專(zhuān)利名稱(chēng)：白細(xì)胞介素-10抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般地涉及白細(xì)胞介素-IO(IL-IO)特異性抗體和其用途。更具體地，本發(fā) 明涉及人源化的抗體，其識(shí)別人類(lèi)IL-10并調(diào)整其活性，特別是在自體免疫失調(diào)中。
背景技術(shù)：
最初被稱(chēng)為細(xì)胞因子合成抑制因子或CSIF的白細(xì)胞介素-IO(IL-IO)是造 血細(xì)胞、特別是免疫細(xì)胞的有效的免疫調(diào)節(jié)物。一些細(xì)胞，例如活化的Th2細(xì)胞、B細(xì) 胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-10。參見(jiàn)，例如，Moore等，Anne. Rev. Immunol. U :165(1993)。IL-10抑制許多細(xì)胞，包括T細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活化 和效應(yīng)物功能。特別地，IL-10抑制細(xì)胞，例如Thl細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨 噬細(xì)胞的細(xì)胞因子合成，包括IL-1、IFN-Y和TNF的合成。參見(jiàn)，例如，F(xiàn)iorentino等， J. Exp. Med. ,170 :2081-2095 (1989) ；Fiorentino 等，J. Immunol. 146 :3444(1991) ；Hsu 等， Int. Immunol. 4 :563(1992) ；Hsu 等，Int. Immunol. 4 563 (1992) ；D ‘ Andrea 等，J.Exp· Med. 178 :1041(1993) ；de Waal Malefyt 等，J. Exp. Med. 174 :915(1991) ；Fiorentino 等， J. Immunol. 147 :3815(1991)。多種病原體，特別是細(xì)胞內(nèi)病原體，引起IL-10產(chǎn)生來(lái)減慢或完全地停止由免疫 反應(yīng)有效地去除病原體。Moore等，Annu. Rev. Immunol. U 165 (1993)。例如，在來(lái)自患有 HIV、麻瘋病或肺結(jié)核的患者的血液淋巴細(xì)胞中，當(dāng)用病原體攻擊時(shí)，外周血淋巴細(xì)胞在體 外一般是無(wú)變應(yīng)性的或非響應(yīng)性的。然而，在這些當(dāng)中IL-IO的中和作用表明活性的效應(yīng) 物應(yīng)答，即，Thl反應(yīng)性存在于這些細(xì)胞中。因而，相信IL-IO被病原體有效地利用來(lái)促進(jìn) 其傳染性狀態(tài)。IL-IO還與體內(nèi)自身免疫相關(guān)。自身免疫由靶向正常組織的自身抗體、自身反應(yīng) 性T細(xì)胞或它們的某些組合的發(fā)展引起。自身免疫性疾病的一個(gè)實(shí)例是全身性紅斑狼瘡 (SLE)，一種慢性風(fēng)濕性疾病，在其中全身的結(jié)締組織都成為炎性的。自身抗體攻擊正常的 身體組織，好象正常的身體組織是外部侵入的，引起特征性的炎癥。雖然還不完全了解準(zhǔn)確 的原因，研究人員相信它兼?zhèn)溥z傳性和環(huán)境性的因素。特別地，B細(xì)胞超活動(dòng)性和各種自身 抗體的存在是SLE的特征。一般地，與雙鏈DNA反應(yīng)的IgG自身抗體(IgG抗dsDNA abs) 在SLE患者中升高了。60到70%之間的SLE患者產(chǎn)生IgG抗dsDNA abs，其中一些是有腎 臟毒性的。SLE在女性中比在男性中高發(fā)十倍，具有的癥狀從面部的皮疹到致殘性和潛在危 急生命的器官功能障礙。它可以在任何年齡發(fā)作，但最常見(jiàn)的是在年輕成年人中。大量的研究證明了 IL-10在與SLE相關(guān)的病理過(guò)程中的作用。例如，盡管IL-10 —
3般不由未受適當(dāng)刺激的細(xì)胞產(chǎn)生，但是來(lái)自SLE患者的B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在體外都自然地 產(chǎn)生高水平的IL-10。Llorente等，Arthritis Rheum.迎249-60 (1997)。在幾項(xiàng)研究中，研 究人員證明了 IL-IO血清水平和疾病活動(dòng)性之間的相關(guān)性。此外，體內(nèi)和體外研究都表明， 阻斷IL-10產(chǎn)生可以減輕SLE的臨床表現(xiàn)。參見(jiàn)，例如，Gonzalez-Amaro等，J. Autoimmunity 11 :395-402(1998)。迄今為止，已經(jīng)通過(guò)使用免疫抑制性治療，例如，糖皮質(zhì)激素和環(huán)磷酰胺，治療了 SLE的表現(xiàn)之一，狼瘡腎炎。盡管是有效的，這些治療是非特異性的，并且存在妨礙長(zhǎng)期治療 的顯著的毒性。因而，特異性中和抗體可能是IL-IO的有效拮抗物，容許除去IL-IO的抑制 性效果而保持免疫反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)的其余部分的完整性。在體內(nèi)使用抗體作為治療劑的最重要限制是抗體的免疫原性。大多數(shù)單克隆抗體 來(lái)源于嚙齒動(dòng)物，在人類(lèi)中重復(fù)使用引起針對(duì)治療性抗體的免疫反應(yīng)的產(chǎn)生。這種免疫反 應(yīng)最小會(huì)引起治療效力的損失，最大會(huì)引起潛在的致死性過(guò)敏反應(yīng)。降低嚙齒動(dòng)物抗體的 免疫原性的最初的努力包括產(chǎn)生嵌合抗體，其中鼠可變區(qū)與人類(lèi)恒定區(qū)融合。Liu等，Proc。 Natl. Acad. Sci. USA 84 :3439 (1987)。然而，用人類(lèi)可變區(qū)和小鼠恒定區(qū)的雜合體注射的小 鼠發(fā)展出針對(duì)人類(lèi)可變區(qū)的強(qiáng)烈的抗抗體反應(yīng)，提示在這種嵌合抗體中保留完整的嚙齒 動(dòng)物Fv區(qū)域仍可能在患者中產(chǎn)生不需要的免疫原性。普遍認(rèn)為的是，可變結(jié)構(gòu)域的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)環(huán)包括抗體分子的結(jié)合位點(diǎn)。因 此，嘗試將嚙齒動(dòng)物CDR環(huán)移植到人類(lèi)框架上(即，人源化)來(lái)進(jìn)一步最小化嚙齒動(dòng)物 序列。Jones 等，Nature 321 :522(1986) ；Verhoeyen 等，Science 239 1534(1988) 然 而，CDR環(huán)交換仍然不能一致地產(chǎn)生具有與起始抗體相同結(jié)合性質(zhì)的抗體。在人源化抗體 中涉及CDR環(huán)支持的框架殘基(FR)的變化也是保存抗原結(jié)合親合性所需的。Kabat等， J. Immunol. 147 =1709(1991)。盡管已經(jīng)報(bào)道了在許多人源化抗體構(gòu)建體中使用⑶R移植和 框架殘基保留，還是很難預(yù)測(cè)具體的序列是否會(huì)產(chǎn)生具有期望的結(jié)合性質(zhì)、有時(shí)是生物學(xué) 性質(zhì)的抗體。參見(jiàn)，例如，Queen 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 100 (1989)，Gorman 等， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 :4181 (1991)，and Hodgson, Bio/Technology 9 :421 (1991)。 此外，大多數(shù)在先的研究使用了不同的人類(lèi)序列用于動(dòng)物的輕鏈和重鏈可變序列，使得這 種研究的預(yù)測(cè)的性質(zhì)是不可靠的。已經(jīng)使用了已知抗體的序列，或更典型地，具有已知X射 線(xiàn)結(jié)構(gòu)的那些抗體，抗體NEW和KOL的序列。參見(jiàn)，例如，Jones等，見(jiàn)上文；Verhoeyen等， 見(jiàn)上文；和Gorman等，見(jiàn)上文。僅對(duì)少數(shù)的人源化構(gòu)建體報(bào)道了確切的序列信息。本發(fā)明提供了識(shí)別人類(lèi)IL-IO并調(diào)整其活性，特別是關(guān)于自體免疫失調(diào)的活性的 人源化單克隆抗體。人源化抗體應(yīng)當(dāng)提供沒(méi)有與當(dāng)前的治療相關(guān)的毒性和非特異性的替換 性治療選擇。

發(fā)明內(nèi)容
在此提供的是一種結(jié)合IL-IO的人源化重組抗體分子或其結(jié)合片段，包含至少 一個(gè)抗體輕鏈可變區(qū)或其結(jié)合片段，包含具有選自由⑶Rl的SEQ ID N0:1、⑶R2的SEQ ID NO :2和⑶R3的SEQ ID NO :3構(gòu)成的組的至少一個(gè)氨基酸序列的多肽；和框架區(qū)，其中框架 區(qū)的氨基酸序列全部或基本上全部是人類(lèi)免疫球蛋白氨基酸序列；和至少一個(gè)抗體重鏈可 變區(qū)或其結(jié)合片段，包含具有選自⑶Rl的SEQ ID NO :6、⑶R2的SEQ ID NO 7和⑶R3的SEQ ID NO :8的組的至少一個(gè)氨基酸序列的多肽；和框架區(qū)，其中框架區(qū)的氨基酸序列全 部或基本上全部是人類(lèi)免疫球蛋白氨基酸序列。在此還提供的是抗體，其中所述抗體輕鏈 或其結(jié)合片段包含具有SEQ ID NO :4的可變區(qū)的多肽。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，所述抗 體輕鏈或其結(jié)合片段包含具有SEQ ID NO :5的可變區(qū)和恒定區(qū)的多肽。在一個(gè)特定的實(shí)施 方式中，所述抗體重鏈或其結(jié)合片段包含具有SEQ ID NO :9的可變區(qū)的多肽。在另一個(gè)特 定的實(shí)施方式中，所述抗體重鏈或其結(jié)合片段包含具有SEQ ID NO :10的可變區(qū)和恒定區(qū)的 多肽。在此進(jìn)一步提供是一種結(jié)合IL-10的嵌合重組抗體分子或其結(jié)合片段，包含至 少一個(gè)抗體輕鏈可變區(qū)或其結(jié)合片段，包含具有選自由⑶Rl的SEQ ID NO :1、⑶R2的SEQ ID N0:2和⑶R3的SEQ ID NO :3構(gòu)成的組的至少一個(gè)氨基酸序列的多肽；和至少一個(gè)抗體 重鏈可變區(qū)或其結(jié)合片段，包含具有選自由⑶Rl的SEQ IDNO :6、⑶R2的SEQ ID NO 7和 ⑶R3的SEQ ID NO 8構(gòu)成的組的至少一個(gè)氨基酸序列的多肽。還在此提供的是一種結(jié)合IL-10的人源化重組抗體分子或其結(jié)合片段，包含至 少一個(gè)抗體輕鏈或其結(jié)合片段，包含具有選自由⑶Rl的SEQ ID NO :11、⑶R2的SEQ ID NO: 12和CDR3的SEQID NO 13構(gòu)成的組的氨基酸序列的多肽；和框架區(qū)，其中所述框架區(qū)的氨 基酸序列全部或基本上全部是人類(lèi)免疫球蛋白氨基酸序列；和至少一個(gè)抗體重鏈或其結(jié)合 片段，包括具有選自由 CDRl 的 SEQ IDNO :15、CDR2 的 SEQ ID NO 16 和 CDR3 的 SEQ ID NO 17構(gòu)成的組的氨基酸序列的多肽；和框架區(qū)，其中所述框架區(qū)的氨基酸序列全部或基本上 全部是人類(lèi)免疫球蛋白氨基酸序列。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，所述抗體輕鏈或其結(jié)合片 段包含具有SEQ ID NO :14的可變區(qū)和恒定區(qū)的多肽。在又一個(gè)特定的實(shí)施方式中，所述抗 體重鏈或其結(jié)合片段包含具有SEQ ID NO :18的可變區(qū)和恒定區(qū)的多肽。在此進(jìn)一步提供是一種結(jié)合IL-10的嵌合重組抗體分子或其結(jié)合片段，包含至 少一個(gè)抗體輕鏈或其結(jié)合片段，包含具有選自由⑶Rl的SEQ ID NO :11、⑶R2的SEQ ID NO: 12和⑶R3的SEQID NO 13構(gòu)成的組的至少一個(gè)氨基酸序列的多肽；和至少一個(gè)抗體重鏈 或其結(jié)合片段，包含具有選自由CDRl的SEQ ID NO :15、CDR2的SEQ ID NO 16和CDR3的 SEQ ID NO :17構(gòu)成的組的至少一個(gè)氨基酸序列的多肽。在一個(gè)實(shí)施方式中，以上描述的抗體進(jìn)一步包含重鏈恒定區(qū)，其中所述重鏈恒定 區(qū)包含Yl、Υ2, 或Y 4人類(lèi)重鏈恒定區(qū)或其變體。在一個(gè)實(shí)施方式中，上述抗體進(jìn)一 步包含輕鏈恒定區(qū)，其中所述輕鏈恒定區(qū)包含lambda或kappa人類(lèi)輕鏈恒定區(qū)。在某些實(shí) 施方式中，這些抗體的結(jié)合片段是選自由Fab、Fab，、Fab，_SH、Fv、ScFV、F(ab，) 2和雙抗 體(diabody)構(gòu)成的組的抗體片段。在此進(jìn)一步提供的是在人類(lèi)受試者中抑制免疫反應(yīng)的方法，包括向需要其的受試 者以有效阻斷IL-10的生物學(xué)活性的量施用特異于IL-10的抗體或其結(jié)合片段，其中所述 抗體是在此公開(kāi)的抗體。通過(guò)這種方法抑制的免疫反應(yīng)是體液的或細(xì)胞的反應(yīng)。在一個(gè)實(shí) 施方式中，用這種方法治療的受試者患有全身性紅斑狼瘡。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述受試 者患有免疫性血小板減少性紫癜(ITC)。在又一個(gè)實(shí)施方式中，所述受試者患有狼瘡腎炎。 在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述受試者患有HIV。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述受試者患有肝炎 C。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，在人類(lèi)受試者中抑制免疫反應(yīng)的方法包括向需要其的受試者 施用(1)有效阻斷IL-10的生物學(xué)活性的量的特異于IL-10的抗體或其結(jié)合片段，其中所述抗體是在此公開(kāi)的抗體，和(2)免疫抑制試劑。在此提供的是一種組合物，包含抗體或其結(jié)合片段，與藥學(xué)上可接受的載體或稀 釋劑組合，其中所述抗體是以上公開(kāi)的抗體之一。進(jìn)一步提供的是編碼以上公開(kāi)的抗體的多肽的分離的核酸。在此還提供的是表達(dá) 載體，包含與控制序列可操作連接的分離的核酸序列，所述控制序列由用所述載體轉(zhuǎn)染的 宿主細(xì)胞識(shí)別。在此提供的是包含所述載體的宿主細(xì)胞，所述載體包含所述分離的核酸序 列。在此進(jìn)一步提供的是生產(chǎn)多肽的方法，包括在表達(dá)所述核酸序列的條件下培養(yǎng)包含所 述載體的宿主細(xì)胞，從而產(chǎn)生所述多肽，并從宿主細(xì)胞回收所述多肽。在此提供的是編碼特異于IL-10的抗體的分離的核酸序列，包含具有SEQ ID NO 19的核酸序列的輕鏈和具有SEQ ID NO :20的核酸序列的重鏈。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所 述輕鏈于2004年4月20日保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，保藏號(hào)為PTA-5923， 所述重鏈于2004年4月20日保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，具有ATCC保藏號(hào) PTA-5922。在此提供的是編碼特異于IL-10的抗體的分離的核酸序列，包含具有SEQ ID NO 21的核酸序列的輕鏈和具有SEQ ID NO :22的核酸序列的重鏈。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中， 所述輕鏈于2004年4月20日保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，具有ATCC保藏號(hào) PTA-5927，所述重鏈于2004年4月20日保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，具有ATCC 保藏號(hào)PTA-5926。在此進(jìn)一步提供的是編碼抗體的結(jié)合片段的分離的核酸序列，所述抗體由上述核 酸序列編碼。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述結(jié)合片段是選自由Fab、Fab，、Fab，-SH、Fv、SCFv和 F(ab' )2構(gòu)成的組的抗體片段。在此提供的是鑒定人源化抗體的接受體種系序列的方法，包括步驟a)鑒定具有 期望的生物學(xué)活性的非人類(lèi)抗體；b)確定非人類(lèi)抗體Vh和\結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列；和c) 將非人類(lèi)抗體序列與一組人類(lèi)種系序列進(jìn)行比較，其中所述比較包括子步驟1)給非人類(lèi) Vh和\結(jié)構(gòu)域序列的序列分配殘基編號(hào)；2)描繪序列中的CDR和FR區(qū)域；3)在非人類(lèi)和 人類(lèi)種系序列相同的每個(gè)殘基位置分配預(yù)定的數(shù)字分值；和4)總和所有的殘基分值來(lái)產(chǎn) 生每個(gè)人類(lèi)種系序列的總分值；和d)將具有最高的總殘基分值的人類(lèi)種系序列鑒定作為 接受體種系序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括子步驟力)在子步驟(4)之后， 為具有相同總殘基分值的種系序列，對(duì)在子步驟(3)中未計(jì)分的非人類(lèi)和人類(lèi)種系序列相 同的每個(gè)殘基位置分配數(shù)字分值1 ；6)總和所有殘基分值來(lái)產(chǎn)生每個(gè)人類(lèi)種系序列的總分 值。在特定的實(shí)施方式中，所述非人類(lèi)抗體特異于IL-10并且抑制IL-10的生物學(xué)活性。在 特定的實(shí)施方式中，對(duì)于Vh和\區(qū)分別如表2和3中的將數(shù)字分值分配給殘基。在此進(jìn)一步提供的是通過(guò)上述方法產(chǎn)生的抗體。


附圖IC顯示了相對(duì)于抗人類(lèi)IL-10抗體11D8的可變輕鏈，給潛在的接受體種系 序列分配殘基編號(hào)和數(shù)字分值。附圖ID顯示了相對(duì)于抗人類(lèi)IL-10抗體12D8的可變重鏈，給潛在的接受體種系 序列分配殘基編號(hào)和數(shù)字分值。附圖2A是如實(shí)施例III中描述i. v.施用的12G8抗體的濃度-時(shí)間分布曲線(xiàn)。具 體地，圖2A表示0. 03mg/kg-30mg/kg的靜脈內(nèi)彈丸施用后的濃度時(shí)間分布。附圖2B是如實(shí)施例III中描述s. c.施用的12G8的濃度-時(shí)間分布曲線(xiàn)。具體 地，圖2B表示0. 03mg/kg-30mg/kg的皮下彈丸施用后的濃度時(shí)間分布。附圖3A顯示了施用人源化抗IL-10抗體SCH708980，在IL-10轉(zhuǎn)基因小鼠中賦予 了對(duì)Leishmania major感染的抗性。感染通過(guò)在指定的時(shí)間用卡尺測(cè)量爪墊腫脹來(lái)確定。 如實(shí)施例VI中描述的施用12G8抗體。附圖:3B顯示了施用大鼠抗IL-10抗體12G8，在IL-10轉(zhuǎn)基因小鼠中賦予了對(duì) Leishmania major感染的抗性。感染通過(guò)在指定的時(shí)間用卡尺測(cè)量爪墊腫脹來(lái)確定。如實(shí) 施例VI中描述的施用12G8抗體。
具體實(shí)施例方式為了公開(kāi)的清楚性，而不是進(jìn)行限制，將發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明分成以下的小節(jié)。A.定義如果沒(méi)有另外定義，此處使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的 一個(gè)普通技術(shù)人員通常所理解的相同含義。在此引用的所有專(zhuān)利、申請(qǐng)、公開(kāi)的申請(qǐng)和其他 出版物通過(guò)引用將它們完整地合并。如果在本節(jié)中闡述的定義與通過(guò)引用合并在此的專(zhuān) 利、申請(qǐng)、公開(kāi)的申請(qǐng)和其他出版物闡述的定義相反或不一致，在本節(jié)中闡述的定義優(yōu)于通 過(guò)引用合并在此的定義。如在此使用的，“a”或“an”意指“至少一個(gè)”或“一個(gè)或多個(gè)”。如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“抗體”是指展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性的任何形式的抗體或其 片段。因而，在最寬泛的含義上使用它，并且特別地涵蓋單克隆抗體(包括全長(zhǎng)單克隆抗 體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)和抗體片段，只要它們展現(xiàn)了期望 的生物學(xué)活性。如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“ IL-10結(jié)合片段”或“其結(jié)合片段”包括仍然基本上保存了它 抑制IL-10活性的生物學(xué)活性的抗體的片段或衍生物。因此，術(shù)語(yǔ)“抗體片段”或IL-10結(jié) 合片段是指全長(zhǎng)抗體的一部分，通常是其抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的實(shí)例包括Fab、 Fab’、F(ab’)2和Fv片段；雙抗體；線(xiàn)性抗體；單鏈抗體分子，例如，sc-Fv ；和由抗體片段形 成的多特異性抗體。典型地，結(jié)合片段或衍生物保持了它的IL-10抑制活性的至少50%。優(yōu) 選的，結(jié)合片段或衍生物保持了它的IL-10抑制活性的至少60 %、70 %、80 %、90 %、95 %、 99%或100%。還預(yù)期的是IL-10結(jié)合片段可以包括基本上不改變它的生物活性的保守性 氨基酸替換。此處使用的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”是指從基本上同質(zhì)的抗體群體中獲得的抗體，即， 除了可能以少量存在的可能自然發(fā)生的突變之外，組成所述群體的單個(gè)抗體是同一的。單 克隆抗體是高度特異性的，針對(duì)單個(gè)抗原性表位。相比之下，常規(guī)的(多克隆的)抗體制品一般包括針對(duì)(或特異于)不同表位的許多抗體。修飾語(yǔ)“單克隆”表明了抗體是從基本上 同質(zhì)的抗體群體獲得的特性，不能被看作是需要通過(guò)任何特別的方法產(chǎn)生抗體。例如，根據(jù) 本發(fā)明使用的單克隆抗體可以通過(guò)由Kohler等，Nature, 256 =495(1975)首先描述的雜交 瘤方法制備，或可以通過(guò)重組DNA方法制備(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利No. 4，816，567)?！皢慰?隆抗體”也可以利用，例如，Clackson 等，Nature，352 :624-628(1991)和 Marks 等，J. Mol. Biol. 222 :581-597(1991)中描述的技術(shù)從噬菌體抗體文庫(kù)中分離。在此單克隆抗體特別地包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，在“嵌合”抗體中重鏈和 /或輕鏈的一部分與來(lái)源于特定物種或?qū)儆谔囟贵w種類(lèi)或亞類(lèi)的抗體中的相應(yīng)序列同一 或同源，而該鏈的其余部分與來(lái)源于另一個(gè)物種或?qū)儆诹硪粋€(gè)抗體種類(lèi)或亞類(lèi)的抗體中的 相應(yīng)序列同一或同源，還包括這種抗體的片段，只要它們顯示出期望的生物學(xué)活性(美國(guó) 專(zhuān)利 No. 4，816，567 ；和 Morrison 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 :6851-6855 (1984))。如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“單鏈Fv”或“scFv”抗體是指包含抗體的Vh和\結(jié)構(gòu)域 的抗體片段，其中這些結(jié)構(gòu)域以單個(gè)多肽鏈存在。通常，F(xiàn)v多肽進(jìn)一步包含V1^nt結(jié)構(gòu) 域之間的多肽接頭，其允許sFv形成用于抗原結(jié)合的期望的結(jié)構(gòu)。關(guān)于sFv的綜述，參見(jiàn) Pluckthun,THE PHARMACOLOGY OF M0N0CL0NALANTIB0DIES,vol. 113,Rosenburg and Moore eds. , Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994)。如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“雙抗體”是指具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小的抗體片段，所述 片段在同一多肽鏈中包含連接到輕鏈可變區(qū)的重鏈可變區(qū)(Vh) (Vh-VJ。通過(guò)使用非常 短以致不能容許在同一鏈上兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間配對(duì)的接頭，結(jié)構(gòu)域被迫與另一鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu) 域配對(duì)，并產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。雙抗體在例如EP 404, 097 ；WO 93/11161 ；和Hollinger 等，Proc. Natl. Acad. ki. USA 90 :6444-6448(1993)中有更詳細(xì)的描述。如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“人源化抗體”是指含有來(lái)自非人類(lèi)(例如，鼠)抗體以及人 類(lèi)抗體的序列的抗體形式。這種抗體是含有來(lái)源于非人類(lèi)免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗 體。一般地，人源化抗體包括基本上所有至少一個(gè)，典型地是兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其中，所有的 或基本上所有的高變環(huán)相應(yīng)于非人免疫球蛋白的高變環(huán)，和所有的或基本上所有的FR區(qū) 是人免疫球蛋白序列的FR區(qū)。人源化抗體任選地還將包含免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)的至少 一部分，典型地是人免疫球蛋白的恒定區(qū)的一部分。如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“高變區(qū)”是指抗體的負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)包 含來(lái)自“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基(即，輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基23-34(Ll)， 50-56 (L2)和 89-97 (L3)和重鏈可變結(jié)構(gòu)域的殘基 31-35 (HI)，50-65 (H2)和 95-102 (H3)； Kabat Sequences of Proteins of Immunologicallnterest,5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))，禾口 / 或來(lái)自“高變環(huán)” 的那些殘基(即，輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基沈-32 (Li)，50-52 (L2)和91-96 (L3)和重鏈可 變結(jié)構(gòu)域中的 26-32 (Hl)，53-55 (H2)和 96-101 (H3) ；Chothiaand Lesk, J. Mol. Biol. 196 901-917(1987))。如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“框架”或“FR”殘基是指除了在此定義為⑶R殘基 的高變區(qū)殘基之外的那些可變區(qū)殘基。如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“保守性替換”是指本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的氨基酸替換，并可 以在通常不改變產(chǎn)生的分子的生物學(xué)活性的情況下進(jìn)行。本領(lǐng)域技術(shù)人員都認(rèn)可的是， 一般地，在多肽的非關(guān)鍵區(qū)域的單個(gè)氨基酸替換基本上不改變生物學(xué)活性(參見(jiàn)，例如，
權(quán)利要求
1.鑒定人源化抗體的接受體種系序列的方法，該方法包括步驟a)鑒定具有期望的生物學(xué)活性的非人類(lèi)抗體；b)確定非人類(lèi)抗體V1^n\結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列；和c)將所述非人類(lèi)抗體序列與一組人類(lèi)種系序列進(jìn)行比較，其中所述比較包括子步驟1)給非人類(lèi)Vh和\結(jié)構(gòu)域序列的序列分配殘基編號(hào)；2)描繪序列中的CDR和FR區(qū)域；3)在非人類(lèi)和人類(lèi)種系序列相同的每個(gè)殘基位置分配預(yù)定的數(shù)字分值；和4)總和所有的殘基分值來(lái)產(chǎn)生每個(gè)人類(lèi)種系序列的總分值；和d)將具有最高的總殘基分值的人類(lèi)種系序列鑒定作為接受體種系序列。
2.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括子步驟a)在子步驟(4)之后，為具有相同總殘基分值的種系序列，對(duì)在子步驟C3)中未計(jì)分的 非人類(lèi)和人類(lèi)種系序列相同的每個(gè)殘基位置分配數(shù)字分值1 ；b)總和所有的殘基分值來(lái)產(chǎn)生每個(gè)人類(lèi)種系序列的總分值。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述Vh區(qū)域按照表2計(jì)分。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述\區(qū)域按照表3計(jì)分。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述非人類(lèi)抗體特異于IL-10并抑制IL-10的生物學(xué)活性。
全文摘要
本發(fā)明涉及白細(xì)胞介素-10抗體。具體地，在此提供的方法和組合物一般地涉及IL-10特異性抗體和其用途。更具體地說(shuō)，人源化IL-10特異性抗體的組合物和使用這樣的抗體的方法，用于調(diào)整IL-10的生物學(xué)活性，特別是在自體免疫失調(diào)和病原體介導(dǎo)的免疫病理中。
文檔編號(hào)C07K16/24GK102070716SQ20101000458
公開(kāi)日2011年5月25日 申請(qǐng)日期2004年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月10日
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