專利名稱：一種髓樣細胞表達激發(fā)受體-1的重組融合蛋白及其應(yīng)用的制作方法
一種髓樣細胞表達激發(fā)受體-1的重組融合蛋白及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種預防和治療感染性炎癥的藥物，更具體地講，涉及一種髓樣細胞 表達激發(fā)受體-1的重組融合蛋白。
背景技術(shù)：
髓樣細胞表達的激發(fā)受體(TREM)是免疫球蛋白超家族中的一個受體家族。 TREM-I于2001年在NATURE上首次報道，加深了人們對炎癥反應(yīng)的啟動和發(fā)展過程的認識。 TREM-I能識別細菌、真菌這些病原體的表面受體，主要分布在外周血中性粒細胞和單核細 胞亞群，還選擇性地表達在肺泡、腸液及其它體液的吞噬細胞上。TREM-I屬跨膜糖蛋白，具 有胞外單鏈免疫球蛋白可變區(qū)(IgV)，含陽離子化賴氨酸殘基的跨膜區(qū)和較短胞漿內(nèi)尾段 的保守結(jié)構(gòu)。TREM-IIgV能特異性與其配體或單克隆抗體結(jié)合，產(chǎn)生活化效應(yīng)，跨膜區(qū)的賴 氨酸殘基，可與接頭蛋白DAP12跨膜區(qū)內(nèi)的帶負電荷的天冬氨酸相耦聯(lián)，并通過DAP12胞漿 區(qū)中的免疫受體酪氨酸活化基序(ITAM)來傳遞活化信號，轉(zhuǎn)錄編碼促炎因子和細胞表面 分子的基因，最終導致細胞大量分泌促炎因子。文獻報道，當革蘭陽性菌、陰性菌或真菌所致的急性炎癥和肉芽腫性炎癥中，以及 內(nèi)毒素(LPQ或其他微生物導致的感染性休克中，感染組織中滲出的中性粒細胞和單核細 胞表面的TREM-I表達明顯升高。相反，對于那些非感染引起的免疫復合物炎癥反應(yīng)，如鱗 癬、潰瘍性結(jié)腸炎和脈管炎等，則不會出現(xiàn)TREM-I的表達增加。在體外，用活細菌或其胞壁 成分與中性粒細胞和單核細胞共同培養(yǎng)，可誘導免疫細胞表面的TREM-I表達上調(diào)。生物學 實驗證實，假手術(shù)組外周血中單核細胞和中性粒細胞、腹膜和脾臟的巨嗜細胞的TREM-I表 達沒有明顯改變。而膿毒血癥組，所有效應(yīng)細胞的TREM-I均出現(xiàn)特征性高表達(升高3到4 倍)。在膿毒性休克的病人，也證實了單核細胞TREM-I表達的不斷增高。THE NEW ENGLAND 醫(yī)學雜志上報道了 148例接受了機械通氣或可疑社區(qū)獲得性肺炎的病人，通過Western的 方法，快速檢測患者支氣管肺泡灌洗液中的可溶性TREM-I (sTREM-1)，有助于確診或排除細 菌性或真菌性肺炎，支氣管肺泡灌洗液中的可溶性TREM-I可作為獨立診斷肺炎的金標準。小鼠體內(nèi)TREM-I作用機制的研究證明，TREM-I擴大了細菌及真菌所致感染的炎 癥反應(yīng)效應(yīng)，與下游細胞因子之間形成一個正反饋的自分泌調(diào)節(jié)回路，影響機體的天然免 疫，促使炎癥反應(yīng)增強放大。TREM-I介導的信號轉(zhuǎn)導通路在炎癥反應(yīng)的級聯(lián)放大和膿毒癥 的發(fā)生中起著關(guān)鍵性的作用。國外學者們的大量基礎(chǔ)研究，使TREM-I在炎癥反應(yīng)中的表達和診斷價值日益得 到重視，成為炎癥反應(yīng)的分子治療靶點。小鼠膿毒性休克模型的實驗表明，阻斷TREM-I的 信號轉(zhuǎn)導通路，可以明顯降低小鼠的死亡率。根據(jù)TREM屬于IgSF，TREM-I與IgG具有一定 的同源性，有構(gòu)想TREM-I與IgG融合蛋白綜合具有此兩種免疫球蛋白的特性，這種融合蛋 白能與免疫細胞表面的TREM-I競爭性結(jié)合TREM-I配體，從而起到抑制活化信號的誘騙受 體的作用，是目前TREM研究的熱點。美國專利US 6420526 “186個分泌蛋白質(zhì)”要求保護未指明而且未加例證的分離的TREM-I片段，其包含人TREM-I至少30個連續(xù)的氨基酸，沒有提供與這些片段相關(guān)的生 物學數(shù)據(jù)。申請?zhí)?00510104693. X公布了一種“治療性肽和方法”，提供了一種多肽，其序 列為天然TREM-I蛋白序列中的一個或多個部分序列，該肽段在生物化學研究所定購并人 工合成。沒有提供TREM-I重組融合蛋白的序列和制備工藝，沒有提供TREM-I重組融合蛋 白治療感染性炎癥疾病的實施例。感染性疾病是醫(yī)學和獸醫(yī)界最常見的疾病之一，各種革蘭陽性菌、陰性菌或真菌 所致病種不勝枚舉，現(xiàn)多采用以抗生素治療為主的綜合治療方案。天然免疫應(yīng)答是機體抗 感染的第一道防線，切斷病原體和受體的識別，阻斷炎癥反應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導通路，在解決感染 性炎癥疾病方面有巨大潛力。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種小鼠或人的髓樣細胞表達激發(fā)受體-1重組融合蛋白。本發(fā)明的第二個目的在于提供一種髓樣細胞表達激發(fā)受體-1重組融合蛋白的制 備方法。本發(fā)明的第三個目的在于提供一種髓樣細胞表達激發(fā)受體-1的重組融合蛋白在 制備治療動物或人感染性炎癥疾病藥物中的應(yīng)用。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開以下技術(shù)方案一種髓樣細胞表達激發(fā)受體-1的重組融合蛋白，具有與天然TREM-I相似的結(jié)構(gòu)， 通過酶切位點連接TREM-I胞外區(qū)段和IgGFc段，所述融合蛋白具備兩種免疫球蛋白的特 性，能與免疫細胞表面的TREM-I競爭性結(jié)合TREM-I配體。小鼠髓樣細胞表達激發(fā)受體-1重組融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO=I所示。人髓樣細胞表達激發(fā)受體-1重組融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO 3所示。此重組融合蛋白的基因序列包括TREM-I胞外區(qū)段和人IgGFc段的功能區(qū)段，并由 酶切位點連接。此酶切位點可為任意一種或多種酶切位點或保護性堿基。在TREM-I胞外 區(qū)段或人IgGFc區(qū)段中增加或刪減序列，能實現(xiàn)該區(qū)段功能，能實現(xiàn)本發(fā)明的目的，得到與 本發(fā)明公開的序列大致相似的基因序列的，都應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。髓樣細胞表達激發(fā)受體-1的重組融合蛋白的制備方法，包括(1)克隆小鼠 TREM-I胞外區(qū)域和人IgG Fc段，將IgG Fc段基因插入TREM-I胞外區(qū)域基因的下游位點得 到融合片段；(2)將所述融合片段插入原核表達載體的相應(yīng)位點上，構(gòu)建重組原核表達質(zhì) 粒；C3)構(gòu)建的重組原核表達質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化受體菌，經(jīng)IPTG誘導表達，對蛋白表達產(chǎn)物進行 純化，應(yīng)用SUMO蛋白酶，其特征在于步驟O)中所述表達載體為pet-28a-HiS-Sum0 ；步驟(3)中所述蛋白表達時，IPTG 37°C誘導4_6小時，優(yōu)選4小時。步驟(3)中所述蛋白表達的條件為(1)將新抽的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21(DE3)中，37°C培 養(yǎng)過夜；(2)挑取單克隆，37°C LB培養(yǎng)10小時；(3)轉(zhuǎn)入到500ml LB培養(yǎng)基中，22°C培養(yǎng) 3-4小時，菌體濃度達到0. 6后加入IPTG，終濃度為10 μ Μ,培養(yǎng)4小時;步驟(3)中所述蛋白產(chǎn)物純化，酶切去除SUMO蛋白酶的條件為溫度4-10°C，時 間12-16小時；優(yōu)選4°C酶切12小時。髓樣細胞表達激發(fā)受體-1的重組融合蛋白在制備治療動物感染性炎癥疾病藥物 中的應(yīng)用。
髓樣細胞表達激發(fā)受體-1的重組融合蛋白在制備治療人感染性炎癥疾病藥物中 的應(yīng)用。本發(fā)明的積極效果本發(fā)明人提供的利用基因工程技術(shù)構(gòu)建表達的TREM-I重組融合蛋白，相對于人 工合成肽段，具有可增加蛋白質(zhì)分子在血液中半衰期，便于純化檢測，兼具TREM-I與IgG 融合蛋白兩種免疫球蛋白的特性，生物功能多樣等特點?？扇苄訲REM-1/IgG結(jié)構(gòu)與天然 TREM-I結(jié)構(gòu)相似，能與免疫細胞表面的TREM-I競爭性結(jié)合TREM-I配體，從而起到抑制活化 信號的誘騙受體的作用，阻斷TREM-I介導的炎癥信號轉(zhuǎn)導通路。本發(fā)明公開的蛋白基因易于修飾和改造、穩(wěn)定性好、制備簡單、療效顯著，對感染 性炎癥疾病具有很高的預防和治療作用。

圖1為小鼠TREM-1/IgG重組質(zhì)粒的構(gòu)建策略圖；圖2為人TREM-1/IgG重組質(zhì)粒的構(gòu)建策略圖；圖3為目的片段基因克隆質(zhì)粒酶切鑒定圖其中M為標準參照物，圖3-1，-2，_3 分別為質(zhì)粒PMD18-T/人TREM，pMD18-T/小鼠TREM，pMD18_T/人IgGFc酶切鑒定圖；圖3_1 中M為DNA分子量標準，1為質(zhì)粒pMD18-T/人TREM，2為EcoRV/BamH I雙酶切質(zhì)粒；圖3_2 中M為DNA分子量標準，1為EcoR I/BamH I雙酶切質(zhì)粒；圖3_3中M為DNA分子量標準，1 為質(zhì)粒pMD18-T/人IgG Fe，2為BamH I/Xho I雙酶切質(zhì)粒；圖4中，圖4-1為重組質(zhì)粒pet28a/人TREM-IgG酶切鑒定圖；圖4_2為重組質(zhì)粒 pet28a/小鼠TREM-IgG酶切鑒定圖；其中M為DNA分子量標準，1為BglIlAho I雙酶切質(zhì) 粒；圖5為表達產(chǎn)物小鼠TREM-1/IgG融合蛋白的SDS-PAGE分析M為蛋白質(zhì)分子量標 準，1為空載體pet-^a-His-sumo表達的蛋白，2為可溶部分純化后的小鼠TREM-1/IgG融 合蛋白(含載體上sumo)，3為將sumo tag酶切后的小鼠TREM-1/IgG融合蛋白；圖6為表達產(chǎn)物人TREM-1/IgG融合蛋白的SDS-PAGE分析M為蛋白質(zhì)分子量標 準；圖6-1中1，2，3分別為對照菌液上清，未誘導菌液上清，IPTG37度誘導4小時菌液上清； 圖6-2中1，2，3分別為誘導菌液上清，穿柱液和純化洗脫后的人TREM-1/IgG融合蛋白；圖7為表達產(chǎn)物小鼠TREM-1/IgG融合蛋白的flfestern Blot檢測1為可溶部分 純化后的小鼠TREM-1/IgG融合蛋白(含載體上sumo)，2為空載體petj8a-HiS-Sum0表達 的蛋白，3為將sumo tag酶切后的小鼠TREM-1/IgG融合蛋白；圖8為肺臟組織病理改變；圖9為胰腺組織病理改變。
具體實施方式
以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案做詳細說明。一、制備方法實施例1、小鼠髓樣細胞表達激發(fā)受體-1 (TREM-I)重組融合蛋白制備方法利用分子克隆和基因重組技術(shù)，從重癥感染性小鼠的外周血中，克隆小鼠TREM-I胞外區(qū)域，從健康志愿者的外周血中，克隆人IgG Fc段，再分別采用酶切和PCR方法將IgG Fc段基因插入TREM-I胞外區(qū)域基因的下游位點，然后將融合片段插入原核表達載體的相 應(yīng)位點上，構(gòu)建重組原核表達質(zhì)粒。將上述構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化受體菌，經(jīng)IPTG 誘導表達，對表達產(chǎn)物進行純化，SDS-PAGE分析表達產(chǎn)物，并對其進行體外活性測定和模型 動物感染性炎癥治療。(1)基因克隆健康雄性昆明種小鼠，清潔級，體重20 22g，由第二軍醫(yī)大學動物 中心提供。造模前禁食12h，自由飲水。按照4g/kg的劑量，腹腔注射20% L-精氨酸，間隔 一小時，重復注射一次。造模后24h經(jīng)心臟采血，抽取新鮮抗凝血Iml ；取健康志愿者的外周 新鮮抗凝血各5ml ；上述兩個新鮮抗凝血，均在室溫4小時內(nèi)抽提總mRNA，在反轉(zhuǎn)錄酶的作 用下，合成cDNA，經(jīng)PCR分別擴增，獲得小鼠TREM-I胞外區(qū)和人IgG-Fc段，并經(jīng)這兩個基因 分別克隆入PMD-18T載體，經(jīng)酶切鑒定陽性克隆，并經(jīng)測序鑒定重組T載體質(zhì)粒(pMD-18T/ 小鼠 TREM 和 pMD-18T/ 人 IgG-Fc)。(2)表達載體構(gòu)建利用限制性內(nèi)切酶位點EcoRI和BioI，雙酶切原核表達 載體pGEX4T-l ；pMD-18T/小鼠TREM胞外區(qū)質(zhì)粒經(jīng)EcoRI/BamHI雙酶切；pMD_18T/人 IgG-Fc質(zhì)粒經(jīng)BamHIAhoI雙酶切；酶切后的三片段由T4DNA1 igase酶連接，連接產(chǎn)物 應(yīng)用CaC12法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，抽提鑒定重組質(zhì)粒pGEX4T-l/小鼠TREMl_IgG。選擇自 構(gòu)建載體pet-^a-His-sumo為表達載體，選擇同尾酶BglII (AGATCT)，使用上游引物 BglII+ :tcagagatcatggaagtcaaagctgccatt，其序列表如SEQ ID NO :5所示；下游引物T7- tgctagttattgctcagcgg，其序列表如 SEQ ID N0:6 所示。從 pGEX4T_l/小鼠 TREMl-IgG 質(zhì) 粒上PCR擴增目的片段，Bglll+Xhol雙酶切以后接入到pet28a-HiS-Sum0，構(gòu)建表達重組蛋 白的原核表達質(zhì)粒peU8a/小鼠TREM-IgG。經(jīng)測序鑒定無誤。(3)蛋白表達純化該克隆轉(zhuǎn)入BL21以后，IPTG 37°C誘導4_6小時，尤其是誘導4 小時，可以很好地表達，40%左右為包涵體部分，經(jīng)優(yōu)化表達條件，可溶部分超過20mg/L LB 培養(yǎng)基。通過以下方法優(yōu)化表達條件將新抽的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21(DE3)中，37°C培養(yǎng)過夜；挑 取單克隆，37°C LB培養(yǎng)10小時；轉(zhuǎn)入到500ml LB培養(yǎng)基中，22°C培養(yǎng)3_4小時，菌體濃度 達到0. 6后加入IPTG(終濃度10 μ Μ)培養(yǎng)4小時；收菌，超聲破菌，電泳比較全細胞以及上 清的目標蛋白的含量。純化方法如下1L培養(yǎng)菌體，超聲破菌于40ml PBS中以后，離心取上清，使用 His-affinity-resin Iml層析柱純化；上樣完全以后，使用上樣緩沖液充分沖洗上樣柱 (40倍柱體積)，再使用20mM咪唑洗柱(20倍柱體積)，40mM咪唑洗柱(10倍柱體積)； 使用200mM咪唑洗脫樣品，收集洗脫峰，電泳觀察純度；集中純度符合要求的樣品，使用 Millipore超濾管濃縮樣品，切換緩沖液到PBS中；使用Bradford方法測定蛋白濃度；初步 純化后的融合蛋白為小鼠TREMl-IgG (含載體上SUMO蛋白)，應(yīng)用SUMO蛋白酶，4°C _10°C酶 切12-16小時可以特異性地去除SUM0，尤其是在4°C酶切12小時，從而得到不含任何標簽 的重組蛋白。包涵體部分，可使用以下方法純化菌體沉淀使用8M尿素溶解，高速離心，取 上清，用PBS稀釋4倍，將稀釋后的上清高速離心，去除沉淀，然后使用His-affinity-Resin 純化，所有純化Buffer中均包含2M尿素。純化后的樣品經(jīng)復性，濃縮PBS透析過夜，離心 棄取沉淀，上清部分超濾管濃縮定蛋白濃度。(4)蛋白表達鑒定=SDS-PAGE分析表達產(chǎn)物，對純化后的表達產(chǎn)物行WesternBlot和ELISA檢測，證實為目的蛋白。2、人髓樣細胞表達激發(fā)受體-1 (TREM-I)重組融合蛋白制備方法利用分子克隆和基因重組技術(shù)，從重癥感染性小鼠的外周血中，克隆小鼠TREM-I 胞外區(qū)域，從健康志愿者的外周血中，克隆人IgG Fc段，再分別采用酶切和PCR方法將IgG Fc段基因插入TREM-I胞外區(qū)域基因的下游位點，然后將融合片段插入原核表達載體的相 應(yīng)位點上，構(gòu)建重組原核表達質(zhì)粒。將上述構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化受體菌，經(jīng)IPTG 誘導表達，對表達產(chǎn)物進行純化，SDS-PAGE分析表達產(chǎn)物，并對其進行體外活性測定和模型 動物感染性炎癥治療。人髓樣細胞表達激發(fā)受體-I(TREM-I)重組融合蛋白制備方法的步驟，同小鼠樣 細胞表達激發(fā)受體-1 (TREM-I)重組融合蛋白制備方法。二、在制備治療感染性炎癥疾病藥物中的應(yīng)用實施例60只昆明種小鼠，每只經(jīng)腹腔注射精氨酸構(gòu)建重癥急性胰腺炎(SAP)模型后，隨 機將其分為6組，一組和二組為TREM-I治療組，造模后6小時經(jīng)尾靜脈注射TREM-I重組融 合蛋白，給藥濃度為8mg/Kg，三組和四組為陽性對照組，采用目前臨床上治療SAP的藥物烏 司他丁，給藥濃度為10萬U/Kg，五組和六組為SAP對照組，以生理鹽水靜脈注射。一、三、五 組分別在造模后M小時處死，二、四、六組分別在造模后72小時處死。檢測外周血中炎癥 因子的表達，病理分析胰腺和肺臟的損傷情況(見圖8、圖9)，評估TREM-I重組融合蛋白的 治療效果。結(jié)果顯示，TREM-I治療組和烏司他丁治療組的總體死亡率顯著低于SAP對照組 (P < 0. 05)；炎癥因子(MIP-1和超敏CRP)顯著低于SAP對照組(P < 0. 05)。病理分析提示SAP對照組肺泡腔出血水腫，間質(zhì)明顯增寬，大量炎性細胞浸潤， TREM-I治療組和烏司他丁治療組出血水腫好轉(zhuǎn)，炎癥細胞浸潤明顯減輕；SAP對照組胰腺 組織大片壞死，胰腺組織小葉結(jié)構(gòu)不清，出血壞死明顯，大量中性粒細胞細胞浸潤，TREM-I 治療組和烏司他丁治療組出血壞死程度明顯減輕，小葉結(jié)構(gòu)清楚，少量炎性細胞浸潤。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為 本發(fā)明的保護范圍。Untitled3. ST25. txt
SEQUENCE LISTING
<110>中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學
<120> 一種髓樣細胞表達激發(fā)受體-1的重組融合蛋白及其應(yīng)用
<130>、
<160>6
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1059
<212>DNA
<213>小鼠和人
<220>
<221>CDS6/12 頁
<222>(1) · (1059)
<400>1
atggaagtcSlSlSlgetgccattgttctagaggaagaaaggtatgaccta48
MetGluValLysAlaAlalieValLeuGluGluGluArgTyrAspLeu
151015
gtggagggccagactttgacagtgaagtgtCCCttcaacateatgaag96
ValGluGlyGlnThrLeuThrValLysCysProPheAsnlieMetLys
202530
tatgccaacagecagaaggettggcagagactaccagacgggaaggaa144
TyrAlaAsnSerGlnLysAlaTrpGlnArgLeuProAspGlyLysGlu
354045
CCCttgaccCtggtggtcacacagaggCCCtttacaagaCCCagtgaa192
ProLeuThrLeuValValThrGlnArgProPheThrArgProSerGlu
505560
gtccacatggggaagttcaccCtgcatgaccctagtgaggccatg240
ValHisMetGlyLysPheThrLeuLysHisAspProSerGluAlaMet
65707580
ctacaagttcaaatgactgacCttcaagtgacagactctggattgtat288
LeuGlnValGlnMetThrAspLeuGlnValThrAspSerGlyLeuTyr
859095
CgttgtgtgatttaccatcctCCgaatgaccctgttgtgctcttccat336
ArgCysVallieTyrHisProProAsnAspProValValLeuPheHis
100105110
cctgtcCgCCtggtggtgaccaagggttctteagatgtgttcactCgC384
ProValArgLeuValValThrLysGlySerSerAspValPheThrArg
115120125
ggatccacatgcccaCCgtgcccagcacctgaactcCtggggggaCCg432
GlySerThrCysProProCysProAlaProGluLeuLeuGlyGlyPro
130135140
teagtcttcctcttcCCCccaSlSlSlCCCaaggacaccctcatgatetcc480
SerValPheLeuPheProProLysProLysAspThrLeuMetlieSer
145150155160
eggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagecacgaagac528
ArgThrProGluValThrCysValValValAspValSerHisGluAsp
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cctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataat576
ProGluValLysPheAsnTrpTyrValAspGlyValGluValHisAsn
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權(quán)利要求
1.一種髓樣細胞表達激發(fā)受體-1的重組融合蛋白，具有與天然TREM-I相似的結(jié)構(gòu)，其 特征在于通過酶切位點連接TREM-I胞外區(qū)段和IgGFc段，所述融合蛋白具備兩種免疫球 蛋白的特性，能與免疫細胞表面的TREM-I競爭性結(jié)合TREM-I配體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述髓樣細胞表達激發(fā)受體-1的重組融合蛋白，其特征在于小鼠 髓樣細胞表達激發(fā)受體-1重組融合蛋白的基因序列如SEQ IDNO 1所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述髓樣細胞表達激發(fā)受體-1的重組融合蛋白，其特征在于人髓 樣細胞表達激發(fā)受體-1重組融合蛋白的基因序列如SEQ ID N0:3所示。
4.一種髓樣細胞表達激發(fā)受體-1的重組融合蛋白的制備方法，包括(1)克隆小鼠 TREM-I胞外區(qū)域和人IgG Fc段，將IgG Fc段基因插入TREM-I胞外區(qū)域基因的下游位點得 到融合片段；(2)將所述融合片段插入原核表達載體的相應(yīng)位點上，構(gòu)建重組原核表達質(zhì) 粒；C3)構(gòu)建的重組原核表達質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化受體菌，經(jīng)IPTG誘導表達，對蛋白表達產(chǎn)物進行 純化，應(yīng)用SUMO蛋白酶，其特征在于步驟O)中所述表達載體為pet-28a-HiS-Sum0。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于步驟(3)中所述蛋白表達時，IPTG 37度誘導4-6小時，優(yōu)選4小時。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于步驟(3)中所述蛋白表達的條件為 (1)將新抽的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21中，37°C培養(yǎng)過夜；(2)挑取單克隆，37°C LB培養(yǎng)10小時；(3) 轉(zhuǎn)入到500ml LB培養(yǎng)基中，22°C培養(yǎng)3_4小時，菌體濃度達到0. 6后加入IPTG，終濃度為 10 μ M，培養(yǎng)4小時。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于步驟(3)中所述蛋白產(chǎn)物純化，酶切 去除SUMO蛋白酶的條件為溫度4-10°C，時間12-16小時。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于酶切去除SUMO蛋白酶的條件為溫 度4°C，時間12小時。
9.權(quán)利要求1或2所述的髓樣細胞表達激發(fā)受體-1的重組融合蛋白在制備治療動物 感染性炎癥疾病藥物中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1或3所述的髓樣細胞表達激發(fā)受體-1的重組融合蛋白在制備治療人感 染性炎癥疾病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種髓樣細胞表達激發(fā)受體-1(TREM-1)重組融合蛋白及其在制備治療感染性炎癥疾病藥物中的應(yīng)用，利用分子克隆和基因重組技術(shù)，從重癥感染性休克患者和重癥感染小鼠的外周血中，分別克隆人TREM-1胞外區(qū)域和小鼠TREM-1胞外區(qū)域，再分別采用酶切和PCR方法將人IgG Fc段基因插入TREM-1胞外區(qū)域基因的下游位點，然后將融合片段插入原核表達載體的相應(yīng)位點上，構(gòu)建了重組原核表達質(zhì)粒。小鼠和人的TREM-1重組融合蛋白的基因序列分別如SEQ ID NO1和SEQ ID NO3所示。本發(fā)明公開的蛋白基因易于修飾和改造、穩(wěn)定性好、療效顯著，對感染性炎癥疾病具有很高的預防和治療作用。
文檔編號C07K16/46GK102127168SQ20101002295
公開日2011年7月20日 申請日期2010年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月19日
發(fā)明者劉巖, 李兆申, 路箏 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學