過(guò)對(duì)比，檢測(cè)在DO和D56時(shí)的處理效應(yīng)。
0174]必要時(shí)，該變量是預(yù)先對(duì)數(shù)變換的，從而使得其分布更具有正態(tài)分布性。
0175]使用SPSS軟件(第14版)進(jìn)行描述性分析(方法曲線圖和箱形圖(graphs of themeans and box plots)),以及SAS企業(yè)指導(dǎo)軟件(第3版)用于干擾部分。
0176]在雙邊法中，第一種阿爾法風(fēng)險(xiǎn)定在5%。
0177]圖2說(shuō)明了本研究的結(jié)果。
0178]圖2表現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)產(chǎn)品對(duì)可溶性物質(zhì)的數(shù)量的作用。橋粒芯糖蛋白I的可溶性物質(zhì) 的釋放顯著增加，從而表明了該產(chǎn)品對(duì)橋粒芯糖蛋白I釋放具有刺激效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)產(chǎn)品具有 真正的抗衰老作用，因?yàn)樵摦a(chǎn)品能抵消隨著年齡的增長(zhǎng)出現(xiàn)的橋粒芯糖蛋白I的積累。
0179]序列表
0180]<110> 歐萊雅
0181]<120>可溶性的橋粒芯糖蛋白I蛋白物質(zhì)用于篩選抗衰老活性劑的用途
0182]<130>BR87469/96082/KLP/PLC/cf
0183]<160>85
0184]<170>PatentIn version 3.3
0185]<210>1
0186]<211>4512
0187]<212>DNA
0188]<213> 智人
0189]<400>1
0190]cccagcccaagtttttagggtggggatccagactggttatacgtaccttcagtccttctc600191]ccagaggaaggcagaaacacctcaaagcctgcatgtaagaacatctactgagaaattatt1200192]ttaatcagacaccagctgagtgggagaaaggaaaagaacagagaagaacaaacaaaactc1800193]ccttggtcttggatgtaagagaatccagcagagatggactggagtttcttcagagtagtt2400194]gcagtgctgttcatttttctggtggtggtagaagttaacagtgaattccgaatccaggta3000195]agagattataQ.CQ.CX^Q.Q.Q.Q.0·tggcaccatcaaatggcattcaatccgaaggcagaaacgt360
ctgggctatggtaatgtcactgtgaccgagtcttacaccacctctgacactctgaagccc2760
tctgtgcacgttcacgataaccgaccagcatcaaacgtggtagtgacagagagagtggtc2820
ggcccaatctctggcgctgatttgcatggaatgttagagatgcctgacttgcgagatggg2880
tcgaatgttatagtgacagaaagggtaatagcaccaagctctagtctacccacctctctg2940
actatccatcatcctagagagtcttcaaatgtggtagtgacagaaagagtaatccaacca3000
acttccggcatgataggtagtctgagtatgcaccccgagttagccaatgcccacaatgtc3060
attgtgacagagagggttgtttctggtgctggcgtaactggaattagtggcaccactggg3120
atcagcggtggcataggcagcagtggcctggttggcaccagcatgggtgctgggagcggt3180
gccctgagtggagctggcataagtggtggtggcattggcctgagcagcttgggagggaca3240
gccagcattggccacatgaggagttcctctgaccatcactttaaccaaaccattgggtcc3300
gcctcccctagcacagctcgaagtcgaatcacaaagtatagtaccgtgcaatatagcaag3360
tagtcaggaccccagctcactttttcatagtcattgtggtttagatccaattcccaccac3420
￡l￡l￡l￡l￡l￡lC ￡1acaatgtgatttataacgcacaacttcgtgctcaggtcatctaggagcaa3480
ggtgagaaatcacaatgagaaaaataaatggaaacaccactgctaggggagagctctcct3540
tagcattcataaacttttctcttatattaggactaaggaactaaaacttgaggcagagtc3600
ttctttgtgcctgagtggcctgtagtccatctccagcatgtaactggccttacgatggca3660
attggcatcattctccttgctctgttttgcttttccatatagctcgagca3.3.3. C 3.3.3.3.3720
agaactaaatatgcaatatatgttcatatctatgggaaaaatctaaaatgtgtgccagat3780
gccctgttggtttcacagataacataaataaaaattcaaccacagatttatacaagggtt3840
aaccattttttttaagtttgactacatagtcaagtccacaagccatcaagcactcctacc3900
ttaattattgcactagagaaaataaattccaaattaggaagtgtttcctaggaggaaaat3960
tccattagagagtggcaataggatgaggtttcttcagggtaaactagcaatgcctgagcc4020
tgaaccttaatgtggggcctcagttaatatccctgtggagtcaaggattcttctgattct4080
agtgtgtgtttagtgatagatgtagtcttgacgaatattgcttactggtgaggttgagga4140
atatcacactcgtctttccctttaccactgtggttttgacttaagaaagc4200
aagtttacttctcgaattgaagcaagtgaggcctgacatggttgtcatcactagtggcaa4260
atgaccttccaagtaagcagatgggaactgaattgtgttttcaggttttgtttttagtag4320
gtgatattcattcgtatccagctctttattacatagctctgaagttaaaatgatttacat4380
aggccgagctgtggacaaaaaaaaagaagcagcagcttgtagtatgcttaagctttgggg4440
aatttttttttaaggggatctaaaaaaatgtttttagaacatgtaaaatgtttaatggtg4500
aaagttggaaaa4512
<210>2
<211>1049
<212>PRT
〈213〉智人
<400>2
Met Asp Trp Ser Phe Phe Arg ValVal Ala Val Leu Phelie Phe Leu
151015
Val Val Val Glu Val Asn Ser GluPhe Arg lie Gln Val Arg Asp Tyr
17
645650655
ThrGluGlyValLysThrSerGlyMetProGlulieCysGlnGluTyr
660665670
SerGlyThrLeuArgArgAsnSerMetArgGluCysArgGluGlyGly
675680685
LeuAsnMetAsnPheMetGluSerTyrPheCysGlnLysAlaTyrAla
690695700
TyrAlaAspGluAspGluGlyArgProSerAsnAspCysLeuLeulie
705710715720
TyrAsplieGluGlyValGlySerProAlaGlySerValGlyCysCys
725730735
SerPhelieGlyGluAspLeuAspAspSerPheLeuAspThrLeuGly
740745750
ProLysPheLysLysLeuAlaAsplieSerLeuGlyLysGluSerTyr
755760765
ProAspLeuAspProSerTrpProProGlnSerThrGluProValCys
770775780
LeuProGlnGluThrGluProValValSerGlyHisProProlieSer
785790795800
ProHisPheGlyThrThrThrVallieSerGluSerThrTyrProSer
805810815
GlyProGlyValLeuHisProLysProlieLeuAspProLeuGlyTyr
820825830
GlyAsnValThrValThrGluSerTyrThrThrSerAspThrLeuLys
835840845
ProSerValHisValHisAspAsnArgProAlaSerAsnValValVal
850855860
ThrGluArgValValGlyProlieSerGlyAlaAspLeuHisGlyMet
865870875880
LeuGluMetProAspLeuArgAspGlySerAsnVallieValThrGlu
885890895
ArgVallieAlaProSerSerSerLeuProThrSerLeuThrlieHis
900905910
HisProArgGluSerSerAsnValValValThrGluArgVallieGln
915920925
ProThrSerGlyMetlieGlySerLeuSerMetHisProGluLeuAla
930935940
AsnAlaHisAsnVallieValThrGluArgValValSerGlyAlaGly
945950955960Val Ser Gly Thr Asn Ile
Thr Gly lie Ser Gly Thr Thr Gly lie Ser Gly Gly lie Gly Ser
965970975
Gly Leu Val Gly Thr Ser Met Gly Ala Gly Ser Gly Ala Leu Ser
980985990
Ala Gly lie Ser Gly Gly Gly lie Gly Leu Ser Ser Leu Gly Gly
99510001005
Ala Ser lie Gly His Met Arg Ser Ser Ser Asp His His Phe
1010
Gln Thr 1025
Thr Lys 1040 <210>3 <211>8 <212>PRT <213>智人 <400>3 Ala Glu Phe 1
<210>4 <211>12 <212>PRT <213>智人 <400>4 Ala Glu Phe 1
<210>5 <211>13 <212>PRT <213>智人 <400>5 Ala Gly Gln 1
<210>6
<211>14
<212>PRT
<213>智人
<400>6
Ala Gly Gln
lie Gly lie Gly Tyr Ser
1015 Ser Ala 1030 Thr Val 1045
Ser Pro Gln Tyr
1020
Ser Thr Ala Arg Ser Arg 1035
Ser Lys
His His Ser lie Met 5
His His Ser lie Met Ser Gln Tyr Lys 510
lie Glu Glu Asn Ser Asn Ala Asn Thr Leu 510
lie Glu Glu Asn Ser Asn Ala Asn Thr Leu Val
1
<210>7
<211>16
<212>PRT
<213>智人
<400>7
Ala Leu Asn
1
<210>8
<211>18
<212>PRT
<213>智人
<400>8
Ala Ser Ala
1
Phe Arg
<210>9
<211>22
<212>PRT
<213>智人
<400>9
Ala Ser Ala
1
Phe Arg Pro
<210>10
<211>16
<212>PRT
<213>智人
<400>10
Asp Gly Gly
1
<210>11
<211>17
<212>PRT
<213>智人
<400>11
Asp Gly Gly
1
5
10
Ser Met Gly Gln Asp Leu Glu Arg Pro Leu Glu Leu Arg 51015
lie Ser Val Thr Val Leu Asn Val lie Glu Gly Pro Val 51015
lie Ser Val Thr Val Leu Asn Val lie Glu Gly Pro Val
51015
Gly Ser Lys 20
Ala Asp Gly Met Ser Ala Glu Cys Glu Cys Asn lie Lys 51015
Ala Asp Gly Met Ser Ala Glu Cys Glu Cys Asn lie Lys 51015
22lie <210>12 <211>18 <212>PRT <213>智人 <400>12
Asp Gly Gly Ala Asp Gly Met Ser Ala Glu Cys Glu Cys Asn lie Lys
151015
lie Leu
<210>13
<211>13
<212>PRT
<213>智人
<400>13
Asp lie Asn Asp Asn Pro Pro Val Phe Ser Met Ala Thr
1510
<210>14
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>14
Asp Leu Asp Thr Gly Arg Pro Ser Thr Thr Val Arg
1510
<210>15
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>15
Asp Ser Pro Met Phe lie lie Asn Arg 15
<210>16 <211>11 <212>PRT <213>智人 <400>16
Glu lie Arg Val lie Asp Leu Asp Glu Glu Phe 1510
<210>17 <211>14
CN 10<213>智人
<400>33
Lys lie lie
1
Arg
<210>34
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>34
Lys Leu Lys
1
<210>35
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>35
Lys Leu Lys
1
<210>36
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>36
Leu Ala Asp
1
<210>37
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>37
Leu Asp Arg
1
<210>38
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>38
Asn Met Leu
Arg Gin Glu Pro Ser Asp Ser Pro Met Phe lie lie Asn 51015
Ala Ser Ala lie Ser Val Thr Val 510
Ala Ser Ala lie Ser Val Thr Val Leu 510
lie Ser Leu Gly Lys 5
Glu Gin Tyr Gly Gin Tyr 5
Gly Gly Lys Tyr Gin Gly Thr lie
27<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>39
Asn Met Leu Gly Gly Lys Tyr Gin Gly Thr lie Leu
1510
<210>40
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<400>40
Asn Asn Phe Leu Asp Arg Glu Gin Tyr
15
<210>41
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>41
Asn AsnPhe Leu Asp Arg Glu Gin Tyr Gly
1510
<210>42
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>42
Asn Asn Phe Leu Asp Arg Glu Gin Tyr Gly Gin
1510
<210>43
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>43
Ash Asn Phe Leu Asp Arg Glu Gin Tyr Gly Gin Tyr
1510
<210>44
<211>8
<212>PRT
CN 10<213> 智人
0704]<400>44
0705]Asn Ser Asn Leu Leu Glu lie Arg
0706]15
0707]<210>45
0708]<211>9
0709]<212>PRT
0710]<213> 智人
0711]<400>45
0712]Asn Val lie Glu Gly Pro Val Phe Arg
0713]15
0714]<210>46
0715]<211>12
0716]<212>PRT
0717]<213> 智人
0718]<400>46
0719]Asn Val lie Glu Gly Pro Val Phe Arg Pro Gly Ser
0720]1510
0721]<210>47
0722]<211>13
0723]<212>PRT
0724]<213> 智人
0725]<400>47
0726]Asn Val lie Glu Gly Pro Val Phe Arg Pro Gly Ser Lys
0727]1510
0728]<210>48
0729]<211>14
0730]<212>PRT
0731]<213> 智人
0732]<400>48
0733]Asn Val lie Glu Gly Pro Val Phe Arg Pro Gly Ser Lys Thr
0734]1510
0735]<210>49
0736]<211>15
0737]<212>PRT
0738]<213> 智人
0739]<400>49
0740]Asn Val lie Glu Gly Pro Val Phe Arg Pro Gly Ser Lys Thr Tyr
0741]151015
<210>50
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>50
Pro Pro Tyr
1
<210>51
<211>13
<212>PRT
<213>智人
<400>51
Gin Glu Pro
1
<210>52
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>52
Arg lie Ser
1
<210>53
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>53
Arg lie Ser
1
<210>54
<211>13
<212>PRT
<213>智人
<400>54
Arg lie Ser
1
<210>55
<211>14
<212>PRT
<213>智人
Gly lie Phe Val lie Asn Gin Lys 510
Ser Asp Ser Pro Met Phe lie lie Asn Arg 510
Gly Val Gly lie Asp Gin Pro Pro 510
Gly Val Gly lie Asp Gin Pro Pro Tyr 510
Gly Val Gly lie Asp Gin Pro Pro Tyr Gly 510
<210>61
<211>10
<212>PRT
<213>智人
<400>61
Thr Leu Ash
1
<210>62
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<400>62
Thr Met Asn
1
<210>63
<211>13
<212>PRT
<213>智人
<400>63
Thr Tyr Val
1
<210>64
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>64
Val Ala Thr
1
<210>65
<211>14
<212>PRT
<213>智人
<400>65
Val Ala Thr
1
<210>66
<211>15
<212>PRT
<213>智人
Ser Asn Leu Leu Glu lie Arg 510
Asn Phe Leu Asp Arg 5
Val Thr Gly Asn Met Gly Ser Asn Asp Lys 510
Asp Leu Asp Thr Gly Arg Pro Ser Thr 510
Asp Leu Asp Thr Gly Arg Pro Ser Thr Thr Val 510
<211>20
<212>PRT
<213>智人
<400>82
Val Val ThrGlyAsn
15
Ala Thr AspLeu
20
<210>83
<211>30
<212>PRT
<213>智人
<400>83
Val Val ThrGlyAsn
15
Ala Thr AspLeuAsp
20
<210>84
<211>14
<212>PRT
<213>智人
<400>84
Tyr Gin GlyThrlie[1000]15[1001]<210>85[1002]<211>16[1003]<212>PRT[1004]<213>智人[1005]<400>85[1006]Tyr Val MetGlyAsn[1007]15
10
15
10
15
25
30
10
10
1權(quán)利要求
至少一種可溶性肽復(fù)合物或非復(fù)合物用作預(yù)防和/或治療皮膚衰老的活性劑的篩選工具的用途，所述肽至少部分地衍生于含有由全部或部分SEQ ID No.1表達(dá)的核酸序列編碼的氨基酸序列的多肽或其類似物。
2.如權(quán)利要求1的所述用途，其特征在于檢測(cè)到所述肽的存在或其含量增加表示活性 劑具有預(yù)防和/或治療皮膚衰老的性能。
3.如權(quán)利要求1或2的所述用途，其特征在于所述肽至少部分地衍生于含有由SEQ IDNo. 2表達(dá)的氨基酸序列的多肽水解物或其類似物。
4.如權(quán)利要求1的所述用途，其特征在于所述多肽含有選自以下氨基酸序列SEQIDNo.3，SEQID No. 4，SEQ ID No.5，SEQID No. 6，SEQ ID No. 7，SEQIDNo. 8，SEQ ID No. 9，SEQIDNo.10，SEQIDNo.11，SEQIDNo.12，SEQIDNo.13，SEQIDNo.14，SEQIDNo.15，SEQIDNo.16，SEQIDNo.17，SEQIDNo.18，SEQIDNo.19，SEQIDNo.20，SEQEDNo.21，SEQIDNo.22，SEQIDNo.23，SEQIDNo.24，SEQIDNo.25，SEQIDNo.26，SEQIDNo.27，SEQIDNo.28，SEQIDNo.29，SEQIDNo.30，SEQIDNo.31，SEQIDNo.32，SEQIDNo.33，SEQIDNo.34，SEQIDNo.35，SEQIDNo.36，SEQIDNo.37，SEQIDNo.38，SEQIDNo.39，SEQIDNo.40，SEQIDNo.41，SEQIDNo.42，SEQIDNo.43，SEQIDNo.44，SEQIDNo.45，SEQIDNo.46，SEQIDNo.47，SEQIDNo.48，SEQIDNo.49，SEQIDNo.50，SEQIDNo.51，SEQIDNo.52，SEQIDNo.53，SEQIDNo.54，SEQIDNo.55，SEQIDNo.56，SEQIDNo.57，SEQIDNo.58，SEQIDNo.59，SEQIDNo.60，SEQIDNo.61，SEQIDNo.62，SEQIDNo.63，SEQIDNo.64，SEQIDNo.65，SEQIDNo.66，SEQIDNo.67，SEQIDNo.68，SEQIDNo.69，SEQIDNo.70，SEQIDNo.71，SEQIDNo.72，SEQIDNo.73，SEQIDNo.74，SEQIDNo.75，SEQIDNo.76，SEQIDNo.77，SEQIDNo.78，SEQIDNo.79，SEQIDNo.80，SEQIDNo.81，SEQIDNo.82，SEQIDNo.83，SEQIDNo,.84 禾口 SEQIDNo. 85，及其混合物。
5.如權(quán)利要求1的用途，所述可溶性肽是非復(fù)合型。
6.如權(quán)利要求1的用途，其特征在于所述可溶性復(fù)合物衍生于橋粒芯糖蛋白 KDesmoglein I)或其片段與另一種橋粒芯糖蛋白I蛋白或其片段、或靶蛋白的結(jié)合。
7.如權(quán)利要求6所述用途，其特征在于其中靶蛋白選自橋粒芯膠蛋白2a(Dsc2)，斑 珠蛋白1、2和3，盤狀球蛋白，激肽釋放酶5，生長(zhǎng)激素I(GHl)，SSSCAl (27kD的著絲粒自身 抗原)，RuvB樣蛋白1，C3orfl0蛋白及VRK3(痘苗相關(guān)激酶3)。
8.抗衰老活性劑的篩選方法，包括至少以下步驟a)在適于可溶性肽釋放的條件下，將至少一種細(xì)胞類型與至少一種待試抗衰老活性 劑相接觸，該細(xì)胞類型能釋放至少一種肽，所述肽至少部分地衍生于含有由全部或部分SEQ ID No. 1表達(dá)的核酸序列編碼的氨基酸序列的多肽或其類似物，b)測(cè)定所述可溶性肽的含量，以及c)將步驟b)所測(cè)得的含量，與無(wú)待試化學(xué)化合物或生物化合物存在條件下測(cè)得的可 溶性肽的含量比較。
9.對(duì)美容或治療性處置的效果進(jìn)行表征的方法，所述美容或治療性處置用于預(yù)防和/ 或治療個(gè)體中與自然老化相關(guān)的皮膚衰老征兆，所述方法至少包括對(duì)至少一種復(fù)合的或非 復(fù)合的可溶性肽進(jìn)行定性或定量地表征，所述肽至少部分地衍生于含有由全部或部分SEQ ID No. 1表達(dá)的核酸序列編碼的氨基酸序列的多肽或其類似物。
10.如權(quán)利要求8或9的所述方法，其中檢測(cè)或表征所述可溶性肽的存在或其含量增加 表示所述活性劑或處置具有的效果。
11.對(duì)處置的效果進(jìn)行表征的非治療方法，所述處置用于預(yù)防和/或治療個(gè)體皮膚衰 老征兆，該方法包括至少以下步驟i.提供至少第一個(gè)代表上述個(gè)體的皮膚表面樣品，ii.在上述樣品中，尤其是通過(guò)ELISA分析技術(shù)，對(duì)所述的至少一種可溶性肽定量，所 述肽至少部分地衍生于含有由全部或部分SEQ ID No. 1表達(dá)的核酸序列編碼的氨基酸序列 的多肽或其類似物，iii.對(duì)代表上述個(gè)體的第二個(gè)皮膚表面樣品重復(fù)進(jìn)行步驟i和ii，以及iv.比較步驟ii和iii所得的結(jié)果，尤其是由此推導(dǎo)出與所述處置、對(duì)應(yīng)于不同處置階 段的所述第一和第二皮膚表面樣品的至少一種效果有關(guān)的信息。
12.如權(quán)利要求11所述方法，其特征在于其中第一個(gè)樣品代表預(yù)處置的狀態(tài)，第二個(gè) 樣品代表處置期間或處置后的狀態(tài)。
13.如權(quán)利要求11所述方法，其特征在于在步驟iv中，檢測(cè)到所述可溶性肽的存在或 其含量增加是所述處置有效的指標(biāo)。
14.如權(quán)利要求11的方法，其特征在于進(jìn)一步包括對(duì)個(gè)體施用美容護(hù)理組合物的調(diào)節(jié) 步驟，用以調(diào)節(jié)所述處置，所述組合物是通過(guò)步驟iv所獲的相關(guān)信息而構(gòu)建或選擇的。
15.一種復(fù)合的或非復(fù)合的可溶性肽作為篩選工具的用途，所述肽至少部分地衍生于 含有由全部或部分SEQ ID No. 1表達(dá)的核酸序列編碼的氨基酸序列的多肽或其類似物，其 特征在于用于篩選能夠促進(jìn)可溶性橋粒芯糖蛋白I釋放的生物化合物或化學(xué)化合物。
16.一種復(fù)合的或非復(fù)合的可溶性肽作為篩選工具的用途，所述肽至少部分地衍生于 含有由全部或部分SEQ ID No. 1表達(dá)的核酸序列編碼的氨基酸序列的多肽或其類似物，用 以體內(nèi)或體外表征上皮細(xì)胞的實(shí)齡。
17.如權(quán)利要求16所述的用途，其特征在于其中檢測(cè)所述可溶性肽的存在或其含量下 降作為上皮自然老化狀態(tài)的指標(biāo)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種或多種橋粒芯糖蛋白I的可溶性肽復(fù)合物或非復(fù)合物的用途，該肽可用作一種標(biāo)記，用以評(píng)估活性劑和/或治療、尤其是表皮的抗衰老活性劑和/或治療的效果。
文檔編號(hào)C07K14/47GK101980022SQ20101000238
公開(kāi)日2011年2月23日 申請(qǐng)日期2010年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月13日
發(fā)明者多米尼克·貝爾納, 露西·西莫內(nèi)蒂, 馬克·多諾萬(wàn) 申請(qǐng)人:歐萊雅