專利名稱：心肌特異性同源盒部分多肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種心肌特異性同源盒部分多肽及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
心臟發(fā)育是一個極其復(fù)雜的過程，它涉及到多種基因不同時間和不同空間的先后 表達與相互作用。Nkx2_5/Csx(cardiac specific homeobox)基因正是目前研究最多的與 心臟發(fā)育密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子之一，它屬于NK型同源盒基因家族中NK2型(NK2-NK4)成 員。最初，人們應(yīng)用果蠅同源結(jié)構(gòu)域(homeodomain，HD)寡梭苷酸探針篩查果蠅DNA文庫， 克隆出NK型同源盒基因，隨后分離出一種與果蠅背側(cè)血管/心臟發(fā)育密切相關(guān)的果蠅NK2 型基因-tin基因。當(dāng)tin基因發(fā)生突變時會導(dǎo)致果蠅心臟形成異常。該類基因在進化中的 高度保守性，1993年研究人員應(yīng)用cDNA文庫篩查、Southern印跡雜交、Northern印跡雜交、 RT-PCR和原位雜交等分子技術(shù)分別在兩棲類和嚙齒類動物體中分離出Nkx2_5基因并證實 其確實與果蠅tin基因高度同源。1995年Lyons等報道了靶性破壞Nkx2_5基因的小鼠產(chǎn) 生心臟發(fā)育的異常，同時又有學(xué)者分離出人類Nkx2_5基因，并將其定位染色體5q34。1996 年Turbay等在成人心臟cDNA文庫中分離出Nkx2_5基因，進一步將其定位于染色體5q35。 1998年Schott等證實在人類先天性心臟病(congenital heart diesase，CHD)患者中確 實存在Nkx2_5基因的突變。針對人體及鼠等Nkx2. 5研究中均開發(fā)出特異性的抗體，使得 心臟發(fā)育研究進展得到很大提升。針對雞Nkx2. 5特異性的抗體目前還沒有
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種心肌特異性同源盒部分多肽及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的心肌特異性同源盒(Nkx2. 5)部分多肽，其氨基酸序列為序列表 中的序列1。本發(fā)明的心肌特異性同源盒(Nkx2. 5)部分多肽，可用來制備免疫原，該免疫原免 疫動物可獲得與心肌特異性同源盒(Nkx2. 5)特異結(jié)合的多克隆抗體。對在動物體內(nèi)產(chǎn)生免疫反應(yīng)而言，大多數(shù)多肽的分子量都太小，將多肽與載體蛋 白如匙孔血藍蛋白或牛血清白蛋白等交聯(lián)之后，不僅能增加抗原的大小，也能增強免疫性。因此，本發(fā)明還提供了 一種復(fù)合蛋白。本發(fā)明所提供的復(fù)合蛋白是所述多肽與載體蛋白偶聯(lián)形成的復(fù)合蛋白。本發(fā)明的復(fù)合蛋白中，所述載體蛋白為匙孔血藍蛋白或牛血清白蛋白。在免疫動物時，為了增強免疫原性通常將復(fù)合蛋白與免疫佐劑混合。本發(fā)明所提供的免疫原，是所述復(fù)合蛋白和免疫佐劑的混合物。本發(fā)明的與雞心肌特異性同源盒(Nkx2. 5)特異結(jié)合的多克隆抗體，是用免疫原 免疫動物，采取免疫后動物的血液，獲得的血清；所述免疫原是復(fù)合蛋白和免疫佐劑的混合 物；所述復(fù)合蛋白是多肽與載體蛋白偶聯(lián)形成的復(fù)合蛋白，所述多肽的氨基酸序列為序列 表中的序列1。
本發(fā)明的與雞心肌特異性同源盒(Nkx2. 5)特異結(jié)合的多克隆抗體，其中，所述載 體蛋白為匙孔血藍蛋白或牛血清白蛋白。本發(fā)明的免疫原免疫動物獲得了較高效價的免疫血清，經(jīng)ELISA檢驗效價高于 1 62500，并且免疫印跡法證明該免疫血清能與禽源心肌特異性同源盒(Nkx23)特異結(jié) 合，免疫血清能在細胞水平上檢測禽源心肌特異性同源盒(Nkx2.5)的表達。


圖1為免疫印跡法檢測免疫血清的特異性。圖2為空白對照組激光共聚焦顯微鏡下顯示結(jié)果的圖片；A為相差圖像，B為熒光圖像，C為疊加圖像。圖3為對照血清組激光共聚焦顯微鏡下顯示結(jié)果的圖片；A為相差圖像，B為熒光圖像，C為疊加圖像。圖4為免疫血清組激光共聚焦顯微鏡下顯示結(jié)果的圖片；A為相差圖像，B為熒光圖像，C為疊加圖像。
具體實施例方式實施例1、與心肌特異性同源盒(Nkx2. 5)特異結(jié)合的多克隆抗體(一 )合成免疫原人工合成免疫多肽，其氨基酸序列為CSLEQEKRELEDPERPRQ。人工合成對照多肽，其氨基酸序列為CMELSSPSCMLAIFKQEA。對人工合成的多肽進行檢測。結(jié)果表明，人工合成的免疫多肽分子量為2M2. 47Da，高效液相色譜O20nm，C18， 線性梯度)檢測其純度達92%。對照多肽分子量為1976. 32Da, HPLC檢測純度為90%。( 二 )與心肌特異性同源盒(Nkx2. 5)特異結(jié)合的多克隆抗體免疫多肽與載體蛋白按照質(zhì)量比1 1偶聯(lián)，形成多肽-載體復(fù)合蛋白，載體蛋白 可以為匙孔血藍蛋白(KLH)或牛血清白蛋白(BSA)，本實施例為免疫多肽-KLH復(fù)合蛋白。對照多肽與KLH按照質(zhì)量比1 1偶聯(lián)，形成對照多肽-KLH復(fù)合蛋白。免疫多肽-KLH復(fù)合蛋白與費氏完全佐劑(Sigma)混合，制成免疫原。對照多肽-KLH復(fù)合蛋白與費氏完全佐劑(Sigma)混合，制成對照免疫原。用上述制備的免疫原和對照免疫原分別免疫SPF新西蘭大耳兔。20周齡以內(nèi)，2. 5-3Kg的SPF新西蘭大耳兔，隨機分成兩組，免疫多肽組和對照多 肽組，每組2只。免疫多肽組注射免疫原，對照多肽組注射對照免疫原。免疫的具體過程如下第1周，每天多點背部皮下注射免疫SPF新西蘭大耳兔一次，每只SPF新西蘭大耳 兔注射免疫多肽-KLH復(fù)合蛋白或?qū)φ斩嚯?KLH復(fù)合蛋白的總量為0. Img ；第2周，對SPF新西蘭大耳兔不做任何處理；第3周-第7周，每天多點背部皮下注射免疫SPF新西蘭大耳兔一次，每只SPF新 西蘭大耳兔注射免疫多肽-KLH復(fù)合蛋白或?qū)φ斩嚯?KLH復(fù)合蛋白的總量為0. Img ；
第7周免疫結(jié)束，處死SPF新西蘭大耳兔，從耳部及心臟采取150ml血液，用促凝 劑促凝，3000轉(zhuǎn)離心20分鐘。免疫多肽組獲得免疫血清01和02。對照多肽組獲得對照血清01和02。ELISA檢測免疫血清和對照血清的效價，具體方法如下1)雞心肌特異性同源盒(Nkx2. 5)用PBS配成100 μ g/ml的溶液，按100 μ 1/每孔 加入96孔酶標(biāo)板，4°C過夜吸附；2)次日將過夜包被的酶標(biāo)板中未吸附的蛋白溶液倒掉，以PBS洗3次。加入3% (質(zhì)量百分比)BSA (用PBS配制不含Tween20,)封閉，100 μ 1/每孔，37°C，1. 5小時；3)用PBS徹底洗2)中的沉淀4次后加入免疫血清或?qū)φ昭?用PBS按體積比 為 1 100、1 500、1 2500、1 12500 或 1 62500 稀釋)，100 μ 1/每孔，37°C，1. 5 小 時；4)用PBS洗3)中的沉淀4次，加二抗(羊抗兔IgG用PBS按體積比為1 10000 稀釋)，100 μ 1/每孔，37°C，lhr ；5)用PBS洗4)中的沉淀4次，加AP顯色液P-NPP (2mg/ml)，80 μ 1/每孔，避光反 應(yīng)，加等體積0. 2Μ NaOH終止反應(yīng)。6)取100 μ 1 5)中終止反應(yīng)后的溶液100 μ 1，用酶標(biāo)儀測定405nm下的OD值。實驗重復(fù)三次，結(jié)果以三次的平均值表示。
血清效價檢測結(jié)果如表1和圖1所示；表1.血清效價檢測結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種多肽，其氨基酸序列為序列表中的序列1。
2.一種復(fù)合蛋白，是多肽與載體蛋白偶聯(lián)形成的復(fù)合蛋白，所述多肽的氨基酸序列為 序列表中的序列1。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的復(fù)合蛋白，其特征在于所述載體蛋白為匙孔血藍蛋白或牛 血清白蛋白。
4.一種免疫原，是復(fù)合蛋白和免疫佐劑的混合物；所述復(fù)合蛋白是多肽與載體蛋白偶 聯(lián)形成的復(fù)合蛋白，所述多肽的氨基酸序列為序列表中的序列1。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的免疫原，其特征在于所述載體蛋白為匙孔血藍蛋白或牛血 清白蛋白。
6.權(quán)利要求4或5所述的免疫原在制備多克隆抗體中的應(yīng)用。
7.與雞心肌特異性同源盒特異結(jié)合的多克隆抗體，是用免疫原免疫動物，采取免疫后 動物的血液，獲得的血清；所述免疫原是復(fù)合蛋白和免疫佐劑的混合物；所述復(fù)合蛋白是 多肽與載體蛋白偶聯(lián)形成的復(fù)合蛋白，所述多肽的氨基酸序列為序列表中的序列1。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的多克隆抗體，其特征在于所述載體蛋白為匙孔血藍蛋白或 牛血清白蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種心肌特異性同源盒部分多肽及其應(yīng)用。本發(fā)明的心肌特異性同源盒部分多肽，其氨基酸序列為序列表中的序列1。所述多肽與載體蛋白偶聯(lián)可形成復(fù)合蛋白。所述載體蛋白可以為匙孔血藍蛋白或牛血清白蛋白。所述復(fù)合蛋白和免疫佐劑混合的混合物可作為免疫原。本發(fā)明的免疫原免疫動物獲得了較高效價的免疫血清，經(jīng)ELISA檢驗效價高于1∶62500，免疫血清能在細胞水平上檢測禽源心肌特異性同源盒的表達。
文檔編號C07K7/08GK102127149SQ20101003442
公開日2011年7月20日 申請日期2010年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月19日
發(fā)明者何曉紅, 侯玲玲, 傅寶玲, 關(guān)偉軍, 馮寶剛, 宮雪蓮, 王磊, 趙倩君, 馬月輝 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所