專利名稱：血管內(nèi)皮細(xì)胞表面決定簇部分多肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種血管內(nèi)皮細(xì)胞表面決定簇部分多肽，本發(fā)明特別涉及雞的血管內(nèi) 皮細(xì)胞表面決定簇部分多肽及多肽的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
多克隆抗體技術(shù)(Polyclone antibodies preparation technique)，抗原朿Ij激機(jī) 體，產(chǎn)生免疫學(xué)反應(yīng)，由機(jī)體的漿細(xì)胞合成并分泌的與抗原有特異性結(jié)合能力的一組球蛋 白，這就是免疫球蛋白，這種與抗原有特異性結(jié)合能力的免疫球蛋白就是抗體?？乖ǔＪ?由多個(gè)抗原決定簇組成的，由一種抗原決定簇刺激機(jī)體，由一個(gè)B淋巴細(xì)胞接受該抗原所 產(chǎn)生的抗體稱之為單克隆抗體(Monclone antibody) 0由多種抗原決定簇刺激機(jī)體，相應(yīng) 地就產(chǎn)生各種各樣的單克隆抗體，這些單克隆抗體混雜在一起就是多克隆抗體，機(jī)體內(nèi)所 產(chǎn)生的抗體就是多克隆抗體；除了抗原決定簇的多樣性以外，同樣一類抗原決定簇，也可刺 激機(jī)體產(chǎn)生IgG、IgM、IgA、IgE和IgD等五類抗體。供免疫用的動(dòng)物主要是哺乳動(dòng)物和禽 類，常選擇家兔、綿羊、山羊、馬、騾和豚鼠及小鼠等。動(dòng)物的選擇常根據(jù)抗體的用途和量來 決定，也與抗原的性質(zhì)有關(guān)。如要獲得大量的抗體，多采用大動(dòng)物；如要是獲得直接標(biāo)記診 斷的抗體，則直接采用本動(dòng)物；如要獲得間接的標(biāo)記診斷用抗體，則必須用異源動(dòng)物制備抗 體；如果難以獲得的抗原，且抗體的需要量少，則可以采用純系小鼠制備；一般實(shí)驗(yàn)室采用 的抗體，多用兔和羊制備。免疫用的動(dòng)物最好選擇適齡的健康雄性動(dòng)物，雌性動(dòng)物特別是妊 娠動(dòng)物用于制備免疫抗體則非常不合適，有時(shí)甚至不產(chǎn)生抗體。由于對(duì)免疫應(yīng)答的個(gè)別差 異，免疫時(shí)應(yīng)同時(shí)選用數(shù)只動(dòng)物進(jìn)行免疫。血管內(nèi)皮細(xì)胞表面決定簇CD;34(Cluster of Differentiation 34，白細(xì)胞分化 抗原34)是一種分子量為105kD-120kD的高度糖基化的I型跨膜蛋白，其分子中的35% 氨基酸由蘇氨酸和絲氨酸組成。這種蛋白能夠選擇性地表達(dá)于早期造血干細(xì)胞、胚胎纖 維母細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞的膜表面。在二十世紀(jì)八十年代中期，Civin等人首次用髓系細(xì) 胞KG-Ia制備出單克隆抗體MylO，發(fā)現(xiàn)這種抗體能夠特異性地與造血干細(xì)胞的膜蛋白相 結(jié)合，并將此膜蛋白命名為CD34抗原。進(jìn)而發(fā)現(xiàn)，編碼CD34抗原基因位于第一條染色 體長(zhǎng)臂上，全長(zhǎng)cDNA為2.651Λ，ORF為119bp，編碼383個(gè)氨基酸。經(jīng)過核苷酸序列分 析表明，CD34抗原與任何其他已知細(xì)胞表面分子編碼基因無明顯的同源性。目前用來 從外周血、周圍組織微血管中分離內(nèi)皮前體細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞的方法主要依賴于選擇 ⑶34，進(jìn)而再擴(kuò)增富集這些細(xì)胞。根據(jù)血管內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)⑶34的原理，還可以分離 和純化血管內(nèi)皮細(xì)胞(Endothelial Cell，EC)。Arts等從皮下脂肪提取微血管內(nèi)皮細(xì)胞 (MicrovascularEndothelial Cell, MVEC)，以 Nexell 通用法作 CD34 抗體選擇，經(jīng)過分離、 培養(yǎng)和恢復(fù)MVEC，使MVEC富集到86 %。自從發(fā)現(xiàn)、純化和標(biāo)記抗CD34單克隆抗體以后，使利用流式細(xì)胞定量檢測(cè)在外周 血或骨髓中的⑶34陽性造血干細(xì)胞成為可能。⑶34單克隆抗體識(shí)別⑶34抗原的不同表 位，這些表位根據(jù)他們對(duì)神經(jīng)氨酸酶，木瓜蛋白酶和糖蛋白酶的敏感程度不同，可以分為三
3類1類(對(duì)三種酶均敏感)；II類(對(duì)神經(jīng)氨酸酶抵抗，對(duì)木瓜蛋白酶和糖蛋白酶敏感)； III類(對(duì)三種酶抵抗)，在正常造血干細(xì)胞中這些表位的分布不同，可能與造血干細(xì)胞的 分化，成熟和功能有關(guān)。這一個(gè)強(qiáng)大而標(biāo)準(zhǔn)化的⑶34分析系統(tǒng)的建立，極大地推動(dòng)了⑶34 研究領(lǐng)域的迅速進(jìn)步。例如，熒光素標(biāo)記的單克隆抗體可用于CD34鑒定細(xì)胞，同時(shí)結(jié)合流 式細(xì)胞儀，為鑒定和計(jì)數(shù)CD34細(xì)胞提供了一個(gè)快速、定量、重復(fù)性好的方法，進(jìn)而決定動(dòng)員 干細(xì)胞及采集最佳時(shí)間。內(nèi)皮細(xì)胞的CD34抗原可與L選擇素結(jié)合，但造血干細(xì)胞上的CD34 抗原的配體尚未發(fā)現(xiàn)，此抗原在細(xì)胞粘附中起作用。盡管現(xiàn)已證實(shí)造血干細(xì)胞表達(dá)⑶34抗原，然而用其鑒別多能干細(xì)胞的工作相當(dāng) 復(fù)雜且剛起步。近年利用⑶；34單克隆抗體顯示血管EC的研究結(jié)果表明，⑶34為EC的最 敏感的特異性標(biāo)記，優(yōu)于EC的其他標(biāo)記物。但是目前關(guān)于CD34的多克隆抗體報(bào)道罕見，特 別在家禽方面，造成了以家禽為模式生物進(jìn)行科學(xué)研究的限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的為提供一種CD34部分多肽，及其在制備CD34多克隆抗體方面的應(yīng)用。一種血管內(nèi)皮細(xì)胞表面決定簇部分多肽，其中，其氨基酸序列為序列表中的序列 1。一種復(fù)合蛋白，是多肽與載體蛋白偶聯(lián)形成的復(fù)合蛋白，其中，所述多肽的氨基酸 序列為序列表中的序列1。本發(fā)明的復(fù)合蛋白，其中，載體蛋白是匙孔血藍(lán)蛋白或牛血清白蛋白。一種免疫原，是復(fù)合蛋白和免疫佐劑的混合物；所述復(fù)合蛋白是多肽與載體蛋白 偶聯(lián)形成的復(fù)合蛋白，所述多肽的氨基酸序列為序列表中的序列1。本發(fā)明的免疫原，其中所述載體蛋白為匙孔血藍(lán)蛋白或牛血清白蛋白。本發(fā)明的免疫原在制備多克隆抗體中的應(yīng)用。與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面決定簇特異結(jié)合的多克隆抗體，是用免疫原免疫動(dòng)物，采取 免疫后動(dòng)物的血液，獲得的血清；所述免疫原是復(fù)合蛋白和免疫佐劑的混合物；所述復(fù)合 蛋白是多肽與載體蛋白偶聯(lián)形成的復(fù)合蛋白，所述多肽的氨基酸序列為序列表中的序列1。本發(fā)明的多克隆抗體，其中所述載體蛋白為匙孔血藍(lán)蛋白或牛血清白蛋白。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為提供了一種血管內(nèi)皮細(xì)胞表面決定簇部分多肽，該多肽的特異性和敏感性好。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)為使用該多肽所制備的多克隆抗體的特異性和敏感性較高， 使用該多肽制備多克隆抗體的方法，操作過程簡(jiǎn)單節(jié)省時(shí)間，節(jié)約經(jīng)費(fèi)。


圖1免疫組化檢測(cè)SPF新西蘭大耳白兔五回免疫后陽性血清圖A圖為相差圖片， B圖為相差與熒光疊加圖片，C圖為熒光圖片。圖2免疫組化檢測(cè)SPF新西蘭大耳白兔免疫前陰性血清圖A圖為相差圖片，B圖 為相差與熒光疊加圖片，C圖為熒光圖片。
圖3免疫組化以PBS代替血清圖A圖為相差圖片，B圖為相差與熒光疊加圖片，C 圖為熒光圖片。圖4免疫印跡法檢測(cè)檢測(cè)SPF新西蘭大耳白兔五回免疫后陽性血清圖。
具體實(shí)施例方式(一 )合成免疫原人工合成免疫多肽，其氨基酸序列為CQSSAHPSTHPSVHPSTH。人工合成對(duì)照多肽，其氨基酸序列為CLATSEVDQECLLLILDGN。對(duì)人工合成的多肽進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，人工合成的免疫多肽為白色凍干粉末，分子量為1897. 03，HPLCO20nm， C18，線性梯度)檢測(cè)純度為90%。對(duì)照多肽為白色凍干粉末，分子量為2049. 34，HPLC(220nm, C18，線性梯度)檢測(cè) 純度為90%。(二)與雞⑶34特異結(jié)合的多克隆抗體免疫多肽與載體蛋白按照質(zhì)量比1 1偶聯(lián)，形成多肽-載體復(fù)合蛋白，載體蛋白 可以是匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)或牛血清白蛋白(BSA)，本實(shí)施例為免疫多肽-KLH復(fù)合蛋白。對(duì)照多肽與KLH按照質(zhì)量比1 1偶聯(lián)，形成對(duì)照多肽-KLH復(fù)合蛋白。免疫多肽-KLH復(fù)合蛋白與費(fèi)氏完全佐劑(Sigma)混合，制成免疫原。對(duì)照多肽-KLH復(fù)合蛋白與費(fèi)氏完全佐劑(Sigma)混合，制成對(duì)照免疫原。用上述制備的免疫原和對(duì)照免疫原分別免疫SPF新西蘭大耳兔。20周齡以內(nèi)，2. 5-3Kg的SPF新西蘭大耳兔，隨機(jī)分成兩組，免疫多肽組和對(duì)照多 肽組，每組2只。免疫多肽組注射免疫原，對(duì)照多肽組注射對(duì)照免疫原。免疫的具體過程如下第1周，每天多點(diǎn)背部皮下注射免疫SPF新西蘭大耳兔一次，每只SPF新西蘭大耳 兔注射免疫多肽-KLH復(fù)合蛋白或?qū)φ斩嚯?KLH復(fù)合蛋白的總量為0. Img ；第2周，對(duì)SPF新西蘭大耳兔不做任何處理；第3周-第7周，每天多點(diǎn)背部皮下注射免疫SPF新西蘭大耳兔一次，每只SPF新 西蘭大耳兔注射免疫多肽-KLH復(fù)合蛋白或?qū)φ斩嚯?KLH復(fù)合蛋白的總量為0. Img ；第7周免疫結(jié)束，處死SPF新西蘭大耳兔，從耳部及心臟采取150ml血液，用促凝 劑促凝，3000轉(zhuǎn)離心20分鐘。免疫多肽組獲得免疫血清01和02。對(duì)照多肽組獲得對(duì)照血清01和02。ELISA檢測(cè)免疫血清和對(duì)照血清的效價(jià)，具體方法如下1)上述雞⑶34特異結(jié)合的多克隆抗體用PBS配成100 μ g/ml的溶液，按100 μ 1/ 每孔加入96孔酶標(biāo)板，4°C過夜吸附；2)次日將過夜包被的酶標(biāo)板中未吸附的雞⑶34特異結(jié)合的多克隆抗體倒掉，以 PBS洗3次。加入3% (質(zhì)量百分比)BSA (用PBS配制不含Tween20，)封閉，ΙΟΟμΙ/每孔， 37°C，1. 5 小時(shí)；3)用PBS徹底洗2)中的沉淀4次后加入免疫血清或?qū)φ昭?用PBS按體積比為 1 100、1 500、1 2500、1 12500 或 1 62500 稀釋)，100 μ 1/每孔，37°C，1. 5 小 時(shí)；4)用PBS洗3)中的沉淀4次，加二抗(羊抗兔IgG用PBS按體積比為1 10000 稀釋)，100 μ 1/每孔，37°C，lhr ；5)用PBS洗4)中的沉淀4次，加AP顯色液P-NPP (2mg/ml)，80 μ 1/每孔，避光反 應(yīng)，加等體積0. 2Μ NaOH終止反應(yīng)。6)取100μ 1 5)中終止反應(yīng)后的溶液100μ 1，用酶標(biāo)儀測(cè)定405nm下的OD值。實(shí) 驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果以三次的平均值表示。血清效價(jià)檢測(cè)結(jié)果如表1所示；表1.血清效價(jià)檢測(cè)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種血管內(nèi)皮細(xì)胞表面決定簇部分多肽，其特征在于，其氨基酸序列為序列表中的 序列1。
2.一種復(fù)合蛋白，是多肽與載體蛋白偶聯(lián)形成的復(fù)合蛋白，其特征在于，所述多肽的氨 基酸序列為序列表中的序列1。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的復(fù)合蛋白，其特征在于，載體蛋白是匙孔血藍(lán)蛋白或牛血清 白蛋白。
4.一種免疫原，是復(fù)合蛋白和免疫佐劑的混合物；所述復(fù)合蛋白是多肽與載體蛋白偶 聯(lián)形成的復(fù)合蛋白，所述多肽的氨基酸序列為序列表中的序列1。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的免疫原，其特征在于所述載體蛋白為匙孔血藍(lán)蛋白或牛血 清白蛋白。
6.權(quán)利要求4或5所述的免疫原在制備多克隆抗體中的應(yīng)用。
7.與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面決定簇特異結(jié)合的多克隆抗體，是用免疫原免疫動(dòng)物，采取免 疫后動(dòng)物的血液，獲得的血清；所述免疫原是復(fù)合蛋白和免疫佐劑的混合物；所述復(fù)合蛋 白是多肽與載體蛋白偶聯(lián)形成的復(fù)合蛋白，所述多肽的氨基酸序列為序列表中的序列1。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的多克隆抗體，其特征在于所述載體蛋白為匙孔血藍(lán)蛋白或 牛血清白蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種雞CD34部分多肽，其中，其氨基酸序列為Cys Gln Ser Ser Ala HisPro Ser Thr His Pro Ser Val His Pro Ser Thr His，本發(fā)明提供了一種血管內(nèi)皮細(xì)胞表面決定簇部分多肽，該多肽的特異性和敏感性好。
文檔編號(hào)C07K16/28GK102127148SQ201010034219
公開日2011年7月20日 申請(qǐng)日期2010年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月14日
發(fā)明者何曉紅, 關(guān)偉軍, 馮寶剛, 宮雪蓮, 李向臣, 白春雨, 趙倩君, 鄭揚(yáng), 馬月輝 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所